Summary
Bu makale, birden fazla maksiller molar içeren bir ligatür kaynaklı murine periodontitis modeli nin oluşturulması için bir protokol sunmaktadır, sonraki analizler için ilgili dişeti dokusu ve kemik daha geniş alanlarda sonuçlanan yanı sıra azaltılmış hayvan kullanımı. Oral nötrofilleri insan deneklere benzer bir şekilde değerlendirme tekniği de tanımlanmıştır.
Abstract
Murine modellerini kullanarak periodontal hastalığın patofizyolojisini incelemenin başlıca avantajları hayvanların düşük maliyeti, genetiği değiştirilmiş suşlar dizisi, hasat edilen yumuşak ve sert dokularda yapilebilen çok sayıda analizdir. Ancak, bu sistemlerin çoğu usule yönelik eleştirilere tabidir. Alternatif olarak, periodontal hastalığın ligatür kaynaklı modeli, lokalize gelişim ve bir disbiyotik oral mikrobiyom tutma tarafından tahrik, istihdam edilebilir, hangi hızla indüklenen ve nispeten güvenilir. Ne yazık ki ligatürkaynaklı murine periodontitis protokolünün varyantları periodontiumun odak bölgelerine izole edilmiştir ve kurulu ligaturun erken avulsiyonuna tabidir. Bu, sonraki analizler için kullanılabilir doku miktarını en aza indirir ve çalışma için gerekli hayvan sayısını artırır. Bu protokol, yukarıda bahsedilenleri azaltan alternatif bir yaklaşımla farelerde oral nötrofillerin kurtarılması için daha iyi tutma ve yeni bir durulama tekniği nin kullanımı ile uzun molar ligatürler yerleştirmek için gerekli kesin manipülasyonları açıklar teknik zorluklar.
Introduction
Periodontal hastalık (PH) önemli konak morbidite ve ekonomik yük ile ilişkili bir osteolitik durumdur, hangi dişeti iltihabı ve etkilenen dentition için hem yumuşak doku eki ve osseous destek kaybı ile kendini gösterir1,2,3,4. Bu süreç, oral mikrobiyota ve konak doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimler tarafından yönetilir. Ayrıca diyabet, kardiyovasküler hastalık ve kanser5,6,7,8dahil olmak üzere diğer sistemik inflamatuar hastalıkların alevlenme ile ilişkilidir. Tarihsel olarak, BU PD patogenezpors gibibelirli bakterilerin büyük miktarlarda bağımlı olduğu varsayımında 9. Ancak, son kanıtlar PH mikrobiyal bileşeni diş biyofilm aracılık olduğunu göstermektedir. Biyofilm sağlıklı simbiyotik ve yıkıcı disbiyotik devletlerde var olabilir çok sayıda mikroorganizmaların organize, karmaşık bir topluluktur10,11. Oral biyofilm normalde patojenik bakterilerin foci kurulmasını engelleyerek ev sahibine direnç sağlar ve konak bağışıklık yanıtı 12 düzenlenmesi ile ideal dişeti doku yapısı ve fonksiyonu teşvik12,13. Oral kavite içinde kommensal organizmalar ve konak bağışıklık sistemi arasındaki dengesel ilişkinin perturbations doku homeostaz değişikliklere yol açabilir, dysbacteriosis ve PD damgasını klinik ve radyografik görünümlerin gelişimi ile sonuçlanan5,10,12,13,14.
İlginçtir, oral disbacteriosis kurulması, PD başlatılması için gerekli iken, tüm bireylerde PH sürücü için yeterli değildir, simbiyotik ve disbiyotik durumlar arasında mikrobiyota geçiş bozmak için konak bağışıklık yanıtı yeteneğine doğru kaçan15. Bu pd doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önde gelen karakterlerinden biri, yani polimorfonükleer granülosit (PMN) veya nötrofil, yerel ve sistemik bakış açılarından16,17etkiler anlamına belirli bir spot yerleştirir .
İnsanlarda, PMN'ler sağlıklı periodontal bağ dokularında ~2 x 106 hücre/h oranında dolaşımdan alınırlar, burada hakim lökosit popülasyonudur. Burada, daha sonra dişeti kreviküler sıvı bir bileşeni olarak ağız boşluğuna dişeti sulkus atılır. PH varlığında, nötrofili dolaşım ve ağız boşluğu içinde tezahür, Bu efektör hücreleri periodontium yukarıda belirtilen imha yol açan bir hiperinflamatuar fenotip sahipnerede 17,18,19,20,21,22. Bu nedenle, PD ve diğer sistemik inflamatuar durumlarda PMN'lerin rolünü anlamak son derece önemlidir.
Kronik hastalıkların PH'ye karşılıklı olarak bağlı olduğu yaygın olarak kabul edilse de, altta yatan mekanizmalar henüz açıklığa kavuşturulamamıştır ve bu morbid ve potansiyel olarak ölümcül sistemik durumların yönetiminde zorluklara katkıda bulunmaktadır. Birden fazla deneysel hayvan modelleri, her biri benzersiz avantajları ve dezavantajları ile, PD23,24patofizyolojisi çalışmak için kullanılmıştır. Özellikle murine modellerine odaklanan pd çalışmasının kolaylaştırıldığı çeşitli protokoller vardır; ancak, çeşitli teknik ve fizyolojik eksiklikleri sahip25,26,27,28,29,30,31.
İlk olarak, oral gavage fare modeli dişeti iltihabı ve kemik kaybı oluşturmak için insan periodontal patojenlerin çok sayıda oral aşılama gerektirir. Ayrıca, genellikle antibiyotik tedavisi bir süre önce murine commensal oral flora yıkmak için25. Bu model genellikle güvenli bir şekilde oral gavaj gerçekleştirmek için özel eğitim gerektirir, daha karmaşık insan oral mikrobiyom periodontal patojenlerin sadece küçük bir kısmını kullanır, ve alveoler kemik kaybı kurmak için birkaç ay gerektirir.
Buna karşılık, kimyasal olarak indüklenen mürin modelleri trinitrobenzen sülfonik asit oral teslim kullanmak (TNBS) veya dekstran sülfat sodyum (DSS), ajanlar genellikle periodontal kemik kaybı neden birkaç aylık bir süre içinde kolit murine modelleri kurulmasında kullanılan26. Dorsumun mürin ifilsorve dokularının yanı sıra kalvaryum içeren intraoral ve ekstraoral apse bazlı modeller mevcuttur. Eski apse modelinde, bakteri çeşitli enjeksiyonlar uygulanır, birden fazla dişeti apse ve alveoler kemik kaybı eksikliği oluşturarak, PH çalışmada kullanımını sınırlayan. İkinci apse modelleri önemli ölçüde daha bakteriyel virülans çalışmaya apt, inflamasyon, ve ağız boşluğu dışında sitelerde kemik rezorpsiyonu, periodontium ve oral mikrobiyom değerlendirme ortadan kaldırır27,28,29,30,31.
Periodontitin ligatür kaynaklı modeli kullanılarak, örgülü ipek dikiş genellikle ikinci azı dişleri etrafında çevresel olarak yüklenmiştir. Alternatif olarak, dikiş malzemesinin tek bir doğrusal segmenti birinci ve ikinci azı dişleri arasına eklenebilir32,33. Ligatür yerleşiminin amacı bakteri birikimini kolaylaştırmak ve dişeti sülfür içinde disbiyoz oluşturmak, periodontal doku iltihabı ve periodontium oluşturan dokuların imha ile sonuçlanan. En önemlisi, Bu model daha yaygın olarak kullanılan oral gavage modeli34ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha alveoler kemik kaybı üretme yeteneğine sahiptir. Oral gavaj modelinin kullanımını daha da zorlaştıran şey, farelerin çeşitli suşlarının (c57BL/6) alveoler kemik kaybına karşı doğal direncidir. Bu aynı zamanda sorunludur, çünkü bu tür en sık kullanılan rürin bazlı hayvanaraştırmalarında 35'tir.
Marchesan ve ark. ve Abe ve Hajishengallis tarafından açıklanan mevcut prosedürler ligature33,36yerleştirerek teknik hareket basitleştirmek için icat edilebildi. Ne yazık ki, eski protokol özel 3D baskılı ekipman gerektirir ve erken ligatür kaybı potansiyeline sahip, bu nedenle artan hayvan kullanımı ve ameliyathanede harcanan ek zaman ile ilgili maliyetler. Ayrıca, her iki protokol de bir çalışma için mevcut hastalıklı periodontium sadece küçük bölgeler oluşturur.
Bu teknikle yatan avantajlar, periodontium'u yöneten oral disbiyoz ve immünolojinin eşzamanlı çalışmasında, farklı genetik geçmişe sahip düşük maliyetli hayvanların kullanımı ve basit barınma ve hayvancılık uygulamalarında temellenmiştir. Bu nedenle, hedefler hastalıklı doku hacimlerini en üst düzeye çıkarmak ve hayvan araştırmalarında azaltma ilkelerini uygulama girişimlerinde, hayvan tüketimini mümkün olduğunca düşük bir seviyeye düşürmek olmalıdır. Bu, tüm hayvanların deneysel analizlere dahil edilme lerini sağlamayı gerektirir37. Ancak, periodontal hastalığın hangi hayvan modeli kullanılırsa kullanılsın, insan PH patofizyolojisinin her unsurunu kapsayan tek bir model olmadığı unutulmamalıdır.
Bu yeni protokol, çoğu laboratuvarda bulunan enstrümantasyon ve malzemeler kullanılarak birden fazla maksiller azı dişinin etrafına bir bağ yerleştirilmelerini sağlar. Kolayca ve güvenle erken avulse olası olmayan bir ligatür yüklemek için yeterli miktarda zaman sağlar. Son olarak, PMN'ler PD'deki periodontium'un yok oluşunun koordinasyonu yla, oral nötrofilleri insanlara benzer bir şekilde kurtarmak için yeni bir metodoloji de sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm murine çalışmaları ilgili etik düzenlemelere uygun ve Toronto Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Araştırma Etik Kurulu (Protokol 2001930) tarafından onaylanmıştır.
1. Ligatür kurulumu
NOT: Bu standart bir ameliyathanede yapIlebilen steril olmayan bir cerrahi işlemdir. Mikropsuz hayvanların kullanımı (burada kapsanmayan) bir biyogüvenlik kabini içinde işleme, steril aletlerin kullanımı ve periodontal patojenler ile oral kavitenin aşılanması periodontitin klinik belirtilerine neden olmayı zorunlu kılır.
- Onaylı kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) yönergelerine göre 0,5" 26 G steril hipodermik iğne ve 1 mL şırınga kullanarak barınma tesisine alışılması gereken 8-12 haftalık erkek C57BL/6 farelere intraperitoneal anestezi uygulayın.
NOT: Ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) anestezinin birleşimi, işlem süresince uygun anestezi düzeyini oluşturur. - İşlem sırasında işlem sırasında pedal refleksinin kaybedilmesiyle kanıtlanmış olarak anestezik derinliği değerlendirin.
- Fareyi ısıtmalı bir cerrahi platforma yerleştirin (Şekil 1A). Elastik bantlar kullanarak açık pozisyonda maksilla ve mandibula stabilize ve daha yatay bir yönde maksilla korumaya yardımcı olmak için bir pamuk rulo ile boyun prop(Şekil 1B). İşlem sırasında ısı kaybını azaltmak için hayvanın gövdesini ve kuyruğunu kapatın.
- Cerrahi mikroskobu, diş inin görselleştirilmesi için ağız boşluğunun üzerine istenilen büyütme ve aydınlatmaya (doğrudan mikroskoba monte edilmemişse) yerleştirin. İstenilen büyütme operatöre bağlı iken, oral kavitenin optimal görselleştirmesi 16x'te elde edilir.
- Kıymık forceps kullanarak dişeti sulkus içinde birinci (M1) ve ikinci (M2) maksiller molar etrafında steril 5-0 örgülü ipek dikiş yükleyin.
NOT: Daha küçük bir ölçerin örgülü ipek dikişleri daha hızlı kurulumkolaylaştırmak ve iyatrojenik yumuşak doku hasarı olasılığını azaltmak için bu amaçla kullanılabilir.- Dikişin distal kuyruğunu dentinin aldata tarafına yerleştirin ve proksimal segmenti M2 ile M3 teması arasına yerleştirin(Şekil 2A).
- Sütürü M2'nin bukkal yüzeyinin etrafına sarın ve M1 ve M2'nin teması arasına yerleştirin. Sütürün her iki ucunun da dişeti sulkuna dikiş sürmek ve tüm bolluğu gidermek için sıkıca çekildiğine emin olun(Şekil 2B).
- Proksimal sütür segmentini M1'in etrafına sarın, kontur yüksekliğinin altında, ve M1 ve M2'nin teması arasına takın. Sütürle sütürlü somurtkanlığa doğru sürüklüyor ve tüm bolluğu çıkarmak için sütürün proksimal kuyruğunu sıkıca çekin(Şekil 2C).
NOT: Dikişin M1 ve M2 veya M2 veya M3 arasına takılması durumunda, kontak standart bir diş kaşifi kullanılarak hafifçe açılabilir. - Dikişin uçlarını bir cerrah düğümüile bağlayın ve kuyrukları mümkün olduğunca kısa kestirin. M1 ve M2 arasındaki dişeti embrasure düğüm maksiller dentition(Şekil 2D)palatal tarafında yerleştirin.
NOT: 1.4.1-1.4.4 adımları gerekirse kontralateral tarafta tekrarlanabilir. - Her hayvan denek arasında sıcak cam boncuk sterilizatör cerrahi aletleri sterilize.
DİkKAT: Forceps uçları son derece keskin ve kolayca oral travma ve önemli kanamaya neden olabilir. Ağız boşluğundaki kanı çıkarmak ve aktif olarak kanayan yaralara basınç uygulamak için gazlı bezin küçük parçalarını hazırlayın.
- Ligatür kurulumdan sonra fareyi cerrahi cihazdan çıkarın, ısı lambasının altına temiz bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar monitörü kullanın.
- Her fareyi uygun çevresel zenginleştirme ile ayrı ayrı barındırın ve 7-11 gün boyunca filtrelenmiş suya ve nem kontrollü bir ortamda (12 saat ışık/12-h karanlık döngü) standart chow püresi neresine reklam libitum erişimine izin verin.
NOT: Püre chow böylece beslenme ile ilişkili ağrı yıkıntma için gerekli kuvvetleri azaltır ve yüklü ligature erken kaybını önlemede yardımcı olur.
2. Örnek toplama
- Onaylı IACUC yönergelerine göre fareleri ötenazi.
NOT: Bu protokol için tercih edilen yöntem, CO2 haznesini ve ardından servikal çıkığı kullanan tek tek ötanazi yöntemidir. Bu ek dokuların hasat gerektiren deneylere bağlı olarak değiştirilebilir. - Bir pipet kullanarak, 10 s kalsiyum ve magnezyum olmadan 100 μL sterilize 4 °C 1x fosfat-tamponlu salin (PBS) ile ağız boşluğunu hemen durulayın.
- Adımı 2,2 2x'i tekrarlayın ve her bir durulamayı tek bir 15 mL konik polipropilen steril test tüpüne yerleştirin.
- İçeriği 40 m'lik naylon örgü filtreden geçirerek 50 mL konik polipropilen steril test tüpüne aktarın.
- Bu içeriği yeni bir 15 mL konik polipropilen steril test tüpüne aktarın.
NOT: Numunenin daha küçük bir tüpe son transferi, önümüzdeki adımlarda hücresel peletin daha iyi görüntülenmesine olanak tanır.- İstenirse, 15 mL'lik konik polipropilen steril test tüpünde molar ligature(ler) çıkarın ve sterilize edilmiş 1x PBS (4 °C, kalsiyum ve magnezyumsuz) 300 μL'lik bir alana yerleştirin. Hafifçe çalkalayın ve tüp dikiş çıkarın. Bu örnek, bu noktadan itibaren oral durulama örneği ile aynı şekilde tedavi edilir.
- Örnek fiksasyonu kolaylaştırmak için %16 paraformaldehit (PFA) 33,3 μL ekleyin.
- Girdap örnekleri hemen ve 15 dakika buz üzerinde kuluçka.
- Tüpü 15 mL'ye 1x PBS ile doldurun ve PFA'yı seyreltin, ardından 1000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin.
- 4 °C'de floresan aktive hücre sıralama (FACS) tamponunun 1 mL'sinde süpernatantı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın. Hücreleri hemositometre veya otomatik hücre sayacında say.
- Numuneyi 1000 RCF ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
- 0.5-1.0 x 106 hücre/50 μL FACS tamponu için uygun bir FACS tampon hacminde postayı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın.
3. Akış sitometrik analizi için antikor boyama
NOT: Kullanmadan önce gerekli tüm FACS tüplerini etiketleyip soğutun.
- Numunenin 50 μL'sine 1 000 fare serumu ve 2 μL anti-fare IgG antikor ekleyin, hemen girdap ve 20 dakika boyunca buz üzerinde blok yapın.
- Her numuneye uygun antikorları ekleyin, hemen girdap ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
NOT: Antikor ların seçimi ve hacimleri, bu özel tekniğe uygun önceki optimizasyon pilot deneylerine bağlıdır. - 1 mL FACS tamponu ile numuneleri yıkayın, kısa bir süre girdap ve 1000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj. Bu adımı 2x tekrarlayın.
- 250 μL FACS tamponundaki numuneleri yeniden askıya alın, parafin filmli tüpleri kapatın, alüminyum folyoya sarın ve analiz ene kadar 4 °C'de tutun.
NOT: Uzun depolama sürelerindeki floresan sinyal kaybı nedeniyle protokolün tamamlanmasından sonraki saatler içinde numuneleri analiz etmek idealdir. Ancak, numuneler kesinlikle gerekirse 2-3 gün sonra analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oral durulama örneklerinden(Şekil 3A)ve iltihaplı (Şekil 3B) bağ kaynaklı periodontite sekonder olan murine oral kaviteden temsili akış sitometri verileri sağlanır. PmN'lerin yüklü bir ligatürden geri kazanımı da gösterilmiştir (Şekil 3C). Akış sitometre kanal gerilimleri manuel olarak kalibre edildi ve tek lekeli kompanzasyon boncukları ile telafi yapıldı. PMN'ler Ly6G+veF4/80-ve ana hatlarıyla38strateji kullanılarak tanımlanmıştır. Her oral durulama ve ligatür örneğinden en az 500 kapılı PMN olayı elde edildi. PMN canlılığı trypan mavi boyama ile yaklaşık %37 olarak saptıldı. Alveoler kemik ibik (ABC) sağlıklı için setoenamel kavşak (CEJ) ve ligated fareler için ölçülen alveoler kemik düzeylerinin temsili görüntüler(Şekil 4A) (Şekil 4B). Bu ölçümler arasındaki bağıl farklar(Şekil 4C)sağlanır.
Şekil 1: Azı yağı ligasyonu için hayvan konumlandırması. (A) Oral kaviteye erişim maksiller ve mandibular kesici diş titremesi üzerine hafif çekiş yerleştirerek mandibul depresif bir pozisyonda tutarak elde edilir. (B) Gazlı bez başın hareketini önlemek ve nispeten yatay bir pozisyonda maksilla yerleştirmek için kafatası altına yerleştirilir. Vücut ve kuyruk mikroskop altında cerrahi aşamada hareket önce ısı kaybını önlemek için kaplıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ligatür kurulumunun sıralı fotoğrafı. (A) Sütürün distal kuyruğu dentinin palatal tarafına yerleştirilir ve proksimal segment M2 ve M3 teması arasına yerleştirilir. (B) Dikiş daha sonra M2'nin bukkal yüzeyine sarılır ve M1 ve M2'nin teması arasına yerleştirilir. (C) Proksimal dikiş segmenti, kontur yüksekliğinin altında M1'e sarılır ve M1 ve M2 kontağı arasına yerleştirilir. (D) Dikişin uçları bir cerrahın düğümü ile bağlanır ve düğüme mümkün olduğunca yakın kırpılır. Düğüm maksiller dentinin palatal tarafında M1 ve M2 arasındaki dişeti embrasure yerleştirilir. Tüm fotoğraflar molar dentition engelsiz bir görünüm ile prosedür adımları kayıt için parçalanmış maksilla elde edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili FACS arsalar ve sözlü nötrofil varlığını gösteren gating stratejisi. Nötrofiller aşağıdaki örneklerden kurtarıldı ve akış sitometrisi ile değerlendirildi: (A) naif bir fareden oral durulama, (B) oral durulama, ve (C) ligatür kaynaklı periodontit (bilateral) ile bir fareden elde edilen bağlar. Temsili gating strateji scatterplots gösterilir. Singlets (SSC-H x SSC-W ve FSC-H x FSC-W) ve nötrofiller (Ly6G+ve/F480-ve)gösterildiği gibi geçitli idi. Sayısal değerler her kapıdaki hücrelerin yüzdesini yansıtır. SSC-A = yan dağılım alanı; SSC-W = yan dağılım genişliği; SSC-H = yan dağılım yüksekliği; FSC-A = ileri dağılım alanı; FSC-W = ileri dağılım genişliği; FSC-H = ileri dağılım yüksekliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Alveoler kemik kaybı kontrol ve ligated hayvanlar arasındaki farklar. (A) kontrolü ve (B) ligated fareler arasında alveoler kemik kaybı farklılıkları gösteren temsili fotoğraflar. (C) Sementoenamel kavşaktan (CEJ) alveoler kemik imine (ABC) ölçümleri ve M1 ve M2'nin mesiopalatal ve distopalatal çizgi açıları gösterilmiştir (ortalama ± SEM, n = 3). P-değerleri post-hoc Fisher'ın LSD testi ile iki yönlü ANOVA ile belirlendi. (*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periodontitin murin ligatür kaynaklı modelinin kullanımı ile ilişkili en kritik unsur, kurban veya kasıtlı olarak çıkarılma zamanına kadar bağın tutulması etrafında ortalanır. Yüklü biyofilm-retentive ligatür az 6 gün içinde alveoler kemik yüksekliği önemli bir kayıp indükleyen yeteneğine sahiptir, 11-16 günlük dönem arasında platolama39. Kemik kaybının en üst düzey döneminden önce hayvan denekleri kurban etme kararı, bunu ligatür kaynaklı periodontitin çok daha kısa bir modeli haline getirerek, kurban zamanından önce ligatür kaybı olarak tanımlanan ve hayvanı tanısal olmayan hale getiren erken ligatür avulsiyon insidansını daha da azaltmak için seçilmiştir.
Bu modelin en sık atıf dezavantajı 4,4 mm (M1) ile 2,6 mm (M3)40çevresi aralığı murine molar dentinin küçük boyutları nedeniyle ligatür yükleme algılanan teknik zorluk vurgulamaktadır. Bu sorun, (en fazla) 10 dakika/hayvan gerektiren ve anestezi nin doğumunu içeren ligatür kurulumu için cerrahi personel/kursiyerlerin katılımı ile azaltılabilir. Ayrıca, bağ yerleştirme tekrarı ile hakim bir beceridir, ve el becerisi yüksek bir derece gerektiren birçok ortak laboratuvar tabanlı teknikler daha yoğun değildir. Prosedürel açıdan bakıldığında, intraperitoneal anestezi kullanımı ligatür kurulumunu kolaylaştırmak için geniş zaman sağlar. Gerekirse, aynı zamanda tatmin edici bir şekilde yüklü olmayan herhangi bir ligatür değiştirilmesine izin verir, Dişeti sulkus ve düğüm için dikiş lokalizasyonu M1 ve M2 teması arasında tutma için idealdir.
Bu protokollerin önerilen modifikasyonları, tek bir azı telinin çevresel dikiş veya 2) molar dentiksiyonunun tek bir teması arasına yerleştirilen tek bir doğrusal dikiş segmenti kullanılarak tek bir azı telinin ligasyonunu gerektiren çeşitli avantajlar sağlar. Teknik açıdan bakıldığında, protokol ya hazır ya da Abe ve Hajishengallis benzer bir şekilde önceden mevcut ekipman inşa edilebilir ekipman kullanır. Bu 3D baskı33tarafından özel siparişler veya ekipman üretimi için ihtiyaç obviates. Birden fazla dişin etrafına sürekli ipek dikiş sapanının, bir cerrah ın düğümle sabitlenmesi, dilden rahatsız edilemeyecek şekilde bağ tutmasını da artırabilir.
Bu protokol sırasında, Marchesan ve ark. tarafından önerilen teknik ile karşılaştırıldığında hangi kadar% 20 kayıpları tahmin edilmektedir, prematüre ligatür avulsiyon tam bir yokluğu vardı36. Ligatür kaybı insidansı doğrudan Abe ve Hajishengallis tarafından değerlendirilmemiş olsa da, teknik41,42,43,44. Teknik açıdan, ligated hayvanlarda iyatrojenik yumuşak doku hasarı önlendi. Bu fenomeniçin katkıda bulunan faktörler bir mikroskop yoluyla ağız boşluğusürekli bir gözlem, forceps uçları sürekli görselleştirme ve yerleştirme sırasında dikiş kaymaönlemek için temiz çifeklerin kullanımı içerir.
Ağız boşluğu içinde, dikiş malzemesinin uzamış segmentleri de önemli ölçüde analiz için kullanılabilir hastalıklı doku miktarını artırmak ve hayvan kullanımında belirgin bir azalmaya neden olabilir. Bunun nedeni tüm deneklerin analize dahil edilebilmeleri ve doku ve durulama örneklerinin biraraya edilmesi nin gerekli olmamasıdır. Bu etkilenen doku alanını artırmak için daha önce bildirilen teknikleri kullanarak kontralateral maksiller molar dentition ligate mümkün olduğu unutulmamalıdır41. Ancak, bu değişiklik, bölünmüş ağızlı tasarımın gerekli olduğu durumlarda, bu yeni protokolün uygulanması için ödünç verme desteği sağlamak mümkün değildir. Son olarak, önceki ligatür kaynaklı periodontitis protokollerine benzer şekilde, bu tekniğin kullanımı 8-12 haftalık erkek C57BL/6 farelerle sınırlı değildir. Yaşlı fareler, her iki cinsiyet, ve çeşitli genetik arka planlar deneysel tasarıma bağlı olarak kabul edilebilir.
Ne yazık ki, bu model hala bazı teknik ve metodolojik hatalar sahip. Yukarıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi spesifik patojen içermeyen farelerin kullanımı insan periodontitisinin ilerlemesini taklit edemez. Bu onların commensal oral biyofilmlerin bileşimi arasındaki çeşitli farklılıklar nedeniyle, hangi bakteri-bakteri ve bakteri-konak etkileşimleri değerlendirilmesinin dış geçerliliğini sınırlar45. Bu teorik olarak mikropsuz farelerin kullanımı ile azaltılabilir, bu da protokolü önemli ölçüde karmaşıklaştırır. Ek çaba ve kaynaklar hayvan deneklerin konut ve cerrahi manipülasyon sırasında mikropsuz kalmasını sağlamak için gereklidir. Bu fareler bakteriyel birikimi yokluğunda ligatür kaynaklı PH dirençli olduğu gibi, periodontitis geliştirmek için ek önlemler de uygulanmalıdır46,47.
Ayrıca, periodontal hastalık biyofilm ve konak bağışıklık sistemi arasında daha karmaşık bir polimikrobiyal etkileşimi temsil ettiği için mono-enfeksiyon ve ko-enfeksiyon ligatür modelleri insan durumunu özetlemede yetersiz kalmaktadır. Bu durumlarda, insan oral bakterilerin sınırlı sayıda rolleri ve etkileşimleri açıklığa kavuşturma eksik ve potansiyel olarak dezavantajlı olarak kabul edilebilir, periodontium immünobiyoloji çalışma bağlamında özellikle.
Son olarak, son kanıtlar mastikülasyon güçlerinin t helper birikimi ile dişeti immünogözetim değiştirme yeteneğine sahip olduğunu ima etmiştir 17 hücreleri, bariyer bağışıklık ayrılmaz bir aracı48. Bu nedenle, yumuşak bir diyet kullanımı, özellikle yaşlı hayvanlarda, potansiyel bir confounder hareket edebilir. Bu durum, ligatürler uygulanan bölgelerde normal fizyolojik kemik kaybı riskini azaltabilir. Bu kanıtlar ışığında, yaşlı hayvanların kullanımına dikkat edilmeli ve bu bulguların en belirgin olduğu yerlerde yaşa uygun kontroller verilmelidir.
Bu nispeten basit modelin kullanımı mikro-bilgisayarlı tomografi ile alveoler kemik kaybı değerlendirmek için uzatılabilir, alveoler kemik histolojik analizleri ve bağlı dişeti çevreleyen, ve oral mikrobiyota karakterizasyonu iletken, hepsi mevcut ligatür kaynaklı PD modelleri ile gerçekleştirilmiştir33,49. Nadiren tartışılan veya kullanılan rağmen, aynı zamanda tedavinin etkilerini değerlendirmek için mümkündür, (yanı sıra onarım ve periodontium rejenerasyon) ligatür kaynaklı murine periodontitis ayarında ince nokta kıymık forceps ile genel anestezi altında ligatür kaldırarak39. Son olarak, bu modelin kullanımı periodontal hastalığın sistemik etkileri nin incelenmesine kadar uzatılabilir, istenirse birden fazla dişin ligasyonunun neden olduğu artmış inflamatuar yük, ayrıca istenirse sol ve sağ maksiller molar dentisyinin nedeni artmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
J. W. C. Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) tarafından desteklenir. Yazarlar trypan mavi boyama performans onu yardım için Dr Chunxiang Sun teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W.
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D.
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P.
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A.
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P.
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
