Summary
Denne protokollen beskriver en reproduserbar metode for isolering av mus rhabdomyosarcoma primære celler, tumorsphere dannelse og behandling, og allograft transplantasjon fra tumorspheres kulturer.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) er den vanligste bløtvevet sarkom hos barn. Selv om betydelig innsats har aktivert identifisering av vanlige mutasjoner knyttet til RMS og tillot diskriminering av ulike RMS undergrupper, store utfordringer fortsatt eksisterer for utvikling av romanen behandlinger for å ytterligere forbedre prognosen. Selv identifisert av uttrykk for myogenic markører, er det fortsatt betydelig uenighet om RMS har myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, som cellen av opprinnelse er fortsatt dårlig forstått. I denne studien, en pålitelig metode er gitt for tumorsphere analysen for mus RMS. Analysen er basert på funksjonelle egenskaper av tumorceller og tillater identifisering av sjeldne populasjoner i tumor med tumorigene funksjoner. Også beskrevet er prosedyrer for å teste rekombinant proteiner, integrere transfeksjoner protokoller med tumorsphere analysen, og evaluere kandidat gener involvert i tumor utvikling og vekst. Beskrevet videre er en prosedyre for allograft transplantasjon av tumorspheres i mottaker mus for å validere tumorigene funksjon in vivo. Samlet, den beskrevne metoden gir pålitelig identifisering og testing av sjeldne RMS tumorigene populasjoner som kan brukes til RMS som oppstår i ulike sammenhenger. Endelig kan protokollen benyttes som en plattform for narkotika screening og fremtidig utvikling av legemiddel.
Introduction
Kreft er en heterogen sykdom; Videre kan samme type svulst presentere ulike genetiske mutasjoner i ulike pasienter, og innenfor en pasient en svulst er sammensatt av flere populasjoner av celler1. Heterogenitet presenterer en utfordring i identifisering av celler ansvarlig for initiering og spre kreft, men deres karakterisering er avgjørende for utviklingen av effektive behandlinger. Oppfatningen av tumor spre celler (TPC), en sjelden befolkning av celler som bidrar til tumor utvikling, har vært tidligere grundig gjennomgått2. Til tross for det faktum at TPCs har vært preget i flere typer kreft, er identifisering av markører for deres pålitelig isolasjon en utfordring for flere tumor typer3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9. således, en metode som ikke er avhengig av molekylære markører, men heller på TPC funksjonelle egenskaper (høy selv-fornyelse og evnen til å vokse i lav-vedlegg forhold), kjent som tumorsphere formasjon analysen, kan bli mye brukt for identifisering av TPCs fra de fleste svulster. Viktigere, kan denne analysen også være ansatt for utvidelse av TPCs og dermed direkte brukt til kreft narkotika screening og studier på kreft resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en sjelden form for bløtvev sarkom mest vanlig i små barn11. Promodell RMS kan histologisk identifisert gjennom vurdering av uttrykk for myogenic markører, RMS-cellen av opprinnelse har ikke blitt univocally preget på grunn av flere tumor undergrupper og høy heterogenitet av tumor utviklingsmessige stimuli. Faktisk har nyere studier generert betydelige vitenskapelige diskusjonen om RMS er av myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, noe som tyder på at RMS kan utledes fra ulike celler typer avhengig av sammenhengen12,13, 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17. Tallrike studier på RMS cellelinjer har blitt utført ansette tumorsphere formasjon analysen for identifisering av trasé involvert i tumor utvikling og karakterisering av markører forbundet med svært selv-fornyelse populasjoner 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21i denne.
Men til tross for tumorsphere dannelse analysen potensial for å identifisere RMS celler opprinnelse, en pålitelig metode som kan brukes på primære RMS celler har ennå ikke blitt beskrevet. I denne sammenheng, en fersk studie fra vår gruppe ansatt en optimalisert tumorsphere formasjon analysen for identifisering av RMS-cellene opprinnelse i en Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) mus modell22. Flere pre-tumorigene celletyper, isolert fra muskel vev, er testet for deres evne til å vokse i lav-vedlegg forhold, slik at identifisering av muskel stamceller som Opprinnelses celler for RMS i dystrophic sammenhenger. Beskrevet her er en reproduserbar og pålitelig protokoll for tumorsphere formasjon analysen (figur 1), som har blitt ansatt for identifisering av ekstremt sjeldne celle populasjoner som er ansvarlig for musen RMS utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bolig, behandling, og offer av mus ble utført etter godkjent IACUC protokollen av Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. forberedelse av reagens
- Forbered 100 mL celle isolasjons medier: F10 medium supplert med 10% heste serum (HS).
- Forbered 50 mL kollagenase type II løsning: oppløse 1 g av kollagenase type II pulver i 50 mL av celle isolasjons medier (Legg merke til enhetene av enzymet per 1 mL av Media, siden antall enheter endres avhengig av mye). Alikvot løsningen og oppbevar den i en-20 ° c fryser til den er klar til bruk.
Merk: hver masse kollagenase bør testes før bruk, siden enzymet aktivitet kan endres på tvers av forskjellige partier. - Forbered 10 mL per prøve av andre fordøyelsen løsning: celler isolasjons medier med 100 enheter/mL kollagenase type II løsning og 2 enheter/mL dispase II fersk vektet. Forbered umiddelbart før bruk.
- Forbered 500 mL av tumorceller medier: DMEM høy glukose supplert med 20% FBS og 1% penn/strep.
- Klargjør 500 mL FACS buffer: 1x PBS supplert med 2,5% v/v normal geit serum og 1 mM EDTA.
- Klargjør 500 mL tumorsphere medium: DMEM/F12 supplert med 1% penn/strep. Rett før bruk legger du til følgende vekstfaktorer: 1% N2-tillegg, 10 ng/mL EGF og 10 ng/mL β-FGF.
2. celle isolasjon og kultur
- Forbered en 10 cm plate som inneholder 5 mL av cellene isolasjons medier (en plate per tumor prøve) og legg den i en inkubator på 37 ° c til klar til å høste tumorvevet.
- RMS har blitt rapportert å spontant utvikle seg i både mannlige og kvinnelige mus modeller for Duchenne muskuløse dystrofi, for eksempel B10 MDX mus på rundt 18 måneders alder og i B6 MDX/mTR mus med 9 måneder22,23. Bedøve musa som utvikler RMS svulst bruker isoflurane, og ofre dyret gjennom cervical forvridning eller i henhold til IACUC retningslinjer for institusjonen. Med saks, gjør et snitt på huden i området der svulsten er lokalisert, og (ved hjelp av pinsett) trekke huden bort fra området av interesse. Ansette en barberhøvel blad, avgiftsdirektoratet svulsten fra dyret.
- Veie 500 – 1000 mg av tumorvevet og legg den i platen fremstilt i trinn 2,1 (figur 1a).
Merk: større mengder vev negativt påvirke fordøyelsen trinnene og redusere den totale avkastningen. Hvis høstes tumor er større enn 1000 mg, dele den inn i deler og prøve tilfeldig til ønsket vekt er nådd. Random prøvetaking er nødvendig for å evaluere vev heterogenitet. - Plasser platen som inneholder tumor vev i steril cellekultur hette og hakke den med en barberhøvel blad. Tumor vev fra RMS er heterogen; Dermed kan ulike områder presentere ulik motstand mot kuttene. Pass på at størrelsene på de resulterende hakket brikkene er uniform for å sikre optimal fordøyelse.
Merk: RMS finnes som blandinger av ulike typer vev (hovedsakelig antifibrotiske, vascularized, og fettvev) som kan identifiseres i hver svulst. Til 1) isolere en heterogen celle befolkning nøyaktig recapitulating sammensetningen av den opprinnelige tumor og 2) ikke bias isolasjonen prosedyren, utføre tilfeldige prøvetaking av høstet vev. Celler fra forskjellige områder av svulsten bør bli fordøyd og testet parallelt in vitro i analysen beskrevet i avsnitt 3. - Flytt hakket vev og celle isolasjons medier i en 15 mL sentrifuge slange, vask platen med 4 mL celle isolasjons medier og legg den i røret.
- Tilsett 700 enheter/mL kollagenase løsning for å fordøye vevet og ruge i et riste vannbad ved 37 ° c for 1,5 h.
- Etter inkubasjons, snurr ned vevet ved 300 x g i 5 min ved RT. aspirer supernatanten uten å forstyrre pellet, resuspend pellet i 10 ml andre fordøyelsen løsning (dispase), og ruge i en risting vannbad ved 37 ° c i 30 min.
- Når den andre fordøyelsen er fullført, Pipet opp og ned og passerer cellen suspensjon gjennom et 70 μm nylon filter på en 50 mL sentrifugerør. Deretter legger 10 mL av celle isolasjons medier å vaske filteret og fortynne fordøyelsen løsningen, og spinne ned vevet på 300 x g og RT i 5 min.
- Aspirer den supernatanten og resuspend pellet i 20 mL av tumorceller Media. Deretter overføre celle suspensjonen i en 15 cm cellekultur plate. Plasser cellene i inkubator ved 37 ° c over natten. Denne platen vil bli identifisert som p0.
- Dagen etter isolasjon, endre Media. Dette trinnet er nødvendig for å sikre fjerning av rusk og døde celler som kan negativt påvirke celle overlevelse.
- Vurder celle confluency etter at mediene er endret, som spenner fra 30%-60% avhengig av mengden av Start materiale og Cellestørrelse. La cellene vokser i inkubator til de når 90% confluency. Overvåk celler hver dag og endre Media hver 2 dager. Den tiden som er nødvendig for tumorceller å bli confluent varierer avhengig av flere parametre: tumor aggressivitet, genotype av svulsten, alder av musen, heterogenitet av vevet.
- Gjør følgende for celle passaging:
- Pre-Warm cellen avløsning løsning og tumorceller Media i et vannbad ved 37 ° c.
- Vask cellene med 1x steril PBS og ruge dem ved 37 ° c i 10 mL varm celle løsning i 5 – 10 min.
- Når alle cellene er løsrevet fra platen, tilsett 10 mL av varme tumorceller medier, flytte løsningen inn i en 50 mL sentrifugerør og spinne celler ned ved 300 x g i 5 min ved RT.
- Resuspend cellene i 5 – 10 mL av tumorceller medier, avhengig av pellet størrelse, og telle levende celler ved hjelp av Trypan blå (1:5 fortynning) for å utelukke døde celler.
- Plate 105 celler i 10 cm plater eller 3 x 105 celler i 15 cm plater. Celle dobling tid varierer avhengig av faktorene beskrevet i trinn 2,10.
3. Tumorsphere avledning
- Bruk tumorceller i passasje P1 eller P2 for å unngå Cellevalg gjennom flere passasjer (figur 1B). For å løsne celler fra platen, må du først vaske parabolen med 1x PBS, uten å forstyrre cellene, og deretter dekke dem ved hjelp av celle avløsning løsning (5 mL for en 10 cm plate eller 10 mL for en 15 cm plate) og plassere dem i inkubator for 5-10 min.
- Bekreft at cellene er løsrevet ved å se på platen under en lys-feltet mikroskop, tilsett 1:1 volum av tumorceller Media (celle avløsning løsning: tumorceller Media), plassere cellen suspensjonen i en sentrifugerør og spinne cellene ned ved 300 x g for 5 min ved RT.
- Resuspend celler i enten FACS buffer (del 3,4) eller tumorspheres Media (§ 3,5), i henhold til metoden som brukes for plating.
- Plating celler gjennom Flow flowcytometer
- Resuspend celler i FACS buffer (beløpet avhenger av pellet størrelse) og manuelt telle Live celler ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Kontroller at den endelige celle konsentrasjonen er 107 celler/mL (100 ΜL av FACS buffer per 106 celler). Tilsett 1 μL av FX syklus fiolett beis per 106 celler å diskriminere leve fra døde celler under celle sortering. Forbered en unstained kontroll der FX syklus Violet flekken ikke er lagt til cellene.
Merk: konsentrasjonen er optimalisert for effektiv farging og hastighet under sortering. En lavere celle konsentrasjon vil resultere i en lengre sorterings tid, mens en høyere konsentrasjon vil påvirke farging. - Ansette unstained kontroll, sette opp en FACS gate segregerende Live (FX Cycle Violet-) fra Dead (FX Cycle Violet+) celler. Deretter ansette fluorescerende-aktivert celle sortering (med 450/50 filter band pass) for separasjon og telling av levende/døde celler og for plating ønsket antall levende celler i hver brønn av 96 godt lav-vedlegg plater. Hver brønn av platen må fylles med 200 μL av tumorspheres medier før du starter sorteringen.
Merk: gitt at TPCs er en sjelden pasientpopulasjonen i hele svulsten, optimalisere protokollen ved plating 100 celler/brønn fra mus RMS å observere dannelsen av tumorspheres i suspensjon kultur. Celle nummeret per brønn bør justeres for den spesifikke svulsten som testes. - Plasser celler i inkubator til slutten av eksperimentet. Prøv ikke å forstyrre platen med mindre det er nødvendig. For en 30 dagers eksperiment, bør hver brønn etterfylles med Media og en passende andel av vekstfaktorer hver uke (Media har en tendens til å fordampe og vekstfaktorer er ikke effektive etter 1 uke).
- Etter at eksperimentet er fullført, må du manuelt skrive ut skjerm plater under et skarpt mikroskop for å identifisere tumorspheres (se trinn 3,6).
Merk: en timepoint på 30 dager ble optimalisert for enkelt å oppdage mus RMS tumorspheres av størrelser fra 50 – 300 μm av diameter. Timepoint bør justeres avhengig av aggressivitet av tumor testet og dens proliferativ hastighet.
- Resuspend celler i FACS buffer (beløpet avhenger av pellet størrelse) og manuelt telle Live celler ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Kontroller at den endelige celle konsentrasjonen er 107 celler/mL (100 ΜL av FACS buffer per 106 celler). Tilsett 1 μL av FX syklus fiolett beis per 106 celler å diskriminere leve fra døde celler under celle sortering. Forbered en unstained kontroll der FX syklus Violet flekken ikke er lagt til cellene.
- Plating celler manuelt
- Resuspend celler i tumorsphere Media (beløpet avhenger av pellet) og manuelt telle levende celler ved hjelp trypan blå (1:10 fortynning). Beregn celle konsentrasjonen i røret og platen riktig antall celler i en 96 brønn lav festeplate. Plasser celler i inkubator til slutten av eksperimentet. Prøv ikke å forstyrre platen med mindre det er nødvendig for påfyll av media og vekstfaktorer, som beskrevet i trinn 3.4.3.
- Etter at eksperimentet er fullført, må skjerm platene manuelt under et skarpt mikroskop for å identifisere tumorspheres eller bruke Celigo-programvaren, som beskrevet tidligere i Kessel et al.24 se trinn 3,6 nedenfor.
- Merk at to separate readouts kan evalueres som følge av denne analysen: antall og størrelse dannet tumorspheres.
Merk: når mer enn én celle er belagt i en brønn, kan enten tumorspheres eller celle klynger danne (figur 1C, tredje og fjerde panel). Celle klynger er små cellulære aggregater som danner i suspensjon kultur som forbedrer celle overlevelse og er preget av en uregelmessig form. Tumorspheres er store og har en mer kompakt struktur med en spheroid form. De stammer fra en enkelt celle som har evnen til å overleve i en forankring-uavhengig måte og sprer på en høy sats25. Plating celler gjennom Flow flowcytometer eller manuelt kan brukes om hverandre, avhengig av mulighetene som er tilgjengelige i laboratoriet. Videre ansette lav-vedlegg plater av størrelse annerledes enn 96 brønn platene er mulig og avhengig av ønsket utfall. Faktisk bør vurdering av tumorsphere frekvens gjøres ansette 96 brønn lav vedlegg plater, mens første screening for vurdering av celler tumorigene potensialet vil gi raskere og pålitelige resultater på 6 godt lav-vedlegg plater.
4. Tumorsphere behandling med rekombinant proteiner
- Gjenta trinn 3,1 og 3,2.
- Hvis du setter opp en behandling med rekombinant proteiner, må du først finne den beste konsentrasjonen å bruke følgende avsnitt 4,3, eller hvis den optimale konsentrasjonen er tidligere fastslått, hoppe til § 4,4.
- Bestem rekombinant protein behandling konsentrasjon.
- Resuspend cellene i tumorsphere Media (volumet avhenger av pellet størrelse) og telle Live celler manuelt ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Beregn celle konsentrasjon i røret og plate 100 000 celler i en 6 godt lav festeplate. Plate to brønner per konsentrasjon testet og to brønner for ubehandlede kontroller (figur 2). Protein konsentrasjoner som skal testes er basert på litteratursøk.
- Behandle hver brønn av suspensjon celler med en annen proteinkonsentrasjon og plassere cellene i inkubator for 48 h (tid nødvendig for å kunne evaluere effekten av behandlingen på både celle levedyktighet og på uttrykk for nedstrøms mål gener). Deretter vurdere følgende parametere:
- Celle overlevelse: ved hjelp av et lys-felt mikroskop samt sammenligning med ubehandlede kontroller, sjekk celle morfologi. Sunne celler vises lyse og reflekterende under mikroskopet, mens overdreven celle død vil indusere opphopning av rusk i Media. For en målbar bestemmelse av celle død, Trypan blå eksklusjon, krystall fiolett farging, MTT, eller TUNEL analysen kan benyttes (i dette tilfellet, legge en brønn til den opprinnelige plating).
- Effekt av rekombinant proteiner på nedstrøms veier: utføre et litteratursøk ved hjelp av PubMed for identifisering av nedstrøms gener kjent for å bli påvirket av testet protein. Design qRT-PCR-primere for mål genene, og utfør qRT-PCR-analyse på RNA isolert fra de behandlede cellene (figur 2).
- Behandle med rekombinant protein.
- Resuspend cellene i tumorsphere Media (volumet avhenger av pellet størrelse) og telle Live celler manuelt ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Bestem det totale antall celler som trengs for ønsket eksperiment (100 celler per hver brønn av en 96 brønn lav festeplate) og fortynne dem i riktig tumorsphere medie volum. Hvis du utfører mer enn én behandling, klargjør du separate celle rør.
- Behandle hvert rør med riktig konsentrasjon av rekombinant protein og plate cellene i en egen brønn på 96 godt lav-vedlegg plate. Behandlingen vil bli gjentatt på hver brønn avhengig av halveringstiden av rekombinant protein til 30 dagers endepunkt av eksperimentet.
- På slutten av eksperimentet følger du trinn 3.4.4 og 3,6 for å analysere dataene.
5. Tumorsphere behandling med overuttrykte plasmider
- Gjenta trinn 3,1 og 3,2.
- Hvis du setter opp behandlingen på en ny tumor type, må du først bestemme den beste konsentrasjonen av plasmider å bruke følgende avsnitt 5,3, eller hvis den optimale DNA-konsentrasjonen er tidligere fastslått, gå til seksjon 5,4.
- Bestem optimal plasmider konsentrasjon.
- Resuspend celler i tumorceller Media (volumet avhenger av pellet størrelse) og manuelt telle levende celler ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Plate de telte cellene for å oppnå en confluency fra 70%-90% (celle nummer er svært avhengig av Cellestørrelse og morfologi). GFP-plasmider vil bli brukt til å teste transfeksjoner effektivitet etter produsentens protokoll for transfeksjoner reagens for tilhenger celler. Parallelt, også teste en ubehandlet kontroll (figur 3a). Utfør en effektivitets test i en 24 brønn plate.
Merk: tilhenger celler brukes til å forbedre transfeksjoner effektivitet, som transfeksjoner utført på suspensjon celler er ikke effektiv og negativt påvirker celle levedyktighet. - 48 h etter transfeksjoner vurdere celler for følgende parametre:
- Celle overlevelse: ved hjelp av en lys-felt mikroskop, sammenligne antall celler til stede i hver-brønn og sammenligne den med ubehandlede celler godt.
- GFP-uttrykk: Tell prosentandelen av celler som er GFP-positive over totalt antall celler i hver brønn (figur 3b).
- Resuspend celler i tumorceller Media (volumet avhenger av pellet størrelse) og manuelt telle levende celler ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Plate de telte cellene for å oppnå en confluency fra 70%-90% (celle nummer er svært avhengig av Cellestørrelse og morfologi). GFP-plasmider vil bli brukt til å teste transfeksjoner effektivitet etter produsentens protokoll for transfeksjoner reagens for tilhenger celler. Parallelt, også teste en ubehandlet kontroll (figur 3a). Utfør en effektivitets test i en 24 brønn plate.
- Overuttrykte plasmider behandling
- Resuspend cellene i tumor celle medier (volumet avhenger av pellet størrelse) og telle Live celler manuelt ved hjelp av Trypan blå eksklusjon. Plate 200 000 celler per brønn av en 6 brønn plate. Hver brønn vil bli brukt til en uavhengig transfeksjoner begivenhet. Hver brønn vil bli transfekterte ved hjelp av oppsettet som er utviklet for den spesifikke tumor typen (figur 3a).
- 24 h etter transfeksjoner, vask hver brønn med 1x PBS og ruge cellene i varm celle avløsning løsning (nok til å dekke brønnen). Plasser platen i inkubator ved 37 ° c i 5 – 10 min, avhengig av faktorene som er beskrevet i avsnitt 2,15.
- Når cellene er løsrevet, telle cellene avledet fra hver enkelt brønn uavhengig bruker Trypan blå eksklusjon. Plasser 100 000 celler per brønn av en 6 godt lav festeplate, og pass på å ikke blande celler avledet fra ulike brønner. Plasser platen i inkubator ved 37 ° c og la den være uforstyrret i en uke.
Merk: varigheten av denne analysen er 7 dager, en tilstrekkelig tid til å tillate tumorsphere formasjon mens forebygge tumorsphere fusjon. Tumorsphere fusjon er et fenomen som blir tydelig når 100 000 eller flere celler er belagt sammen i suspensjon i over 1 uke, noe som kan bias vurderingen av Tumorsphere dannelse evne. I tilfelle at eksperimentet krever lengre inkubasjonstid, bør celle tetthet justeres eller polymer stillaser brukes for å unngå tumorsphere fusjon26. - På slutten av eksperimentet følger du trinn 3.5.2 og 3,6 for å analysere dataene.
6. Tumorsphere forberedelse til allograft transplantasjon
- Place ekstracellulære Matrix (ECM) løsning (50 μL per allograft) og tumorceller Media (50 μL per allograft) på is.
- Tumorspheres kan brukes til allograft Sygehus. Trekk sammen alle tumorspheres Hentet fra en bestemt celle type eller behandling til en 15 mL eller 50 mL rør (i henhold til det totale volumet av Media) (figur 1d). Snurr tumorspheres ned på 300 x g i 5 minutter ved RT. Fjern supernatanten over tumorspheres og vask dem med 10 ml STERIL 1x PBS.
- Snurr tumorspheres ned igjen ved 300 x g i 5 min ved RT, ASPIRER 1x PBS, og tilsett 500 μL til 1 ml celle løsgjøring på toppen av cellen pellet, som starter dissosiasjon prosessen. Ruge tumorspheres i fordøyelsessystemet løsning i en risting vannbad ved 37 ° c og sjekke progresjon av fordøyelsen hver 10 min. For å hjelpe tumorspheres dissosiasjon i en enkelt celle løsning, Pipetter cellene opp og ned for mekaniske forstyrrelser. Fordøyelsen prosessen kan ta opptil 30 min.
Merk: til tross for at inkubasjonstid varierer betraktelig når tumorspheres er avledet fra ulike primære RMS-celler, en betydelig reduksjon i celle levedyktighet i forhold til fordøyelsen tid ble aldri observert. - Når en enkelt celle løsning er innhentet, legge til et volum av tumorceller Media (1:1, celle avløsning løsning: tumorceller Media) og spinne den ned ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
Merk: fra denne tiden av, alle trinnene må utføres på isen. Etter spinning, tumorspheres ikke danne en stabil pellet som enkeltceller løsninger gjør. For å være sikker på å ikke løsne eller aspirer tumorspheres, bruk en 1 mL pipette og forsiktig aspirer væsken. Flytt til en 200 μL pipette når bare 1 mL gjenstår. - Resuspend celler i kaldt tumorceller Media (volumet vil avhenge av pellet størrelse), plassere cellene på isen og telle levende celler ved hjelp Trypan blå eksklusjon. Etter å bestemme riktig mengde celler til bruk for allograft, resuspend dem i et samlet volum på 50 μL av kaldt tumorceller Media. Kjøl ned en pipette spissen i kaldt tumorceller Media. Når tuppen er kald, bruk den til å ta 50 μL av ECM-løsning og legg den til røret som inneholder cellene. Ikke Fjern rørene fra isen under denne prosessen.
Merk: antall celler som skal brukes for transplantasjon bør fastsettes i henhold til tumor testet og eksperimentelle mål: et større antall transplanterte celler vil redusere tiden for tumor utvikling (20 000 celler fra mus RMS tumorspheres har vist til utvikle seg til en svulst 6 uker etter injeksjon). For å kunne sammenligne ulike cellelinjer eller ulike behandlinger, er det viktig å starte fra samme antall celler. - Som celler er nå klar for transplantasjon, opprettholde på isen til injeksjon. Plasser et avkortet 0,5 mL insulinsprøyte med en 29 G nål på isen, for å hindre at celle løsningen blir solid ved aspirasjon.
- Slå på flowmeter til 200 mL/min oksygen og isoflurane fordamper til 2,5%. Bedøve en 2 måneder gammel mannlig NOD/SCID mus ved å plassere den inne i induksjon kammeret. Vent 2 – 3 min til musen ser ut til å sove og avl har bremset ned. Før du starter prosedyren, først bekrefte gjennom en fot klype at musen er i hvilemodus, deretter bruke veterinær salve på øynene. Barber den høyre siden av dyret, aspirer celle oppløsningen i den pre-avkjølte sprøyten, og Injiser dem subkutant inn i det barberte området. En synlig Bump under huden vil danne hvis injeksjonen er utført på riktig måte.
Merk: celle allograft kan utføres i samme muse belastning som for de transplanterte cellene. Hvis RMS-cellene opprinnelig ble isolert fra en C57BL/6-mus, kan for eksempel allograft utføres i C57BL/6-mus. Hvis belastningen er forskjellig, så immunodeficient mottaker mus bør utnyttes for å unngå avvisning. Alderen på mottakerens mus kan også justeres avhengig av det eksperimentelle målet. - Overvåk musene for tumor formasjon en gang per uke.
Merk: for å validere identiteten til tumor avledet fra allograft transplantasjon, bør det sammenlignes med den opprinnelige svulsten som cellene ble isolert. Til dette målet, kan histologiske analyse for morfologiske funksjoner og uttrykk for myogenic markører samt mer omfattende RNAseq utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorspheres deteksjon
Celle isolasjon var optimalisert for å oppnå maksimal heterogenitet av celle populasjoner til stede i tumorvevet. Først, siden isolert vev presentert morfologisk ulike områder, for å øke sjansene for å isolere uniform sjeldne celle populasjoner, ble prøvetaking utført fra flere områder av svulsten (figur 1a, første panel til venstre). For det andre, mekanisk dissosiasjon av høstes prøvene ble utført samtidig opprettholde homogenitet i hakket vev størrelse, til tross for ulike motstander som kan ha vært tilstede på tvers av prøvene (figur 1a, tredje og fjerde panel fra venstre ). Avhengig av utgangsmaterialet (tumor aggressivitet, alder og genotype av mus, tumor plassering), kan gjenvinning av cellene fra mekanisk stress av isolasjons prosessen variere, alt fra 3-7 dager (figur 1a, siste panel til høyre). For å forbedre celle overlevelse og vekst, bør Media bli endret dagen etter isolasjon og deretter hver 2 dager. Dette vil fjerne rusk og døde celler akkumulert under isolasjons prosessen som kan påvirke til celle levedyktighet. Tumorsphere formasjon analysen bør starte etter at cellene har blitt passert minst én gang for å sikre optimal levedyktighet når den plasseres i suspensjon kulturer (figur 1B, første panelet til venstre). I våre hender ble optimale resultater innhentet fra Start med celler fra passasje 2 (P2) (figur 1C, første og andre panel til venstre). Denne spesifikke passasjen ble valgt etter flere tester. Når p0 celler ble belagt i lav-vedlegg forhold, dannet de et lavt antall tumorspheres i forhold til senere passasjer, muligens på grunn av mobilnettet rusk fortsatt til stede etter isolasjon. I senere passasjer ble det observert ulike mønstre av tumorsphere dannelse og tilskrevet valget som oppstår etter mange passasjer i kultur. Når forskjellige cellelinjer sammenlignes, foreslås det å starte fra samme passasje.
Diskriminering mellom tumorspheres og celle klynger er av fundamental betydning for kvantifisering av analysen. Figur 1C (de to siste panelene til høyre) viser tydelig de morfologiske forskjellene mellom en tumorsphere (til venstre) og en celle klynge (høyre). Tumorspheres er avledet fra en enkelt celle som har en høy evne til å fornye seg selv og vokse i lav-vedlegg forhold (begge funksjonene i TPCs). Faktisk, tumorsphere utvikling indikerer tumorgenisitet hos potensiale. Imidlertid er denne analysen utføres in vitro uavhengig av signaler avledet fra hele organismen; Således, for å validere cellenes tumorigene potensial in vivo, bør allograft transplantasjon eksperimenter utføres (figur 1d).
Validering av rekombinant protein behandling
Før du setter opp tumorspheres behandling, den optimale konsentrasjon der protein av interesse utløser en effekt på tumorceller bør fastsettes. For å gjøre dette, er vurdering av nivået av uttrykk for protein nedstrøms mål gener nødvendig (figur 2). Et litteratursøk på PubMed ble utført før fastsettelsen av mål gener for å teste gjennom qRT-PCR. I tilfelle at protein av interesse har vist å modulere ulike nedstrøms trasé, valg av flere gener knyttet til hver av disse veiene bør utføres. For eksempel, Flt3l (FMS-lignende tyrosin kinase 3) har vist å modulere STAT5 signalering i akutt myelogen leukemi, inducing nedstrøms uttrykk for P21, c-myC, og CyclinD1 (figur 2)27. Videre er uttrykk for Flt3l nødvendig for dendrittiske celler differensiering formidling aktivering av STAT3 signalering Pathway28. For å vurdere STAT3 aktivitet ble Socs3 og CyclinD1-uttrykket kontrollert (figur 2). Analyse av resultatene viste en dose avhengig effekt av rekombinant protein behandling på noen av de testede gener (P21, CyclinD1, og Socs3), mens andre ikke ble påvirket (c-myC). Det er viktig å bestemme nedstrøms gener mottakelig for protein av interesse i den spesifikke tumor testet for pålitelig vurdering av behandling effektivitet.
Optimalisering av protokollen for plasmider transfeksjoner
For å etablere en effektiv protokoll for plasmider transfeksjoner og ytterligere tumorsphere dannelse analysen, ble effekten av transfeksjoner på tilhenger tumorceller testet (figur 3a). Transfeksjoner reagens behandling ble utført etter produsentens protokoll, og to forskjellige mengder av reagens ble testet. Effektivitet ble vurdert ansette en GFP reporter plasmider. I våre hender observerte vi en høyere transfeksjoner effektivitet ved hjelp av lavere mengder av reagens (figur 3a). Faktisk høyere konsentrasjoner føre til økt celle død, som starter på 48 h og blir mer tydelig etter 72 h fra tidspunktet for transfeksjoner. Det samme transfeksjoner protokollen var ikke effektiv i cellene i suspensjon, som akkumulering av døde celler og cellulære rusk ble tydelig 24 timer etter begynnelsen av behandlingen, indikerer redusert cellulær levedyktighet. For å overvinne denne tekniske utfordringen, en to trinn protokoll ble ansatt: utføre transfeksjoner på tilhenger celler, løsne dem 24 h etter behandlingen, og plate dem i suspensjon i 7 dager. Kontroll tumorspheres var faktisk uttrykker GFP på slutten av eksperimentet (figur 3b).
Figur 1: tumor celle isolasjon, tumorsphere avledning og transplantasjon. (A) skjematisk representasjon av del 2 av protokollen (tumor celle isolasjon). Hvert nøkkeltrinn i protokollen summeres. (B) skjematisk representasjon av § 3 i protokollen (tumorspheres avledning). Hvert nøkkeltrinn i protokollen summeres. (C) fra venstre: lyse felt bilde av isolerte tumorceller ved passering 2 (P2) ved lav forstørrelse (skala bar = 50 μm) og høy forstørrelse (skala bar = 50 μm); lyse felt bilde av en tumorsphere avledet fra tumorceller etter 30 dager i suspensjon kultur (skala bar = 250 μm), og lyse felt bilde av en celle klynge dannet av tumorceller etter 30 dager i suspensjon kultur (skala bar = 50 μm). (D) skjematisk representasjon av § 6 i protokollen (tumorsphere allograft transplantasjon). Hvert nøkkeltrinn i protokollen summeres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: validering av nedstrøms mål gener for bestemmelse av rekombinant proteinkonsentrasjon. qRT-PCR resultater for vurdering av Flt3l behandling konsentrasjon. Toveis ANOVA ble utført. Betydning vises for sammenligningen med ikke-behandlet kontroll. (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: oppsett av tumorspheres transfeksjoner protokoll. (A) representative lyse felt og fluorescerende bilder av tumorceller behandlet med lav (øvre) eller høy (bunn) konsentrasjon av transfeksjoner reagens (0,75 μL eller 1,5 μL i 24 brønn plater) (skala bar = 50 μm). (B) representativt bilde av tumorspheres DANNET fra GFP plasmider-behandlede celler, 7 dager etter plating cellene i suspensjon (skala bar = 50 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder har vært ansatt for isolasjon og karakterisering av TPCs fra tumor heterogene celle populasjoner: tumor clonogenic analyser, FACS isolasjon, og tumorsphere dannelse analysen. Svulsten clonogenic analysen ble først beskrevet i 1971, brukes for stilk cellen studier, og bare senere brukes til kreft biologi29,30. Denne metoden er basert på kreft stamceller iboende eiendom for å utvide uten begrensninger i myke gels kulturer31. Siden sin utvikling, har denne metoden vært mye brukt i kreftforskning for flere formål, inkludert tumor celle heterogenitet studier, effekten av hormonell behandling på cellevekst, og tumor motstand studier31. Hittil er denne analysen fortsatt ansatt for identifisering av tumor initiere celler for flere typer kreft32.
FACS isolasjon er basert på tidligere kunnskap om molekylære markører tilstede på overflaten av celler på renter. Det har vært mye benyttet for isolering av TPCs fra både flytende og solide svulster. For eksempel, den første identifisering av menneskelig akutt myelogen leukemi (AML) initiere celler ble utført av Dr. Dick ' s gruppe ved å benytte FACS fraksjonering og transplantasjon analyser basert på kunnskap om markører stede på bulk AML celler9. Bruker en lignende tilnærming, er Dr. Clarke ' s gruppe isolert brystkreft initiere celler3. Tumorsphere formasjon analysen er en annen tilnærming som brukes for identifisering og studier av TPCs. Denne metoden ble først utviklet for å identifisere kreft stamceller fra hjernesvulster33. Interessant nok var det i utgangspunktet testet ved hjelp av de samme forholdene kjent for å favorisere nevrale stamceller vekst, og dermed favoriserer selv-fornyelse eiendom også forbundet med TPCs33. Videre er tumorsphere dannelse avhengig av kapasiteten til TPCs til vekst i en forankring-uavhengig måte.
De tre ovennevnte tilnærminger kan brukes parallelt for å øke sannsynligheten for å isolere og Molecularly karakterisere TPCs populasjoner, overvinne begrensningene for hver metode. For eksempel, FACS, til tross for å bringe den store fordelen av å isolere rene celle populasjoner, er sterkt avhengig av bruk av overflaten markører som ennå ikke er kjent for alle krefttyper. Således er bruken begrenset til isolering av TPCs uttrykke kjente markører. Tumor clonogenic og tumorsphere formasjon analysene er begge basert på cellulære egenskaper, kjent for å være assosiert med TPCs. Begge disse metodene kan anvendes som første linje av studier på nye eller ennå ikke studert kreft. Videre disse to metodene kan sikre ekspansjon og berikelse av cellen befolkning av interesse, tilrettelegging for identifisering av molekylære markører, og gir mulighet for både kreft resistens og narkotika screening studier. I denne sammenhengen er tumorsphere formasjon analysen mer fordelaktig, siden disse spheroid strukturene bedre gjenskape miljøet til stede i tumor vev (hypoxic områder i midten av kulene)34. Faktisk har det vært tidligere vist at 3D-kulturer er mer pålitelige for å forutsi narkotika behandlinger utfall34. Tumorspheres kan utvinnes etter kultur, og brukes til allograft eksperimenter: fordøyelse av Tumorspheres i enkeltceller løsninger og transplantasjon i mottaker mus vil tillate in vivo vurdering av tumorigene kapasitet på nylig identifisert TPCs, sammenlignet med bulk tumorceller.
For å lykkes med å få en start cellulære materiale representant for tumor heterogenitet, er det avgjørende å først utføre tilfeldige prøvetaking av vevet. RMS er preget av antifibrotiske, fet, eller svært vascularized områder som er klart gjenkjennelig i isolerte svulster, og dermed, for å opprettholde denne cellulære mangfoldet, vil innsamling av hvert område av vevet være nødvendig. Videre, for å øke sjansene for cellene overlevelse under fordøyelsen prosessen, hakking av det innsamlede vevet må resultere i jevnt store stykker: mindre fragmenter er mer sannsynlig å være overdigested inducing reduksjon av celler levedyktighet. Dette kan være spesielt kjedelig på grunn av ulike morfologi og stivhet av RMS.
For kvantifisering av resultatet av tumorsphere formasjon analysen, er det av avgjørende betydning å skille mellom reelle tumorspheres og cellulære klynger (figur 1C, siste to paneler til høyre). En tumorsphere er solid spheroid struktur der det ikke er mulig å diskriminere cellen composiiton; i kontrast, i en celle klynge, enkeltceller kan lett diskriminert. Celle klynger kan ikke anta en avrundet form og er betydelig mindre sammenlignet med tumorspheres, som varierer mellom 50-250 μm25.
For å oppnå tumorspheres transplantasjon, få en ensartet enkeltceller løsning er et viktig trinn. Faktisk, gitt den stramme struktur og stor størrelse på en tumorsphere, fordøyelsen av cellene blir en stor begrensende trinn i utarbeidelsen av en enkelt celle suspensjon som er videre ansatt for transplantasjon. Flere sykluser av enzymatisk fordøyelse kombinert med mekaniske dissosiasjon er således nødvendig for fullstendig dissosiasjon av tumorspheres. For å bekrefte fremdriften til dissosiasjon og et vellykket resultat må oppløsningen overvåkes under et mikroskop med lyse felt.
Til tross for flere fordeler som tilbys av tumorsphere formasjon analysen, har tumorspheres vist ikke å stamme fra alle typer tumor eller fra alle kommersielt tilgjengelige cellelinjer. I disse tilfellene kan ikke analysen brukes som standard for bestemmelse av celle tumorgenisitet hos og kvantifisering av TPCs i en heterogen populasjon. En annen begrensning av denne analysen er forbundet med det faktum at ulike tumor typer krever ulike voksende og dissosiasjon forhold; dermed krever det tidkrevende optimalisering og feilsøking av begge protokollene for hver tumor type eller cellelinje. Videre kan fusjon av flere tumorspheres oppstå i kulturen, noe som gjør vurderingen av deres størrelser og tall uklart.
Til tross for at tumorsphere formasjon analysen har vært tidligere benyttet i RMS studier, har det vært hovedsakelig brukt til kommersielt tilgjengelige RMS cellelinjer å identifisere molekylære trasé involvert i tumor formasjon og utvikling18, 20,21. Gitt den heterogene vev sammensetning, de mange under typer av svulster og ulike utviklingsmessige sammenhenger som RMS stammer, sysselsetting av RMS cellelinjer begrenser anvendelsen av denne analysen for identifisering av begge celler av opprinnelse og utviklingsmessige signaler som fører til tumor utvikling in vivo.
Et forsøk på å utvikle en effektiv protokoll for tumorsphere avledning, som starter fra menneskelige sarkom prøver, har tidligere vist dårlige resultater. Faktisk ble tumorspheres utviklet fra bare 10% av prøvene35. Dermed er det behov for en reproduserbar og pålitelig analysen for isolering av primære RMS celler og tumorsphere utvikling. Som svar på dette behovet, den beskrevne tumorsphere formasjon analysen var optimalisert for å være ansatt i primær cellekulturer. Utviklingen av denne protokollen er det første skrittet mot å besvare store spørsmål i feltet (dvs. hvordan RMS celler opprinnelse varierer avhengig av miljø-kontekst). I mer detalj, beskrevet her er en reproduserbar protokoll for isolering av primære tumorceller fra RMS vev, dannelse av tumorspheres, tumorsphere behandling (begge utført med rekombinant proteiner eller overuttrykte plasmider), og allograft transplantasjon eksperimenter.
Avslutningsvis er tumorsphere formasjon analysen en veletablert og allsidig metode for identifisering av TPCs i ulike typer svulster, berikende cellene med økt selv-fornyelse kapasitet og evnen til å vokse i en forankring-uavhengig Måte. Denne analysen er basert på funksjonelle egenskaper av cellen populasjoner blir studert og ikke på den tidligere kunnskapen om molekylære markører; Dermed kan det brukes som et undersøkende verktøy for et bredt spekter av svulster typer. Videre er isolering av sjeldne celle populasjoner oppnådd med tumorsphere kulturer gjør dette in vitro analysen en ideell plattform for kreft narkotika testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Ellison Medical Foundation stipend AG-NS-0843-11, og NIH pilot Grant innenfor NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 til A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
