Summary
Este protocolo descreve um método reprodutível para a isolação de pilhas preliminares do rabdomiossarcoma do rato, da formação e do tratamento do tumorsphere, e da transplantação do aloenxerto que partem das culturas dos tumorspheres.
Abstract
O rhabdomyosarcoma (RMS) é o sarcoma macio o mais comum do tecido nas crianças. Embora esforços significativos permitiram a identificação de mutações comuns associadas ao RMS e permitiram a discriminação de diferentes subtipos de RMS, ainda existem grandes desafios para o desenvolvimento de novos tratamentos para melhorar ainda mais o prognóstico. Embora identificada pela expressão de marcadores miogênicos, ainda há controvérsia significativa sobre se o RMS tem origens miogênicas ou não miogênicas, já que a célula de origem ainda é pouco compreendida. No presente estudo, um método confiável é fornecido para o ensaio de tumorfera para o mouse RMS. O ensaio é baseado em propriedades funcionais de pilhas do tumor e permite a identificação de populações raras no tumor com funções tumorigênico. Também são descritos procedimentos para testar proteínas recombinantes, integrando protocolos de transfecção com o ensaio de tumorfera e avaliando genes candidatos envolvidos no desenvolvimento e crescimento tumoral. Descrito mais é um procedimento para a transplantação do aloenxerto de tumorspheres em ratos destinatários para validar a função tumorigênico in vivo. Globalmente, o método descrito permite a identificação e o teste confiáveis de populações tumorigênicas de RMS raras que podem ser aplicadas a RMS que surgem em diferentes contextos. Finalmente, o protocolo pode ser utilizado como plataforma para triagem de fármacos e desenvolvimento futuro da terapêutica.
Introduction
O câncer é uma doença heterogênea; Além disso, o mesmo tipo de tumor pode apresentar mutações genéticas diferentes em pacientes diferentes, e dentro de um paciente um tumor é compor por populações múltiplas das pilhas1. A heterogeneidade apresenta um desafio na identificação de células responsáveis pelo início e propagação do câncer, mas sua caracterização é essencial para o desenvolvimento de tratamentos eficientes. A noção de pilhas de propagação do tumor (TPC), uma população rara das pilhas que contribuem ao desenvolvimento do tumor, foi revista previamente extensivamente2. Apesar do fato de que os TPCs têm sido caracterizados em múltiplos tipos de câncer, a identificação de marcadores para seu isolamento confiável continua sendo um desafio para vários tipos de tumores3,4,5,6 , 7 anos de , 8 . º , 9. assim, um método que não dependa de marcadores moleculares, mas em propriedades funcionais de TPC (alta autorenovação e a capacidade de crescer em condições de baixa fixação), conhecido como o ensaio de formação de tumorfera, pode ser amplamente aplicado para o identificação de TPCs da maioria dos tumores. Importante, este ensaio também pode ser empregado para a expansão de TPCs e, portanto, aplicado diretamente à triagem de drogas de câncer e estudos sobre a resistência ao câncer1,10.
O rabdomiossarcoma (RMS) é uma forma rara de sarcoma de tecido mole mais comum em crianças jovens11. Althoug RMS pode ser identificado histologicamente através da avaliação da expressão de marcadores miogênicos, a célula RMS de origem não foi caracterizada univocalmente devido aos subtipos de tumores múltiplos e alta heterogeneidade dos estímulos de desenvolvimento tumoral. De fato, estudos recentes têm gerado uma discussão científica significativa sobre se o RMS é de origem miogênica ou não-miogênica, sugerindo que o RMS pode derivar de diferentestipos decélulas, dependendodo contexto12,13, 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17. numerosos estudos sobre as linhagens de células RMS foram realizados empregando o ensaio de formação de tumorfera para a identificação de vias envolvidas no desenvolvimento tumoral e caracterização de marcadores associados a populações de alta autorenovação 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , a 21.
Entretanto, apesar do potencial do ensaio de formação da tumorfera para identificar as células de origem do RMS, um método confiável que pode ser empregado em células RMS primárias ainda não foi descrito. Neste contexto, um estudo recente de nosso grupo empregou um ensaio otimizado de formação de tumorfera para a identificação das células de origem do RMS em um modelo de rato de distrofia muscular de Duchenne (DMD)22. Vários tipos de células pré-tumorigênicas, isolados de tecidos musculares, são testados por sua capacidade de crescer em condições de baixo apego, permitindo a identificação de células-tronco musculares como células de origem para RMS em contextos distróficos. Descrito aqui é um protocolo reprodutível e confiável para o ensaio de formação de tumorfera (Figura 1), que tem sido empregado com sucesso para a identificação de populações de células extremamente raras que são responsáveis pelo desenvolvimento do mouse RMS.
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Protocol
A habitação, o tratamento e o sacrifício de camundongos foram realizados seguindo o protocolo IACUC aprovado do Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. preparação do reagente
- Prepare 100 mL de meio de isolamento celular: F10 médio suplementado com 10% de soro de cavalo (HS).
- Preparar 50 ml de solução de colagenase tipo II: dissolver 1 g de pó de colagenase tipo II em 50 ml de meios de isolamento celular (Observe as unidades da enzima por 1 ml de mídia, uma vez que o número de unidades muda dependendo do lote). Aliquot a solução e armazene-o em um congelador de-20 ° c até que esteja pronto para o uso.
Nota: cada lote de colagenase deve ser testado antes de usar, uma vez que a atividade enzimática pode mudar em lotes diferentes. - Prepare 10 ml por amostra de segunda solução de digestão: meios de isolamento de células com 100 unidades/ml de solução de colagenase tipo II e 2 unidades/ml de Dispase II recém-ponderadas. Prepare-se imediatamente antes do uso.
- Prepare 500 mL de meios das pilhas do tumor: glicose elevada de DMEM suplementado com 20% FBS e 1% pena/Strep.
- Prepare 500 mL de tampão de FACS: 1X PBS suplementado com o soro normal da cabra de 2,5% v/v e o EDTA de 1 milímetro.
- Prepare 500 mL de mídia tumorsphere: DMEM/F12 suplementado com 1% de caneta/Strep. Pouco antes de usar, adicione os seguintes fatores de crescimento: 1% N2 suplemento, 10 ng/mL EGF, e 10 ng/mL β-FGF.
2. isolamento celular e cultura
- Prepare uma placa de 10 cm contendo 5 mL de meio de isolamento de células (uma placa por amostra de tumor) e coloque-a em uma incubadora a 37 ° c até estar pronta para colher o tecido tumoral.
- RMS foram relatados para desenvolver espontaneamente em ambos os modelos de mouse masculino e feminino para distrofia muscular de Duchenne, tais como camundongos B10 MDX em cerca de 18 meses de idade e em B6 camundongos MDX/mTR por 9 meses22,23. Anestesiar o camundongo que desenvolve o tumor RMS usando isoflurano, e sacrificar o animal através da luxação cervical ou de acordo com as diretrizes da IACUC da instituição. Com tesouras, faça uma incisão na pele na área onde o tumor está localizado, e (usando pinças) Puxe a pele para longe da área de interesse. Empregando uma lâmina de barbear, extirpar o tumor do animal.
- Pesar 500 – 1000 mg do tecido tumoral e colocá-lo na placa preparada na etapa 2,1 (Figura 1a).
Nota: quantidades maiores de tecido afetam negativamente as etapas de digestão e diminuem o rendimento geral. Se o tumor colhido for maior que 1000 mg, divida-o em partes e prove aleatoriamente até que o peso desejado seja atingido. A amostragem aleatória é necessária para avaliar a heterogeneidade tecidual. - Coloc a placa que contem tecidos do tumor na capa estéril da cultura de pilha e mince a com uma lâmina de lâmina. O tecido tumoral do RMS é heterogêneo; assim, diferentes áreas podem apresentar diferentes resistências aos cortes. Certifique-se de que os tamanhos das peças triturados resultantes são uniformes para garantir a digestão ideal.
Nota: o RMS existe como misturas de diferentes tipos de tecidos (principalmente fibróticos, vascularizados e gordurosos) que podem ser identificados em todos os tumores. Para 1) isolar uma população de células heterogêneas com precisão recapitulando a composição do tumor original e 2) não viés do procedimento de isolamento, realizar amostragem aleatória do tecido colhido. As células de diferentes áreas do tumor devem ser digeridas e testadas paralelamente in vitro no ensaio descrito na secção 3. - Mova o tecido picado e a mídia de isolamento de células em um tubo de centrífuga de 15 mL, lave a placa com 4 mL de mídia de isolamento celular e coloque-a no tubo.
- Adicionar 700 unidades/mL de solução de colagenase para digerir o tecido e incubar em um banho de água agitando a 37 ° c para 1,5 h.
- Após a incubação, gire para baixo o tecido em 300 x g por 5 min em RT. aspirar o sobrenadante sem perturbar a pelota, ressuscitem a pelota em 10 ml da segunda solução da digestão (Dispase), e incubar em um banho de água de agitação em 37 ° c por 30 minutos.
- Uma vez que a segunda digestão é concluída, Pipet cima e para baixo e passar a suspensão celular através de um filtro de nylon de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL. Em seguida, adicione 10 mL de meios de isolamento celular para lavar o filtro e diluir a solução de digestão, e girar para baixo o tecido em 300 x g e RT por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuscite a pelota em 20 mL de meios das pilhas do tumor. Em seguida, transfira a suspensão celular em uma placa de cultura de células de 15 cm. Coloc as pilhas na incubadora em 37 ° c durante a noite. Esta placa será identificada como P0.
- No dia após o isolamento, mude a mídia. Esta etapa é necessária para assegurar a remoção dos restos e das pilhas inoperantes que podem negativamente influenciar a sobrevivência da pilha.
- Avalie a confluência celular após a mudança da mídia, que varia de 30% a 60%, dependendo da quantidade de material inicial e do tamanho da célula. Deixe as células crescendo na incubadora até atingirem 90% de confluência. Monitore as células a cada dia e mude a mídia a cada 2 dias. O tempo necessário para que as células tumorais se tornem confluentes varia dependendo dos múltiplos parâmetros: agressividade tumoral, genótipo do tumor, idade do camundongo, heterogeneidade do tecido.
- Para o passaging da pilha, faça o seguinte:
- Pre-aqueça a solução do destacamento da pilha e os meios das pilhas do tumor em um banho de água em 37 ° c.
- Lave as células com 1X PBS estéril e incubar-os a 37 ° c em 10 mL de solução de descolamento de células quentes por 5 – 10 min.
- Quando todas as células são destacadas da placa, adicionar 10 mL de células tumorais quentes mídia, mova a solução em um tubo de centrífuga 50 mL e células de rotação para baixo em 300 x g por 5 min em RT.
- Ressuscite as células em 5 – 10 mL de meios de células tumorais, dependendo do tamanho da pelota, e contagem de células ao vivo usando trypan azul (1:5 diluição) para excluir células mortas.
- Placa 105 células em placas de 10 cm ou 3 x 105 células em placas de 15 cm. O tempo de duplicação da célula varia de acordo com os fatores detalhados na etapa 2,10.
3. derivação do tumorsphere
- Use células tumorais na passagem P1 ou P2 para evitar a seleção celular através de múltiplas passagens (Figura 1b). Para separar as células da placa, primeiro lave o prato com 1X PBS, sem perturbar as células, em seguida, cobri-los usando solução de descolamento de células (5 mL para uma placa de 10 cm ou 10 mL para uma placa de 15 cm) e colocá-los na incubadora por 5 – 10 min.
- Confirme que as pilhas estão destacadas olhando a placa um microscópio do brilhante-campo, adicionam o volume 1:1 de meios das pilhas do tumor (solução do destacamento da pilha: meios das pilhas do tumor), coloc a suspensão da pilha em um tubo de centrifugação e gire as pilhas para baixo em 300 x g para 5 min na empresa RT.
- Reressuscite as células em qualquer tampão de FACS (seção 3,4) ou tumorspheres Media (seção 3,5), de acordo com o método usado para o chapeamento.
- Células de chapeamento através do citometro de fluxo
- Resuspender as células no buffer de FACS (a quantidade depende do tamanho da pelota) e contar manualmente as células ao vivo usando a exclusão azul de trypan. Certifique-se de que a concentração final da célula é de 107 células/mL (100 μl de tampão FACS por 106 células). Adicionar 1 μL de FX Cycle mancha violeta por 106 células para discriminar ao vivo de células mortas durante a triagem celular. Prepare um controle não manchado em que a mancha de FX Cycle Violet não é adicionada às pilhas.
Nota: a concentração é otimizada para uma coloração e velocidade eficientes durante a triagem. Uma concentração mais baixa da pilha conduzirá a um tempo de classificação mais longo, quando uma concentração mais elevada afetará a mancha. - Empregando o controle não manchado, configurar um portão FACS segregando vivo (FX Cycle Violet-) de Dead (FX ciclo violeta+) células. Então, empregue a seleção fluorescente-ativada da pilha (com passagem da faixa do filtro 450/50) para a separação e a contagem de pilhas vivos/inoperantes e para galvanizar o número desejado de pilhas vivos em cada poço das placas do poço do baixo-acessório 96. Cada poço da placa precisa de ser enchido com 200 μL de meios dos tumorspheres antes de começar a classificação.
Nota: dado que os TPCs são uma subpopulação rara dentro do tumor inteiro, otimize o protocolo pelo chapeamento 100 pilhas/poço do rato RMS para observar a formação de tumorspheres na cultura da suspensão. O número de células por poço deve ser ajustado para o tumor específico testado. - Coloque as células na incubadora até o final do experimento. Tente não perturbar a placa a menos que necessário. Para um experimento de 30 dias, cada poço deve ser reabastecido com mídia e uma proporção adequada de fatores de crescimento a cada semana (a mídia tende a evorar e fatores de crescimento não são eficazes após 1 semana).
- Após a conclusão do experimento, manualmente as placas de tela um microscópio de campo brilhante para identificar tumorspheres (ver passo 3,6).
Nota: um temporal de 30 dias foi otimizado para detectar facilmente tumorspheres RMS do mouse de tamanhos variando de 50 – 300 μm de diâmetro. O temporal deve ser ajustado dependendo da agressividade do tumor testado e da sua taxa proliferativa.
- Resuspender as células no buffer de FACS (a quantidade depende do tamanho da pelota) e contar manualmente as células ao vivo usando a exclusão azul de trypan. Certifique-se de que a concentração final da célula é de 107 células/mL (100 μl de tampão FACS por 106 células). Adicionar 1 μL de FX Cycle mancha violeta por 106 células para discriminar ao vivo de células mortas durante a triagem celular. Prepare um controle não manchado em que a mancha de FX Cycle Violet não é adicionada às pilhas.
- Células de chapeamento manualmente
- Reressuscite as células em tumorsphere Media (a quantidade depende da pelota) e manualmente contagem de células ao vivo usando Tripan azul (1:10 diluição). Calcule a concentração celular no tubo e a placa o número adequado de células em uma placa de fixação 96 bem baixa. Coloque as células na incubadora até o final do experimento. Tente não perturbar a placa a menos que necessário para reabastecer meios e fatores de crescimento, como descrito na etapa 3.4.3.
- Após a conclusão do experimento, placas de tela manualmente um microscópio de campo brilhante para identificar tumorspheres ou usando o software Celigo, como descrito anteriormente em Kessel et al.24 ver passo 3,6 abaixo.
- Note-se que dois leituras separados podem ser avaliados como resultado deste ensaio: número e tamanho das tumoresferas formadas.
Observação: quando mais de uma célula é revestida em um poço, tumorspheres ou clusters de células podem formar (Figura 1C, terceiro e quarto painéis). Os aglomerados celulares são pequenos agregados celulares que se formam em cultura de suspensão que melhoram a sobrevida celular e são caracterizados por uma forma irregular. Tumorspheres são grandes e têm uma estrutura mais compacta com uma forma esferoidal. Eles derivam de uma única célula que tem a capacidade de sobreviver de forma independente de ancoragem e proliferar em uma taxa elevada25. As células do chapeamento através do citômetro do fluxo ou manualmente podem ser usadas permutavelmente, dependendo das capacidades disponíveis no laboratório. Além disso, empregar placas do baixo-acessório do tamanho diferente de 96 placas do poço é possível e dependente do resultado exigido. Na verdade, a avaliação da frequência da tumorfera deve ser feita empregando 96 placas de fixação bem baixas, enquanto a triagem inicial para avaliação do potencial tumorigênico de células produzirá resultados mais rápidos e confiáveis em 6 placas de baixo-acessório bem.
4. tratamento da tumorfera com proteínas recombinantes
- Repita as etapas 3,1 e 3,2.
- Se a criação de um tratamento com proteínas recombinantes, primeiro determinar a melhor concentração para usar a seguinte seção 4,3, ou se a concentração ideal tiver sido determinada previamente, pule para a seção 4,4.
- Determine a concentração de tratamento de proteínas recombinantes.
- Ressuscite as células em mídia tumorsphere (o volume depende do tamanho da pelota) e manualmente contagem de células ao vivo usando trypan exclusão azul. Calcule a concentração celular nas células do tubo e da placa 100.000 em uma placa de fixação 6 bem baixa. Placa de dois poços por cada concentração testada e dois poços para controles não tratados (Figura 2). As concentrações proteicas a serem testadas baseiam-se na pesquisa bibliográfica.
- Trate cada poço de pilhas da suspensão com uma concentração diferente da proteína e coloc as pilhas na incubadora para 48 h (tempo necessário para poder avaliar o efeito do tratamento na viabilidade da pilha e na expressão de genes a jusante do alvo). Em seguida, avalie os seguintes parâmetros:
- Sobrevivência celular: usando um microscópio de campo brilhante, bem como a comparação com controles não tratados, verifique a morfologia da célula. As células saudáveis aparecem brilhantes e reflexivas o microscópio, enquanto a morte celular excessiva induzirá o acúmulo de detritos na mídia. Para uma determinação quantificável da morte celular, a exclusão do azul de trypan, a coloração violeta cristalina, o MTT ou o ensaio TUNEL podem ser empregadas (neste caso, adicionar um poço ao chapeamento original).
- Efeito de proteínas recombinantes em vias downstream: realizar uma pesquisa bibliográfica utilizando o PubMed para identificação dos genes a jusante conhecidos por serem afetados pela proteína testada. Projete primers qRT-PCR para os genes alvo e realize a análise de qRT-PCR no RNA isolado das células tratadas (Figura 2).
- Trate com proteína recombinante.
- Ressuscite as células em mídia tumorsphere (o volume depende do tamanho da pelota) e manualmente contagem de células ao vivo usando trypan exclusão azul. Determine o número total de células necessárias para o experimento desejado (100 células por cada poço de uma placa de fixação 96 bem baixa) e dilui-los no volume de mídia de tumorsphere apropriado. Se realizar mais de um tratamento, Prepare tubos de células separadas.
- Trate cada tubo com a concentração apropriada de proteína de recombinação e a placa as pilhas em um poço separado da placa do baixo-acessório do poço 96. O tratamento será repetido em cada poço, dependendo da meia-vida da proteína recombinante até o ponto final de 30 dias do experimento.
- No final do experimento, siga as etapas 3.4.4 e 3,6 para analisar os dados.
5. tratamento da tumorfera com plasmís de superexpressão
- Repita as etapas 3,1 e 3,2.
- Se a configuração do tratamento em um novo tipo de tumor, primeiro determine a melhor concentração de plasmídeo para usar a seguinte seção 5,3, ou se a concentração de DNA ideal tiver sido determinada previamente, pule para a seção 5,4.
- Determine a concentração óptima do plasmídeo.
- Ressuscite células em meios de células tumorais (o volume depende do tamanho da pelota) e contagem manual de células ao vivo usando a exclusão de azul de trypan. Placa as células contadas para alcançar uma confluência de 70%-90% (número de células é altamente dependente do tamanho da célula e morfologia). O GFP-Plasmid será empregado para testar a eficiência do transfection que segue o protocolo do fabricante do reagente do transfection para pilhas aderentes. Paralelamente, teste também um controle não tratado (Figura 3a). Realize um teste de eficiência em uma placa de 24 poços.
Nota: as células aderentes são usadas para melhorar a eficiência da transfecção, pois a transfecção realizada em células de suspensão não é eficiente e afeta negativamente a viabilidade celular. - 48 h após o transfection avalie pilhas para os seguintes parâmetros:
- Sobrevivência celular: usando um microscópio de campo brilhante, comparar o número de células presentes em cada-bem e compará-lo com as células não tratadas bem.
- Expressão GFP: contar a porcentagem de células que são GFP positivo sobre o número total de células em cada poço (Figura 3B).
- Ressuscite células em meios de células tumorais (o volume depende do tamanho da pelota) e contagem manual de células ao vivo usando a exclusão de azul de trypan. Placa as células contadas para alcançar uma confluência de 70%-90% (número de células é altamente dependente do tamanho da célula e morfologia). O GFP-Plasmid será empregado para testar a eficiência do transfection que segue o protocolo do fabricante do reagente do transfection para pilhas aderentes. Paralelamente, teste também um controle não tratado (Figura 3a). Realize um teste de eficiência em uma placa de 24 poços.
- Tratamento do plasmídeo da superexpressão
- Ressuscite as células em meios de células tumorais (o volume depende do tamanho da pelota) e contagem manual de células ao vivo usando a exclusão azul de trypan. Placa 200.000 células por poço de uma placa de 6 poços. Cada poço será usado para um evento de transfecção independente. Cada poço será transfected usando o set-up desenvolvido para o tipo específico do tumor (Figura 3a).
- 24 h após o transfection, lave cada poço com 1X PBS e incubar as pilhas na solução morna do destacamento da pilha (bastante para cobrir o poço). Coloque a placa na incubadora a 37 ° c por 5 – 10 min, dependendo dos fatores detalhados na seção 2,15.
- Quando as células são desanexadas, contar as células derivadas de cada simples bem independentemente usando trypan exclusão azul. Coloque 100.000 células por poço de uma placa de fixação 6 bem baixa, certificando-se de não misturar células derivadas de diferentes poços. Coloque a placa na incubadora a 37 ° c e deixe-a sem perturbações durante uma semana.
Nota: a duração deste ensaio é de 7 dias, um tempo suficiente para permitir a formação de tumorfera, evitando a fusão da tumorfera. A fusão do tumorsphere é um fenômeno que se torne evidente quando 100.000 ou mais pilhas são chapeadas junto na suspensão por mais de 1 semana, que pode viés a avaliação da habilidade da formação do tumorsphere. Caso o experimento exija maior tempo de incubação, a densidade celular deve ser ajustada ou os andaimes poliméricos usados para evitar a fusão da tumorfera26. - No final do experimento, siga as etapas 3.5.2 e 3,6 para analisar os dados.
6. preparação da tumorfera para transplante de aloenxerto
- Coloque a solução de matriz extracelular (ECM) (50 μL por aloenxerto) e os meios de células tumorais (50 μL por aloenxerto) no gelo.
- Os tumorspheres podem ser usados para transplantações do aloenxerto. Reunir todas as tumoresferas obtidas de um tipo ou tratamento específico de células em um tubo de 15 mL ou 50 mL (de acordo com o volume total de mídia) (Figura 1D). Gire as tumorspheres para baixo em 300 x g por 5 min em RT. Retire o sobrenadante sobre as tumoresferas e lave-os com 10 ml de PBS 1x estéril.
- Gire as tumorspheres para baixo novamente em 300 x g por 5 min em RT, aspirar o 1X PBS, e adicione 500 μl a 1 ml de solução de descolamento celular em cima do pellet celular, que inicia o processo de dissociação. Incubar tumorspheres em solução digestiva em um banho de água agitando a 37 ° c e verificar a progressão da digestão a cada 10 min. Para ajudar a dissociação tumorspheres em uma única célula solução, pipeta as células para cima e para baixo para o rompimento mecânico. O processo de digestão pode demorar até 30 min.
Nota: apesar do fato de que o tempo de incubação varia consideravelmente quando as tumoresferas são derivadas de diferentes células RMS primárias, uma diminuição significativa na viabilidade celular em relação ao tempo de digestão nunca foi observada. - Quando uma única solução da pilha é obtida, adicione um volume de meios das pilhas do tumor (1:1, solução do destacamento da pilha: meios das pilhas do tumor) e gire-o para baixo em 300 x g por 5 minutos em 4 ° c.
Nota: a partir deste momento, todas as etapas precisam ser executadas no gelo. Depois de girar, tumorspheres não formam uma pelota estável como as soluções de células individuais fazer. Para se certificar de não desalojar ou aspirar as tumoresferas, utilize uma pipeta de 1 mL e aspirar suavemente o líquido. Passar para uma pipeta de 200 μL quando restar apenas 1 mL. - Ressuscite células em meios de células tumorais frias (o volume dependerá do tamanho da pelota), coloque as células no gelo e conte células ao vivo usando a exclusão azul de trypan. Após ter determinado a quantidade apropriada de pilhas a usar-se para o allograft, ressuscite-os em um volume total de 50 μL de meios frios das pilhas do tumor. Esfrie uma ponta de pipeta na mídia de células tumorais frias. Quando a ponta estiver fria, use-a para tomar 50 μL de solução de ECM e adicioná-la ao tubo que contém as células. Não retire os tubos do gelo durante este processo.
Nota: o número de células a usar para o transplante deve ser determinado de acordo com o tumor testado e objetivo experimental: um maior número de células transplantadas diminuirá o tempo de desenvolvimento tumoral (20.000 células de tumorspheres RMS do mouse foram mostrados para desenvolver em um tumor 6 semanas após a injeção). Para ser capaz de comparar diferentes linhas celulares ou tratamentos diferentes, é importante começar a partir do mesmo número de células. - Como as células estão agora prontas para transplante, manter no gelo até a injeção. Coloque uma seringa de insulina tampada de 0,5 mL com uma agulha de 29 G no gelo, para evitar que a solução celular se torne sólida após a aspiração.
- Gire sobre o medidor de vazão para 200 mL/min de oxigênio e o vaporizador isoflurano para 2,5%. Anestesiar um 2 mês-velho macho NOD/SCID mouse, colocando-o dentro da câmara de indução. Aguarde 2 – 3 min até que o mouse apareça adormecido e a reprodução tenha abrandado. Antes de iniciar o procedimento, primeiro confirme através de uma pitada de pé que o mouse está dormindo, em seguida, aplique a pomada vet nos olhos. Raspar o lado direito do animal, aspirar a solução celular na seringa pré-resfriada, e injetá-los subcutaneamente na área raspada. Uma colisão visível a pele irá formar-se se a injeção é realizada corretamente.
Nota: os aloenxertos celulares podem ser realizados na mesma estirpe do rato que as células transplantadas. Por exemplo, se as células do RMS foram originalmente isoladas de um mouse C57BL/6, o aloenxerto pode ser realizado em camundongos C57BL/6. Se a estirpe é diferente, então camundongos receptor imunodeficientes devem ser utilizados para evitar a rejeição. As idades dos ratos destinatários também podem ser ajustadas dependendo do objetivo experimental. - Monitore os camundongos para formação tumoral uma vez por semana.
Nota: para validar a identidade do tumor derivado da transplantação do aloenxerto, deve ser comparado ao tumor original de que as pilhas foram isoladas. Para este fim, a análise histológica para características morfológicas e a expressão de marcadores myogenic assim como um RNAseq mais detalhado pode ser executada.
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Representative Results
Detecção de tumorspheres
O isolamento celular foi otimizado para obter a máxima heterogeneidade das populações celulares presentes no tecido tumoral. Em primeiro lugar, uma vez que os tecidos isolados apresentavam áreas morfologicamente dissimilares, para aumentar as chances de isolar populações de células raras uniformes, a amostragem foi realizada a partir de múltiplas áreas do tumor (Figura 1a, primeiro painel à esquerda). Segundo, a dissociação mecânica das amostras colhidas foi realizada mantendo-se a homogeneidade no tamanho do tecido picado, apesar das diferentes resistências que podem estar presentes nas amostras (Figura 1a, terceiro e quarto painel da esquerda ). Dependendo do material de partida (agressividade tumoral, idade e genótipo do camundongo, localização do tumor), a recuperação das células do estresse mecânico do processo de isolamento pode variar, variando de 3-7 dias (Figura 1a, último painel à direita). Para melhorar a sobrevivência celular e crescimento, a mídia deve ser alterada no dia após o isolamento e, em seguida, a cada 2 dias. Isto removerá os restos e as pilhas inoperantes acumuladas durante o processo da isolação que pôde afetar à viabilidade da pilha. O ensaio de formação de tumorfera deve começar após as células terem sido passadas pelo menos uma vez para garantir a viabilidade ideal quando colocadas em culturas de suspensão (Figura 1b, primeiro painel à esquerda). Em nossas mãos, resultados ótimos foram obtidos a partir das células da passagem 2 (P2) (Figura 1C, primeiro e segundo painel à esquerda). Esta passagem específica foi escolhida após o teste múltiplo. Quando as pilhas P0 foram chapeadas em condições do baixo-acessório, deram forma a um baixo número de tumorspheres comparados às passagens mais atrasadas, possivelmente devido aos restos celulares ainda atuais após a isolação. Em passagens posteriores, diferentes padrões de formação de tumorfera foram observados e atribuídos à seleção que ocorre após inúmeras passagens na cultura. Quando diferentes linhas celulares são comparadas, sugere-se para começar a partir da mesma passagem.
A discriminação entre tumoresferas e aglomerados celulares é de fundamental importância para a quantificação do ensaio. Figura 1C (últimos dois painéis à direita) mostra claramente as diferenças morfológicas entre uma tumorsphere (esquerda) e um aglomerado de células (direita). Tumorspheres derivam de uma única célula que tem uma alta capacidade de autorenovar e crescer em condições de baixo apego (ambos os recursos de TPCs). De fato, o desenvolvimento da tumorfera indica potencial de tumorigenicidade. No entanto, este ensaio é realizado in vitro independentemente das pistas derivadas de todo o organismo; assim, para validar o potencial tumorigênico das células in vivo, devem ser realizados experimentos de transplante de aloenxertos (Figura 1D).
Validação do tratamento de proteínas recombinantes
Antes de estabelecer o tratamento das tumoresferas, a concentração óptima em que a proteína do interesse desencadeia um efeito em pilhas do tumor deve ser determinada. Para tanto, é necessária a avaliação do nível de expressão dos genes alvo a jusante da proteína (Figura 2). Uma pesquisa de literatura no PubMed foi realizada antes de determinar os genes alvo para testar através da qRT-PCR. No caso de a proteína de interesse ter sido mostrada para modular diferentes vias downstream, a seleção de múltiplos genes associados a cada uma dessas vias deve ser realizada. Por exemplo, Flt3l (FMS-como a tirosina quinase 3) foi mostrado para modular a sinalização STAT5 na leucemia Myeloid aguda, induzindo a expressão a jusante de P21, de c-Myc, e de CyclinD1 (Figura 2)27. Além disso, a expressão de Flt3l é necessária para diferenciação das células dendríticas, mediando a ativação da via de sinalização STAT328. Para a avaliação da atividade STAT3, foram verificadas a expressão Socs3 e CyclinD1 (Figura 2). A análise dos resultados mostrou um efeito dependente da dose do tratamento da proteína de recombinação em alguns dos genes testados (P21, CyclinD1, e Socs3), visto que outros não foram afetados (c-Myc). É importante determinar os genes a jusante responsivos à proteína do interesse no tumor específico testado para a avaliação de confiança da eficácia do tratamento.
Otimização do protocolo para transfecção de plasmídeo
Para estabelecer um protocolo eficiente para o transfection do plasmídeo e o ensaio mais adicional da formação do tumorsphere, os efeitos do transfection em pilhas aderentes do tumor foram testados (Figura 3a). O tratamento do reagente do transfection foi executado depois do protocolo do fabricante, e duas quantidades diferentes do reagente foram testadas. A eficiência foi avaliada empregando um plasmídeo do repórter do GFP. Em nossas mãos, observou-se maior eficiência de transfecção com menor quantidade de reagente (Figura 3a). Na verdade, concentrações mais elevadas levam ao aumento da morte celular, a partir de 48 h e tornando-se mais evidente após 72 h do tempo de transfecção. O mesmo protocolo do transfection não era eficiente nas pilhas na suspensão, porque a acumulação de pilhas inoperantes e de restos celulares tornou-se evidente 24 h após o começo do tratamento, indicando a viabilidade celular diminuída. Para superar esse desafio técnico, empregou-se um protocolo de dois passos: realizar transfecção em células aderentes, desanexá-las 24 horas após o tratamento e placas em suspensão por mais 7 dias. As tumoresferas de controle expressaram, de fato, a GFP no final do experimento (Figura 3B).
Figura 1: isolamento da célula tumoral, derivação da tumorfera e transplante. (A) representação esquemática da seção 2 do protocolo (isolamento de células tumorais). Cada etapa chave do protocolo é resumida. (B) representação esquemática da seção 3 do protocolo (derivação tumorferas). Cada etapa chave do protocolo é resumida. (C) da esquerda: imagem de campo brilhante de células tumorais isoladas na passagem 2 (P2) em baixa ampliação (barra de escala = 50 μm) e alta ampliação (barra de escala = 50 μm); imagem do brilhante-campo de um tumorsphere derivado das pilhas do tumor após 30 dias na cultura da suspensão (barra da escala = 250 μm), e imagem do brilhante-campo de um conjunto da pilha dado forma das pilhas do tumor após 30 dias na cultura da suspensão (barra da escala = 50 μm). (D) representação esquemática da seção 6 do protocolo (transplante de aloenxerto de tumorfera). Cada etapa chave do protocolo é resumida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: validação de genes alvo a jusante para determinação da concentração de proteínas recombinantes. resultados de qRT-PCR para a avaliação da concentração do tratamento Flt3l. ANOVA bidirecional foi realizada. A significância é mostrada para a comparação com o controle não tratado. (* p < 0, 5; * * p < 0, 1; * * * p < 0, 1; n = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: configurar o protocolo de transfecção de tumoresferas. (A) imagens de campo luminoso e fluorescente representativas de células tumorais tratadas com baixa (superior) ou alta (inferior) concentração de reagente de transfecção (0,75 μl ou 1,5 μL em 24 placas de poços) (barra de escala = 50 μm). (B) imagem representativa de tumoresferas formadas a partir de células tratadas com PLASMÍDEO GFP, 7 dias após o revestimento das células em suspensão (barra de escala = 50 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos múltiplos foram empregados para a isolação e a caracterização dos TPCs das populações heterogêneas da pilha do tumor: ensaios ensaios do tumor, isolação de FACS, e ensaio da formação do tumorsphere. O ensaio clonogénico do tumor foi descrito primeiramente em 1971, usado para estudos da pilha de haste, e aplicado somente subseqüentemente à biologia do cancer29,30. Este método é baseado na propriedade intrínseca das pilhas de haste do cancro a expandir sem limitações em culturas macias do géis31. Desde o seu desenvolvimento, este método tem sido amplamente utilizado na pesquisa de câncer para múltiplos propósitos, incluindo estudos de heterogeneidade de células tumorais, efeito do tratamento hormonal no crescimento celular e estudos de resistência tumoral31. Até agora, este ensaio é empregado ainda para a identificação de pilhas de início do tumor para tipos múltiplos de cancros32.
A isolação de FACS é baseada no conhecimento prévio dos marcadores moleculars atuais na superfície das pilhas no interesse. Tem sido amplamente utilizado para o isolamento de TPCs de ambos os tumores líquidos e sólidos. Por exemplo, a primeira identificação de células iniciadoras de leucemia mielóide aguda humana (AML) foi realizada pelo grupo do Dr. Dick através da utilização de ensaios de fraccionamento e transplante de FACS com base no conhecimento dos marcadores presentes nas células de AML a granel9. Utilizando uma abordagem semelhante, o grupo do Dr. Clarke isolou o câncer de mama iniciando as células3. O ensaio de formação de tumorfera é uma abordagem diferente utilizada para a identificação e estudo de TPCs. Este método foi desenvolvido primeiramente para identificar pilhas de haste do cancro dos tumores cerebrais33. Curiosamente, foi inicialmente testado usando as mesmas condições conhecidas para favorecer o crescimento das células-tronco neurais, favorecendo assim a propriedade de autorenovação também associada a TPCs33. Além disso, a formação de tumorfera depende da capacidade dos TPCs para o crescimento de forma independente de ancoragem.
As três abordagens descritas acima podem ser utilizadas paralelamente para aumentar a probabilidade de isolar e caracterizar molecularmente as populações de TPCs, superando as limitações de cada método. Por exemplo, FACS, apesar de trazer a grande vantagem de isolar as populações de células puras, depende fortemente do uso de marcadores de superfície que ainda não são conhecidos por todos os tipos de câncer. Assim, seu uso é limitado ao isolamento de TPCs expressando marcadores conhecidos. Os ensaios clonogénicos e da formação do tumorsphere do tumor são baseados em Propriedades celulares, conhecidas para ser associadas com os TPCs. Ambos os métodos podem ser empregados como a primeira linha de estudos em cânceres novos ou ainda não estudados. Além disso, estes dois métodos podem garantir a expansão e enriquecimento da população celular de interesse, facilitando a identificação de marcadores moleculares, e permitindo tanto a resistência ao câncer e estudos de triagem de drogas. Neste contexto, o ensaio de formação de tumorfera é mais vantajoso, uma vez que essas estruturas esferóides recriam melhor o ambiente presente nos tecidos tumorais (áreas hipóxicas no centro das esferas)34. Na verdade, tem sido mostrado anteriormente que as culturas 3D são mais confiáveis para prever os tratamentos medicamentoso resultado34. Tumorspheres pode ser recuperado após a cultura, e usado para experimentos de aloenxerto: digestão de tumorspheres em soluções de células únicas e transplante em camundongos destinatários permitirá in vivo avaliação da capacidade tumorigênica de recém- identificados TPCs, em comparação com células tumorais em massa.
Para obter com sucesso um representante material celular de partida da heterogeneidade do tumor, é crítico executar primeiramente a amostragem aleatória do tecido. Os RMS são caracterizados por áreas fibrotic, gordas, ou altamente vascularized que são distinguíveis claramente em tumores isolados, assim, para manter esta diversidade celular, a coleção de cada área do tecido será exigida. Além disso, para realçar as possibilidades da sobrevivência das pilhas durante o processo da digestão, picar do tecido coletado precisa de conduzir às partes uniformente feitas medida: os fragmentos menores são mais prováveis ser overdiested induzindo a redução da viabilidade das pilhas. Isso pode ser particularmente tedioso devido à diversidade de morfologia e rigidez do RMS.
Para a quantificação do resultado do ensaio de formação de tumorfera, é de fundamental importância distinguir entre tumoresferas reais e aglomerados celulares (Figura 1C, últimos dois painéis à direita). Um tumorsphere é estrutura esferóide contínua em que não é possível discriminar o composiiton da pilha; em contraste, em um cluster de células, as células individuais podem ser facilmente discriminadas. Os clusters de células podem não assumir uma forma arredondada e são significativamente menores quando comparados a tumorspheres, que variam entre 50-250 μm25.
Para alcançar o transplante de tumoresferas, a obtenção de uma solução uniforme de células simples é um passo fundamental. De fato, dada a estrutura apertada e o grande tamanho de uma tumorfera, a digestão das células torna-se um importante passo limitante na preparação de uma única suspensão de células que é ainda mais empregada para transplante. Os ciclos múltiplos da digestão enzimática combinada com a dissociação mecânica são assim necessários para a dissociação completa de tumorspheres. Para confirmar o progresso da dissociação e um resultado bem-sucedido, a solução deve ser monitorada um microscópio de campo brilhante.
Apesar das vantagens múltiplas fornecidas pelo ensaio da formação do tumorsphere, os tumorspheres foram mostrados para não originar de cada tipo de tumor ou de todas as linhas de pilha comercialmente disponíveis. Nestes casos, o ensaio não pode ser empregado como o padrão para determinar o tumorigenicidade da pilha e a quantificação de TPCs dentro de uma população heterogênea. Outra limitação deste ensaio está associada ao fato de que diferentes tipos de tumores requerem diferentes condições de crescimento e dissociação; assim, requer otimização demorada e solução de problemas de ambos os protocolos para cada tipo de tumor ou linha celular. Além disso, a fusão de tumorspheres múltiplas pode ocorrer na cultura, fazendo a avaliação de seus tamanhos e números obscuros.
Apesar do fato de que o ensaio de formação de tumorfera tem sido utilizado anteriormente em estudos de RMS, tem sido aplicado principalmente a linhas celulares RMS comercialmente disponíveis para identificar as vias moleculares envolvidas na formação e desenvolvimento do tumor18, 20,21. Dada a composição heterogênea dos tecidos, os numerosos subtipos de tumores e diversos contextos de desenvolvimento dos quais o RMS se origina, o emprego de linhas celulares RMS limita a aplicação deste ensaio para a identificação de ambas as células de origem e que levam ao desenvolvimento tumoral in vivo.
Uma tentativa de desenvolver um protocolo eficiente para a derivação do tumorsphere, partindo das amostras humanas do sarcoma, mostrou previamente resultados pobres. De fato, as tumoresferas foram desenvolvidas a partir de apenas 10% das amostras35. Assim, há uma necessidade para um ensaio reprodutível e de confiança para a isolação de pilhas preliminares de RMS e de desenvolvimento do tumorsphere. Em resposta a esta necessidade, o ensaio descrito da formação do tumorsphere foi aperfeiçoado para ser empregado em culturas da pilha preliminar. O desenvolvimento deste protocolo é o primeiro passo para responder a questões importantes no campo (ou seja, como as células de origem do RMS diferem dependendo do contexto ambiental). Em mais detalhes, aqui descrito é um protocolo reprodutível para o isolamento de células tumorais primárias de tecidos RMS, formação de tumoresferas, tratamento de tumorfera (ambos realizados com proteínas recombinantes ou plasmímetros de superexpressão), e aloenxerto experimentos de transplante.
Em conclusão, o ensaio de formação de tumorfera é um método bem estabelecido e versátil para a identificação de TPCs em diferentes tipos de tumores, enriquecedora as células com maior capacidade de autorenovação e a capacidade de crescer em um independente de ancoragem Maneira. Este ensaio baseia-se nas características funcionais das populações celulares que estão sendo estudadas e não no conhecimento prévio de marcadores moleculares; assim, ele pode ser aplicado como uma ferramenta exploratória para uma ampla gama de tipos de tumores. Além disso, a isolação de populações raras da pilha conseguidas com culturas do tumorsphere faz este in vitro o ensaio uma plataforma ideal para o teste de droga do cancro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão AG-NS-0843-11 da Fundação médica de Ellison, e pelo Grant piloto de NIH dentro da concessão do apoio do centro do cancer de NCI P30CA030199 a A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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