Summary
Ce protocole décrit une méthode reproductible pour l'isolement des cellules primaires de rhabdomyosarcoma de souris, de la formation et du traitement de la tumorsphere, et de la transplantation d'allogreffe commençant des cultures de tumorspheres.
Abstract
Le rhabdomyosarcome (RMS) est le sarcome des tissus mous le plus courant chez les enfants. Bien que des efforts significatifs aient permis l'identification des mutations communes associées au RMS et aient permis la discrimination de différents sous-types de RMS, des défis majeurs existent toujours pour le développement de nouveaux traitements pour améliorer davantage le pronostic. Bien qu'identifié par l'expression des marqueurs myogéniques, il y a encore une controverse significative quant à savoir si RMS a des origines myogéniques ou non myogéniques, car la cellule d'origine est encore mal comprise. Dans la présente étude, une méthode fiable est fournie pour l'analyse de la tumorsphere pour la souris RMS. L'analyse est basée sur les propriétés fonctionnelles des cellules tumorales et permet l'identification de populations rares dans la tumeur avec des fonctions tumorigènes. On décrit également des procédures pour tester des protéines recombinantes, intégrant des protocoles de transfection avec l'essai de la tumorsphere, et évaluant des gènes candidats impliqués dans le développement et la croissance de tumeur. Décrit en outre est une procédure pour la transplantation allogreffe de tumorspheres dans les souris destinataires pour valider la fonction tumorigenic in vivo. Dans l'ensemble, la méthode décrite permet l'identification et l'essai fiables des populations tumorigenic rares de RMS qui peuvent être appliquées au RMS surgissant dans différents contextes. Enfin, le protocole peut être utilisé comme une plate-forme pour le dépistage des médicaments et le développement futur de la thérapeutique.
Introduction
Le cancer est une maladie hétérogène; en outre, le même type de tumeur peut présenter différentes mutations génétiques dans différents patients, et dans un patient une tumeur est composée par des populations multiples des cellules1. L'hétérogénéité présente un défi dans l'identification des cellules responsables de l'initiation et de la propagation du cancer, mais leur caractérisation est essentielle au développement de traitements efficaces. La notion des cellules de propagation de tumeur (TPC), une population rare de cellules qui contribuent au développement de tumeur, a été précédemment examiné intensivement2. Malgré le fait que les TPC ont été caractérisés dans plusieurs types de cancer, l'identification des marqueurs pour leur isolement fiable demeure un défi pour plusieurs types de tumeur3,4,5,6 , 7 Annonces , 8 Annonces , 9 . Ainsi, une méthode qui ne repose pas sur des marqueurs moléculaires, mais plutôt sur des propriétés fonctionnelles du PTC(renouvellement élevé et capacité de croître dans des conditions de faible attachement), connue sous le nom d'analyse de formation de la tumorsphere, peut être largement appliquée pour le l'identification des TPC de la plupart des tumeurs. Fait important, cet analyse peut également être utilisé pour l'expansion des TPC et donc directement appliqué au dépistage des médicaments contre le cancer et des études sur la résistance au cancer1,10.
Le rhabdomyosarcome (RMS) est une forme rare de sarcome des tissus mous le plus fréquent chez les jeunes enfants11. Althoug RMS peut être histologiquement identifié par l'évaluation de l'expression des marqueurs myogéniques, la cellule d'origine de RMS n'a pas été unvocally caractérisée en raison des sous-types multiples de tumeur et de l'hétérogénéité élevée des stimulus développementals de tumeur. En effet, des études récentes ont suscité une discussion scientifique importante sur la question de savoir si le RMS est d'origine myogène ou non myogénique, suggérant que le RMS peut provenir de différents types de cellules selon le contexte12,13, 14 (en) , 15 Annonces , 16 Annonces , 17. De nombreuses études sur les lignées cellulaires rmS ont été réalisées en utilisant l'exemple de formation de la tumorsphère pour l'identification des voies impliquées dans le développement tumoral et la caractérisation des marqueurs associés à des populations fortement auto-renouveau 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21.
Cependant, en dépit du potentiel d'analyse de formation de tumorsphere pour identifier des cellules de RMS d'origine, une méthode fiable qui peut être employée sur les cellules primaires de RMS n'a pas encore été décrite. Dans ce contexte, une étude récente de notre groupe a utilisé un test optimisé de formation de tumorsphere pour l'identification des cellules rmS d'origine dans un modèle de souris de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD)22. Plusieurs types de cellules prétumorigènes, isolés des tissus musculaires, sont testés pour leur capacité à se développer dans des conditions de faible attachement, permettant l'identification des cellules souches musculaires comme cellules d'origine pour RMS dans des contextes dystrophiques. Décrit ici est un protocole reproductible et fiable pour l'analyse de formation de la tumorsphère (Figure 1), qui a été utilisé avec succès pour l'identification des populations cellulaires extrêmement rares qui sont responsables du développement de la souris RMS.
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Protocol
Le logement, le traitement et le sacrifice des souris ont été effectués selon le protocole approuvé de l'IACUC du Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. Préparation de réactif
- Préparer 100 ml de milieux d'isolement cellulaire : f10 moyen complété à 10 % de sérum de cheval (HS).
- Préparer 50 ml de collagène type II solution: dissoudre 1 g de collagène de type II poudre dans 50 ml de flux d'isolement cellulaire (notez les unités de l'enzyme par 1 ml de médias, puisque le nombre d'unités change en fonction du lot). Aliquot la solution et conserver dans un congélateur de -20 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.
REMARQUE: Chaque lot de collagène doit être testé avant utilisation, puisque l'activité enzymatique peut changer à travers différents lots. - Préparer 10 mL par échantillon de deuxième solution de digestion : média d'isolement des cellules avec 100 unités/mL de solution de collagène de type II et 2 unités/mL de dispase II fraîchement pondérée. Préparer immédiatement avant l'utilisation.
- Préparer 500 mL de cellules tumorales médias: DMEM glucose élevé complété par 20% FBS et 1% stylo / streptocoque.
- Préparer 500 mL de tampon FACS : 1x PBS complété par un sérum de chèvre normal de 2,5 % v/v et 1 mM EDTA.
- Préparer 500 mL de médias tumorsphere: DMEM/F12 complété avec 1% stylo / streptocoque. Juste avant l'utilisation, ajoutez les facteurs de croissance suivants : 1 % de supplément N2, 10 ng/mL EGF et 10 ng/mL-FGF.
2. Isolement et culture cellulaires
- Préparer une plaque de 10 cm contenant 5 ml de cellules de l'isolement des médias (une plaque par échantillon de tumeur) et le placer dans un incubateur à 37 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à récolter le tissu tumoral.
- RMS ont été rapportés pour se développer spontanément dans les modèles masculins et femelles de souris pour la dystrophie musculaire de Duchenne, telle que des souris de M10 mdx à environ 18 mois et dans les souris de M6 mdx/mTR par 9 mois22,23. Anesthésiez la souris qui développe la tumeur rmS à l'aide d'isoflurane, et sacrifiez l'animal par luxation cervicale ou selon les directives de l'IACUC de l'institution. Avec des ciseaux, faire une incision sur la peau dans la zone où la tumeur est localisée, et (à l'aide d'une pince à épiler) tirer la peau loin de la zone d'intérêt. En utilisant une lame de rasoir, accise la tumeur de l'animal.
- Peser 500 à 1 000 mg du tissu tumoral et le placer dans la plaque préparée à l'étape 2.1 (Figure 1A).
REMARQUE : De plus grandes quantités de tissu affectent négativement les étapes de digestion et diminuent le rendement global. Si la tumeur récoltée est supérieure à 1000 mg, divisez-la en parties et échantillonnez au hasard jusqu'à ce que le poids désiré soit atteint. L'échantillonnage aléatoire est nécessaire pour évaluer l'hétérogénéité tissulaire. - Placez la plaque contenant des tissus tumoraux dans le capuchon de culture cellulaire stérile et hachez-la avec une lame de rasoir. Le tissu tumoral de RMS est hétérogène ; ainsi, différentes zones peuvent présenter une résistance différente aux coupures. Assurez-vous que les tailles des morceaux hachés qui en résultent sont uniformes pour assurer une digestion optimale.
REMARQUE : Le SGR existe sous forme de mélanges de différents types de tissus (principalement fibrotiques, vascularisés et tissus adipeux) qui peuvent être identifiés dans chaque tumeur. Pour 1) isoler une population hétérogène de cellules récapitulant avec précision la composition de la tumeur originale et 2) ne pas biaiser la procédure d'isolement, effectuer l'échantillonnage aléatoire du tissu récolté. Les cellules de différentes zones de la tumeur doivent être digérées et testées en parallèle in vitro dans l'essai décrit dans la section 3. - Déplacer le tissu haché et le support d'isolement cellulaire dans un tube centrifugeuse de 15 ml, laver la plaque avec 4 ml de support d'isolement cellulaire et le placer dans le tube.
- Ajouter 700 unités/mL de solution de collagène pour digérer le tissu et couver dans un bain d'eau tremblant à 37 oC pendant 1,5 h.
- Après l'incubation, faire tourner le tissu à 300 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le supernatant sans déranger le granule, resuspendre la pastille dans 10 ml de deuxième solution de digestion (dispase), et couver dans un bain d'eau tremblant à 37 oC pendant 30 min.
- Une fois la deuxième digestion terminée, pipet de haut en bas et passer la suspension cellulaire à travers un filtre en nylon de 70 m sur un tube de centrifugeuse de 50 ml. Ensuite, ajoutez 10 ml de milieu xcellulaire pour laver le filtre et diluer la solution de digestion, et faites tourner le tissu à 300 x g et RT pendant 5 min.
- Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 20 ml de cellules tumorales. Ensuite, transférer la suspension cellulaire dans une plaque de culture cellulaire de 15 cm. Placer les cellules dans l'incubateur à 37 oC pendant la nuit. Cette plaque sera identifiée comme P0.
- Le lendemain de l'isolement, changer les médias. Cette étape est nécessaire pour assurer l'enlèvement des débris et des cellules mortes qui peuvent influencer négativement la survie des cellules.
- Évaluer la confluence cellulaire après le changement des médias, qui varie de 30 à 60 % selon la quantité de matériau de départ et la taille des cellules. Laissez les cellules pousser dans l'incubateur jusqu'à ce qu'elles atteignent 90% de confluence. Surveillez les cellules tous les jours et changez de média tous les 2 jours. Le temps nécessaire pour que les cellules tumorales deviennent confluents varie en fonction de paramètres multiples : agressivité tumorale, génotype de la tumeur, âge de la souris, hétérogénéité du tissu.
- Pour le passaging cellulaire, faites ce qui suit :
- Préchauffez la solution de détachement cellulaire et les cellules tumorales dans un bain d'eau à 37 oC.
- Laver les cellules avec 1x PBS stérile et les incuber à 37 oC dans 10 ml de solution de détachement cellulaire chaud pendant 5 à 10 min.
- Lorsque toutes les cellules sont détachées de la plaque, ajouter 10 ml de cellules tumorales chaudes de médias, déplacer la solution dans un tube de centrifugeuse de 50 ml et spin cellules vers le bas à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Resuspendre les cellules dans 5 à 10 ml de cellules tumorales, selon la taille des granulés, et compter les cellules vivantes à l'aide du bleu Trypan (1:5 dilution) pour exclure les cellules mortes.
- Plaque 105 cellules dans des plaques de 10 cm ou 3 x 105 cellules dans des plaques de 15 cm. Le temps de doublement cellulaire varie selon les facteurs détaillés à l'étape 2.10.
3. Dérivation de la tumorsphere
- Utilisez des cellules tumorales au passage P1 ou P2 pour éviter la sélection cellulaire par plusieurs passages (Figure 1B). Pour détacher les cellules de l'assiette, lavez d'abord le plat avec 1x PBS, sans déranger les cellules, puis couvrez-les à l'aide d'une solution de détachement cellulaire (5 ml pour une plaque de 10 cm ou 10 ml pour une plaque de 15 cm) et placez-les dans l'incubateur pendant 5 à 10 min.
- Confirmer que les cellules sont détachées en regardant la plaque sous un microscope à champ lumineux, ajouter 1:1 volume de cellules tumorales médias (solution de détachement cellulaire: cellules tumorales médias), placer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse et faire tourner les cellules vers le bas à 300 x g pour 5 min à RT.
- Resuspendre les cellules dans le tampon FACS (section 3.4) ou tumorspheres médias (section 3.5), selon la méthode utilisée pour le placage.
- Placage des cellules à travers le cytomètre de flux
- Resuspendre les cellules dans le tampon FACS (la quantité dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes à l'aide de l'exclusion bleue Trypan. Assurez-vous que la concentration cellulaire finale est de 107 cellules/mL (100 oL de tampon FACS pour 106 cellules). Ajouter 1 l de tache violette Fx Cycle pour 106 cellules pour distinguer les cellules mortes pendant le tri cellulaire. Préparer un contrôle non taché dans lequel Fx Cycle Violet tache n'est pas ajouté aux cellules.
REMARQUE : La concentration est optimisée pour une coloration et une vitesse efficaces lors du tri. Une concentration cellulaire plus faible se traduira par un temps de tri plus long, tandis qu'une concentration plus élevée affectera la coloration. - En utilisant le contrôle non taché, mettre en place une porte FACS ségrégation vivante (Fx Cycle Violet-) à partir de morts (Fx Cycle Violet)cellules. Ensuite, utilisez le tri des cellules activées par fluorescent (avec 450/50 passe de bande de filtre) pour la séparation et le comptage des cellules vivantes/mortes et pour placage le nombre désiré de cellules vivantes dans chaque puits des 96 plaques bien faible attachement. Chaque puits de la plaque doit être rempli de 200 L de tumorspheres médias avant de commencer le tri.
REMARQUE : Étant donné que les TPC sont une sous-population rare dans la tumeur entière, optimisez le protocole en placageant 100 cellules/puits de la souris RMS pour observer la formation des tumorspheres dans la culture de suspension. Le nombre de cellules par puits doit être ajusté pour la tumeur spécifique testée. - Placer les cellules dans l'incubateur jusqu'à la fin de l'expérience. Essayez de ne pas déranger la plaque à moins que nécessaire. Pour une expérience de 30 jours, chaque puits doit être reconstitué avec des médias et une proportion appropriée de facteurs de croissance chaque semaine (les médias ont tendance à s'évaporer et les facteurs de croissance ne sont pas efficaces après 1 semaine).
- Une fois l'expérience terminée, filtrer manuellement les plaques sous un microscope à champ lumineux pour identifier les tumorspheres (voir l'étape 3.6).
REMARQUE : Un délai de 30 jours a été optimisé pour détecter facilement les tumorspheres de la souris RMS de tailles allant de 50 à 300 m de diamètre. Le délai doit être ajusté en fonction de l'agressivité de la tumeur testée et de son taux de prolifération.
- Resuspendre les cellules dans le tampon FACS (la quantité dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes à l'aide de l'exclusion bleue Trypan. Assurez-vous que la concentration cellulaire finale est de 107 cellules/mL (100 oL de tampon FACS pour 106 cellules). Ajouter 1 l de tache violette Fx Cycle pour 106 cellules pour distinguer les cellules mortes pendant le tri cellulaire. Préparer un contrôle non taché dans lequel Fx Cycle Violet tache n'est pas ajouté aux cellules.
- Cellules de placage manuellement
- Resuspendre les cellules dans les médias tumorspheresphere (la quantité dépend de la pastille) et compter manuellement les cellules vivantes en utilisant le bleu trypan (1:10 dilution). Calculer la concentration cellulaire dans le tube et la plaque du nombre approprié de cellules dans une plaque d'attachement 96 bien faible. Placer les cellules dans l'incubateur jusqu'à la fin de l'expérience. Essayez de ne pas déranger la plaque à moins que nécessaire pour reconstituer les médias et les facteurs de croissance, tel que décrit à l'étape 3.4.3.
- Après l'achèvement de l'expérience, les plaques d'écran manuellement sous un microscope de champ lumineux pour identifier les tumorspheres ou en utilisant le logiciel Celigo, comme précédemment décrit dans Kessel et autres24 Voir l'étape 3.6 ci-dessous.
- Notez que deux lectures distinctes peuvent être évaluées à la suite de cet exemple : le nombre et la taille des tumorspheres formés.
REMARQUE : Lorsque plus d'une cellule est plaquée dans un puits, des tumorspheres ou des amas cellulaires peuvent se former(figure 1C,troisième et quatrième panneaux). Les amas cellulaires sont de petits agrégats cellulaires qui se forment dans la culture de suspension qui améliorent la survie cellulaire et sont caractérisés par une forme irrégulière. Les tumorsphères sont grandes et ont une structure plus compacte avec une forme sphéroïde. Ils dérivent d'une seule cellule qui a la capacité de survivre d'une manière indépendante d'ancrage et de proliférer à un taux élevé25. Le placage des cellules à travers le cytomètre d'écoulement ou manuellement peut être utilisé de façon interchangeable, selon les capacités disponibles en laboratoire. De plus, l'utilisation de plaques à faible fixation de taille différente de 96 plaques de puits est possible et dépend des résultats requis. En effet, l'évaluation de la fréquence de la tumorsphere devrait être faite en utilisant 96 plaques d'attachement bien faibles, tandis que le criblage initial pour l'évaluation du potentiel tumorigène de cellules donnera des résultats plus rapides et fiables sur 6 plaques bien basses d'attachement.
4. Traitement de la tumorsphere avec des protéines recombinantes
- Répétez les étapes 3.1 et 3.2.
- Si vous établiez un traitement avec des protéines recombinantes, déterminez d'abord la meilleure concentration à utiliser après la section 4.3, ou si la concentration optimale a déjà été déterminée, passez à la section 4.4.
- Déterminer la concentration de traitement protéique recombinant.
- Resuspendre les cellules dans les médias tumorsphere (le volume dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes en utilisant l'exclusion bleue Trypan. Calculer la concentration cellulaire dans le tube et la plaque 100.000 cellules dans une plaque d'attachement de 6 bien faible. Plaque deux puits par concentration testée et deux puits pour les contrôles non traités (figure 2). Les concentrations de protéines à tester sont basées sur la recherche documentaire.
- Traiter chaque puits de cellules de suspension avec une concentration de protéines différente et placer les cellules dans l'incubateur pendant 48 h (temps nécessaire pour être en mesure d'évaluer l'effet du traitement à la fois sur la viabilité cellulaire et sur l'expression des gènes cibles en aval). Ensuite, évaluez les paramètres suivants :
- Survie cellulaire : à l'aide d'un microscope à champ lumineux ainsi qu'à la comparaison avec les témoins non traités, vérifiez la morphologie cellulaire. Les cellules saines semblent brillantes et réfléchissantes sous le microscope, tandis que la mort cellulaire excessive induira l'accumulation de débris dans les médias. Pour une détermination quantifiable de la mort cellulaire, l'exclusion bleu Trypan, la coloration violette cristalline, MTT, ou TUNEL essai peut être utilisé (dans ce cas, ajouter un puits au placage d'origine).
- Effet des protéines recombinantes sur les voies en aval : effectuez une recherche documentaire à l'aide de PubMed pour identifier les gènes en aval connus pour être affectés par la protéine testée. Concevoir des amorces qRT-PCR pour les gènes cibles, et effectuer une analyse qRT-PCR sur l'ARN isolé des cellules traitées (Figure 2).
- Traiter avec des protéines recombinantes.
- Resuspendre les cellules dans les médias tumorsphere (le volume dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes en utilisant l'exclusion bleue Trypan. Déterminer le nombre total de cellules nécessaires pour l'expérience souhaitée (100 cellules par puits chacun d'une plaque d'attachement 96 bien faible) et les diluer dans le volume média tumorsphere approprié. Si vous effectuez plus d'un traitement, préparez des tubes cellulaires distincts.
- Traiter chaque tube avec la concentration appropriée de protéines recombinantes et plaquer les cellules dans un puits séparé de 96 plaques bien faible attachement. Le traitement sera répété sur chaque puits en fonction de la demi-vie de la protéine recombinante jusqu'au point final de 30 jours de l'expérience.
- À la fin de l'expérience, suivez les étapes 3.4.4 et 3.6 pour analyser les données.
5. Traitement de la tumorsphere avec plasmides surexpression
- Répétez les étapes 3.1 et 3.2.
- Si la mise en place du traitement sur un nouveau type de tumeur, d'abord déterminer la meilleure concentration de plasmide à utiliser après la section 5.3, ou si la concentration optimale d'ADN a été précédemment déterminée, passer à la section 5.4.
- Déterminer la concentration optimale de plasmide.
- Resuspendre les cellules dans les cellules tumorales (le volume dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes à l'aide de l'exclusion bleue Trypan. Plaquer les cellules comptées pour atteindre une confluence de 70% à 90% (le nombre de cellules est très dépendant de la taille et de la morphologie des cellules). GFP-plasmid sera utilisé pour tester l'efficacité de la transfection suivant le protocole du fabricant du réactif de transfection pour les cellules adhérentes. En parallèle, testez également un contrôle non traité (figure 3A). Effectuez un test d'efficacité dans une plaque de 24 puits.
REMARQUE : Les cellules adhérentes sont utilisées pour améliorer l'efficacité de la transfection, car la transfection effectuée sur les cellules de suspension n'est pas efficace et affecte négativement la viabilité cellulaire. - 48 h après la transfection évaluent les cellules pour les paramètres suivants :
- Survie cellulaire : à l'aide d'un microscope à champ lumineux, comparez le nombre de cellules présentes dans chaque puits et comparez-le bien aux cellules non traitées.
- Expression GFP : comptez le pourcentage de cellules qui sont GFP positives sur le nombre total de cellules dans chaque puits (figure 3B).
- Resuspendre les cellules dans les cellules tumorales (le volume dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes à l'aide de l'exclusion bleue Trypan. Plaquer les cellules comptées pour atteindre une confluence de 70% à 90% (le nombre de cellules est très dépendant de la taille et de la morphologie des cellules). GFP-plasmid sera utilisé pour tester l'efficacité de la transfection suivant le protocole du fabricant du réactif de transfection pour les cellules adhérentes. En parallèle, testez également un contrôle non traité (figure 3A). Effectuez un test d'efficacité dans une plaque de 24 puits.
- Traitement plasmide surexpression
- Resuspendre les cellules dans les cellules tumorales (le volume dépend de la taille des granulés) et compter manuellement les cellules vivantes à l'aide de l'exclusion bleue Trypan. Plaque 200 000 cellules par puits d'une plaque de 6 puits. Chaque puits sera utilisé pour un événement de transfection indépendant. Chaque puits sera transfecté à l'aide de la configuration développée pour le type de tumeur spécifique (Figure 3A).
- 24 h après la transfection, laver chaque puits avec 1x PBS et incuber les cellules dans la solution de détachement de cellules chaudes (assez pour couvrir le puits). Placez la plaque dans l'incubateur à 37 oC pendant 5 à 10 min, selon les facteurs détaillés à la section 2.15.
- Lorsque les cellules sont détachées, compter les cellules dérivées de chaque puits unique indépendamment en utilisant l'exclusion bleue Trypan. Placez 100 000 cellules par puits d'une plaque d'attachement de 6 puits, en veillant à ne pas mélanger les cellules dérivées de différents puits. Placer l'assiette dans l'incubateur à 37 oC et laisser tranquille pendant une semaine.
REMARQUE : La durée de cet assay est de 7 jours, un temps suffisant pour permettre la formation de tumorsphere tout en empêchant la fusion de la tumorsphere. La fusion de la tumorsphere est un phénomène qui devient évident quand 100.000 cellules ou plus sont plaquées ensemble dans la suspension pendant plus d'une semaine, qui peut biaiser l'évaluation de la capacité de formation de la tumorsphere. Dans le cas où l'expérience nécessite un temps d'incubation plus long, la densité cellulaire doit être ajustée ou des échafaudages polymères utilisés pour éviter la fusion de la tumorsphere26. - À la fin de l'expérience, suivez les étapes 3.5.2 et 3.6 pour analyser les données.
6. Préparation de la tumorsphere pour la transplantation d'allogreffe
- Placer la solution de matrice extracellulaire (ECM) (50 l par allogreffe) et les cellules tumorales (50 l par allogreffe) sur la glace.
- Les tumorspheres peuvent être utilisés pour les transplantations d'allogreffes. Rassembler toutes les tumorosphères obtenues à partir d'un type de cellule ou d'un traitement spécifique dans un tube de 15 ml ou 50 ml (selon le volume total des médias) (Figure 1D). Faites tourner les tumorspheres vers le bas à 300 x g pendant 5 min à RT. Enlevez le supernatant au-dessus des tumorspheres et lavez-les avec 10 ml de 1x PBS stérile.
- Faites tourner les tumorspheres vers le bas encore à 300 x g pendant 5 min à RT, aspirez le 1x PBS, et ajoutez 500 l à 1 ml de solution de détachement cellulaire sur le dessus de la pastille cellulaire, qui commence le processus de dissociation. Incuber les tumorspheres dans une solution digestive dans un bain d'eau secouant à 37 oC et vérifier la progression de la digestion toutes les 10 min. Pour aider les tumorspheres à se dissocier en une seule solution cellulaire, pipette les cellules de haut en bas pour les perturbations mécaniques. Le processus de digestion peut prendre jusqu'à 30 min.
REMARQUE : Malgré le fait que le temps d'incubation varie considérablement lorsque les tumorspheres sont dérivés de différentes cellules primaires de RMS, une diminution significative de la viabilité cellulaire par rapport au temps de digestion n'a jamais été observée. - Lorsqu'une solution cellulaire unique est obtenue, ajouter un volume de cellules tumorales (1:1, solution de détachement cellulaire : cellules tumorales) et la faire tourner à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
REMARQUE : À partir de ce moment, toutes les étapes doivent être exécutées sur la glace. Après la rotation, les tumorspheres ne forment pas une granule stable comme le font les solutions de cellules simples. Pour s'assurer de ne pas déloger ou aspirer les tumorspheres, utilisez une pipette de 1 ml et aspirez doucement le liquide. Déplacez-vous vers une pipette de 200 l lorsqu'il ne reste que 1 mL. - Resuspendre les cellules dans les cellules tumorales froides (le volume dépendra de la taille des granulés), placer les cellules sur la glace et compter les cellules vivantes en utilisant l'exclusion bleue Trypan. Après avoir déterminé la quantité appropriée de cellules à utiliser pour l'allogreffe, les resuspendre dans un volume total de 50 L de cellules tumorales froides médias. Refroidir une pointe pipette dans les cellules tumorales froides médias. Lorsque la pointe est froide, l'utiliser pour prendre 50 l de solution ECM et l'ajouter au tube contenant les cellules. Ne retirez pas les tubes de la glace pendant ce processus.
REMARQUE : Le nombre de cellules à utiliser pour la greffe devrait être déterminé en fonction de la tumeur testée et de l'objectif expérimental : un plus grand nombre de cellules transplantées diminueront le temps de développement de tumeur (20.000 cellules des tumorspheres de RMS de souris ont été montrées à se développer en tumeur 6 semaines après l'injection). Pour pouvoir comparer différentes lignées cellulaires ou différents traitements, il est important de partir du même nombre de cellules. - Comme les cellules sont maintenant prêtes pour la transplantation, maintenir sur la glace jusqu'à l'injection. Placez une seringue d'insuline plafonnée de 0,5 ml avec une aiguille de 29 G sur la glace, afin d'éviter que la solution cellulaire ne devienne solide dès l'aspiration.
- Allumez le débitmètre à 200 ml/min d'oxygène et le vaporisateur d'isoflurane à 2,5 %. Anesthésiez une souris NOD/SCID mâle de 2 mois en la plaçant à l'intérieur de la chambre d'induction. Attendez 2 à 3 min jusqu'à ce que la souris semble endormie et que la reproduction ait ralenti. Avant de commencer la procédure, d'abord confirmer par une pincée de pied que la souris est endormie, puis appliquer onguent vétérinaire sur les yeux. Raser le côté droit de l'animal, aspirer la solution cellulaire dans la seringue pré-réfrigérée et l'injecter sous-cutanée dans la zone rasée. Une bosse visible sous la peau se formera si l'injection est effectuée correctement.
REMARQUE : Les allogreffes cellulaires peuvent être effectuées dans la même souche de souris que celle des cellules transplantées. Par exemple, si les cellules RMS ont été à l'origine isolées d'une souris C57BL/6, l'allogreffe peut être réalisée chez des souris C57BL/6. Si la souche est différente, alors les souris immunodéficientes receveur devraient être utilisés pour éviter le rejet. L'âge des souris récepteuses peut également être ajusté en fonction de l'objectif expérimental. - Surveiller les souris pour la formation de tumeurs une fois par semaine.
REMARQUE : Pour valider l'identité de la tumeur dérivée de la transplantation d'allogreffe, il devrait être comparé à la tumeur originale à partir de laquelle les cellules ont été isolées. À cet effet, une analyse histologique des caractéristiques morphologiques et de l'expression des marqueurs myogéniques ainsi que des RNAseq plus complets peuvent être effectuées.
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Representative Results
Détection des tumorspheres
L'isolement cellulaire a été optimisé pour obtenir l'hétérogénéité maximale des populations cellulaires présentes dans le tissu tumoral. Tout d'abord, puisque les tissus isolés présentaient des zones morphologiquement différentes, afin d'améliorer les chances d'isoler des populations de cellules rares uniformes, l'échantillonnage a été effectué à partir de plusieurs zones de la tumeur(figure 1A, premier panneau sur la gauche). Deuxièmement, la dissociation mécanique des échantillons récoltés a été effectuée tout en maintenant l'homogénéité dans la taille du tissu haché, malgré différentes résistances qui auraient pu être présentes dans les échantillons (figure 1A, troisième et quatrième panneau de la gauche ). Selon le matériau de départ (agressivité tumorale, âge et génotype de la souris, emplacement tumoral), la récupération des cellules du stress mécanique du processus d'isolement peut varier, allant de 3-7 jours(figure 1A, dernier panneau sur la droite). Pour améliorer la survie et la croissance cellulaires, les médias doivent être modifiés le lendemain de l'isolement, puis tous les 2 jours. Cela permettra d'éliminer les débris et les cellules mortes accumulées au cours du processus d'isolement qui pourraient affecter la viabilité cellulaire. L'évaluation de la formation de la tumorsphère devrait commencer après que les cellules ont été passées au moins une fois pour assurer une viabilité optimale lorsqu'elles sont placées dans des cultures de suspension(figure 1B, premier panneau à gauche). Dans nos mains, des résultats optimaux ont été obtenus à partir de cellules du passage 2 (P2)(figure 1C, premier et deuxième panneau sur la gauche). Ce passage spécifique a été choisi après plusieurs tests. Quand les cellules de P0 ont été plaquées dans des conditions de bas-attachement, elles ont formé un petit nombre de tumorspheres comparés aux passages postérieurs, probablement dû aux débris cellulaires toujours présents après isolement. Dans les passages postérieurs, différents modèles de formation de tumorsphere ont été observés et attribués à la sélection qui se produit après de nombreux passages dans la culture. Lorsque différentes lignées cellulaires sont comparées, il est suggéré de commencer à partir du même passage.
La discrimination entre les tumorspheres et les amas cellulaires est d'une importance fondamentale pour la quantification de l'analyse. Figure 1C (les deux derniers panneaux à droite) montre clairement les différences morphologiques entre une tumeursphere (à gauche) et un amas cellulaire (à droite). Les tumorspheres dérivent d'une seule cellule qui a une capacité élevée de se renouveler et de se développer dans des conditions de faible attachement (les deux caractéristiques des TPC). En effet, le développement de la tumorsphere indique le potentiel de tumorigenicity. Cependant, cet exemple est effectué in vitro indépendamment des indices dérivés de l'organisme tout entier; ainsi, pour valider le potentiel tumorigène des cellules in vivo,des expériences de transplantation d'allogreffes devraient être effectuées (Figure 1D).
Validation du traitement des protéines recombinantes
Avant de mettre en place le traitement tumorspheres, la concentration optimale à laquelle la protéine d'intérêt déclenche un effet sur les cellules tumorales doit être déterminée. Pour ce faire, il est nécessaire d'évaluer le niveau d'expression des gènes cibles en aval de la protéine (figure 2). Une recherche de littérature sur PubMed a été effectuée avant de déterminer les gènes cibles à tester par qRT-PCR. Dans le cas où la protéine d'intérêt a été montrée pour moduler différentes voies en aval, la sélection de plusieurs gènes associés à chacune de ces voies devrait être exécutée. Par exemple, Flt3l (Fms-like tyrosine kinase 3) a été montré pour moduler la signalisation STAT5 dans la leucémie myéloïde aigue, induisant l'expression en aval de p21, c-Myc, et CyclinD1 (figure 2)27. En outre, l'expression de Flt3l est nécessaire pour la différenciation des cellules dendritiques de médiation de l'activation de stat3 voie de signalisation28. Pour évaluer l'activité de STAT3, l'expression Socs3 et CyclinD1 a été vérifiée (figure 2). L'analyse des résultats a montré un effet dépendant de la dose du traitement de protéine recombinante sur certains des gènes examinés (p21, CyclinD1, et Socs3), alors que d'autres n'ont pas été affectés (c-Myc). Il est important de déterminer les gènes en aval sensibles à la protéine d'intérêt dans la tumeur spécifique testée pour une évaluation fiable de l'efficacité du traitement.
Optimisation du protocole de transfection plasmide
Pour établir un protocole efficace pour la transfection plasmide et d'autres essais de formation de la tumorsphere, les effets de la transfection sur les cellules tumorales adhérentes ont été testés (Figure 3A). Le traitement de réactif de transfection a été exécuté suivant le protocole du fabricant, et deux quantités différentes du réactif ont été examinées. L'efficacité a été évaluée à l'utilisation d'un plasmide de journaliste de GFP. Dans nos mains, nous avons observé une efficacité de transfection plus élevée en utilisant des quantités plus faibles du réactif (Figure 3A). En effet, des concentrations plus élevées conduisent à une augmentation de la mort cellulaire, à partir de 48 h et de venant plus évidente après 72 h à partir du moment de la transfection. Le même protocole de transfection n'était pas efficace dans les cellules en suspension, car l'accumulation des cellules mortes et des débris cellulaires est devenue évidente 24 h après le début du traitement, indiquant la viabilité cellulaire diminuée. Pour surmonter ce défi technique, un protocole en deux étapes a été utilisé : effectuer la transfection sur les cellules adhérentes, les détacher 24 h après le traitement, et les suspendre pendant 7 jours de plus. Les tumorosphères témoins exprimaient en effet le GPF à la fin de l'expérience (Figure 3B).
Figure 1 : Isolement de cellules de tumeur, dérivation de tumorsphere, et transplantation. (A) Représentation schématique de la section 2 du protocole (isolement des cellules tumorales). Chaque étape clé du protocole est résumée. (B) Représentation schématique de la section 3 du protocole (dérivation des tumorspheres). Chaque étape clé du protocole est résumée. (C) De gauche à gauche : image en champ lumineux de cellules tumorales isolées au passage 2 (P2) à faible grossissement (barre d'échelle de 50 m) et grossissement élevé (barre d'échelle de 50 m); image de champ lumineux d'une tumeursphere dérivée des cellules de tumeur après 30 jours dans la culture de suspension (barre d'échelle ' 250 'm), et image lumineuse de champ d'un groupe de cellules formé à partir des cellules de tumeur après 30 jours dans la culture de suspension (barre d'échelle ' 50 'm). (D) Représentation schématique de la section 6 du protocole (transplantation d'allogreffe de la tumorsphère). Chaque étape clé du protocole est résumée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Validation des gènes cibles en aval pour déterminer la concentration de protéines recombinantes. résultats qRT-PCR pour l'évaluation de la concentration de traitement de Flt3l. ANOVA bidirectionnel a été exécuté. L'importance est montrée pour la comparaison avec le contrôle non traité. (p 'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01; 'p 'lt; 0.001; n '3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mise en place du protocole de transfection des tumorspheres. (A) Images représentatives du champ lumineux et fluorescentes des cellules tumorales traitées avec une faible (en haut) ou une concentration élevée (en bas) de réactif de transfection (0,75 l ou 1,5 l dans 24 plaques de puits) (barre d'échelle de 50 m). (B) Image représentative des tumorspheres formées à partir de cellules traitées au plasmide GFP, 7 jours après le placage des cellules en suspension (barre d'échelle de 50 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Des méthodes multiples ont été employées pour l'isolement et la caractérisation des TPC des populations hétérogènes de cellules de tumeur : essais clonogènes de tumeur, isolement de FACS, et analyse de formation de tumorsphere. L'exemple clonogène de tumeur a été décrit la première fois en 1971, employé pour des études de cellules souches, et seulement plus tard appliqué à la biologie de cancer29,30. Cette méthode est basée sur la propriété intrinsèque des cellules souches cancéreuses à se développer sans contraintes dans les cultures de gels mous31. Depuis son développement, cette méthode a été largement utilisée dans la recherche sur le cancer à des fins multiples, y compris les études d'hétérogénéité des cellules tumorales, l'effet du traitement hormonal sur la croissance cellulaire, et les études de résistance tumorale31. À ce jour, cet exemple est encore utilisé pour l'identification des cellules initiatrices de tumeurs pour plusieurs types de cancers32.
L'isolement FACS est basé sur la connaissance préalable des marqueurs moléculaires présents à la surface des cellules sur l'intérêt. Il a été largement utilisé pour l'isolement des TPC des tumeurs liquides et solides. Par exemple, la première identification des cellules initiatrices de la leucémie myéloïde aigue humaine (LAM) a été réalisée par le groupe du Dr Dick en utilisant des tests de fractionnement et de transplantation FACS basés sur la connaissance des marqueurs présents sur les cellules AML en vrac9. Utilisant une approche similaire, le groupe du Dr Clarke a isolé les cellules initiatrices du cancer du sein3. L'étude de la formation de la tumorsphère est une approche différente utilisée pour l'identification et l'étude des TPC. Cette méthode a d'abord été développée pour identifier les cellules souches cancéreuses des tumeurs cérébrales33. Fait intéressant, il a été initialement testé en utilisant les mêmes conditions connues pour favoriser la croissance des cellules souches neurales, favorisant ainsi la propriété d'auto-renouvellement également associée aux TPC33. En outre, la formation de tumorsphere repose sur la capacité des TPC à se croissancer d'une manière ancrage-indépendante.
Les trois approches décrites ci-dessus peuvent être utilisées en parallèle pour augmenter la probabilité d'isoler et de caractériser moléculairement les populations de TPC, surmontant les limites de chaque méthode. Par exemple, LE FACS, bien qu'il apporte le grand avantage d'isoler les populations de cellules pures, s'appuie fortement sur l'utilisation de marqueurs de surface qui ne sont pas encore connus pour tous les types de cancer. Ainsi, son utilisation se limite à l'isolement des TPC exprimant des marqueurs connus. Les essais de formation de clonogenic de tumeur et de tumeur sont tous les deux basés sur des propriétés cellulaires, connues pour être associées aux TPC. Ces deux méthodes peuvent être utilisées comme première ligne d'études sur les cancers nouveaux ou non encore étudiés. De plus, ces deux méthodes peuvent assurer l'expansion et l'enrichissement de la population cellulaire d'intérêt, facilitant l'identification des marqueurs moléculaires et permettant à la fois la résistance au cancer et les études de dépistage des médicaments. Dans ce contexte, l'analyse de formation de la tumorsphère est plus avantageuse, puisque ces structures sphéroïdes mieux recréer l'environnement présent dans les tissus tumoraux (zones hypoxiques dans le centre des sphères)34. En effet, il a déjà été démontré que les cultures 3D sont plus fiables pour prédire les résultats des traitements médicamenteux34. Les tumorspheres peuvent être récupérés après la culture, et utilisés pour des expériences d'allogreffe : la digestion des tumorspheres dans des solutions de cellules simples et la transplantation dans les souris destinataires permettront l'évaluation in vivo de la capacité tumorigenic de la nouvelle TPC identifiés, comparés aux cellules de tumeur en vrac.
Pour obtenir avec succès un matériel cellulaire de départ représentant de l'hétérogénéité tumorale, il est essentiel d'effectuer d'abord l'échantillonnage aléatoire du tissu. RMS sont caractérisés par des zones fibrotiques, grasses, ou fortement vascularisées qui sont clairement distinguables dans les tumeurs isolées, ainsi, pour maintenir cette diversité cellulaire, la collecte de chaque secteur du tissu sera exigée. En outre, pour améliorer les chances de survie des cellules pendant le processus de digestion, le mi-pied du tissu recueilli doit entraîner des morceaux de taille égale: de plus petits fragments sont plus susceptibles d'être surdisé induisant la réduction de la viabilité des cellules. Cela peut être particulièrement fastidieux en raison de la morphologie diversifiée et la rigidité de RMS.
Pour la quantification du résultat de l'analyse de formation de la tumorsphère, il est d'une importance critique de distinguer entre les véritables tumorosphères et les amas cellulaires(Figure 1C, les deux derniers panneaux sur la droite). Une tumorsphere est structure sphéroïde solide dans laquelle il n'est pas possible de discriminer le composiiton de cellules ; en revanche, dans un groupe cellulaire, les cellules individuelles peuvent être facilement discriminées. Les amas cellulaires peuvent ne pas prendre une forme arrondie et sont significativement plus petits par rapport aux tumorspheres, qui vont de 50 à 250 m25.
Pour réaliser la transplantation de tumorspheres, l'obtention d'une solution uniforme de cellules simples est une étape clé. En effet, étant donné la structure serrée et la grande taille d'une tumeursphere, la digestion des cellules devient une étape limitante majeure dans la préparation d'une suspension de cellules simples qui est davantage employée pour la transplantation. Des cycles multiples de digestion enzymatique combinés à la dissociation mécanique sont donc nécessaires pour la dissociation complète des tumorspheres. Pour confirmer les progrès de la dissociation et un résultat positif, la solution doit être surveillée au microscope lumineux.
En dépit des avantages multiples fournis par l'assay de formation de tumorsphere, les tumorspheres ont été montrés pour ne pas provenir de chaque type de tumeur ou de toutes les lignes de cellules disponibles commercialement. Dans ces cas, l'analyse ne peut pas être employée comme norme pour déterminer la tumorigenicité cellulaire et la quantification des TPC au sein d'une population hétérogène. Une autre limitation de cet assay est associée au fait que différents types de tumeur exigent différentes conditions de croissance et de dissociation ; ainsi, il exige l'optimisation et le dépannage de temps-temps des deux protocoles pour chaque type de tumeur ou ligne cellulaire. En outre, la fusion des tumorspheres multiples peut se produire dans la culture, rendant l'évaluation de leurs tailles et nombres peu claires.
Malgré le fait que l'analyse de formation de la tumorsphere a été précédemment utilisée dans les études RMS, il a été principalement appliqué à des lignées cellulaires RMS disponibles dans le commerce pour identifier les voies moléculaires impliquées dans la formation et le développement de tumeurs18, 20,21. Compte tenu de la composition hétérogène des tissus, des nombreux sous-types de tumeurs et de divers contextes de développement d'où provient RMS, l'utilisation des lignées cellulaires RMS limite l'application de cet analyse pour l'identification des deux cellules d'origine et signaux de développement qui mènent au développement de tumeur in vivo.
Une tentative de développer un protocole efficace pour la dérivation de la tumorsphère, à partir d'échantillons de sarcome humain, a déjà montré de mauvais résultats. En effet, les tumorspheres ont été développés à partir de seulement 10% des échantillons35. Ainsi, il y a un besoin pour un analyse reproductible et fiable pour l'isolement des cellules primaires de RMS et du développement de la tumorsphere. En réponse à ce besoin, l'assay décrit de formation de tumorsphere a été optimisé pour être employé dans les cultures cellulaires primaires. L'élaboration de ce protocole est la première étape vers la réponse à des questions majeures dans le domaine (c.-à-d. comment les cellules d'origine RMS diffèrent selon le contexte environnemental). Plus en détail, décrit ici est un protocole reproductible pour l'isolement des cellules tumorales primaires des tissus RMS, la formation des tumorspheres, le traitement de la tumorsphere (tous deux exécutés avec des protéines recombinantes ou des plasmides surexpression), et l'allogreffe expériences de transplantation.
En conclusion, l'essais de formation de la tumorsphere est une méthode bien établie et polyvalente pour l'identification des TPC dans différents types de tumeurs, enrichissant les cellules avec la capacité accrue d'auto-renouvellement et la capacité de se développer dans un ancrage-indépendant comportement. Cet analyse est basé sur les caractéristiques fonctionnelles des populations cellulaires étudiées et non sur la connaissance antérieure des marqueurs moléculaires; ainsi, il peut être appliqué comme outil exploratoire pour un large éventail de types de tumeurs. En outre, l'isolement des populations rares de cellules réalisées avec des cultures de tumorsphere fait de cet essai in vitro une plate-forme idéale pour le test de drogue de cancer.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention ag-NS-0843-11 de la Ellison Medical Foundation et par la subvention pilote des NIH au sein de la subvention de soutien du Centre de cancérologie de l'INC P30CA030199 à A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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