Summary
Этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции мышей рабдомиосаркомы первичных клеток, формирования опухолевой сферы и лечения, и аллотрансплантата трансплантации, начиная с опухолевых культур.
Abstract
Рабдомиосаркома (RMS) является наиболее распространенной саркомой мягких тканей у детей. Хотя значительные усилия позволили выявить общие мутации, связанные с RMS и позволили дискриминации различных подтипов RMS, основные проблемы по-прежнему существуют для разработки новых методов лечения для дальнейшего улучшения прогноза. Хотя определены выражения миогенных маркеров, по-прежнему значительные споры по поводу того, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, как клетка происхождения по-прежнему плохо понимается. В настоящем исследовании, надежный метод предусмотрен для опухолевого исследования для мыши RMS. Ассеи основан на функциональных свойствах опухолевых клеток и позволяет выявлять редкие популяции в опухоли с опухолевыми функциями. Также описаны процедуры тестирования рекомбинантных белков, интеграция протоколов трансфекции с анализом опухолевой сферы и оценка генов-кандидатов, участвующих в развитии и росте опухоли. Описано далее процедура для аллотрансплантата трансплантации опухолевых сфер в реципиентных мышей для проверки опухолевой функции in vivo. В целом, описанный метод позволяет надежно идентифицировать и тестировать редкие опухолевые популяции RMS, которые могут быть применены к RMS, возникающим в различных контекстах. Наконец, протокол может быть использован в качестве платформы для скрининга лекарственных средств и дальнейшего развития терапии.
Introduction
Рак является неоднородным заболеванием; кроме того, один и тот же тип опухоли может представлять различные генетические мутации у разных пациентов, и в пределах пациента опухоль состоит из нескольких популяций клеток1. Гетерогения представляет собой проблему в выявлении клеток, ответственных за инициацию и распространение рака, но их характеристика имеет важное значение для развития эффективных методов лечения. Понятие опухолевых клеток( размножающихся (TPC), редкая популяция клеток, которые способствуют развитию опухоли, ранее широко рассмотрены2. Несмотря на то, что ТЦ характеризовались несколькими видами рака, выявление маркеров для их надежной изоляции остается проблемой для нескольких типов опухолей3,4,5,6 , 7 (г. , 8 , 9. Таким образом, метод, который не опирается на молекулярные маркеры, а скорее на функциональные свойства TPC (высокое самообновление и способность расти в условиях низкой привязанности), известный как анализ формирования опухолевой сферы, может быть широко применен для идентификация ТЦ от большинства опухолей. Важно отметить, что этот анализ также может быть использован для расширения ТЦ и, таким образом, непосредственно применяется к скринингу рака наркотиков и исследований по устойчивости к раку1,10.
Рабдомиосаркома (RMS) является редкой формой саркомы мягких тканей, наиболее распространенной у маленьких детей11. Althoug RMS может быть гистологически определены путем оценки экспрессии миогенных маркеров, RMS ячейки происхождения не была однозначно характеризуется из-за нескольких подтипов опухоли и высокой неоднородности стимулов развития опухоли. Действительно, недавние исследования вызвали значительную научную дискуссию о том, RMS имеет миогенное или немиогенное происхождение, предполагая, что RMS может вытекать из различных типов клеток в зависимости от контекста12,13, 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17. Многочисленные исследования на линиях клетки RMS были выполнены используя ассецию образования tumorsphere для идентификации путей, участвующих в развитии опухоли и характеристики маркеров, связанных с высоко самообновляющимися популяциями 18 лет , 19 лет , 20 , 21.
Однако, несмотря на потенциал формирования опухолевой сферы для выявления RMS-клеток происхождения, надежный метод, который может быть использован на первичных клетках RMS еще не описан. В этом контексте, недавнее исследование от нашей группы использовали оптимизированные опухолевые формирования исследования для идентификации RMS клеток происхождения в мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) мыши модели22. Несколько типов предопухолевых клеток, изолированных от мышечных тканей, проверяются на их способность расти в условиях низкой привязанности, что позволяет идентифицировать мышечные стволовые клетки как клетки происхождения для RMS в дистрофических контекстах. Описанный здесь воспроизводимый и надежный протокол для оценки формирования опухоли(рисунок 1),который был успешно использован для идентификации крайне редких популяций клеток, которые отвечают за развитие мыши RMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Корпус, лечение и жертвоприношение мышей были выполнены в соответствии с утвержденным протоколом IACUC Института медицинского открытия Сэнфорда Бёрнхема.
1. Подготовка реагента
- Подготовка 100 мл клеточной изоляции средств: F10 среды дополнены 10% лошади сыворотки (HS).
- Приготовьте 50 мл раствора коллагеназа ii типа: растворите 1 г порошка коллагеназа ii типа в 50 мл клеточных изоляционных носителей (обратите внимание на единицы фермента на 1 мл носителя, так как количество единиц меняется в зависимости от лота). Aliquot раствор и хранить в морозильной камере -20 градусов до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лот коллагеназы должны быть проверены перед использованием, так как активность фермента может меняться по разным партиям. - Подготовка 10 мл на образец второго раствора пищеварения: клетки изоляции средств с 100 единиц / мл коллагеназа типа II раствора и 2 единиц /мл диспазы II свежевзвешенный. Приготовьтесь непосредственно перед использованием.
- Подготовка 500 мл опухолевых клеток средств: DMEM с высоким содержанием глюкозы дополнены 20% FBS и 1% перо / стрептококк.
- Подготовка 500 мл буфера FACS: 1x PBS дополнен2,5% v/v нормальной сыворотки коз и 1 мМ EDTA.
- Подготовка 500 мл опухолевых носителей: DMEM/F12 дополнен 1% перо / стрептококк. Непосредственно перед использованием, добавить следующие факторы роста: 1% N2 дополнения, 10 нг /мл EGF, и 10 нг /мл-FGF.
2. Изоляция и культура клеток
- Подготовьте 10-сантиметровую пластину, содержащую 5 мл клеточных изоляционных носителей (одна пластина на образец опухоли) и поместите ее в инкубатор при 37 градусах Цельсия до готовности к сбору опухолевой ткани.
- RMS, как сообщается, спонтанно развиваться в мужских и женских моделей мыши для мышечной дистрофии Дюшенна, таких как B10 mdx мышей в возрасте около 18 месяцев и в B6 mdx/mTR мышей на 9 месяцев22,23. Анестезия мыши, которая развивает сяртовую опухоль RMS с помощью изофруран, и жертвовать животным через вывих шейки матки или в соответствии с руководящими принципами IACUC учреждения. С ножницами, сделать разрез на коже в области, где опухоль локализована, и (с помощью пинцета) вытащить кожу от области интереса. Используя лезвие бритвы, вырезают опухоль от животного.
- Взвесьте 500–1000 мг опухолевой ткани и поместите его в тарелку, подготовленную в шаге 2.1(Рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Большее количество ткани негативно влияет на шаги пищеварения и снижение общей урожайности. Если собранная опухоль больше 1000 мг, разделите ее на части и образец случайным образом, пока не будет достигнут желаемый вес. Случайная выборка необходима для оценки неоднородности тканей. - Поместите пластину, содержащую ткани опухоли, в капюшон культуры стерильных клеток и фарш его лезвием бритвы. Опухолевые ткани из RMS неоднородны; таким образом, различные области могут представлять различное сопротивление сокращениям. Убедитесь, что размеры полученных кусочков фарша являются однородными, чтобы обеспечить оптимальное пищеварение.
ПРИМЕЧАНИЕ: RMS существует как смеси различных типов тканей (в основном фиброзных, васкуляризированных и жировых тканей), которые могут быть определены в каждой опухоли. К 1) изолировать неоднородную популяцию клеток, точно переопределяя состав исходной опухоли и 2) не смещение процедуры изоляции, выполнять случайную выборку собранной ткани. Клетки из различных областей опухоли должны быть усваиваются и тестироваться параллельно in vitro в анализе, описанном в разделе 3. - Переместите измельченные ткани и средства изоляции клеток в центрифугу мощностью 15 мл, вымойте пластину 4 мл клеточных средств и поместите ее в трубку.
- Добавьте 700 единиц/мл раствора коллагеназа, чтобы переварить ткани и инкубировать в трясущейся водяной бане при 37 градусах по Цельсию на 1,5 ч.
- После инкубации, спина вниз ткани на 300 х г в течение 5 мин на RT. Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, resuspend гранулы в 10 мл второго раствора пищеварения (диспаз), и инкубировать в тряске водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
- Как только второе пищеварение завершено, pipet вверх и вниз и пройти подвески клетки через 70 мкм нейлоновый фильтр на 50 мл центрифуги трубки. Затем добавьте 10 мл клеточных средств изоляции, чтобы промыть фильтр и разбавить раствор пищеварения, и вращать вниз ткани на 300 х г и RT в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и resuspend гранулы в 20 мл опухолевых клеток средств. Затем перенесите суспензию клетки в 15-сантиметровую пластину культуры клеток. Поместите клетки в инкубатор на ночь при 37 градусах Цельсия. Эта пластина будет идентифицирована как P0.
- На следующий день после изоляции, изменить средства массовой информации. Этот шаг необходим для обеспечения удаления мусора и мертвых клеток, которые могут негативно повлиять на выживание клеток.
- Оцените слоечность клеток после изменения носителя, которая колеблется от 30%-60% в зависимости от количества исходного материала и размера ячейки. Оставьте клетки, растущие в инкубаторе, пока они не достигнут 90% выпуклости. Мониторинг ячеек каждый день и изменения средств массовой информации каждые 2 дня. Время, необходимое опухолевым клеткам, варьируется в зависимости от нескольких параметров: агрессивность опухоли, генотип опухоли, возраст мыши, неоднородность ткани.
- Для пропуска ячеек сделайте следующее:
- Предварительно разогреть раствор отслоения клеток и опухолевые клетки, которые мультики в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки с 1x стерильной PBS и инкубировать их при 37 кв С в 10 мл теплого раствора отслоения клеток в течение 5-10 мин.
- Когда все клетки отделяются от пластины, добавьте 10 мл теплых опухолевых клеток, переместите раствор в 50 мл центрифуги и спираль клетки вниз при 300 х г в течение 5 мин на РТ.
- Resuspend клетки в 5-10 мл опухолевых клеток средств массовой информации, в зависимости от размера гранул, и рассчитывать живые клетки с помощью Трипан синий (1:5 разбавления), чтобы исключить мертвых клеток.
- Плита 105 клеток в 10 см пластин или 3 х 105 клеток в 15 см пластин. Время удвоения клеток варьируется в зависимости от факторов, описанных в шаге 2.10.
3. Произвобливание опухолевой сферы
- Используйте опухолевые клетки при прохождении P1 или P2, чтобы избежать выбора клеток через несколько проходов(рисунок 1B). Чтобы отделить клетки от тарелки, сначала вымойте блюдо 1x PBS, не нарушая клетки, затем накройте их с помощью раствора отслоения клеток (5 мл для 10 см пластины или 10 мл для 15 см пластины) и поместите их в инкубатор в течение 5-10 мин.
- Подтвердите, что клетки отделяются, глядя на пластину под ярким полем микроскопа, добавить 1:1 объем опухолевых клеток средств (решение клеточного отслоения: опухолевые клетки сми), место клеточной подвески в центрифуге трубки и спина клеток вниз на 300 х г в течение 5 Мин на RT.
- Resuspend клетки в буфере FACS (раздел 3.4) или tumorspheres media (раздел 3.5), в соответствии с методом, используемым для покрытия.
- Покрытие клеток через цитометр потока
- Resuspend ячеек в буфере FACS (сумма зависит от размера гранул) и вручную подсчитываете живые ячейки с помощью синего исключения Trypan. Убедитесь, что конечная концентрация клеток составляет 107 ячеек/мл (100 л буфера FACS на 106 ячеек). Добавьте 1 Зл фиолетового пятна fx Cycle на 106 клеток, чтобы различать живые клетки из мертвых клеток во время сортировки клеток. Подготовьте неокрашенный контроль, в котором фиолетовое пятно Fx Cycle не добавляется в клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация оптимизирована для эффективного окрашивания и скорости во время сортировки. Более низкая концентрация клеток приведет к более длительному времени сортировки, в то время как более высокая концентрация повлияет на окрашивание. - Используя неокрашенный контроль, установите ворота FACS, отделяющиеся живыми (Fx Cycle Violet- )из мертвых (Fx Cycle Violet)ячеек. Затем используйте флуоресцентную сортировку клеток (с пропуском фильтра 450/50) для разделения и подсчета живых/мертвых клеток и для покрытия нужного количества живых клеток в каждой скважине из 96 хорошо вложенных пластин. Каждый колодец пластины должен быть заполнен 200 Л опухолевых носителей перед началом сортировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что TPCs являются редкой субпопуляции в пределах всей опухоли, оптимизировать протокол путем покрытия 100 клеток / хорошо от мыши RMS наблюдать образование опухолевых сфер в культуре подвески. Номер клетки на скважину должен быть скорректирован для конкретной опухоли испытания. - Поместите клетки в инкубатор до конца эксперимента. Старайтесь не беспокоить пластины, если это необходимо. Для 30-дневного эксперимента каждая скважина должна пополняться средствами массовой информации и соответствующей долей факторов роста каждую неделю (медиа, как правило, испаряются, а факторы роста не эффективны через 1 неделю).
- После завершения эксперимента вручную экранируют пластины под ярким полевым микроскопом для выявления опухолевых сфер (см. шаг 3.6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время 30 дней был оптимизирован, чтобы легко обнаружить мышь RMS опухолей размеров, начиная от 50-300 мкм диаметра. Временная точка должна быть скорректирована в зависимости от агрессивности протестированной опухоли и ее пролиферативной скорости.
- Resuspend ячеек в буфере FACS (сумма зависит от размера гранул) и вручную подсчитываете живые ячейки с помощью синего исключения Trypan. Убедитесь, что конечная концентрация клеток составляет 107 ячеек/мл (100 л буфера FACS на 106 ячеек). Добавьте 1 Зл фиолетового пятна fx Cycle на 106 клеток, чтобы различать живые клетки из мертвых клеток во время сортировки клеток. Подготовьте неокрашенный контроль, в котором фиолетовое пятно Fx Cycle не добавляется в клетки.
- Покрытие ячеек вручную
- Resuspend клетки в опухолевой среде (количество зависит от гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью трипан синий (1:10 разбавления). Рассчитайте концентрацию клеток в трубке и пластины надлежащее количество клеток в 96 хорошо низкой пластины крепления. Поместите клетки в инкубатор до конца эксперимента. Старайтесь не беспокоить пластину, если это необходимо для пополнения средств массовой информации и факторов роста, как описано в шаге 3.4.3.
- После завершения эксперимента, экран пластин ы вручную под ярким полем микроскоп для выявления опухолевых сфер или с помощью программного обеспечения Celigo, как ранее описано в Kessel et al.24 См. Шаг 3.6 ниже.
- Обратите внимание, что в результате этого исследования можно оценить два отдельных считывания: количество и размер сформированных опухолей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда более чем одна клетка покрыта в колодце, либо опухоли или клеточные кластеры могут образовываться(рисунок 1C,третья и четвертая панели). Клеточные кластеры представляют собой небольшие клеточные агрегаты, которые образуюткультуру подвески, которые повышают выживаемость клеток и характеризуются неправильной формой. Опухоли большие и имеют более компактную структуру с сфероидной формой. Они происходят из одной клетки, которая имеет возможность выжить в якорной независимой манере и размножаться с высокой скоростью25. Покрытие клеток через цитометр потока или вручную может быть использовано взаимозаменяемо, в зависимости от возможностей, имеющихся в лаборатории. Кроме того, использование низкоприкреплящих пластин размером, отличающихся от 96 пластин скважин, возможно и зависит от требуемого результата. Действительно, оценка частоты опухолевой сферы должна быть сделана с использованием 96 хорошо низких пластин крепления, в то время как первоначальный скрининг для оценки опухолевого потенциала клеток даст более быстрые и надежные результаты на 6 хорошо низкоприкосновенных пластин.
4. Лечение опухолевой сферы рекомбинантными белками
- Повторите шаги 3.1 и 3.2.
- При настройке лечения рекомбинантными белками сначала определите наилучшую концентрацию для использования следующего раздела 4.3, или если оптимальная концентрация была ранее определена, перейдите в раздел 4.4.
- Определите концентрацию рекомбинантного белка.
- Resuspend клетки в опухолевой среде (объем зависит от размера гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью Trypan синий исключение. Рассчитайте концентрацию клеток в трубке и пластине 100 000 клеток в 6 хорошо низкой пластине крепления. Плита две скважины на каждую проверенную концентрацию и две скважины для необработанного управления(рисунок 2). Концентрации протеина, которые будут проверены, основаны на поиске литературы.
- Лечить каждый колодец клеток подвески с различной концентрацией белка и поместить клетки в инкубатор в течение 48 ч (время, необходимое, чтобы иметь возможность оценить влияние лечения как на жизнеспособность клеток и на выражение вниз по течению целевых генов). Затем оцените следующие параметры:
- Выживание клеток: использование ярко-полевого микроскопа, а также сравнение с необработанным управлением, проверка морфологии клеток. Здоровые клетки появляются яркие и отражающие под микроскопом, в то время как чрезмерная гибель клеток вызовет накопление мусора в средствах массовой информации. Для количественного определения смерти клеток, Трипан синий исключение, кристаллно-фиолетовый окрашивания, MTT, или TUNEL асссс может быть использован (в этом случае, добавить один хорошо к первоначальному покрытию).
- Влияние рекомбинантных белков на пути вниз по течению: выполнить поиск литературы с помощью PubMed для идентификации нисходящего генов, как известно, пострадавших от испытания белка. Дизайн qRT-PCR праймеры для целевых генов, и выполнить qRT-PCR анализ на РНК изолированы от обработанных клеток(Рисунок 2).
- Лечить с рекомбинантным белком.
- Resuspend клетки в опухолевой среде (объем зависит от размера гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью Trypan синий исключение. Определите общее количество клеток, необходимых для желаемого эксперимента (100 клеток на каждую скважину из 96 хорошо низкой пластины крепления) и разбавьте их в соответствующем томе мультимедиа опухоли. При выполнении более одного лечения, подготовить отдельные клеточные трубки.
- Лечить каждую трубку с соответствующей концентрацией рекомбинантного белка и пластины клетки в отдельном колодце 96 хорошо низкой пластины. Лечение будет повторяться на каждом колодце в зависимости от периодов полураспада рекомбинантного белка до 30-дневной конечной точки эксперимента.
- В конце эксперимента выполните шаги 3.4.4 и 3.6 для анализа данных.
5. Лечение опухолевой сферы с помощью плазмидов переэкспрессии
- Повторите шаги 3.1 и 3.2.
- Если настройка лечения на новый тип опухоли, сначала определить лучшую концентрацию плазмида для использования следующих раздел 5.3, или если оптимальная концентрация ДНК была ранее определена, перейти к разделу 5.4.
- Определить оптимальную концентрацию плазмида.
- Resuspend клетки в средствах клетки тумора (объем зависит на размере гранул) и вручную подсчитывают живые клетки используя исключение Trypan голубое. Плита подсчитанных клеток для достижения спущения от 70%-90% (число клеток сильно зависит в размере клеток и морфологии). GFP-плазмид будет использоваться для проверки эффективности трансфекции после протокола производителя трансфекционного реагента для клеток адептов. Параллельно, также проверить необработанный контроль(Рисунок 3A). Выполните тест эффективности в 24 хорошо пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженные клетки используются для повышения эффективности трансфекции, так как трансфекция, выполняемая на клетках подвески, не эффективна и негативно влияет на жизнеспособность клеток. - 48 ч после трансфекции оценить клетки по следующим параметрам:
- Выживание клеток: с помощью ярко-поляного микроскопа, сравните количество клеток, присутствующих в каждом колодце, и сравните его с необработанными клетками.
- Выражение GFP: подсчитайте процент ячеек, которые являются Положительными GFP по сравнению с общим числом ячеек в каждой скважине(рисунок 3B).
- Resuspend клетки в средствах клетки тумора (объем зависит на размере гранул) и вручную подсчитывают живые клетки используя исключение Trypan голубое. Плита подсчитанных клеток для достижения спущения от 70%-90% (число клеток сильно зависит в размере клеток и морфологии). GFP-плазмид будет использоваться для проверки эффективности трансфекции после протокола производителя трансфекционного реагента для клеток адептов. Параллельно, также проверить необработанный контроль(Рисунок 3A). Выполните тест эффективности в 24 хорошо пластины.
- Чрезмерное плазмида лечение
- Resuspend клетки в носителях опухолевых клеток (объем зависит от размера гранул) и вручную рассчитывать живые клетки с помощью Трипан синий исключение. Плита 200,000 клеток на скважину из 6 хорошо пластины. Каждая скважина будет использоваться для независимого трансфекционного мероприятия. Каждая скважина будет трансфицироваться с помощью настройки, разработанной для конкретного типа опухоли(рисунок 3A).
- 24 ч после трансфекции, мыть каждый хорошо с 1x PBS и инкубировать клетки в теплом растворе отслоения клеток (достаточно, чтобы покрыть хорошо). Поместите пластину в инкубатор на 37 градусов по Цельсию в течение 5-10 мин, в зависимости от факторов, описанных в разделе 2.15.
- Когда клетки отделены, подсчитайте клетки, полученные из каждого колодца, независимо, используя исключение Trypan blue. Поместите 100 000 клеток на скважину из 6 хорошо низкой пластины крепления, убедившись, что не смешивать клетки, полученные из различных скважин. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах Цельсия и оставьте спокойно в течение недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность этого асссея составляет 7 дней, достаточное время, чтобы образование опухоли, предотвращая слияние опухолевой сферы. Слияние опухолей является явлением, которое становится очевидным, когда 100000 или более клеток покрывают вместе в подвеске в течение 1 недели, что может смещения оценки способности формирования опухоли. В случае, если эксперимент требует более длительного времени инкубации, плотность клеток должна быть скорректирована или полимерные леса, используемые, чтобы избежать слияния опухоли26. - В конце эксперимента выполните шаги 3.5.2 и 3.6 для анализа данных.
6. Подготовка опухолевой сферы для трансплантации аллотрансплантата
- Поместите на лед внеклеточный матричные (ECM) растворы (50 л на аллотрансплантат) и соцдем опухолевых клеток (50 л л. на аллотрансплантат).
- Опухоли могут быть использованы для аллотрансплантата трансплантации. Соберите все опухоли, полученные из определенного типа клеток или лечения в трубку 15 мл или 50 мл (в зависимости от общего объема носителей)(рисунок 1D). Спин опухоли вниз на 300 х г в течение 5 мин на RT. Удалить супернатант над tumorspheres и мыть их с 10 мл стерильных 1x PBS.
- Спин опухоли вниз снова на 300 х г в течение 5 минут на RT, аспирировать 1x PBS, и добавить 500 КЛ до 1 мл раствора клеточного отслоения в верхней части клеточной гранулы, которая начинает процесс диссоциации. Инкубировать опухоли в пищеварительном растворе в тряску водяной бане при 37 градусах Цельсия и проверять прогрессирование пищеварения каждые 10 минут. Чтобы помочь опухолевых сфер диссоциации в одноклеточный раствор, pipette клеток вверх и вниз для механических нарушений. Процесс пищеварения может занять до 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что время инкубации значительно варьируется, когда опухоли являются производными от различных первичных клеток RMS, значительное снижение жизнеспособности клеток в связи со временем пищеварения никогда не наблюдалось. - Когда одноклеточный раствор получен, добавить объем опухолевых клеток средств (1:1, решение отслоения клеток: опухолевые клетки сми) и спина его вниз на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого времени, все шаги должны быть выполнены на льду. После вращения, опухоли не образуют стабильный гранулы, как одноклеточные решения делать. Чтобы не выбить и не выбить опухолевые сферы, используйте 1 мл пипетку и аккуратно аспирируйте жидкость. Перейдите к пипетке с 200 л, когда остается только 1 мл. - Resuspend клетки в холодных опухолевых клеток средств (объем будет зависеть от размера гранул), место клетки на льду и рассчитывать живые клетки с помощью Trypan синий исключение. После определения надлежащего количества клеток для использования для аллотрансплантата, resuspend их в общей сумме 50 зл холодных опухолевых клеток средств. Охладите кончик пипетки в холодных опухолевых клетках. Когда кончик холодный, используйте его, чтобы взять 50 зл eCM раствора и добавить его в трубку, содержащую клетки. Во время этого процесса не снимайте трубки со льда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток, которые можно использовать для трансплантации, должно определяться в соответствии с проверенной опухолью и экспериментальной целью: большее количество пересаженных клеток уменьшит время развития опухоли (20 000 клеток из опухолевых опухолей мыши RMS перерастают в опухоль через 6 недель после инъекции). Чтобы иметь возможность сравнить различные клеточные линии или различные методы лечения, важно начать с того же количества клеток. - Поскольку клетки теперь готовы к трансплантации, поддерживать на льду до инъекции. Поместите ограниченный 0,5 мл инсулина шприц с 29 G иглы на льду, чтобы предотвратить клеточный раствор становится твердым при устремлении.
- Включите поток опрокидный прибор до 200 мл/мин кислорода и изофлуранового испарителя до 2,5%. Анестезия 2-месячный мужчина NOD / SCID мыши, поместив его в индукционной камере. Подождите 2–3 мин, пока мышь не заснет и разведение не замедлится. Перед началом процедуры, сначала подтвердить через ногу щепотку, что мышь спит, а затем применить ветеринар мазь на глазах. Бритье правой стороне животного, аспирировать клеточный раствор в предварительно охлажденном шприц, и вводить их подкожно в бритую область. Видимый удар под кожей будет образовываться, если инъекция выполняется правильно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые аллотрансплантаты могут быть выполнены в том же штамммыши, что и пересаженные клетки. Например, если клетки RMS были первоначально изолированы от мыши C57BL/6, аллотрансплантат может быть выполнен у мышей C57BL/6. Если штамм отличается, то иммунодефицитных мышей-реципиентов должны быть использованы, чтобы избежать отторжения. Возраст мышей-реципиентов также может быть скорректирован в зависимости от экспериментальной цели. - Мониторинг мышей для формирования опухоли один раз в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки идентичности опухоли, полученной от аллотрансплантата трансплантации, следует сравнить с оригинальной опухоли, из которой клетки были изолированы. С этой целью может быть проведен гистологический анализ морфологических особенностей и экспрессии миогенных маркеров, а также более полный РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обнаружение опухолевых сфер
Клеточная изоляция была оптимизирована для получения максимальной неоднородности клеточных популяций, присутствующих в опухолевой ткани. Во-первых, так как изолированные ткани представлены морфологически непохожих областей, для повышения шансов изоляции равномерной редких клеточных популяций, выборка была проведена из нескольких областей опухоли(Рисунок 1A, первая панель слева). Во-вторых, механическая диссоциация собранных образцов была проведена при сохранении однородности в размере измельченной ткани, несмотря на различные сопротивления, которые, возможно, присутствовали на образцах(Рисунок 1A, третья и четвертая панель слева ). В зависимости от исходного материала (агрессивность опухоли, возраст и генотип мыши, расположение опухоли), восстановление клеток от механического напряжения процесса изоляции может варьироваться, начиная от 3-7 дней(рисунок 1A, последняя панель справа). Для повышения выживаемости и роста клеток, средства массовой информации должны быть изменены на следующий день после изоляции, а затем каждые 2 дня. Это позволит удалить мусор и мертвые клетки, накопленные в процессе изоляции, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток. Обработка образования tumorsphere должна начать после того как клетки проходили хотя бы раз для того чтобы обеспечить оптимальную жизнеспособность помещено в культурах подвески(Рисунок 1B, первая панель на левой стороне). В наших руках были получены оптимальные результаты, начиная с ячеек из прохода 2 (P2)(рисунок 1С, перваяи вторая панель слева). Этот конкретный отрывок был выбран после нескольких испытаний. Когда p0 клетки были покрыны в условиях low-attachment, они сформировали низкое число tumorspheres сравненных к более поздним проходам, по возможности из-за клетчатых твердых частиц все еще присутствуют после изоляции. В более поздних пассажах наблюдались различные модели формирования опухолевой сферы, приписываемые отбору, который происходит после многочисленных проходов в культуре. При сравнении различных клеточных линий предлагается начинать с одного и того же прохода.
Дискриминация между опухолевыми и клеточными кластерами имеет основополагающее значение для количественной оценки асссе. Рисунок 1С (последние две панели справа) ясно показывает морфологические различия между опухолевой сферы (слева) и клеточного кластера (справа). Опухоли происходят из одной клетки, которая обладает высокой способностью к самообновлению и растет в условиях низкой привязанности (обе особенности ТЦ). Действительно, развитие опухолевой сферы указывает на потенциал опухолевости. Тем не менее, этот анализ проводится в пробирке независимо от сигналов, полученных от всего организма; таким образом, для проверки опухолевого потенциала клеток in vivo,аллотрансплантатов трансплантации эксперименты должны быть выполнены(Рисунок 1D).
Проверка лечения рекомбинантных белков
Перед созданием лечения опухолевых сфер следует определить оптимальную концентрацию, при которой интересующий белок вызывает влияние на опухолевые клетки. Для этого необходима оценка уровня экспрессии нисходящего целевого гена белка(рисунок 2). Поиск литературы на PubMed был выполнен до определения целевых генов для тестирования через qRT-PCR. В случае, если было показано, что интересуемый белок модулирует различные пути вниз по течению, следует провести отбор нескольких генов, связанных с каждым из этих путей. Например, Flt3l (Fms-как тирозина киназы 3) было показано, модулировать STAT5 сигнализации в острой миелоидной лейкемии, вызывая вниз по течению выражение p21, c-Myc, и CyclinD1 (Рисунок 2)27. Кроме того, экспрессия Flt3l требуется для дифференциации дендритных клеток, посредничающих активации сигнального пути STAT328. Для оценки активности STAT3 были проверены экспрессия Socs3 и CyclinD1(рисунок 2). Анализ результатов показал, что зависимость дозы от лечения рекомбинантным белком на некоторые из проверенных генов (p21, CyclinD1 и Socs3) не была затронута (c-Myc). Важно определить нюпопопом гены, реагирующие на интерес к белку к специфической опухоли, проверенной для надежной оценки эффективности лечения.
Оптимизация протокола для плазмидной трансфекции
Для создания эффективного протокола для плазмидной трансфекции и дальнейшего изучения формирования опухолей были протестированы эффекты трансфекции на опухолевые клетки адептов(рисунок 3A). Обработка реагентами трансфекционного реагента была проведена по протоколу производителя, и были протестированы два разных количества реагента. Эффективность была оценена с использованием GFP репортер плазмид. В наших руках мы наблюдали более высокую эффективность трансфекции с использованием более низкого количества реагента(рисунок 3A). Действительно, более высокие концентрации приводят к увеличению клеточной смерти, начиная с 48 ч и становясь более очевидными после 72 ч со времени трансфекции. Тот же протокол трансфекции не был эффективен в клетках в суспензии, так как накопление мертвых клеток и клеточного мусора стало очевидным 24 ч после начала лечения, что свидетельствует о снижении жизнеспособности клеток. Для преодоления этой технической проблемы был использован протокол на два этапа: выполнить трансфекцию на клетках адептов, отсоединить их на 24 ч после лечения и навесить еще на 7 дней. Контроль опухолей действительно выражали GFP в конце эксперимента(рисунок 3B).
Рисунок 1: Изоляция опухолевых клеток, произвобление опухолевой сферы и трансплантация. (A) Схематическое представление раздела 2 протокола (изоляция опухолевых клеток). Обобщен каждый ключевой этап протокола. (B) Схематическое представление раздела 3 протокола (производные опухолевые сферы). Обобщен каждый ключевой этап протокола. (C) Слева направо: ярко-полевое изображение изолированных опухолевых клеток при прохождении 2 (P2) при низком увеличении (шкала бар 50 мкм) и высоком увеличении (шкала бар 50 мкм); ярко-поле изображение опухолевой сферы, полученных из опухолевых клеток после 30 дней в культуре подвески (шкала бар 250 мкм), и ярко-поле изображение клеточного кластера формируется из опухолевых клеток после 30 дней в культуре подвески (шкала бар 50 мкм). (D) Схематическое представление раздела 6 протокола (трансплантация аллотрансплантата опухоли). Обобщен каждый ключевой этап протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Проверка низных генов-мишеней для определения концентрации рекомбинантного белка. результаты qRT-PCR для оценки концентрации лечения Flt3l. Была выполнена двусторонняя ANOVA. Значение показано для сравнения с необработанным контролем. (Пч злт; 0,05; зп злт; 0,01; злиц юнт; 0,001; н 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Настройка протокола трансфекции опухолей. (A) Представитель ярко-поля и флуоресцентные изображения опухолевых клеток, обработанных с низкой (вверх) или высокой (снизу) концентрации трансфекционного реагента (0,75 л или 1,5 л в 24 хорошо пластин) (шкала бар 50 мкм). (B) Репрезентативное изображение опухолевых сфер, образованных из плазмидных клеток GFP, через 7 дней после покрытия клеток в подвеске (шкала бар 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для изоляции и характеристики ТЦ из опухолевых неоднородных клеточных популяций применялись многочисленные методы: клоногенные анализы опухолей, изоляция FACS и анализ формирования опухолевой сферы. Клоногенный ассеия опухоли была впервые описана в 1971 году, используется для исследования стволовых клеток, и только впоследствии применяется к биологии рака29,30. Этот метод основан на раковых стволовых клеток внутреннее свойство расширить без ограничений в мягких гелей культур31. С момента своего развития, этот метод был широко использован в исследованиях рака для различных целей, в том числе исследования неоднородности опухолевых клеток, влияние гормонального лечения на рост клеток, и исследования устойчивости к опухолевостью31. На сегодняшний день, этот ассс по-прежнему используется для выявления опухолевых клеток, инициирующих для нескольких типов рака32.
Изоляция FACS основана на предварительных знаниях молекулярных маркеров, присутствующих на поверхности клеток на интерес. Он был широко использован для изоляции ТЦ от как жидких, так и твердых опухолей. Например, первое выявление человека острый миелоидный лейкоз (AML) инициирующих клеток была выполнена группой д-р Дик путем использования FACS фракционные и трансплантации анализы на основе знаний маркеров, присутствующих на массовых клеток AML9. Используя аналогичный подход, группа доктора Кларка изолированных рака молочной железы инициирующих клеток3. Исследование формирования опухолей – это другой подход, используемый для идентификации и изучения ТЦ. Этот метод был впервые разработан для выявления раковых стволовых клеток из опухолей головного мозга33. Интересно, что он был первоначально протестирован с использованием тех же условий, как известно, в пользу роста нервных стволовых клеток, тем самым в пользу самообновления собственности также связаны с TPCs33. Кроме того, образование опухолевой сферы зависит от способности ТЦ к росту на якорной основе независимым образом.
Три описанных выше подхода могут быть использованы параллельно для повышения вероятности изоляции и молекулярной характеристики популяций ТЦ, преодолевая ограничения каждого метода. Например, FACS, несмотря на большое преимущество изоляции популяций чистых клеток, сильно полагается на использование поверхностных маркеров, которые еще не известны для всех типов рака. Таким образом, его использование ограничивается изоляцией ТЦ, выражающих известные маркеры. Опухолевые клоногенные и опухолевые анализы образования основаны на клеточных свойствах, которые, как известно, связаны с ТПК. Оба эти метода могут быть использованы в качестве первой линии исследований на новых или еще не изученных раковых заболеваний. Кроме того, эти два метода могут обеспечить расширение и обогащение группы клеток, представляющих интерес, способствуя идентификации молекулярных маркеров и позволяя проводить исследования как устойчивости к раку, так и исследования по скринингу на наркотики. В этом контексте, опухолевое образование асссе является более выгодным, так как эти сфероидные структуры лучше воссоздать окружающую среду, присутствуюую в опухолевых тканях (гипоксических областях в центре сфер)34. Действительно, ранее было показано, что 3D культуры являются более надежными для прогнозирования результатов лечения наркомании34. Опухоли могут быть восстановлены после культуры, и используется для аллотрансплантатэкспериментов: переваривание опухолевых сфер в одноклеточные растворы и трансплантации в реципиентных мышей позволит in vivo оценки опухолевой способности вновь идентифицированных ТЦ, по сравнению с объемными опухолевыми клетками.
Для успешного получения исходного клеточного материала, репрезентативного неоднородности опухоли, очень важно сначала выполнить случайную выборку ткани. RMS характеризуются фиброзными, жирными или высоко васкуляризированными областями, которые четко различимы в изолированных опухолях, таким образом, для поддержания этого клеточного разнообразия потребуется сбор каждой области ткани. Кроме того, для повышения шансов на выживание клеток в процессе пищеварения, измельчение собранной ткани должно привести к равномерного размера частей: меньшие фрагменты, скорее всего, будет переваривать вызывая снижение жизнеспособности клеток. Это может быть особенно утомительно из-за разнообразной морфологии и жесткости RMS.
Для количественной оценки результата оценки формирования опухоли крайне важно различать реальные опухолевые сферы и клеточные кластеры(рисунок 1С,последние две панели справа). Опухолевая сфера представляет собой твердую сфероидную структуру, в которой невозможно различать клеточной композиции; в отличие от этого, в клеточном кластере, одиночные ячейки могут быть легко дискриминированы. Клеточные кластеры не могут принимать округлую форму и значительно меньше по сравнению с опухолями, которые варьируются от 50-250 мкм25.
Для достижения трансплантации опухолевых сфер, получение единообразного раствора одиночных клеток является ключевым шагом. Действительно, учитывая плотную структуру и большой размер опухолевой сферы, переваривание клеток становится важным ограничивающим шагом в подготовке одноклеточной подвески, которая в дальнейшем используется для трансплантации. Таким образом, для полной диссоциации опухолевых сфер необходимы многочисленные циклы ферментативного пищеварения в сочетании с механической диссоциацией. Чтобы подтвердить прогресс диссоциации и успешный результат, решение должно контролироваться под ярким полем микроскопа.
Несмотря на многочисленные преимущества, предоставляемые опухолевой сферы формирования ассеи, tumorspheres были показаны не происходят от каждого типа опухоли или из всех коммерчески доступных клеточных линий. В этих случаях, асссможно не может быть использован в качестве стандарта для определения опухоли клеток и количественной оценки ТЦ в неоднородной популяции. Еще одно ограничение этого ассеа связано с тем, что различные типы опухолей требуют различных условий выращивания и диссоциации; таким образом, это требует многовремени оптимизации и устранения неполадок обоих протоколов для каждого типа опухоли или клеточной линии. Кроме того, слияние множественных опухолей может произойти в культуре, что делает оценку их размеров и чисел неясной.
Несмотря на то, что анализ формирования опухолевой сферы был ранее использован в исследованиях RMS, он был в основном применяется к коммерчески доступным линиям клеток RMS для выявления молекулярных путей, участвующих в образовании опухоли и развитии18, 20,21. Учитывая неоднородный состав тканей, многочисленные подтипы опухолей и различные контексты развития, из которых происходит RMS, занятость линий клеток RMS ограничивает применение этого анализа для идентификации обеих клеток происхождения и сигналы развития, которые приводят к развитию опухоли in vivo.
Попытка разработать эффективный протокол для производной опухолевой сферы, начиная с образцов саркомы человека, ранее показала плохие результаты. Действительно, опухоли были разработаны только из 10% образцов35. Таким образом, необходимо проделать воспроизводимый и надежный асссе для изоляции первичных клеток RMS и развития опухолевой сферы. В ответ на эту потребность, описанное образование опухоли было оптимизировано для работы в первичных культурах клеток. Разработка этого протокола является первым шагом на пути к ответу на основные вопросы в этой области (т.е. как rmS клетки происхождения отличаются в зависимости от экологического контекста). Более подробно описан отомлен протокол для изоляции первичных опухолевых клеток от тканей RMS, образования опухолевых сфер, лечения опухолевой сферы (оба выполняются с рекомбинантными белками или плазмидой переэкспрессии) и аллографата эксперименты по трансплантации.
В заключение, проверка формирования опухолевой сферы является устоявшимся и универсальным методом идентификации ТПК у различных типов опухолей, обогащая клетки повышенной способностью к самообновлению и способностью расти в якорной стоянке-независимой Образом. Этот анализ основан на функциональных характеристиках исследуемых популяций клеток, а не на предыдущих знаниях молекулярных маркеров; таким образом, он может быть применен в качестве исследовательского инструмента для широкого круга типов опухолей. Кроме того, изоляция редких клеточных популяций, достигнутых с культурами опухолевой сферы, делает этот анализ in vitro идеальной платформой для тестирования на наркотики от рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Эллисон Медицинский фонд грант AG-NS-0843-11, и NIH Пилот грант в рамках NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199 в А.С.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
