Denne rapporten beskriver omfattende metoder for å forberede frosne mus Retina seksjoner for immunhistokjemi (IHC). Metodene som er beskrevet inkluderer Disseksjon av øye bakre kopp, paraformaldehyde fiksering, innebygging i optimal skjæring temperatur (OCT) Media og vev orientering, snitting og immunostaining.
Utarbeidelse av høy kvalitet muse øye seksjoner for immunhistokjemi (IHC) er avgjørende for å vurdere retinal struktur og funksjon og for å bestemme mekanismene underliggende retinal sykdommer. Opprettholde strukturelle integritet gjennom hele vevet forberedelse er avgjørende for å oppnå reproduserbar retinal IHC data, men kan være utfordrende på grunn av skjørhet og kompleksiteten i retinal cytoarchitecture. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare retinal struktur, de ofte hemme IHC analyse ved å forbedre bakgrunnen fluorescens og/eller avtagende antistoff-epitope interaksjoner, en prosess som kalles epitope maskering. Mildere fiksativene, på den annen side, som 4% paraformaldehyde, reduserer bakgrunnen fluorescens og epitope-maskering, grundige disseksjon teknikker må benyttes for å bevare retinal struktur. I denne artikkelen presenterer vi en omfattende metode for å forberede musen øye bakre kopper for IHC som er tilstrekkelig til å bevare de fleste antistoff-epitope interaksjoner uten tap av retinal strukturelle integritet. Vi inkluderer representative IHC med antistoffer mot ulike typer Netthinne celle markører for å illustrere vevs bevaring og-orientering under optimale og under optimale forhold. Vårt mål er å optimalisere IHC studier av netthinnen ved å tilby en komplett protokoll fra disseksjon til IHC.
Immunhistokjemi (IHC) er en kraftig teknikk for lokalisere av spesifikke proteiner og cellulære strukturer i vev i situ1,2,3. Upassende fiksering metoder og sub-optimal snitting av komplekse vev kan forstyrre vev struktur, generere høy bakgrunn farging eller redusere antistoff-epitope interaksjoner, noe som resulterer i flekker gjenstander og påfølgende feil tolkning av IHC data4. Som virveldyr Retina er et komplekst og svært organisert neural organ bestående av lag av sammenkoblede fotoreseptorene, interneurons og Ganglion celler, er det svært skjøre og kan lett forstyrres under disseksjon og snitting. En detaljert, standardisert og validert protokoll fra mus øye disseksjon og orientering til immunostaining vil bidra til å redusere IHC-artefakter betraktelig, og dermed øke påliteligheten til resultatene og gi mer nøyaktige sammenlignings data Analyse.
Det er mange protokoller for vev forberedelse for IHC, men ikke alle er egnet for retinal vev. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin ‘ s løsning bevare retinal struktur under disseksjon og skjæring5. Beklageligvis, kraftig fiksativene ofte føre til det forsterket miljøet fluorescens og epitope maske på grunn av det kjemikalie modifisering av epitopes6. På den annen side, mildere fiksativene, som 4% paraformaldehyde (PFA) kan lindre noen av disse gjenstandene, men krever grundige disseksjon og snitting for å bevare den optimale retinal struktur. PFA penetrerer raskt vev, men kryss-koblinger proteiner svært langsomt, redusere risikoen for epitope maskering. Siden kort tid PFA inkubasjons er en relativt mild fiksering, vev ofte krever rask frysing å bevare antigener. Det er viktig å unngå iskrystall formasjon under vev frysing som de forvrenge og skade integriteten av celler og vev7.
Her beskriver vi detaljerte og standardiserte protokoller for disseksjon, fiksering, og fryse beskyttelse av musen øye bakre kopper som gir konsistente og pålitelige IHC data.
Mouse Retina disseksjon er en delikat prosess på grunn av den lille størrelsen og formen på musen øyne og skjørhet av retinal vev. Selv om utføring av høy kvalitet disseksjon er et spørsmål om praksis, har en detaljert protokoll, som gir effektive metoder og tips er en nødvendighet for å få tak i Netthinne seksjoner og IHC. I tillegg til protokollene beskrevet her, er det flere tips som gir konsistent høy kvalitet retinal seksjoner som er egnet for reproduserbar IHC.
Før starter …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler fra NIH (RO1-GMO97327) og University Research Foundation (UPenn). Vi takker spesielt Svetlana Savina for hennes hjelp til å utvikle immunhistokjemi protokollen, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) og penn vet Imaging Core for å få hjelp med mikroskopi og Leslie King, Ph.D. for kritisk lesing dette manuskriptet .
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
Aluminum foil | |||
Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
Styrofoam box | For insulated cooler | ||
Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
Liquid Nitrogen | |||
Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |