Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا لإنشاء نموذج التي يسببها الربط من التهاب اللثة murine التي تنطوي علي العديد من المتعفنة الفك العلوي ، مما ادي إلى مناطق أكبر من الانسجه اللثة المعنية والعظام للتحليل اللاحق ، فضلا عن انخفاض استخدام الحيوانية. ويرد أيضا وصف لتقنية لتقييم العدلات عن طريق الفم بطريقه مماثله للمواضيع البشرية.
Abstract
المزايا الرئيسية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لامراض اللثة باستخدام نماذج murine هي انخفاض تكلفه الحيوانية ، ومجموعه من سلالات معدله وراثيا ، وعدد كبير من التحليلات التي يمكن اجراؤها علي حصاد الانسجه الرخوة والصلبة. غير ان العديد من هذه النظم يخضع لانتقادات اجرائيه. وكبديل لذلك ، يمكن استخدام نموذج الربط المستحث لامراض اللثة ، مدفوعا بالتطوير الموضعي والاحتفاظ بميكروبيوم الفموي الدقيق ، والذي يتم الحث عليه بسرعة ويمكن الاعتماد عليه نسبيا. لسوء الحظ ، يتم عزل المتغيرات من الربط المستحثة اللثة التركيب البروتوكول إلى مناطق التركيز من دواعم الأسنان وتخضع ليثبت تغير السابق لأوانه من الاربطه المثبتة. وهذا يقلل من كميه الانسجه المتاحة للتحليلات اللاحقة ويزيد من عدد الماشية المطلوبة للدراسة. يصف هذا البروتوكول التلاعبات الدقيقة المطلوبة لوضع الحروف المركبة المولي الموسعة مع تحسين الاحتفاظ واستخدام تقنيه شطف الرواية لاستعاده العدلات عن طريق الفم في الفئران مع نهج بديل يخفف من المذكورة أعلاه التحديات التقنية.
Introduction
مرض اللثة (PD) هو شرط العظم المرتبطة بالاعتلال المضيف كبيره والعبء الاقتصادي ، والذي يتجلى من التهاب اللثة وفقدان كل من مرفق الانسجه الرخوة والدعم العظمي للأسنان المتضررة1،2،3،4. وتخضع هذه العملية للتفاعلات بين الميكروبات الفموية والجهاز المناعي الفطري للمضيف. ويرتبط أيضا مع تفاقم الامراض التهابيه الجهازية الأخرى بما في ذلك مرض السكري, امراض القلب والاوعيه الدموية, والسرطان5,6,7,8. تاريخيا, كان الافتراض ان المرض PD يعتمد علي كميات كبيره من البكتيريا المحددة مثل البوررومناس اللثة9. ومع ذلك ، تشير الادله الاخيره إلى ان العنصر الميكروبي من PD هو توسط من قبل biofilm الأسنان. و بيوفيلم هو مجتمع منظم ومعقد من الكائنات المجهرية العديدة التي يمكن ان توجد في التكافلية الصحية والمدمرة dysbiotic الدول10,11. بيوفيلم عن طريق الفم عاده ما يتيح المقاومة للمضيف من خلال منع إنشاء بؤر البكتيريا المسببة للامراض ويعزز هيكل الانسجه اللثة المثالي ووظيفة من خلال تنظيم استجابه المناعي المضيف12,13. اضطرابات العلاقة التوازن بين الكائنات الحية المعلقة داخل تجويف الفم والجهاز المناعي المضيف قد يؤدي إلى تغييرات في التوازن الانسجه ، مما ادي إلى دسباقتريوز وتطوير السمات المميزة السريرية والشعاعية من PD5،10،12،13،14.
ومن المثير للاهتمام ، وإنشاء دسباقتريسيس عن طريق الفم ، في حين المطلوبة للشروع في PD ، ليست كافيه لدفع PD في جميع الافراد ، التملص نحو قدره الاستجابة المناعية المضيف لتخريب الانتقال من الجراثيم بين التكافلية والدول dysاحيائي15. هذا يسلط الضوء بشكل خاص علي الوسائل التي من خلالها التاثيرات PD واحده من الشخصيات الرائدة في الجهاز المناعي الفطري ، وهي الحبيبية الكرياتالسبع(pmn) ، أو العدلات ، من منظور المحلية والجهازية16،17.
في البشر ، يتم تجنيد PMNs من الدورة الدموية بمعدل ~ 2 × 106 خلايا/ساعة في الانسجه الضامة الصحية اللثة ، حيث هم السكان الكريات البيضاء المهيمنة. هنا ، يتم طردهم في وقت لاحق من التلم اللثة في تجويف الفم كعنصر من السائل كريفيكولار اللثة. في وجود PD ، يظهر العدلات داخل الدورة الدموية وتجويف الفم ، حيث تمتلك هذه الخلايا المستجيبة النمط الظاهري التهابي المفرط الذي يؤدي إلى تدمير المذكورة أعلاه من دواعم السن17،18،19،20،21،22. لذلك ، فهم دور PMNs في PD وغيرها من الظروف التهابيه الجهازية ذات اهميه قصوى.
وعلي الرغم من انه من المقبول علي نطاق واسع ان الامراض المزمنة ترتبط ارتباطا متبادلا بالشرطة العامة ، فان أليات الاساسيه لم يتم توضيحها بعد ، مما أسهم في صعوبات في أداره هذه الظروف الجهازية المرضية والتي يحتمل ان تكون مميته. نماذج الحيوانية التجريبية متعددة, كل مع مزايا فريدة من نوعها وعيوب, وقد استخدمت لدراسة الفيزيولوجيا المرضية من PD23,24. التركيز بشكل خاص علي نماذج murine ، وهناك مجموعه متنوعة من البروتوكولات التي من خلالها يتم تسهيل دراسة PD ؛ ومع ذلك ، فانها تمتلك العديد من العيوب التقنية والفسيولوجية25،26،27،28،29،30،31.
أولا ، يتطلب نموذج الماوس أنبوبي عن طريق الفم العديد من التطعيمات عن طريق الفم من مسببات الامراض اللثة البشرية لتوليد التهاب اللثة وفقدان العظام. بالاضافه إلى ذلك ، فانه عاده ما تسبقه فتره من العلاج بالمضادات الحيوية لتخريب النباتات الفموية المعلقة التي تمت25. هذا النموذج غالبا ما يتطلب التدريب المتخصصة لأداء بأمان gavage عن طريق الفم, يستخدم سوي جزء صغير من مسببات الامراض اللثة من ميكروبيوم الإنسان الأكثر تعقيدا, ويتطلب عده أشهر لتاسيس فقدان العظام السنخيه.
وعلي النقيض من ذلك ، تستخدم نماذج murine المستحثة كيميائيا التسليم عن طريق الفم من حمض السلفونيك trinitrobenzene (TNBS) أو الصوديوم كبريتات ديكسكان (مفاجات صيف دبي) ، وكلاء تستخدم عاده في إنشاء نماذج murine من التهاب القولون علي مدي فتره عده أشهر للحث علي فقدان العظام اللثة26. النماذج القائمة علي الخراج في الفم وخارج الفم متاحه ، والتي تنطوي علي القواطع murine والانسجه من ظهر فضلا عن calvarium ، علي التوالي. في نموذج الخراج السابق ، تدار عده حقن من البكتيريا ، وخلق الخراجات اللثة متعددة وندره فقدان العظام السنخيه ، والحد من استخدامها في دراسة PD. نماذج الخراج الاخيره هي أكثر بكثير عرضه لدراسة ضراوة البكتيرية ، والتهاب ، وارتشاف العظام في مواقع خارج تجويف الفم ، والذي يلغي تقييم دواعم الأسنان والفم الميكروبيوم27،28،29،30،31.
باستخدام نموذج التي يسببها الاربطه من التهاب اللثة ، وقد تم عاده تثبيت خياطه الحرير مضفر حول المولي الثاني. كبديل ، يمكن ادراج قطعه خطيه واحده من المواد خياطه بين الاولي والثانية أضراس32،33. الهدف من وضع الاربطه هو تسهيل تراكم البكتيريا وتوليد ديسبيوسيس داخل sulci اللثة ، مما ادي إلى التهاب الانسجه اللثة وتدمير الانسجه التي تتكون من دواعم الأسنان. والاهم من ذلك ، هذا النموذج قادر علي إنتاج أكبر بكثير من فقدان العظم السنخيه بالمقارنة مع نموذج أنبوبي الشفوي الأكثر استخداما34. زيادة تعقيد استخدام نموذج أنبوبي عن طريق الفم هو المقاومة الطبيعية من قبل عده سلالات من الفئران (اي ، C57BL/6) لتطوير فقدان العظام السنخيه. هذا هو أيضا إشكاليه, كما ان هذه السلالة هي الأكثر استخداما في البحوث الحيوانية المستندة إلى murine35.
وقد وضعت الإجراءات القائمة التي وصفتها مارتشيسان وآخرون ، وابي وهاجيشينليس لتبسيط القانون التقني الذي يضع الحروف33،36. ولسوء الحظ ، يتطلب البروتوكول السابق معدات متخصصة مطبوعه بالابعاد الثلاثية ولديه القدرة علي فقدان الاربطه المبكرة ، مما يزيد من استخدام الماشية والتكاليف المرتبطة بالوقت الإضافي الذي يقضيه في غرفه العمليات. وعلاوة علي ذلك ، كلا البروتوكولين توليد مناطق صغيره فقط من دواعم الأسنان المريضة المتاحة للدراسة.
وترتكز المزايا التي تكمن في هذه التقنية علي الدراسة المتزامنة لتشوات الفم والمناعة التي تحكم دواعم اللثة ، واستخدام الماشية منخفضه التكلفة ذات الخلفيات الوراثية المتنوعة ، والممارسات البسيطة للإسكان والتربية. وعلي هذا النحو ، ينبغي ان تكون الأهداف هي تعظيم حجم الانسجه المريضة ، وفي محاولة لممارسه مبادئ الحد من البحوث الحيوانية ، خفض الاستهلاك الحيواني إلى مستوي منخفض قدر الإمكان. وهذا يتطلب ضمان ان جميع الكائنات أليفه قادره علي الادراج في التحاليل التجريبية37. ومع ذلك ، تجدر الاشاره إلى انه بغض النظر عن النموذج الحيواني من الامراض اللثة يتم استخدامها ، لا يوجد نموذج واحد الذي يشمل كل عنصر من عناصر الفيزيولوجيا المرضية PD البشرية.
يستخدم هذا البروتوكول الجديد وضع الربط حول أسنان الفك العلوي متعددة باستخدام الاجهزه والمواد الموجودة داخل معظم المختبرات. فانه يسمح كميه كافيه من الوقت لتثبيت بسهوله وبثقة الاربطه التي من غير المرجح ان تقطع قبل الأوان. وأخيرا ، كما يقدم PMNs تنسيق تدمير دواعم الأسنان في PD ، يتم أيضا تقديم منهجيه جديده لاستعاده العدلات عن طريق الفم بطريقه مماثله للبشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد امتثلت جميع الدراسات المتعلقة بالmurine للوائح الاخلاقيه ذات الصلة ووافقت عليها لجنه الرعاية الحيوانية التابعة لجامعه تورنتو ومجلس أخلاقيات البحوث (البروتوكول 20011930).
1. تركيب الاربطه
ملاحظه: هذا هو اجراء العمليات الجراحية غير معقمه التي يمكن القيام بها في مسرح التشغيل القياسية. استخدام الكائنات الخالية من الجراثيم (غير مغطاه هنا) ولايات التعامل داخل مجلس السلامة البيولوجية ، واستخدام الاداات العقيمة ، والتلقيح من تجويف الفم مع مسببات الامراض اللثة للتسبب في المظاهر السريرية للتهاب اللثة.
- أداره التخدير داخل الصفاق إلى 8 – 12 من العمر الذكور C57BL/6 الفئران ، والتي ينبغي ان يتاقلم إلى مرفق الإسكان الخاصة بهم ، وذلك باستخدام 0.5 "26 G العقيمة ابره المعقمة و 1 مل حقنه وفقا لمؤسسه الرعاية الحيوانية المعتمدة والمبادئ التوجيهية لجنه الاستخدام (IACUC).
ملاحظه: مزيج من الكيتامين (100 ملغم/كغ) و اكسيليازين (10 مغ/كغ) التخدير بسرعة ويؤدي بشكل موثوق المستوي المناسب من التخدير لمده الاجراء. - تقييم عمق التخدير قبل وكل 15 دقيقه خلال العملية كما يتضح من فقدان منعكس دواسة.
- ضع الماوس علي منصة جراحيه ساخنه (الشكل 1ا). تثبيت فك والفك السفلي في موقف مفتوح باستخدام عصابات مرنه ودعم الرقبة مع لفه من القطن للمساعدة في الحفاظ علي فك في اتجاه أفقي أكثر (الشكل 1ب). تغطيه الجسم والذيل من الحيوانية للتخفيف من فقدان الحرارة اثناء العملية.
- وضع المجهر الجراحي في التكبير المطلوب والاضاءه (إذا لم شنت مباشره إلى المجهر) علي تجويف الفم لتصور الأسنان. في حين ان التكبير المطلوب يعتمد علي المشغل ، يتم الحصول علي التصور الأمثل لتجويف الفم في 16x.
- تثبيت العقيمة 5-0 الحرير مضفر خياطه حول الاولي (M1) والثانية (M2) الفك العلوي المتعفنة داخل التلم اللثة باستخدام ملقط شظية.
ملاحظه: يمكن استخدام الغرز الحريرية مضفر من قياس أصغر لهذا الغرض لتسهيل التثبيت بشكل أسرع والحد من امكانيه تلف الانسجه الرخوة ايتروغينيك.- ضع الذيل البعيد للخياطة علي الجانب الشاحب من العاج وادخل الجزء القريب بين الاتصال M2 و M3 (الشكل 2ا).
- التفاف خياطه حول سطح شدق من m2 وادراجه بين الاتصال من M1 و m2. تاكد من ان كلا طرفي الخياطة يتم سحبهما باحكام لدفع الغرز إلى اللثة وأزاله كل الركود (الشكل 2ب).
- التفاف الجزء خياطه القريبة حول M1 ، تحت ارتفاعه من كفاف ، وادراجه بين الاتصال من M1 و M2. سحب الذيل القريب من خياطه باحكام لدفع خياطه في التلم اللثة وأزاله كل الركود (الشكل 2ج).
ملاحظه: إذا لوحظت المقاومة عند ادراج الخياطة بين M1 و M2 أو M2 و M3 ، قد يكون الاتصال مفتوحا قليلا باستخدام مستكشف الأسنان القياسية. - ربط نهايات خياطه مع عقده الجراح وتقليم ذيول قصيرة قدر الإمكان. وضع عقده في اللثة كوة بين M1 و M2 علي الجانب حنكي من الأسنان الفك العلوي (الشكل 2د).
ملاحظه: الخطوات 1-4-1-1.4.4 يمكن تكرارها علي الجانب المعاكس ، إذا لزم الأمر. - تعقيم الاداات الجراحية في الزجاج الساخن حبه معقم بين كل موضوع الحيوانية.
تحذير: نصائح الملقط حاده للغاية ويمكن ان تسبب بسهوله الصدمات الفموية والنزيف الكبير. اعداد شرائح صغيره من الشاش لأزاله الدم من تجويف الفم وممارسه الضغط علي الجروح النزيف بنشاط.
- بعد تركيب الاربطه ، وأزاله الماوس من الجهاز الجراحي ، ووضع في قفص نظيف تحت مصباح الحرارة ورصد حتى تعافي تماما.
- المنزل بشكل فردي كل الماوس مع إثراء البيئية المناسبة والسماح حسب الإعلان الوصول إلى المياه المصفاة والمهروسة القياسية تشاو في بيئة الحرارة والرطوبة التي تسيطر عليها (12-h ضوء/12-h دوره الظلام) لمده 7-11 يوما.
ملاحظه: الطعام المهروس يقلل من القوات اللازمة للمصريب التالي تقليل الم المرتبطة بالتغذية ، ويساعد في منع الفقدان المبكر للربطة المثبتة.
2-جمع العينات
- الفئران موت ببطء وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة IACUC.
ملاحظه: القتل الرحيم الفردية باستخدام غرفه2 CO متبوعا خلع عنق الرحم هو الأسلوب المفضل لهذا البروتوكول. قد يتم تغيير هذا اعتمادا علي التجارب التي تتطلب حصاد انسجه اضافيه. - باستخدام ماصه ، شطف علي الفور تجويف الفم مع 100 μL من تعقيم 4 درجه مئوية 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) دون الكالسيوم والمغنيسيوم لمده 10 ليالي.
- كرر الخطوة 2.2 2x ووضع كل شطف في واحد 15 مل مخروطي أنابيب البولي بروبيلين العقيمة اختبار.
- نقل المحتويات إلى 50 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب اختبار معقمه عن طريق تشغيلها من خلال فلتر شبكه نايلون 40 μm.
- نقل هذه المحتويات إلى 15 مل البولي بروبيلين المخروطية أنبوب اختبار معقمه.
ملاحظه: النقل النهائي للعينه إلى أنبوب أصغر يسمح لتحسين التصور من بيليه الخلوية في الخطوات القادمة.- إذا رغبت في ذلك ، وأزاله الاربطه المولي (ق) ومكان في 300 μL من تعقيم 1x تلفزيوني (4 درجه مئوية ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم) في منفصلة 15 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب اختبار معقمه. التحريض بلطف وأزاله خياطه من الأنبوب. يتم التعامل مع هذه العينة بشكل مطابق لعينه شطف عن طريق الفم من هذه النقطة إلى الامام.
- أضافه 33.3 μL من 16 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لتسهيل تثبيت العينة.
- دوامه العينات علي الفور واحتضان علي الجليد لمده 15 دقيقه.
- ملء أنبوب إلى 15 مل مع 1x تلفزيوني لتمييع PFA ، ثم أجهزه الطرد المركزي في 1000 x g و 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من الفرز الخلية المنشطة مضان (facs) المخزن المؤقت في 4 درجه مئوية. عد الخلايا علي مقياس الكريات الدموية أو عداد الخلايا المؤتمت.
- الطرد المركزي العينة مره أخرى في 1000 الإطار الإقليمي و 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في حجم مناسب من المخزن المؤقت facs للتركيز النهائي من 0.5-1.0 x 106 خلايا/50 μl من المخزن المؤقت facs.
3. تلطيخ الأجسام المضادة لتحليل تدفق الخلوي
ملاحظه: التسمية والبرد جميع أنابيب FACS المطلوبة قبل الاستخدام.
- أضافه 1 μL من مصل الفئران و 2 μL من مكافحه الماوس الأجسام المضادة مفتش إلى 50 μL من العينة ، دوامه فورا ، وكتله علي الجليد لمده 20 دقيقه.
- أضافه الأجسام المضادة المناسبة لكل عينه ، دوامه فورا ، واحتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه في الظلام.
ملاحظه: اختيار واحجام الأجسام المضادة تعتمد علي التجارب التجريبية الأمثل السابقة مصممه خصيصا لهذه التقنية المحددة. - غسل عينات مع 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، vortexing لفتره وجيزة و يطرد لمده 5 دقائق في 1000 x ز و 4 درجه مئوية. كرر هذه الخطوة 2x.
- أعاده التعليق عينات في 250 μL من المخزن المؤقت FACS ، وتغطيه أنابيب مع فيلم البارافين ، التفاف في رقائق ألومنيوم ، وعقد في 4 درجه مئوية حتى التحليل.
ملاحظه: وهو مثالي لتحليل العينات في غضون ساعات من إكمال البروتوكول بسبب فقدان اشاره الفلورسنت خلال فترات طويلة من التخزين. ومع ذلك ، يمكن تحليل عينات 2-3 أيام في وقت لاحق إذا لزم الأمر علي الإطلاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ممثل تدفق البيانات الخلوية من عينات شطف عن طريق الفم من ساذج (الشكل 3ا) وملتهبة (الشكل 3ب) murine تجويف الفم الثانوية للتهاب اللثة المستحثة التي يسببها. كما يظهر استرداد PMNs من الاربطه المثبتة (الشكل 3ج). تم معايره الفولتية تدفق القناة الخلوية يدويا ، وتم اجراء التعويض مع حبات التعويض الملون واحد. تم تعريف PMNs كLy6G + veF4/80-ve باستخدام استراتيجية النابضة المبينة38. تم الحصول علي الحد الأدنى من الاحداث PMN بوابات 500 من كل شطف عن طريق الفم وعينه الاربطه. وقد تقرر ان تكون القدرة علي البقاء PMN حوالي 37 ٪ من التلطيخ الأزرق التريان. الصور التمثيلية لمستويات العظام السنخيه مقيسة من قمة العظم السنخي (ABC) إلى تقاطع السيمينمينا (CEJ) للصحة (الشكل 4ا) والفئران المركبة (الشكل 4ب). وترد الفروق النسبية بين هذه القياسات (الشكل 4ج).
الشكل 1: تحديد مواقع الحيوانية لربط المولي. (ا) يتحقق الوصول إلى تجويف الفم عن طريق عقد الفك السفلي في وضع الاكتئاب عن طريق وضع الجر خفيفه علي الفكي والفك القاطعة الأسنان. (ب) يتم وضع الشاش تحت الجمجمة لمنع حركه الراس ووضع فك في وضع أفقي نسبيا. يتم تغطيه الجسم والذيل لمنع فقدان الحرارة قبل تحريك المرحلة الجراحية تحت المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صوره متسلسلة لتركيب الاربطه. (ا) يتم وضع الذيل البعيد للخياطة علي الجانب الشاحب من الأسنان ، ويتم ادراج الجزء القريب بين الاتصال من M2 و M3. (ب) ثم يتم التفاف خياطه حول سطح البوق من m2 ثم ادراجها بين الاتصال من M1 و m2. (ج) يتم التفاف قطعه الخياطة القريبة حول m1 تحت ارتفاع كفاف ثم ادراجها بين الاتصال من M1 و M2. (د) يتم ربط نهايات خياطه مع عقده الجراح وقلصت أقرب ما يمكن إلى عقده. يتم وضع عقده في اللثة كوة بين M1 و M2 علي الجانب حنكي من الأسنان الفك العلوي. تم الحصول علي جميع الصور علي تشريح فك لتسجيل الخطوات الاجرائيه مع وجهه نظر دون عائق من الأسنان المولي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المؤامرات التمثيلية واستراتيجية الصب التي تظهر وجود العدلات عن طريق الفم. تم انتشال العدلات من العينات التالية وتقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي: (ا) الشطف عن طريق الفم من فاره ساذجه ، (ب) شطف عن طريق الفم ، و (ج) الحروف المركبة المسترجعة من الفاره مع التهاب اللثة المستحث بالاربطه (ثنائيا). وتظهر المؤامرات التمثيلية استراتيجية الصب. الsinglets (SSC-H x SSC-W و FSC-H x FSC-W) و العدلات (Ly6G + ve/f480-ve) كانت بوابات كما هو مبين. وتعكس القيم العددية النسبة المئوية للخلايا داخل كل بوابه. SSC-A = منطقه مبعثر الجانب ؛ SSC-W = عرض الجانب مبعثر; SSC-H = ارتفاع مبعثر الجانب; FSC-A = منطقه مبعثر إلى الامام. FSC-W = عرض مبعثر إلى الامام; FSC-H = ارتفاع مبعثر إلى الامام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الاختلافات في فقدان العظم السنخي بين التحكم والربط بين الماشية. الصور التمثيلية التي تبين الاختلافات في فقدان العظم السنخي بين (ا) التحكم و (ب) الفئران ligated. (ج) يتم عرض القياسات من تقاطع المركز (cej) إلى قمة العظم السنخي (ABC) ، إلى جانب زوايا الخط المسمارية والمنتفخة من M1 و M2 (يعني ± SEM ، n = 3). تم تحديد قيم P بواسطة ANOVA ثنائيه الاتجاه مع اختبار LSD لما بعد المخصص. (* p < 0.01 ؛ * * p < 0.001 ؛ * * * p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتركز العنصر الأكثر اهميه المرتبطة باستخدام نموذج المستحثة الاربطه من التهاب اللثة حول الاحتفاظ بالاربطه حتى وقت التضحية أو الازاله المتعمدة. الربط بيوفيلم-ريتيكتيف المثبتة قادره علي حمل خسارة كبيره من ارتفاع العظم السنخي في عدد قليل من 6 أيام, الهضاب بين 11 – 16 الفترة اليوم39. قرار التضحية بالمواد الحيوانية قبل الفترة القصوى من فقدان العظام ، مما يجعل هذا النموذج أقصر بكثير من التهاب اللثة المستحثة ، وقد اختير لمزيد من الحد من حدوث يثبت تغير الاربطه السابقة لأوانها ، والتي تعرف بأنها فقدان الاربطه قبل وقت التضحية ، مما يجعل الحيوانية غير تشخيصيه.
العيب الأكثر شيوعا المذكورة من هذا النموذج يسلط الضوء علي الصعوبة التقنية المتصورة لتركيب الاربطه بسبب ابعاد ضئيله من الأسنان المولية murine ، والتي تتراوح في محيط من 4.4 مم (M1) إلى 2.6 مم (M3)40. يمكن التخفيف من هذه المشكلة من خلال اشراك الموظفين الجراحيين/المتدربين لتركيب الاربطه ، والذي يتطلب (علي الأكثر) 10 دقيقه/الحيوانية ويشمل تسليم التخدير. وعلاوة علي ذلك ، فان وضع الاربطه هو مهارة يتقنها التكرار ، وليس أكثر كثافة من العديد من التقنيات المختبرية الشائعة التي تتطلب درجه عاليه من البراعة اليدوية. من وجهه النظر الاجرائيه ، واستخدام التخدير داخل الصفاق يوفر وقتا طويلا لتسهيل تركيب الاربطه. إذا لزم الأمر ، فانه يسمح أيضا استبدال اي الحروف المركبة التي لم يتم تثبيتها بطريقه مرضيه ، كما ان توطين خياطه إلى التلم اللثة وعقده بين الاتصال من M1 و M2 مثاليه للاحتفاظ بها.
التعديلات المقترحة لهذه البروتوكولات ، والتي تستدعي اما 1) ربط ضرس واحد باستخدام خياطه الحذر أو 2) قطعه خطيه واحده من خياطه وضعت بين الاتصال واحده من الأسنان المولي ، ويوفر العديد من المزايا. ومن المنظور التقني ، يستخدم البروتوكول المعدات المتاحة بسهوله أو التي يمكن بناؤها من المعدات الموجودة مسبقا بطريقه مماثله إلى ابي والسيد هاجيشينالين. وهذا ينفي الحاجة إلى أوامر خاصه أو تصنيع المعدات بواسطة الطباعة 3D33. تركيب حبال خياطه حريريه مستمرة حول أسنان متعددة مضمونه مع عقده الجراح التي لا يمكن ان يزعجها اللسان قد يحسن أيضا الاحتفاظ الاربطه.
خلال هذا البروتوكول ، بالمقارنة مع التقنية التي اقترحها Marchesan وآخرون ، والتي من المتوقع وقوع خسائر تصل إلى 20 ٪ ، وكان هناك غياب كامل ليثبت تغير السابقة لأوانه الربطال36. وفي حين انه لم يتم تقييم حدوث خسارة الاربطه مباشره من قبل ابي و hajishengallis ، وقد طبقت هذه التقنية في عدد من الدراسات41،42،43،44. من الناحية الفنية ، تم تجنب تلف الانسجه الرخوة في الخلايا المركبة. وتشمل العوامل التي تساهم في هذه الظاهرة المراقبة المستمرة لتجويف الفم عن طريق المجهر ، والتصور المستمر لنصائح الملقط ، واستخدام ملقط نظيف لمنع الانزلاق من الغرز اثناء الوضع.
داخل تجويف الفم ، وأجزاء ممدود من المواد خياطه أيضا زيادة كبيره في كميه الانسجه المريضة المتاحة للتحليل ، ويمكن ان يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في استخدام الحيوانية. وذلك لان جميع المواد قادره علي ان تدرج في التحليل ، وتجميع الانسجه والعينات شطف غير مطلوب. وتجدر الاشاره إلى انه من الممكن لربط الأسنان الفكية الفك العلوي باستخدام التقنيات المبلغ عنها سابقا لزيادة مساحة الانسجه المتضررة41. ومع ذلك ، فان هذا التعديل غير ممكن في الحالات التي يلزم فيها تصميم انقسام الفم ، وتقديم الدعم لتطبيق هذا البروتوكول الجديد. وأخيرا ، أقرب إلى بروتوكولات اللثة المستحثة السابقة ، واستخدام هذه التقنية لا يقتصر علي الفئران C57BL/6 الذكور البالغ من العمر 8-12 أسبوعا. الفئران من كبار السن ، اما الجنس ، والخلفيات الوراثية المختلفة قد تكون مقبوله اعتمادا علي التصميم التجريبي.
للأسف ، هذا النموذج لا يزال يملك بعض الأخطاء التقنية والمنهجية. استخدام الفئران الخالية من مسببات المرض المحددة كما هو مفصل أعلاه لا يمكن ان تحاكي تطور التهاب اللثة البشرية. ويرجع ذلك إلى العديد من الاختلافات بين تركيب الاغشيه الذاتية المعلقة عن طريق الفم ، والتي تحد من الصلاحية الخارجية لتقييم البكتيريا-البكتيريا والبكتيريا-التفاعلات المضيف45. هذا يمكن نظريا كنت خففت من خلال الاستعمال من [جرثومه-فر] فيران, اي يعقد البروتوكول بشكل ملحوظ. ويلزم بذل المزيد من الجهود والموارد لضمان خلو المواد الحيوانية من الجراثيم اثناء المعالجة الاسكانيه والجراحية. ويجب أيضا اتخاذ مزيد من التدابير لتطوير التهاب اللثة ، لان هذه الفئران هي مقاومه لل PD الناجمة عن الاربطه في غياب تراكم البكتيريا46،47.
وعلاوة علي ذلك ، فان العدوى أحاديه الجانب والعدوى المشتركة في نماذج الربط تقصر عن تلخيص الحالة البشرية ، حيث ان امراض اللثة تمثل تفاعلا متعدد الجراثيم أكثر تعقيدا بين البيوفيلم والجهاز المناعي المضيف. في هذه الظروف ، قد يعتبر توضيح ادوار وتفاعلات بين عدد محدود من البكتيريا الفموية البشرية ناقصا ويحتمل ان يكون ضارا ، وخاصه في سياق دراسة علم البيولوجيا المناعية لامراض اللثة.
وأخيرا ، وقد تورطت الادله الاخيره ان قوات مضغ قادره علي تعديل اللثة المناعية من خلال تراكم الخلايا المساعد 17 ، وهو وسيط لا يتجزا من الحصانة الحاجز48. وعلي هذا النحو ، فان استخدام نظام غذائي لين ، وخاصه في الماشية القديمة ، قد يكون بمثابه الخلط المحتمل. وهذا قد يقلل من احتمال فقدان العظام الفسيولوجية الطبيعية في المناطق التي طبقت فيها الحروف المركبة. وفي ضوء هذه الادله ، ينبغي النظر بعناية في استخدام الكائنات القديمة والضوابط الملائمة المطابقة للسن ، حيث لوحظ ان هذه النتائج أبرزها.
ويمكن توسيع استخدام هذا النموذج بسيط نسبيا لتقييم فقدان العظام السنخيه عن طريق التصوير المقطعي المجهري ، والتحليلات النسيجية لكل من العظم السنخي واللثة المحيطة المرفقة ، واجراء توصيف الكائنات المجهرية عن طريق الفم ، وكلها تم إنجازها مع نماذج PD القائمة المستحثة33،49. علي الرغم من ان نادرا ما تناقش أو تستخدم ، فمن الممكن أيضا لتقييم اثار العلاج ، (فضلا عن إصلاح وتجديد دواعم الأسنان) في وضع التهاب اللثة المستحثة التي يسببها الاربطه عن طريق أزاله الاربطه تحت التخدير العام مع النقطة الدقيقة الشظية ملقط39. وأخيرا ، يمكن توسيع استخدام هذا النموذج لدراسة الآثار الجهازية لامراض اللثة بسبب زيادة الحمل التهابي الناجم عن ربط أكثر من سنه واحده ، فضلا عن الأسنان الفكية العلوية اليسرى واليمني ، إذا رغبت في ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويدعم j. w. c. من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR). ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور تشونغشيانغ صن علي مساعدتها في أداء التلطيخ الأزرق التريسان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
References
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W.
- Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
- Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
- Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
- Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
- Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
- Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D.
- Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
- Berezow, A. B., Darveau, R. P.
- Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
- Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
- Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
- Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
- Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
- Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
- Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
- Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A.
- Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
- Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
- Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
- Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
- Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
- Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
- Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
- Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
- Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
- Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
- Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
- de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
- Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Flecknell, P.
- Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
- Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
- Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
- Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
- Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
- Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
- Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
- Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
- Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).
