Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59897
Automatic Translation
1,2,3, 2
1Graduate School of Biomedical Sciences, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Development, Aging and Regeneration Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Division of Female Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University California San Diego

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للاستنساخ لعزل الخلايا الأولية لالروماتيزم الفأر، وتشكيل الأورام وعلاجها، وزرع الطعوم بدءاً من ثقافات الأورام.

Abstract

الساركوما الروماتيزمية (RMS) هي ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعًا لدى الأطفال. وعلى الرغم من أن الجهود الكبيرة قد مكنت من تحديد الطفرات الشائعة المرتبطة بـ RMS وسمحت بالتمييز بين مختلف الأنواع الفرعية لـ RMS، لا تزال هناك تحديات كبيرة أمام تطوير علاجات جديدة لزيادة تحسين التكهن. على الرغم من أن تحديدها من خلال التعبير عن علامات myogenic، لا يزال هناك جدل كبير حول ما إذا كان RMS لديه أصول myogenic أو غير myogenic، كما خلية المنشأ لا يزال غير مفهومة بشكل جيد. في هذه الدراسة، يتم توفير طريقة موثوق بها للبفحص الورم للماوس RMS. ويستند هذا القول على الخصائص الوظيفية للخلايا السرطانية ويسمح بتحديد السكان النادرين في الورم مع وظائف الورم. كما تم وصف إجراءات اختبار البروتينات المؤتلفة، ودمج بروتوكولات التغوط مع فحص محيط الأورام، وتقييم الجينات المرشحة المشاركة في تطوير الورم والنمو. كما هو موضح هو إجراء لزرع الطعوم من الأورام في الفئران المتلقية للتحقق من وظيفة الورم في الجسم الحي. بشكل عام، تسمح الطريقة الموصوفة بتحديد واختبار السكان النادرين في RMS التي يمكن تطبيقها على RMS الناشئة في سياقات مختلفة. وأخيرا، يمكن استخدام البروتوكول كمنبر لفحص المخدرات والتطوير المستقبلي للعلاجات.

Introduction

السرطان هو مرض غير متجانس. وعلاوة على ذلك، فإن نفس النوع من الورم يمكن أن يقدم طفرات جينية مختلفة في مختلف المرضى، وداخل المريض يتكون الورم من مجموعات متعددة من الخلايا1. ويشكل عدم التجانس تحديا في تحديد الخلايا المسؤولة عن بدء انتشار السرطان، ولكن توصيفها ضروري لتطوير علاجات فعالة. فكرة نشر الخلايا الورم (TPC)، وهي مجموعة نادرة من الخلايا التي تسهم في تطوير الورم، وقد تم استعراضها سابقا على نطاق واسع2. على الرغم من حقيقة أن TPCs قد تميزت في أنواع متعددة من السرطان، وتحديد علامات لعزلتها موثوق بها لا يزال تحديا لعدة أنواع الورم3،4،5،6 , 7 , 8 , 9. وهكذا، يمكن تطبيق طريقة لا تعتمد على العلامات الجزيئية ولكن بدلا من ذلك على خصائص وظيفية TPC (التجديد الذاتي عالية والقدرة على النمو في ظروف منخفضة المرفق)، والمعروفة باسم اختبار تشكيل الورم، على نطاق واسع ل تحديد TPCs من معظم الأورام. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا الفحص لتوسيع TPCs وبالتالي تطبق مباشرة على فحص المخدرات السرطان والدراسات على مقاومة السرطان1،10.

الساركوما الروماتيزمية (RMS) هو شكل نادر من ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعا في الأطفال الصغار11. Althoug RMS يمكن تحديدها من الناحية النسيجية من خلال تقييم التعبير عن علامات myogenic، لم يتم وصف خلية أصل RMS بشكل أحادي الصوت بسبب الأنواع الفرعية الورم متعددة وعدم تجانس عالية من المحفزات التنموية الورم. في الواقع، وقد ولدت الدراسات الحديثة مناقشة علمية هامة حول ما إذا كان RMS هو من أصول myogenic أو غير myogenic، مما يشير إلى أن RMS قد تستمد من أنواع الخلايا المختلفة اعتمادا على السياق12،13، 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17. وقد أجريت دراسات عديدة على خطوط الخلايا RMS باستخدام اختبار تشكيل الورم لتحديد المسارات المشاركة في تطوير الورم وتوصيف علامات المرتبطة السكان التجديد الذاتي للغاية 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21.

ومع ذلك، على الرغم من إمكانية اختبار تشكيل محيط الورم لتحديد خلايا RMS المنشأ، لم يتم بعد وصف طريقة موثوق بها التي يمكن استخدامها على خلايا RMS الأولية. في هذا السياق، استخدمت دراسة حديثة من مجموعتنا فحص تشكيل الورم الأمثل لتحديد خلايا RMS المنشأ في ضمور العضلات دوشين (DMD) نموذج الماوس22. يتم اختبار أنواع متعددة من الخلايا قبل الورم، معزولة عن أنسجة العضلات، لقدرتها على النمو في ظروف منخفضة التعلق، مما يسمح بتحديد الخلايا الجذعية العضلية كخلايا المنشأ لRMS في سياقات عسر التغذية. يوصف هنا هو بروتوكول قابل للاستنساخ وموثوق بها لتصور تشكيل الورم (الشكل 1)، والتي تم استخدامها بنجاح لتحديد مجموعات الخلايا النادرة للغاية التي هي المسؤولة عن تطوير RMS الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ السكن والعلاج والتضحية من الفئران بعد بروتوكول IACUC المعتمدة من معهد سانفورد برنهام Prebys الطبية ديسكفري.

1. إعداد الكاشف

  1. إعداد 100 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية: F10 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الحصان (HS).
  2. إعداد 50 مل من حل الكولاجين النوع الثاني: حل 1 غرام من مسحوق الكولاجين من النوع الثاني في 50 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية (لاحظ وحدات الإنزيم لكل 1 مل من وسائل الإعلام، منذ عدد الوحدات يتغير اعتمادا على الكثير). Aliquot الحل وتخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: يجب اختبار كل الكثير من الكولاجين قبل الاستخدام، لأن نشاط الإنزيم قد يتغير عبر الكثير مختلفة.
  3. إعداد 10 مل لكل عينة من محلول الهضم الثاني: الخلايا عزل وسائل الإعلام مع 100 وحدة / مل من حل الكولاجين النوع الثاني و 2 وحدات / مل من dispase الثاني المرجحة حديثا. استعد واجهزه مباشرة قبل الاستخدام.
  4. إعداد 500 مل من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام: DMEM الجلوكوز عالية تستكمل مع 20٪ FBS و 1٪ القلم / العقدية.
  5. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت FACS: 1X PBS تستكمل مع 2.5٪ الخامس / الخامس مصل الماعز العادي و 1 MM EDTA.
  6. إعداد 500 مل من وسائل الإعلام الأورام: DMEM / F12 تستكمل مع 1٪ القلم / العقدية. قبل الاستخدام مباشرة، إضافة عوامل النمو التالية: 1٪ N2 الملحق، 10 نانوغرام/مل EGF، و 10 نانوغرام/مل β-FGF.

2- عزل الخلايا وثقافتها

  1. إعداد لوحة 10 سم تحتوي على 5 مل من الخلايا عزل وسائل الإعلام (لوحة واحدة لكل عينة الورم) ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية حتى تكون جاهزة لحصاد أنسجة الورم.
  2. وقد أفيد RMS لتطوير تلقائيا في كل من نماذج الماوس الذكور والإناث لضمور العضلات دوشين, مثل الفئران Mdx B10 في حوالي 18 شهرا من العمر وفي B6 mdx/mTR الفئران من قبل 9 أشهر22,23. تخدير الماوس الذي يطور ورم RMS باستخدام isoflurane، والتضحية الحيوان من خلال خلع عنق الرحم أو وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC للمؤسسة. مع مقص، وجعل شق على الجلد في المنطقة التي يتم توطين الورم، و (باستخدام ملاقط) سحب الجلد بعيدا عن منطقة الاهتمام. توظيف شفرة الحلاقة، واستئصال الورم من الحيوان.
  3. وزن 500-1000 ملغ من أنسجة الورم ووضعها في لوحة أعدت في الخطوة 2.1(الشكل 1A).
    ملاحظة: كميات أكبر من الأنسجة تؤثر سلبا على خطوات الهضم وتقليل العائد الإجمالي. إذا كان الورم الذي تم حصاده أكبر من 1000 ملغ، قم بتقسيمه إلى أجزاء وتذوقه بشكل عشوائي حتى يتم الوصول إلى الوزن المطلوب. أخذ العينات العشوائية ضروري لتقييم عدم تجانس الأنسجة.
  4. ضع اللوحة التي تحتوي على أنسجة الورم في غطاء محرك السيارة المعقمة للخلية وتستخلصها بشفرة حلاقة. أنسجة الورم من RMS غير متجانسة. وبالتالي، قد تقدم مناطق مختلفة مقاومة مختلفة للتخفيضات. تأكد من أن أحجام القطع المفرومالناتجة موحدة لضمان الهضم الأمثل.
    ملاحظة: RMS موجود كخليط من أنواع الأنسجة المختلفة (أساسا الأورام الليفية، الأوعية الدموية، والأنسجة الدهنية) التي يمكن تحديدها في كل ورم. إلى 1) عزل السكان خلية غير متجانسة تلخيص بدقة تكوين الورم الأصلي و 2) لا التحيز إجراء العزلة، وإجراء أخذ عينات عشوائية من الأنسجة التي تم حصادها. يجب هضم الخلايا من مناطق مختلفة من الورم واختبارها بالتوازي في المختبر في الفحص الموضح في القسم 3.
  5. نقل الأنسجة المفرومة والخلايا وسائل الإعلام العزل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وغسل لوحة مع 4 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية ووضعها في الأنبوب.
  6. إضافة 700 وحدة / مل من محلول الكولاجين لهضم الأنسجة والحضانة في حمام الماء تهتز في 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  7. بعد الحضانة، تدور أسفل الأنسجة في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT. يستنشق supernatant دون إزعاج بيليه، وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من محلول الهضم الثاني (dispase)، وحضانة في حمام الماء تهتز في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. بمجرد الانتهاء من الهضم الثاني، pipet صعودا وهبوطا وتمرير تعليق الخلية من خلال مرشح النايلون 70 م على أنبوب الطرد المركزي 50 مل. ثم إضافة 10 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية لغسل مرشح وتخفيف محلول الهضم، وتدور أسفل الأنسجة في 300 × ز وRT لمدة 5 دقائق.
  9. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في 20 مل من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام. ثم نقل تعليق الخلية في لوحة ثقافة الخلية 15 سم. وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. سيتم تحديد هذه اللوحة على أنها P0.
  10. في اليوم التالي للعزلة، تغيير وسائل الإعلام. هذه الخطوة ضرورية لضمان إزالة الحطام والخلايا الميتة التي قد تؤثر سلبا على بقاء الخلية.
  11. تقييم تزامن الخلايا بعد تغيير الوسائط، والتي تتراوح بين 30٪-60٪ اعتمادا على كمية المواد الأولية وحجم الخلية. ترك الخلايا تنمو في الحاضنة حتى تصل إلى 90٪ من الملاءمة. مراقبة الخلايا كل يوم وتغيير وسائل الإعلام كل يومين. يختلف الوقت اللازم لخلايا الورم لتصبح متانة اعتمادا على معايير متعددة: عدوانية الورم، النمط الجيني للورم، عمر الماوس، عدم تجانس الأنسجة.
  12. لتمرير الخلية، قم بما يلي:
    1. قبل تسخين حل انفصال الخلية والخلايا السرطانية وسائل الإعلام في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
    2. اغسل الخلايا بـ 1x PBS المعقمة واحتضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 10 مل من محلول مفرزة الخلايا الدافئة لمدة 5-10 دقائق.
    3. عندما يتم فصل جميع الخلايا من لوحة، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الخلايا السرطانية الدافئة، نقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل وتدور الخلايا إلى أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    4. إعادة تعليق الخلايا في 5-10 مل من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام، اعتمادا على حجم بيليه، وحساب الخلايا الحية باستخدام الأزرق تريبان (1:5 تخفيف) لاستبعاد الخلايا الميتة.
    5. لوحة 105 خلايا في لوحات 10 سم أو 3 × 105 خلايا في لوحات 15 سم. يختلف وقت مضاعفة الخلية وفقًا للعوامل المفصلة في الخطوة 2.10.

3- اشتقاق الأورام

  1. استخدام الخلايا السرطانية في الممر P1 أو P2 لتجنب اختيار الخلايا من خلال مقاطع متعددة(الشكل 1B). لفصل الخلايا عن اللوحة، قم أولاً بغسل الطبق بـ 1x PBS، دون إزعاج الخلايا، ثم قم بتغطيتها باستخدام محلول مفرزة الخلايا (5 مل للوحة 10 سم أو 10 مل للوحة 15 سم) ووضعها في الحاضنة لمدة 5-10 دقائق.
  2. تأكد من أن الخلايا منفصلة من خلال النظر إلى لوحة تحت المجهر مشرق الميدان، إضافة 1:1 حجم وسائل الإعلام الخلايا السرطانية (حل مفرزة الخلية: الخلايا السرطانية وسائل الإعلام)، ووضع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي وتدور الخلايا إلى أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في RT.
  3. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS (القسم 3.4) أو وسائل الإعلام الأورام (القسم 3.5)، وفقا للطريقة المستخدمة للطلاء.
  4. خلايا الطلاء من خلال تدفق مقياس الخلايا
    1. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS (المبلغ يعتمد على حجم بيليه) ويدوياً عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. تأكد من أن تركيز الخلية النهائي هو 107 خلايا/مل (100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل 106 خلايا). إضافة 1 μL من Fx دورة البنفسج وصمة عار لكل 106 خلايا للتمييز الحية من الخلايا الميتة أثناء فرز الخلايا. إعداد عنصر تحكم غير ملطخة التي لا يتم إضافة Fx دورة البنفسج وصمة عار إلى الخلايا.
      ملاحظة: يتم تحسين التركيز لتلطيخ فعالة وسرعة أثناء الفرز. سيؤدي انخفاض تركيز الخلايا إلى وقت فرز أطول، في حين أن التركيز العالي سيؤثر على التلطيخ.
    2. توظيف السيطرة غير ملطخة، وإعداد بوابة FACS فصل على قيد الحياة (Fx دورة البنفسجي-) من الموتى (Fx دورة البنفسجي+) الخلايا. ثم، استخدم فرز الخلايا الفلورية المنشطة (مع تمرير النطاق مرشح 450/50) لفصل وعدد من الخلايا الحية / الميتة والطلاء العدد المطلوب من الخلايا الحية في كل بئر من لوحات 96 جيدا منخفضة المرفقة. كل بئر من لوحة يحتاج إلى أن تملأ مع 200 درجة مئوية من وسائل الإعلام الأورام قبل البدء في الفرز.
      ملاحظة: بالنظر إلى أن TPCs هي مجموعة فرعية نادرة داخل الورم كله، تحسين البروتوكول عن طريق طلاء 100 خلية / جيدا من RMS الماوس لمراقبة تشكيل الأورام في ثقافة التعليق. يجب تعديل رقم الخلية لكل بئر للورم المحدد الذي تم اختباره.
    3. وضع الخلايا في الحاضنة حتى نهاية التجربة. حاول عدم إزعاج اللوحة إلا إذا لزم الأمر. لتجربة لمدة 30 يوما، ينبغي تجديد كل بئر مع وسائل الإعلام ونسبة مناسبة من عوامل النمو كل أسبوع (وسائل الإعلام تميل إلى تبخر وعوامل النمو ليست فعالة بعد أسبوع واحد).
    4. بعد الانتهاء من التجربة، يدويا لوحات الشاشة تحت المجهر حقل مشرق لتحديد الأورام (انظر الخطوة 3.6).
      ملاحظة: تم تحسين نقطة زمنية من 30 يوما للكشف بسهولة الماوس RMS الأورام من أحجام تتراوح بين 50-300 ميكرومتر من القطر. وينبغي تعديل نقطة زمنية اعتمادا على عدوانية الورم اختبار ومعدل انتشاره.
  5. خلايا الطلاء يدويا
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام الأورام (كمية يعتمد على بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام الأزرق تريبان (1:10 تخفيف). حساب تركيز الخلية في الأنبوب ولوحة العدد المناسب من الخلايا في لوحة مرفق 96 منخفضة جدا. وضع الخلايا في الحاضنة حتى نهاية التجربة. حاول عدم إزعاج اللوحة ما لم تكن ضرورية لتجديد وسائل الإعلام وعوامل النمو، كما هو موضح في الخطوة 3.4.3.
    2. بعد الانتهاء من التجربة، لوحات الشاشة يدويا تحت المجهر حقل مشرق لتحديد الأورام أو استخدام برنامج سيليغو، كما هو موضح سابقا في كيسيل وآخرون24 انظر الخطوة 3.6 أدناه.
  6. لاحظ أنه يمكن تقييم قراءة منفصلتين نتيجة لهذا الفحص: عدد وحجم الأورام المشكلة.
    ملاحظة: عندما يتم طلاء أكثر من خلية واحدة في بئر، يمكن أن تشكل إما الأورام أو مجموعات الخلايا(الشكل 1C،اللوحات الثالثة والرابعة). مجموعات الخلايا هي المجاميع الخلوية الصغيرة التي تشكل في ثقافة التعليق التي تعزز بقاء الخلية وتتميز بشكل غير منتظم. الأورام كبيرة ولها بنية أكثر إحكاما مع شكل spheroid. وهي مستمدة من خلية واحدة لديها القدرة على البقاء على قيد الحياة بطريقة مستقلة عن المرسى وتنتشر بمعدل عال25. يمكن استخدام خلايا الطلاء من خلال مقياس التدفق أو يدويًا بالتبادل، وفقًا للقدرات المتوفرة في المختبر. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام لوحات منخفضة المرفقات ذات حجم مختلف عن 96 لوحة بئر ممكن ة ويعتمد على النتيجة المطلوبة. في الواقع، ينبغي أن يتم تقييم تردد الأورام باستخدام 96 لوحات مرفق منخفضة جدا، في حين أن الفحص الأولي لتقييم الخلايا الإمكانات الورمية سوف تسفر عن نتائج أسرع وموثوق بها على 6 لوحات منخفضة جدا المرفقات.

4. علاج الأورام مع البروتينات المؤتلفة

  1. كرر الخطوتين 3-1 و3-2.
  2. إذا كان إعداد علاج مع البروتينات المؤتلفة، أولاتحديد أفضل تركيز لاستخدام القسم 4.3، أو إذا تم تحديد التركيز الأمثل سابقا، انتقل إلى القسم 4.4.
  3. تحديد تركيز علاج البروتين المؤتلف.
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام الأورام (حجم يعتمد على حجم بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. حساب تركيز الخلية في أنبوب ولوحة 100،000 خلية في لوحة مرفق منخفضة جدا 6. لوحة اثنين من الآبار لكل تركيز اختبار وبئرين للضوابط غير المعالجة(الشكل 2). وتستند تركيزات البروتين التي سيتم اختبارها على البحث الأدب.
    2. علاج كل بئر من الخلايا المعلقة مع تركيز البروتين مختلفة ووضع الخلايا في الحاضنة لمدة 48 ساعة (الوقت اللازم لتكون قادرة على تقييم تأثير العلاج على كل من صلاحية الخلية وعلى التعبير عن الجينات المستهدفة المصب). ثم قم بتقييم المعلمات التالية:
      1. بقاء الخلية: باستخدام مجهر حقل مشرق، فضلا عن المقارنة مع الضوابط غير المعالجة، والتحقق من مورفولوجيا الخلية. تظهر الخلايا السليمة مشرقة وعاكسة تحت المجهر، في حين أن الموت المفرط للخلايا سوف يؤدي إلى تراكم الحطام في وسائل الإعلام. لتحديد كمية من موت الخلية، يمكن استخدام استبعاد الأزرق تريبان، تلطيخ البنفسج الكريستال، MTT، أو اختبار TUNEL (في هذه الحالة، إضافة واحدة بشكل جيد إلى الطلاء الأصلي).
      2. تأثير البروتينات المؤتلفة على مسارات المصب: إجراء بحث أدبي باستخدام PubMed لتحديد الجينات المصب المعروف أن تتأثر بالبروتين المختبر. تصميم التمهيديات qRT-PCR للجينات المستهدفة، وإجراء تحليل qRT-PCR على الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا المعالجة(الشكل 2).
  4. علاج مع البروتين المؤتلف.
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام الأورام (حجم يعتمد على حجم بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. تحديد العدد الإجمالي للخلايا اللازمة للتجربة المطلوبة (100 خلية لكل بئر من لوحة مرفق منخفضة جدا 96) وتخفيفها في حجم وسائل الإعلام الأورام المناسبة. إذا كان إجراء أكثر من علاج واحد، وإعداد أنابيب خلية منفصلة.
    2. علاج كل أنبوب مع التركيز المناسب من البروتين المؤتلف ولوحة الخلايا في بئر منفصلة من 96 جيدا لوحة منخفضة المرفقين. سيتم تكرار العلاج على كل بئر اعتمادا على نصف عمر البروتين المؤتلف حتى نقطة النهاية 30 يوما من التجربة.
    3. في نهاية التجربة، اتبع الخطوتين 3.4.4 و 3.6 لتحليل البيانات.

5. علاج الأورام مع بلازميدات التعبير المفرط

  1. كرر الخطوتين 3-1 و3-2.
  2. إذا كان إعداد العلاج على نوع ورم جديد، أولاتحديد أفضل تركيز بلازميد لاستخدام القسم 5.3، أو إذا تم تحديد تركيز الحمض النووي الأمثل في السابق، انتقل إلى القسم 5.4.
  3. تحديد التركيز البلازمي الأمثل.
    1. إعادة تعليق الخلايا في الخلايا السرطانية وسائل الإعلام (وحدة التخزين يعتمد على حجم بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. لوحة الخلايا التي تم عدها لتحقيق الملاءمة من 70٪ -90٪ (رقم الخلية تعتمد اعتمادا كبيرا في حجم الخلية ومورفولوجيا). سيتم استخدام GFP-plasmid لاختبار كفاءة التغوط عبر التغوط بعد بروتوكول الشركة المصنعة للكاشف الانسياق للخلايا الملتصقة. في موازاة ذلك، أيضا اختبار عنصر تحكم غير المعالجة(الشكل 3A). إجراء اختبار الكفاءة في لوحة 24 جيدا.
      ملاحظة: يتم استخدام الخلايا الملتصقة لتعزيز كفاءة التغوط، حيث أن التغوط الذي يتم تنفيذه على خلايا التعليق ليس فعالاً ويؤثر سلباً على قدرة الخلية على البقاء.
    2. 48 ساعة بعد التغوط تقييم الخلايا للمعلمات التالية:
      1. بقاء الخلية: باستخدام مجهر حقل مشرق، قارن عدد الخلايا الموجودة في كل بئر ومقارنتها مع الخلايا غير المعالجة بشكل جيد.
      2. التعبير GFP: حساب النسبة المئوية للخلايا التي هي GFP إيجابية على العدد الإجمالي للخلايا في كل بئر(الشكل 3B).
  4. علاج البلازميد المفرط
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائط الخلايا السرطانية (يعتمد حجم الصوت على حجم بيليه) وحساب الخلايا الحية يدويا باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. لوحة 200،000 خلية لكل بئر من لوحة 6 جيدا. سيتم استخدام كل بئر لحدث نقل مستقل. وسيتم نقل كل بئر باستخدام الإعداد وضعت لنوع الورم محددة(الشكل 3A).
    2. 24 ساعة بعد التغوط، وغسل كل بئر مع 1X PBS وحضانة الخلايا في حل مفرزة الخلية الدافئة (ما يكفي لتغطية البئر). ضع اللوحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق، وفقًا للعوامل المفصلة في القسم 2.15.
    3. عند فصل الخلايا، عد الخلايا المشتقة من كل بئر بشكل مستقل باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. ضع 100,000 خلية لكل بئر من لوحة مرفق منخفضة جداً، مع التأكد من عدم خلط الخلايا المشتقة من آبار مختلفة. ضع اللوحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واتركيها دون إزعاج لمدة أسبوع.
      ملاحظة: مدة هذا التسريب هي 7 أيام، وهو وقت كاف للسماح بتشكيل الأورام مع منع اندماج الأورام. الانصهار الأورام هو ظاهرة التي تصبح واضحة عندما يتم مطلي 100،000 أو أكثر من الخلايا معا في تعليق لأكثر من 1 أسبوع، والتي يمكن أن التحيز تقييم قدرة تشكيل الورم. في حالة أن التجربة تتطلب وقتا أطول الحضانة، يجب تعديل كثافة الخلايا أو السقالات البوليمرية المستخدمة لتجنب الانصهار الأورام26.
    4. في نهاية التجربة، اتبع الخطوتين 3.5.2 و 3.6 لتحليل البيانات.

6. إعداد الأورام لزرع الطعوم

  1. وضع مصفوفة خارج الخلية (ECM) الحل (50 درجة مئوية لكل allograft) والخلايا السرطانية وسائل الإعلام (50 درجة مئوية لكل allograft) على الجليد.
  2. يمكن استخدام الأورام لزرع الطعوم. جمع جميع الأورام التي تم الحصول عليها من نوع خلية محددة أو العلاج في أنبوب 15 مل أو 50 مل (وفقا لحجم إجمالي وسائل الإعلام)(الشكل 1D). تدور الأورام أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT. إزالة supernatant على الأورام وغسلها مع 10 مل من 1X PBS المعقمة.
  3. تدور الأورام أسفل مرة أخرى في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT، يستنشق PBS 1X، وإضافة 500 درجة مئوية إلى 1 مل من حل مفرزة الخلية على رأس بيليه الخلية، الذي يبدأ عملية التفكك. حضانة الأورام في محلول الجهاز الهضمي في حمام الماء تهتز في 37 درجة مئوية والتحقق من تطور الهضم كل 10 دقيقة. للمساعدة في تفكك الأورام في حل خلية واحدة، ماصة الخلايا صعودا وهبوطا للاضطراب الميكانيكي. قد تستغرق عملية الهضم ما يصل إلى 30 دقيقة.
    ملاحظة: على الرغم من حقيقة أن وقت الحضانة يختلف اختلافا كبيرا عندما تستمد الأورام من خلايا RMS الأولية المختلفة، لم يلاحظ انخفاض كبير في قدرة الخلية على البقاء في العلاقة مع وقت الهضم.
  4. عندما يتم الحصول على حل خلية واحدة، إضافة حجم من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام (1:1، حل مفرزة الخلية: الخلايا السرطانية وسائل الإعلام) وتدور عليه في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: من هذا الوقت فصاعداً، يجب تنفيذ كافة الخطوات على الجليد. بعد الغزل، لا تشكل الأورام بيليه مستقرة كما تفعل حلول الخلايا الواحدة. للتأكد من عدم خلع أو استنشاق الأورام، استخدم ماصة 1 مل وأسكّن السائل بلطف. الانتقال إلى ماصة 200 درجة مئوية عندما يبقى فقط 1 مل.
  5. إعادة تعليق الخلايا في الخلايا السرطانية الباردة وسائل الإعلام (وحدة التخزين سوف تعتمد على حجم بيليه)، ووضع الخلايا على الجليد وعد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. بعد تحديد الكمية المناسبة من الخلايا لاستخدامها في allograft، إعادة تعليقها في حجم إجمالي قدره 50 درجة مئوية من الخلايا السرطانية الباردة وسائل الإعلام. تبريد طرف ماصة في وسائل الإعلام الخلايا السرطانية الباردة. عندما يكون الطرف باردا، استخدمه لاتخاذ 50 ميكرولتر من محلول ECM وإضافته إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا. لا تقم بإزالة الأنابيب من الجليد أثناء هذه العملية.
    ملاحظة: يجب تحديد عدد الخلايا التي سيتم استخدامها في عملية الزرع وفقا للورم اختبار والهدف التجريبي: عدد أكبر من الخلايا المزروعة سوف يقلل من وقت تطور الورم (وقد ثبت أن 20،000 خلية من أورام RMS الماوس تتطور إلى ورم 6 أسابيع بعد الحقن). لتكون قادرة على مقارنة خطوط الخلايا المختلفة أو العلاجات المختلفة، من المهم أن تبدأ من نفس العدد من الخلايا.
  6. كما الخلايا هي الآن على استعداد للزرع، والحفاظ على الجليد حتى الحقن. ضع حقنة الأنسولين المغطاة بـ 0.5 مل مع إبرة 29 G على الجليد، لمنع حل الخلية من أن يصبح صلبًا عند الشفط.
  7. تشغيل مقياس التدفق إلى 200 مل / دقيقة الأكسجين والمرذاذ isoflurane إلى 2.5٪. التخدير 2 شهر ذكر NOD / SCID الماوس عن طريق وضعه داخل غرفة التعريفي. انتظر 2-3 دقائق حتى يظهر الماوس نائماً وتباطأت التربية. قبل بدء الإجراء ، تأكد أولاً من خلال قرصة القدم أن الماوس نائم ، ثم ضع مرهم بيطري على العينين. حلق الجانب الأيمن من الحيوان، يستنشق محلول الخلية في الحقنة المبردة مسبقا، وحقنها تحت الجلد في المنطقة الحليقة. سوف تشكل عثرة مرئية تحت الجلد إذا تم تنفيذ الحقن بشكل صحيح.
    ملاحظة: يمكن إجراء الطعوم الخلية في نفس سلالة الماوس مثل تلك التي من الخلايا المزروعة. على سبيل المثال، إذا كانت خلايا RMS معزولة أصلاً من ماوس C57BL/6، يمكن إجراء الطعوم في الفئران C57BL/6. إذا كانت السلالة مختلفة، ثم الفئران المتلقية نقص المناعة ينبغي أن تستخدم لتجنب الرفض. ويمكن أيضا تعديل أعمار الفئران المتلقية اعتمادا على الهدف التجريبي.
  8. مراقبة الفئران لتكوين الورم مرة واحدة في الأسبوع.
    ملاحظة: للتحقق من هوية الورم المشتق من زرع الطعوم، ينبغي مقارنته بالورم الأصلي الذي تم عزل الخلايا منه. لهذا الهدف، يمكن إجراء التحليل النسيجي للميزات المورفولوجية والتعبير عن علامات myogenic، فضلا عن RNAseq أكثر شمولا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكشف عن الأورام
تم تحسين عزل الخلايا للحصول على أقصى قدر من التباين من مجموعات الخلايا الموجودة في أنسجة الورم. أولا، منذ الأنسجة المعزولة قدمت مناطق مختلفة من الناحية الشكلية، لتعزيز فرص عزل مجموعات الخلايا النادرة موحدة، تم إجراء أخذ العينات من مناطق متعددة من الورم(الشكل 1A، اللوحة الأولى على اليسار). ثانياً، تم إجراء التفكك الميكانيكي للعينات المقطوعة مع الحفاظ على التجانس في حجم الأنسجة المفرومة، على الرغم من المقاومة المختلفة التي قد تكون موجودة عبر العينات(الشكل 1A،اللوحة الثالثة والرابعة من اليسار ). اعتمادا على المواد البداية (عدوانية الورم، والعمر والنمط الجيني للماوس، وموقع الورم)، قد تختلف استعادة الخلايا من الإجهاد الميكانيكي لعملية العزل، تتراوح بين 3-7 أيام(الشكل 1A، اللوحة الأخيرة على اليمين). لتعزيز بقاء الخلية والنمو، يجب تغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي للعزل ثم كل يومين. سيؤدي ذلك إلى إزالة الحطام والخلايا الميتة المتراكمة أثناء عملية العزل التي قد تؤثر على قدرة الخلية على البقاء. يجب أن يبدأ فحص تشكيل الأورام بعد مرور الخلايا مرة واحدة على الأقل لضمان الجدوى المثلى عند وضعها في ثقافات التعليق(الشكل 1B،اللوحة الأولى على اليسار). في أيدينا، تم الحصول على النتائج المثلى بدءا من الخلايا من الممر 2 (P2)(الشكل 1C،اللوحة الأولى والثانية على اليسار). تم اختيار هذا المقطع المحدد بعد اختبار متعددة. عندما كانت خلايا P0 مطلية في ظروف منخفضة المرفق، شكلت عددا منخفضا من الأورام مقارنة مع الممرات في وقت لاحق، وربما بسبب الحطام الخلوي لا تزال موجودة بعد العزلة. في مقاطع لاحقة، لوحظت أنماط مختلفة من تكوين محيط الورم ويعزى إلى الاختيار الذي يحدث بعد العديد من المقاطع في الثقافة. عند مقارنة خطوط الخلايا المختلفة، يقترح أن تبدأ من نفس المقطع.

التمييز بين الأورام ومجموعات الخلايا له أهمية أساسية في التحديد الكمي للتقدير. الشكل 1 جيم (آخر لوحتين على اليمين) يظهر بوضوح الاختلافات المورفولوجية بين الورم (يسار) وكتلة الخلية (يمين). تستمد الأورام من خلية واحدة لديها قدرة عالية على التجديد الذاتي والنمو في ظروف منخفضة المرفقات (كل من ملامح TPCs). في الواقع، يشير تطور الأورام إلى إمكانية الأورام. ومع ذلك، يتم إجراء هذا الاختبار في المختبر بشكل مستقل عن العظة المستمدة من الكائن الحي كله. وبالتالي، للتحقق من صحة الإمكانات الورمية للخلايا في الجسم الحي،يجب إجراء تجارب زرع الطعوم(الشكل 1D).

التحقق من صحة علاج البروتينات المؤتلفة
قبل إعداد علاج الأورام ، يجب تحديد التركيز الأمثل الذي يؤدي فيه بروتين الفائدة إلى تأثير على الخلايا السرطانية. وللقيام بذلك، من الضروري تقييم مستوى التعبير عن الجينات المستهدفة للبروتين في المصب(الشكل 2). تم إجراء بحث أدبي على PubMed قبل تحديد الجينات المستهدفة لاختبارها من خلال qRT-PCR. وفي حالة ما إذا ثبت أن البروتين الذي يهمه الأمر يُقدّم مسارات مختلفة في المصب، ينبغي إجراء اختيار جينات متعددة مرتبطة بكل مسار من هذه المسارات. على سبيل المثال، Flt3l (FMS-مثل التيروزين كيناز 3) وقد ثبت لتعديل STAT5 إشارة في ابيضاض الدم النقوي الحاد، مما يؤدي إلى التعبير المصب من P21، ج-المايك، وCyclinD1(الشكل 2)27. وعلاوة على ذلك، مطلوب التعبير عن Flt3l للخلايا التقشرية التشعب تنشيط الوساطة من مسار إشارة STAT328. لتقييم نشاط STAT3، تم فحص التعبير Socs3 و CyclinD1(الشكل 2). وأظهر تحليل النتائج تأثير تعتمد على جرعة من العلاج البروتين المؤتلف على بعض الجينات التي تم اختبارها (p21، CyclinD1، وSocs3)، في حين أن البعض الآخر لم تتأثر (ج-Myc). من المهم تحديد الجينات المصب استجابة للبروتين من الاهتمام في الورم محددة اختبارها لتقييم موثوق بها لفعالية العلاج.

تحسين بروتوكول الانف بلازميد
لوضع بروتوكول فعال للانعاق بلازميد ومزيد من فحص تشكيل الأورام، تم اختبار آثار التغوط على الخلايا السرطانية الملتصقة(الشكل 3A). تم إجراء علاج كاشف الانقباة بعد بروتوكول الشركة المصنعة، وتم اختبار مبلغين مختلفين من الكاشف. تم تقييم الكفاءة باستخدام مراسل GFP بلازميد. في أيدينا، لاحظنا كفاءة أعلى في التغوط باستخدام كميات أقل من الكاشف(الشكل 3A). في الواقع تركيزات أعلى تؤدي إلى زيادة موت الخلايا، بدءا من 48 ح وتصبح أكثر وضوحا بعد 72 ح من وقت التغوط. ولم يكن نفس بروتوكول التغوط فعالا ً في الخلايا المعلقة، حيث أصبح تراكم الخلايا الميتة والحطام الخلوي واضحاً بعد 24 ساعة من بداية العلاج، مما يشير إلى انخفاض القدرة الخلوية. للتغلب على هذا التحدي التقني، تم استخدام بروتوكول خطوتين: إجراء التغوط على الخلايا الملتصقة، وفصلها 24 ساعة بعد العلاج، ولوحة لهم في تعليق لمدة 7 أيام أخرى. وكانت الأورام السيطرة في الواقع التعبير GFP في نهاية التجربة(الشكل 3B).

Figure 1
الشكل 1: عزل الخلايا السرطانية، اشتقاق محيط الورم، وزرع. (أ) التمثيل التخطيطي للمادة 2 من البروتوكول (عزل الخلايا السرطانية). ويرد موجز لكل خطوة رئيسية من خطوات البروتوكول. (ب) التمثيل التخطيطي للمادة 3 من البروتوكول (اشتقاق الأورام). ويرد موجز لكل خطوة رئيسية من خطوات البروتوكول. (ج) من اليسار: صورة ميدانية مشرقة لخلايا الورم المعزولة عند الممر 2 (P2) عند التكبير المنخفض (شريط المقياس = 50 ميكرومتر) والتكبير العالي (شريط المقياس = 50 ميكرومتر)؛ صورة المجال الساطع للورم المستمدة من الخلايا السرطانية بعد 30 يوما في ثقافة التعليق (شريط مقياس = 250 درجة مئوية)، وصورة مشرقة من كتلة الخلية التي تشكلت من الخلايا السرطانية بعد 30 يوما في ثقافة التعليق (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). (د) التمثيل التخطيطي للمادة 6 من البروتوكول (زرع الطعوم الورميّة). ويرد موجز لكل خطوة رئيسية من خطوات البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من صحة الجينات المستهدفة في المصب لتحديد تركيز البروتين المؤتلف. نتائج qRT-PCR لتقييم تركيز العلاج Flt3l. تم تنفيذ ANOVA في اتجاهين. تظهر الأهمية للمقارنة مع التحكم غير المعالج. (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعداد بروتوكول الانف اللامع للأورام. (أ) الصور التمثيلية ذات المجالات الساطعة والصور الفلورية للخلايا السرطانية المعالجة بتركيز منخفض (أعلى) أو مرتفع (أسفل) من كاشف الانف (0.75 أو 1.5 ميكرولتر في 24 لوحة جيدة) (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (ب) صورة تمثيلية للأورام التي تشكلت من الخلايا المعالجة ببلازميد GFP، بعد 7 أيام من طلاء الخلايا في تعليق (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمت أساليب متعددة لعزل وتوصيف TPCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة الورم: اختبار الورم clonogenic، عزل FACS، ودراسة تشكيل الورم. تم وصف فحص الورم الكلوجيني لأول مرة في عام 1971، ويستخدم لدراسات الخلايا الجذعية، ويطبق فقط في وقت لاحق على بيولوجيا السرطان29،30. ويستند هذا الأسلوب على الخلايا الجذعية السرطانية الملكية الجوهرية لتوسيع دون قيود في الثقافات هلام لينة31. منذ تطورها، وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع في أبحاث السرطان لأغراض متعددة، بما في ذلك دراسات عدم تجانس الخلايا السرطانية، وتأثير العلاج الهرموني على نمو الخلايا، ودراسات مقاومة الأورام31. حتى الآن، لا يزال يستخدم هذا الاختبار لتحديد الخلايا التي تبدأ الورم لأنواع متعددة من السرطانات32.

ويستند عزل FACS على المعرفة المسبقة من العلامات الجزيئية الموجودة على سطح الخلايا على الفائدة. وقد استخدمت على نطاق واسع لعزل TPCs من كل من الأورام السائلة والصلبة. على سبيل المثال، تم إجراء أول تحديد لسرطان الدم النقوي الحاد البشري (AML) الخلايا التي بدأت من قبل مجموعة الدكتور ديك من خلال الاستفادة من تجزئة FACS والاختبارات زرع استنادا إلى معرفة علامات موجودة على الخلايا السائبة مكافحة غسل الأموال9. وباستخدام نهج مماثل، عزلت مجموعة الدكتور كلارك سرطان الثدي بدء الخلايا3. دراسة تشكيل الأورام هو نهج مختلف يستخدم لتحديد ودراسة TPCs. تم تطوير هذه الطريقة لأول مرة لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية من أورام الدماغ33. ومن المثير للاهتمام, تم اختباره في البداية باستخدام نفس الشروط المعروفة لصالح نمو الخلايا الجذعية العصبية, وبالتالي تفضيل خاصية التجديد الذاتي المرتبطة أيضا مع TPCs33. وعلاوة على ذلك، يعتمد تكوين محيط الأورام على قدرة المراكز على النمو بطريقة مستقلة عن المرسى.

ويمكن استخدام النهج الثلاثة المذكورة أعلاه بالتوازي مع تعزيز احتمال عزل مجموعات النقاط السكانية من الـ TPCs وتوصيفها جزيئياً، والتغلب على القيود المفروضة على كل طريقة. على سبيل المثال، على الرغم من تحقيق ميزة كبيرة من عزل مجموعات الخلايا النقية، تعتمد بقوة على استخدام علامات السطح التي لم تعرف بعد لجميع أنواع السرطان. وبالتالي، يقتصر استخدامه على عزل ة TPCs التي تعبر عن علامات معروفة. وتستند كل من الاختبارات الأورام وتكوين محيط الورم على حد سواء على الخصائص الخلوية, المعروف أن تكون مرتبطة مع TPCs. ويمكن استخدام كل من هذه الطرق كخط أول من الدراسات على السرطانات الجديدة أو لم تدرس بعد. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تضمن هاتان الطريقتان توسيع وإثراء سكان الخلايا ذات الأهمية، مما ييسر تحديد العلامات الجزيئية، ويسمح لكل من مقاومة السرطان ودراسات فحص العقاقير. في هذا السياق، يتم تحليل تشكيل الأورام أكثر فائدة، لأن هذه الهياكل spheroid أفضل إعادة خلق البيئة الموجودة في أنسجة الورم (مناطق نقص الأكسجة في وسط المجالات)34. في الواقع، وقد تبين سابقا أن الثقافات 3D هي أكثر موثوقية للتنبؤ العلاج من المخدرات النتيجة34. يمكن استعادة الأورام بعد الثقافة، واستخدامها لتجارب الطعوم: هضم الأورام في حلول الخلايا الواحدة وزرع هافيات متلقية سيسمح في تقييم الجسم الحي للقدرة الورمية حديثاً تحديد TPCs، مقارنة مع الخلايا السرطانية السائبة.

للحصول بنجاح على بداية ممثل المواد الخلوية من عدم تجانس الورم، فمن الأهمية بمكان لإجراء أول أخذ عينات عشوائية من الأنسجة. تتميز RMS بالمناطق الليفية أو الدهنية أو عالية الأوعية الدموية التي يمكن تمييزها بوضوح في الأورام المعزولة، وبالتالي، للحفاظ على هذا التنوع الخلوي، وسوف تكون هناك حاجة لجمع كل منطقة من الأنسجة. وعلاوة على ذلك، لتعزيز فرص بقاء الخلايا أثناء عملية الهضم، يحتاج فرم الأنسجة التي تم جمعها إلى أن يؤدي إلى قطع متساوية الحجم: فالشظايا الأصغر حجماً هي أكثر عرضة للإفراط في الهضم مما يؤدي إلى الحد من قدرة الخلايا على البقاء. قد يكون هذا مملة بشكل خاص بسبب مورفولوجيا متنوعة وصلابة RMS.

للكم من نتيجة قياس تشكيل الأورام ، من الأهمية بمكان التمييز بين الأورام الحقيقية والمجموعات الخلوية (الشكل 1C، آخر فريقين على اليمين). محيط الورم هو بنية صلبة spheroid التي لا يمكن فيها التمييز في تكوين الخلية. في المقابل، في كتلة الخلية، يمكن تمييز الخلايا المفردة بسهولة. قد لا تفترض مجموعات الخلايا شكلًا مستديرًا وهي أصغر بكثير عند مقارنتها بأورام الأورام، والتي تتراوح بين 50-250 درجة مئوية25.

لتحقيق زرع الأورام، والحصول على حل خلايا واحدة موحدة هو خطوة رئيسية. في الواقع، نظرا للبنية الضيقة والحجم الكبير للورم، يصبح هضم الخلايا خطوة رئيسية مقيدة في إعداد تعليق خلية واحدة التي تستخدم كذلك لزرع. دورات متعددة من الهضم الأنزيمي جنبا إلى جنب مع التفكك الميكانيكية وبالتالي ضرورية للانفصال الكامل من الأورام. ولتأكيد تقدم التفكك والنتيجة الناجحة، يجب رصد الحل تحت مجهر حقل مشرق.

على الرغم من المزايا المتعددة التي يوفرها نموذج تشكيل الأورام، فقد ثبت أن الأورام لا تنشأ من كل نوع من أنواع الأورام أو من جميع خطوط الخلايا المتاحة تجاريا. في هذه الحالات، لا يمكن استخدام هذا التصنيف كمعيار لتحديد أورام الخلايا والقياس الكمي لـ TPCs ضمن عدد غير متجانس. ويرتبط قيد آخر من هذا القول مع حقيقة أن أنواع الورم المختلفة تتطلب ظروف مختلفة النمو والتفكك; وبالتالي، فإنه يتطلب التحسين تستغرق وقتا طويلا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من كلا البروتوكولين لكل نوع الورم أو خط الخلية. وعلاوة على ذلك، قد يحدث اندماج الأورام المتعددة في الثقافة، مما يجعل تقييم أحجامها وأرقامها غير واضح.

على الرغم من حقيقة أن تحليل تشكيل الورم قد استخدمت سابقا في دراسات RMS، فقد تم تطبيقه بشكل رئيسي على خطوط الخلايا RMS المتاحة تجاريا لتحديد المسارات الجزيئية المشاركة في تشكيل الورم وتطويره18، 20،21. وبالنظر إلى تكوين الأنسجة غير المتجانسة، والأنواع الفرعية العديدة من الأورام والسياقات التنموية المتنوعة التي تنشأ منها RMS، فإن استخدام خطوط الخلايا RMS يحد من تطبيق هذا الفحص لتحديد كل من خلايا المنشأ و العظة التنموية التي تؤدي إلى تطور الورم في الجسم الحي.

وقد أظهرت محاولة لوضع بروتوكول فعال لاشتقاق الأورام، بدءا من عينات ساركوما الإنسان، في السابق نتائج سيئة. في الواقع، تم تطوير الأورام من 10٪ فقط من العينات35. وبالتالي، هناك حاجة إلى إجراء تخفيض وموثوقية للتحديد لعزل الخلايا الرئيسية RMS وتطوير الأورام. واستجابة لهذه الحاجة، تم تحسين فحص تشكيل محيط الورم الموصوف ليتم استخدامه في ثقافات الخلايا الأولية. ويمثل وضع هذا البروتوكول الخطوة الأولى نحو الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الميدان (أي كيف تختلف خلايا المنشأ في نظام إدارة الموارد البشرية تبعاً للسياق البيئي). بمزيد من التفصيل، وصف هنا هو بروتوكول استنساخ لعزل الخلايا السرطانية الأولية من أنسجة RMS، وتشكيل الأورام، وعلاج الأورام (كلاهما يؤديها مع البروتينات المؤتلفة أو بلازميدات التعبير المفرط)، والطعوم اللوجرافة تجارب زرع.

في الختام، فإن إجراء عملية تحديد تشكيل الأورام هو طريقة راسخة ومتعددة الاستخدامات لتحديد الـ TPCs في أنواع مختلفة من الأورام، مما يثري الخلايا مع زيادة القدرة على التجديد الذاتي والقدرة على النمو في مرسى مستقل طريقه. ويستند هذا التصنيف على الخصائص الوظيفية لتجمعات الخلايا التي تجري دراستها وليس على المعرفة السابقة للعلامات الجزيئية؛ وبالتالي، يمكن تطبيقه كأداة استكشافية لمجموعة واسعة من أنواع الأورام. وعلاوة على ذلك، فإن عزل ة مجموعات الخلايا النادرة التي تحققت مع ثقافات الأورام يجعل هذا الفحص في المختبر منصة مثالية لاختبار المخدرات السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة إليسون الطبية منحAG-NS-0843-11، والمنحة التجريبية للمعهد الوطني للصحة ضمن منحة دعم مركز السرطان NCI P30CA030199 إلى A.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase cell dissociation reagent Gibco A1110501 Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo Nexcelom Celigo Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II Life Technologies 17101015 Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease Life Technologies 17105041 Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media Gibco 11965092 Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media Gibco 11320033 Component of tumosphere media
EDTA ThermoFisher S312500 Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein Gibco PMG8041 Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry BD Biosciences 650033 Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent MWI Vet Supply 502017 Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain Life Technologies F10347 Discriminate live and dead cells
Goat Serum Life Technologies 16210072 Component of FACS buffer
Ham's F10 Media Life Technologies 11550043 Component of FACS buffer
Horse Serum Life Technologies 16050114 Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent ThermoFisher L3000015 Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix Corning CB40234 Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X) Gibco 17502048 Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment MWI Vet Supply 701008 Eyes ointment
PBS Gibco 10010023 Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1 Addgene 6084-1 GFP plasmid
Penicillin - Streptomyocin Life Technologies 15140163 Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic Peprotech 10018B Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 427-FL-005 Recombinant protein
Trypan blue ThermoFisher 15250061 Discriminate live and dead cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  2. Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
  3. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  4. Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
  5. Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
  6. Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
  7. Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
  8. Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
  9. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  10. Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
  11. Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
  12. Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
  13. Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
  14. Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
  15. Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
  16. Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
  17. Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
  18. Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
  19. Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
  20. Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
  21. Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
  22. Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
  23. Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
  24. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
  25. Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
  26. Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
  27. Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
  28. Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
  29. Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
  30. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
  31. Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
  32. Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
  33. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  34. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  35. Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).

Tags

علم الوراثة العدد 151 الأورام الساركوما الروماتيزمية العضلات الهيكلية الخلايا الأولية علاج البروتين المؤتلف التغوط بلازميد
اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boscolo Sesillo, F., Sacco, A.… More

Boscolo Sesillo, F., Sacco, A. Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas. J. Vis. Exp. (151), e59897, doi:10.3791/59897 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter