В настоящем докладе описаны комплексные методы подготовки замороженных секций сетчатки мыши для иммуногистохимии (IHC). Описанные методы включают вскрытие глазной задней чашки, параформальдегидная фиксация, встраивание в оптимальную температуру резки (OCT) носителей и ориентации тканей, секционирование и иммуностоирование.
Подготовка высококачественных секций глаз мыши для иммуногистохимии (IHC) имеет решающее значение для оценки структуры и функции сетчаточной системы и для определения механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчаточной железы. Поддержание структурной целостности на протяжении всей подготовки ткани имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых данных IHC сетчатого, но может быть сложной задачей из-за хрупкости и сложности цитоархитектуры сетчаточной системы. Сильные фиксаторы, как 10% формалин или решение Буин оптимально сохранить структуру сетчатки, они часто препятствуют анализУ IHC путем повышения фоновой флуоресценции и / или уменьшение антител-эпитопов взаимодействий, процесс, известный как эпитоп маскировки. Мягкие фиксаторы, с другой стороны, как 4% параформальдегида, снижает фоновой флуоресценции и эпитоп-маскировки, тщательные методы вскрытия должны быть использованы для сохранения структуры сыворотки. В этой статье мы представляем комплексный метод подготовки мыши глазной задней чашки для IHC, что достаточно, чтобы сохранить большинство антител-эпитоп взаимодействия без потери структурной целостности сетчатых. Мы включаем представительный IHC с антителами к различным маркерам типа сетчаточных клеток, чтобы проиллюстрировать сохранение тканей и ориентацию в оптимальных и неоптимальных условиях. Наша цель заключается в оптимизации IHC исследований сетчатки путем предоставления полного протокола от глазной задней чашки вскрытия IHC.
Иммуногистохимия (IHC) является мощным методом для локализации конкретныхбелков и клеточных структур в тканях на месте 1,2,3. Неуместные методы фиксации и субоптимальное сечение сложных тканей могут нарушить структуру тканей, генерировать высокие фоновые окрашивания или уменьшать антитела-эпитопные взаимодействия, что приводит к окрашиванию артефактов и последующему неправильному толкованию Данные IHC4. Поскольку позвоночную сетчатку является сложным и высокоорганизованным нервным органом, состоящим из слоев взаимосвязанных фоторецепторов, интернейронов и ганглия-клеток, она очень хрупкая и может быть легко нарушена во время вскрытия и секции. Подробный, стандартизированный и проверенный протокол от вскрытия глаз мыши и ориентации на иммуно-стоикирование поможет значительно уменьшить iHC артефакты, тем самым повышая надежность результатов и позволяя более точные сравнительные данные Анализа.
Есть много протоколов для подготовки тканей для IHC, однако, не все подходят для ткани сетчатины. Сильные фиксаторы, такие как 10% формалин или решение Bouin сохранить структуру сытины во время вскрытия и секции5. К сожалению, сильные фиксаторы часто приводят к усиленной фоновой флуоресценции и маскировке эпитопов из-за химической модификации эпитопов6. С другой стороны, более мягкие фиксаторы, как 4% параформальдегида (PFA) может облегчить некоторые из этих артефактов, но требуют тщательного вскрытия и сечения, чтобы сохранить оптимальную структуру сетчатого глаза. ПФА быстро проникает в ткани, но перекрестные белки очень медленно, снижая риск маскировки эпитопа. Поскольку короткое время инкубации ПФА является относительно мягкой фиксации, ткани часто требуют быстрого замораживания для сохранения антигенов. Важно, чтобы избежать образования кристалла льда во время замораживания тканей, как они искажают и повреждения целостности клеток и тканей7.
Здесь мы описываем подробные и стандартизированные протоколы для вскрытия, фиксации и криозащиты мыши глазных задних чашек, которые дают последовательные и надежные данные IHC.
Рассечение сетчатки мыши является деликатным процессом из-за небольшого размера и формы мыжеток и хрупкости ткани сетчатки. Несмотря на то, что выполнение высококачественного вскрытия является вопросом практики, наличие детального протокола, предоставление эффективных методов и сов…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана средствами NIH (RO1-GMO97327) и Университетского исследовательского фонда (UPenn). Мы особенно благодарим Светлану Савину за помощь в разработке протокола иммуногистохимии, Гордона Рутеля (Университет Пенсильвании) и Ядро визуализации ветеринаров Пенна за помощь в микроскопии и Лесли Кинг, доктор философии, за критическое чтение этой рукописи .
6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
Aluminum foil | |||
Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
Styrofoam box | For insulated cooler | ||
Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
Liquid Nitrogen | |||
Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |