Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC). Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.
Die Vorbereitung hochwertiger Mausaugenabschnitte für die Immunhistochemie (IHC) ist entscheidend für die Beurteilung der Netzhautstruktur und -funktion und für die Bestimmung der Mechanismen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität während der gesamten Gewebepräparation ist für die Gewinnung reproduzierbarer retinaler IHC-Daten von entscheidender Bedeutung, kann aber aufgrund der Fragilität und Komplexität der retinalen Zytoarchitektur eine Herausforderung darstellen. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouins Lösung bewahren die Netzhautstruktur optimal, sie behindern oft die IHC-Analyse, indem sie die Hintergrundfluoreszenz und/oder die abnehmenden Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verbessern, ein Prozess, der als Epitopmaskierung bekannt ist. Milderfixative hingegen, wie 4% Paraformaldehyd, reduziert Die Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung, sorgfältige Seziertechniken müssen verwendet werden, um die Netzhautstruktur zu erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine umfassende Methode zur Vorbereitung von Maus-Okularbechern für IHC vor, die ausreicht, um die meisten Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen ohne Verlust der strukturellen Integrität der Netzhaut zu erhalten. Wir schließen repräsentative IHC mit Antikörpern gegen verschiedene Netzhautzelltypmarker ein, um die Gewebeerhaltung und -orientierung unter optimalen und suboptimalen Bedingungen zu veranschaulichen. Unser Ziel ist es, IHC-Studien der Netzhaut zu optimieren, indem wir ein komplettes Protokoll von der okularen hinteren Bechersektion bis zum IHC bereitstellen.
Immunohistochemistry (IHC) ist eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung spezifischer Proteine und zellulärer Strukturen in Geweben in situ1,2,3. Ungeeignete Fixierungsmethoden und suboptimale Schnitte komplexer Gewebe können die Gewebestruktur stören, eine hohe Hintergrundfärbung erzeugen oder Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verringern, was zu Färbeartefakten und daraus resultierender Fehlinterpretation von IHC-Daten4. Da die Netzhaut des Wirbeltiers ein komplexes und hochorganisiertes neuronales Organ ist, das aus Schichten miteinander verbundener Photorezeptoren, Interneuroner und Ganglienzellen besteht, ist es sehr zerbrechlich und kann leicht während der Zerlegung und Schnitte gestört werden. Ein detailliertes, standardisiertes und validiertes Protokoll von der Mausaugensektion und -orientierung bis zur Immunfärbung wird dazu beitragen, IHC-Artefakte deutlich zu reduzieren, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht und genauere Vergleichsdaten möglich sind. analyse.
Es gibt viele Protokolle für die Gewebevorbereitung für IHC, jedoch sind nicht alle für Netzhautgewebe geeignet. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouin-Lösung bewahren die Netzhautstruktur während der Zerlegung und Schnittung5. Leider führen starke Fixative oft zur verstärkten Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung aufgrund der chemischen Modifikation von Epitopen6. Auf der anderen Seite können mildere Fixative, wie 4% Paraformaldehyd (PFA), einige dieser Artefakte lindern, erfordern aber eine sorgfältige Zerlegung und Schnitte, um die optimale Netzhautstruktur zu erhalten. PFA dringt schnell in Gewebe ein, aber Kreuz-Links-Proteine sehr langsam, wodurch das Risiko der Epitopmaskierung reduziert wird. Da die PFA-Inkubation in kurzer Zeit eine relativ milde Fixierung ist, benötigen Gewebe oft schnelles Einfrieren, um Antigene zu erhalten. Es ist wichtig, die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren des Gewebes zu vermeiden, da sie die Integrität von Zellen und Geweben verzerren und schädigen7.
Hier beschreiben wir detaillierte und standardisierte Protokolle für Sezieren, Fixierung und Kryoschutz von Maus-Okularbechern, die konsistente und zuverlässige IHC-Daten liefern.
Maus Netzhaut-Sektion ist ein empfindlicher Prozess aufgrund der geringen Größe und Form der Mausaugen und die Fragilität der Netzhautgewebe. Auch wenn die Durchführung von qualitativ hochwertigen Sezierungen eine Frage der Praxis ist, ist es eine Notwendigkeit, mit einem detaillierten Protokoll effiziente Methoden und Tipps zu erhalten, um Netzhautabschnitte und IHC zu erhalten. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Protokollen gibt es einige Tipps, die konsistente hochwertige Netzhautabschnitte ermöglichen, die f?…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH (RO1-GMO97327) und der University Research Foundation (UPenn) unterstützt. Wir danken insbesondere Svetlana Savina für ihre Hilfe bei der Entwicklung des Immunhistochemie-Protokolls, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) und dem Penn Vet Imaging Core für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Leslie King, Ph.D. für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. .
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
Aluminum foil | |||
Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
Styrofoam box | For insulated cooler | ||
Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
Liquid Nitrogen | |||
Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |