Summary
Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.
Abstract
Rhabdomyosarkom (RMS) çocuklarda en sık görülen yumuşak doku sarkomudur. Önemli çabalar RMS ile ilişkili yaygın mutasyonların belirlenmesini ve farklı RMS alt tiplerinin ayrımcılığa izin vermesine rağmen, prognozu daha da iyileştirmek için yeni tedavilerin geliştirilmesinde hala büyük zorluklar vardır. Miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile tanımlansa da, rms'nin miyojenik mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi olduğu konusunda hala önemli tartışmalar vardır, çünkü menşe hücresi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada fare RMS için tümörfer tetkik için güvenilir bir yöntem sağlanmıştır. Test tümör hücrelerinin fonksiyonel özelliklerine dayanmaktadır ve tümörijenik fonksiyonlar ile tümörnadir popülasyonların belirlenmesini sağlar. Ayrıca rekombinant proteinlerin test edilmesi, transfeksiyon protokollerinin tümörküre testi ile bütünleştirilmesi ve tümör gelişimi ve büyümesinde rol oynayan aday genlerin değerlendirilmesi için yapılan prosedürler de tanımlanmıştır. Ayrıca açıklanan in vivotümörijenik fonksiyonu doğrulamak için alıcı fareler içine tümörkürelerin allogreft nakli için bir prosedürdür . Genel olarak, açıklanan yöntem, farklı bağlamlarda ortaya çıkan RMS'lere uygulanabilen nadir RMS tümörijenik popülasyonların güvenilir bir şekilde tanımlanmasına ve test edilmesine olanak sağlar. Son olarak, protokol ilaç taraması ve terapötik gelecekteki gelişimi için bir platform olarak kullanılabilir.
Introduction
Kanser heterojen bir hastalıktır; ayrıca, aynı tip tümör farklı hastalarda farklı genetik mutasyonlar sunabilir, ve bir hasta içinde bir tümör hücrelerin birden fazla popülasyonları oluşur1. Heterojenlik, kanserin başlatılmasından ve yayılmasından sorumlu hücrelerin belirlenmesinde bir sorun teşkil eder, ancak bunların karakterizasyonu etkin tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir. Tümör yayılma hücreleri kavramı (TPC), tümör gelişimine katkıda bulunan hücrelerin nadir bir popülasyon, daha önce kapsamlı olarak gözden geçirilmiştir2. TPTS kanser birden fazla tip karakterize olmasına rağmen, onların güvenilir izolasyon için belirteçleri belirlenmesi çeşitli tümör tipleri için bir sorun olmaya devam etmektedir3,4,5,6 , 7.000 , 8.000 , 9- Bu nedenle, moleküler belirteçlere değil, TPC fonksiyonel özelliklerine (yüksek kendini yenileme ve düşük bağlanma koşullarında büyüme yeteneği) dayanan bir yöntem, tümörküre oluşumu tsay olarak bilinen, yaygın olarak uygulanabilir çoğu tümörden TPC'lerin belirlenmesi. Daha da önemlisi, bu tsay da TPCs genişlemesi için istihdam edilebilir ve böylece doğrudan kanser ilaç tarama ve kanserdirenciçalışmaları 1 ,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) yumuşak doku sarkomu en küçük çocuklarda en sık görülen birformudur 11. Althoug RMS histolojik olarak miyojenik belirteçlerin ekspresyonunun değerlendirilmesi ile saptanabilir, RMS kökenli hücre birden fazla tümör alt tipleri ve tümör gelişimsel uyaranlarının yüksek heterojenliği nedeniyle tek kesin olarak karakterize edilmemiştir. Nitekim, son çalışmalar RMS miyojenik veya non-miyojenik kökenli olup olmadığı hakkında önemli bilimsel tartışma üretti, RMS bağlam12bağlı olarak farklı hücre tiplerinden elde edilebilir düşündüren 12,13, 14.000 , 15.000 , 16.02.20 , 17- Tümör gelişimi ve yüksek oranda kendini yenileme popülasyonları ile ilişkili belirteçlerin karakterizasyonu ile ilgili yolların belirlenmesi için tümörküre oluşumu tetkiklerinin geliştirilmesi için RMS hücre hatları üzerinde çok sayıda çalışma yapılmıştır. 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 21. yıl.
Ancak, tümörküre oluşumu tsay kökenli RMS hücrelerini tanımlamak için potansiyeline rağmen, birincil RMS hücreleri üzerinde istihdam edilebilir güvenilir bir yöntem henüz tarif edilmemiştir. Bu bağlamda, grubumuzdan yeni bir çalışmada duchenne kas distrofisi (DMD) fare modeli22kökenli RMS hücrelerinin belirlenmesi için optimize edilmiş bir tümörsphere oluşumu tetkik istihdam . Kas dokularından izole edilmiş birden fazla pre-tümörijenik hücre tipi, düşük bağlanma koşullarında büyüme yetenekleri açısından test edilerek, distrofik bağlamlarda RMS için başlangıç hücreleri olarak kas kök hücrelerinin tanımlanmasına olanak sağlar. Burada tanımlanan, fare RMS gelişiminden sorumlu son derece nadir hücre popülasyonlarının belirlenmesinde başarıyla kullanılan tümörsphere formasyon uyrmuş test(Şekil 1)için tekrarlanabilir ve güvenilir bir protokoldür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute'un onaylı IACUC protokolü nün ardından farelerin barınma, tedavisi ve kurban edilmesi gerçekleştirildi.
1. Reaktif hazırlama
- 100 mL hücre izolasyonu ortamı hazırlayın: F10 orta %10 at serumu (HS) ile desteklenir.
- 50 mL kollajenaz tip II çözeltisini hazırlayın: hücre izolasyon uytonunun 50 mL'sinde 1 g kollajenaz tipi II tozunu çözündürün (çok bağlı olarak birim sayısı değiştiğinden, 1 mL'lik ortam başına enzimin birimlerine dikkat edin). Aliquot çözeltisi ve kullanıma hazır olana kadar -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
NOT: Enzim aktivitesi farklı kuralar arasında değişebileceğinden, kollajenazın her yeri kullanılmadan önce test edilmelidir. - İkinci sindirim çözeltisi numunesi başına 10 mL hazırlayın: 100 birim/mL kollajenaz tip II çözeltisi ve 2 birim/mL dispase II taze ağırlıklı hücre izolasyon u Kullanmadan hemen önce hazırlayın.
- 500 mL tümör hücresi ortamı hazırlayın: DMEM yüksek glukoz %20 FBS ve %1 kalem/strep ile desteklenir.
- 500 mL FACS tamponu hazırlayın: %2,5 v/v normal keçi serumu ve 1 mM EDTA ile desteklenen 1x PBS.
- 500 mL tümörsphere media hazırlayın: DMEM/F12 %1 kalem/strep ile desteklenir. Kullanımdan hemen önce aşağıdaki büyüme faktörlerini ekleyin: %1 N2 takviyesi, 10 ng/mL EGF ve 10 ng/mL β-FGF.
2. Hücre izolasyonu ve kültür
- 5 mL hücre izolasyon umasını içeren 10 cm'lik bir plaka hazırlayın (tümör numunesi başına bir tabak) ve tümör dokusuhasata hazır olana kadar 37 °C'de bir kuvöze yerleştirin.
- RMS kendiliğinden Duchenne kas distrofisi için hem erkek hem de kadın fare modellerinde geliştirmek bildirilmiştir, B10 mdx fareler gibi yaş yaklaşık 18 ay ve B6 mdx / mTR farelerde 9 ay22,23. Isofluran kullanarak RMS tümörü geliştiren fareyi anestezi altına alın ve servikal çıkık yoluyla veya kurumun IACUC kurallarına göre hayvanı kurban edin. Makas ile, tümörün lokalize olduğu bölgede deri üzerinde bir kesi yapmak, ve (cımbız kullanarak) ilgi alanından uzak deri çekin. Jilet kullanmak, hayvanı sağır etmek.
- Tümör dokusunun 500-1.000 mg tartMak ve adım 2.1(Şekil 1A)hazırlanan plaka yerleştirin.
NOT: Daha büyük miktarda doku sindirim adımlarını olumsuz etkiler ve genel verimi düşürür. Hasat edilen tümör 1000 mg'dan büyükse, istenilen ağırlığa ulaşıncaya kadar parçalara bölün ve rastgele numune alın. Doku heterojenitenin değerlendirilmesi için rastgele örnekleme gereklidir. - Steril hücre kültürü başlık tümör dokuları içeren plaka yerleştirin ve bir jilet ile kıyma. RMS tümör dokusu heterojendir; böylece, farklı alanlarda kesim farklı direnç sunabilir. En iyi sindirimi sağlamak için elde edilen kıyma lı parçaların boyutlarının tek düze olduğundan emin olun.
NOT: RMS her tümörde tanımlanabilen farklı doku tiplerinin (özellikle fibrotik, vaskülarize ve yağ dokuları) karışımı olarak bulunur. 1) doğru orijinal tümörün bileşimi recapitulating heterojen hücre popülasyonu izole ve 2) izolasyon prosedürü önyargı değil, hasat doku rasgele örnekleme yapmak. Tümörün farklı bölgelerinden gelen hücreler bölüm 3'te açıklanan testte paralel in vitro olarak sindirilmeli ve test edilmelidir. - Kıyma lı dokuyu ve hücre izolasyon ortamını 15 mL'lik bir santrifüj tüpe taşıyın, plakayı 4 mL hücre izolasyonlu ortamla yıkayın ve tüpe yerleştirin.
- 1,5 saat boyunca 37 °C'de sallayarak su banyosunda dokuyu sindirmek ve tüpbebek yapmak için 700 adet/mL kollajenaz çözeltisi ekleyin.
- Kuluçkadan sonra, 300 x g'de ver. Telini bozmadan süpernatantı aspire edin, ikinci sindirim çözeltisi (dispase) 10 mL'de peleti yeniden askıya alın ve 37 °C'de 30 dakika sallayarak su banyosunda kuluçkaya yatırın.
- İkinci sindirim tamamlandıktan sonra, yukarı ve aşağı boru ve 50 mL santrifüj tüp üzerinde 70 μm naylon filtre ile hücre süspansiyon geçmek. Daha sonra filtreyi yıkamak ve sindirim çözeltisini seyreltmek için 10 mL hücre izolasyonu ortamı ekleyin ve 5 dk boyunca 300 x g ve RT'de dokuyu aşağı doğru döndürün.
- Tümör hücrelerinin 20 mL'lik mediasında eksnatantı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın. Daha sonra hücre süspansiyonuna 15 cm'lik hücre kültür plakası ile aktarın. Hücreleri bir gecede 37 °C'de kuvöze yerleştirin. Bu plaka P0 olarak tanımlanacak.
- Tecritten sonraki gün, medyayı değiştirin. Bu adım, hücre sağkalımını olumsuz etkileyebilecek enkaz ve ölü hücrelerin çıkarılmasını sağlamak için gereklidir.
- Başlangıç materyali ve hücre boyutuna bağlı olarak %30-60 arasında değişen ortam değiştirildikten sonra hücre birleşimini değerlendirin. %90 biraraya gelene kadar hücreleri kuvözde büyüyen bırakın. Hücreleri her gün izleyin ve 2 günde bir ortam değiştirin. Tümör hücrelerinin konfluent hale gelmesi için gereken süre birden fazla parametreye bağlı olarak değişir: tümör agresifliği, tümörün genotip, farenin yaşı, dokunun heterojenliği.
- Hücre geçişi için aşağıdakileri yapın:
- 37 °C'de bir su banyosunda hücre ayırma solüsyonu ve tümör hücrelerini ısıtın.
- Hücreleri 1x steril PBS ile yıkayın ve 5-10 dakika boyunca 10 mL sıcak hücre dekolmanı çözeltisi içinde 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Tüm hücreler plakadan ayrıldığında, 10 mL sıcak tümör hücresi ortamı ekleyin, çözeltiyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne taşıyın ve hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Pelet boyutuna bağlı olarak tümör hücrelerinin 5-10 mL'inde hücreleri yeniden askıya alın ve ölü hücreleri dışlamak için Trypan mavisi (1:5 seyreltme) kullanarak canlı hücreleri sayın.
- Plaka 105 hücre 10 cm plakalar veya 3 x 105 hücreleri 15 cm plakalar. Hücre katlama süresi adım 2.10 ayrıntılı faktörlere bağlı olarak değişir.
3. Tümörsphere türevi
- Birden fazla geçitten hücre seçimini önlemek için P1 veya P2 geçidindeki tümör hücrelerini kullanın(Şekil 1B). Hücreleri tabaktan ayırmak için, önce bulaşıkları hücreleri rahatsız etmeden 1x PBS ile yıkayın, sonra hücre ayırma solüsyonu (10 cm plaka için 5 mL veya 15 cm plaka için 10 mL) kullanarak kapatın ve 5-10 dakika kuluçka makinesine yerleştirin.
- Hücrelerin parlak alan mikroskobu altında plakaya bakarak ayrılmış olduğunu doğrulayın, tümör hücreleri medya (hücre dekolmanı çözüm: tümör hücreleri medya) 1:1 hacim ekleyin, bir santrifüj tüpü içine hücre süspansiyon yerleştirin ve 5 için 300 x g hücreleri aşağı spin RT de min.
- Kaplama için kullanılan yönteme göre, FACS tampon (bölüm 3.4) veya tümörküreler ortam (bölüm 3.5) hücreleri resuspend.
- Akış sitometresi ile hücreleri kaplama
- FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın (miktar pelet boyutuna bağlıdır) ve Trypan mavisi hariç tutularak canlı hücreleri el ile sayar. Son hücre konsantrasyonunun 107 hücre/mL olduğundan emin olun (106 hücre de 100 μL FACS tamponu). Hücre sıralama sırasında ölü hücrelerden canlı ayırt etmek için 106 hücre başına 1 μL Fx Döngüsü Menekşe lekesi ekleyin. Hücrelere Fx Döngüsü Menekşe lekesi eklenmediği lekesiz bir kontrol hazırlayın.
NOT: Konsantrasyon, sıralama sırasında verimli boyama ve hız için optimize edilir. Daha düşük bir hücre konsantrasyonu daha uzun bir sıralama süresi neden olurken, daha yüksek bir konsantrasyon boyama etkileyecektir. - Lekesiz kontrolü kullanarak, ölü (Fx Cycle Violet+) hücrelerinden canlı (Fx Cycle Violet-) ayıran bir FACS kapısı ayarlayın. Daha sonra, canlı/ölü hücrelerin ayrılması ve sayımı için floresan aktif hücre sıralaması (450/50 filtre bandı geçişi ile) ve 96 kuyunun her kuyuda istenilen sayıda canlı hücreyi kaplamak için 96 iyi düşük ek plakasının her birinde istenilen sayıda canlı hücreyi kaplamak için. Sıralamaya başlamadan önce plakanın her kuyusu 200 μL tümörküre ler ile doldurulmalıdır.
NOT: TBM'lerin tüm tümör içinde nadir bir alt popülasyon olduğu göz önüne alındığında, süspansiyon kültüründe tümör kürelerinin oluşumunu gözlemlemek için fare RMS'den 100 hücre/kuyu kaplayarak protokolü optimize edin. Kuyu başına hücre numarası test edilen özel tümör için ayarlanmalıdır. - Deney sonuna kadar hücreleri kuvöze yerleştirin. Gerekli olmadıkça plakayı bozmamaya çalışın. 30 günlük bir deney için, her bir kuyu medya ve büyüme faktörlerinin uygun bir oranı her hafta (medya buharlaşma eğilimindedir ve büyüme faktörleri 1 hafta sonra etkili değildir) ile doldurulmalıdır.
- Deney tamamlandıktan sonra, tümör kürelerini tanımlamak için plakaları parlak alan mikroskobu altında elle taranır (bkz. adım 3.6).
NOT: 30 günlük bir zaman dilimi, 50-300 μm çapında ki fare RMS tümör kürelerini kolayca tespit etmek için optimize edildi. Zaman dilimi test edilen tümörün agresifliğine ve proliferatif oranına bağlı olarak ayarlanmalıdır.
- FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın (miktar pelet boyutuna bağlıdır) ve Trypan mavisi hariç tutularak canlı hücreleri el ile sayar. Son hücre konsantrasyonunun 107 hücre/mL olduğundan emin olun (106 hücre de 100 μL FACS tamponu). Hücre sıralama sırasında ölü hücrelerden canlı ayırt etmek için 106 hücre başına 1 μL Fx Döngüsü Menekşe lekesi ekleyin. Hücrelere Fx Döngüsü Menekşe lekesi eklenmediği lekesiz bir kontrol hazırlayın.
- Hücreleri el ile kaplama
- Tümörsphere media hücreleri resuspend (miktar pelet bağlıdır) ve el ile trypan mavi (01:10 seyreltme) kullanarak canlı hücreleri saymak. Tüpteki hücre konsantrasyonu hesaplayın ve 96 iyi düşük ek plakasındaki uygun hücre sayısını plakalayın. Deney sonuna kadar hücreleri kuvöze yerleştirin. Adım 3.4.3'te açıklandığı gibi, ortam ve büyüme faktörlerinin yenilenmesi için gerekli olmadıkça plakayı bozmamaya çalışın.
- Deney tamamlandıktan sonra, ekran plakaları daha önce Kessel ve ark.24 Bkz. aşağıdaki adım 3.6'da açıklandığı gibi, tümör kürelerini tanımlamak veya Celigo yazılımını kullanmak için parlak alan mikroskobu altında manuel olarak plakalar.
- Bu tetkik sonucunda iki ayrı okumanın değerlendirilebileceğini unutmayın: oluşan tümör kürelerinin sayısı ve büyüklüğü.
NOT: Bir kuyuda birden fazla hücre kaplandığında tümör küreleri veya hücre kümeleri oluşabilir(Şekil 1C, üçüncü ve dördüncü paneller). Hücre kümeleri, hücre sağkalımLarını artıran ve düzensiz bir şekille karakterize edilen süspansiyon kültüründe şekillenmiş küçük hücresel agregalardır. Tümör küreler büyüktür ve küresel bir şekle sahip daha kompakt bir yapıya sahiptir. Onlar bir ankraj bağımsız bir şekilde hayatta kalmak ve yüksek oranda25çoğalmak yeteneğine sahip tek bir hücreden türetilmiştir. Akış sitometre sinden veya el ile hücrelere kaplama, laboratuvarda mevcut yeteneklere bağlı olarak birbirinin yerine kullanılabilir. Ayrıca, 96 kuyu plakası farklı boyutlarda düşük eki plakalar istihdam mümkündür ve gerekli sonuca bağlıdır. Gerçekten de, tümörsfer frekansının değerlendirilmesi 96 iyi düşük ek plakası kullanarak yapılmalıdır, hücrelerin tümörijenik potansiyelinin değerlendirilmesi için ilk tarama 6 iyi düşük ek plakalar üzerinde daha hızlı ve güvenilir sonuçlar verecektir.
4. Rekombinant proteinler ile tümörsfer tedavisi
- 3.1 ve 3.2 adımlarını yineleyin.
- Rekombinant proteinler ile bir tedavi ayarlıyorsanız, ilk olarak aşağıdaki bölüm 4.3'te kullanılacak en iyi konsantrasyonu belirleyin veya optimal konsantrasyon daha önce belirlenmişse, bölüm 4.4'e atlayın.
- Rekombinant protein tedavi konsantrasyonu belirleyin.
- Tümörsfer medyasındaki hücreleri yeniden askıya alın (hacim pelet boyutuna bağlıdır) ve Trypan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri el ile sayar. Tüpteki hücre konsantrasyonu ve 6 iyi düşük ek plakasında 100.000 hücreyi hesaplayın. Test edilen her konsantrasyon başına iki kuyu ve işlenmemiş kontroller için iki kuyu(Şekil 2). Test edilecek protein konsantrasyonları literatür taramasına dayanmaktadır.
- Süspansiyon hücrelerinin her kuyuyu farklı bir protein konsantrasyonu yla tedavi edin ve hücreleri 48 saat boyunca kuvöze yerleştirin (tedavinin hem hücre canlılığı hem de aşağı akım hedef genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirebilmek için gereken süre). Ardından, aşağıdaki parametreleri değerlendirin:
- Hücre sağkalım: parlak alan mikroskobu kullanarak yanı sıra işlenmemiş kontrolleri ile karşılaştırıldığında, hücre morfolojisi kontrol edin. Sağlıklı hücreler mikroskop altında parlak ve yansıtıcı görünürken, aşırı hücre ölümü medyada enkaz birikimine neden olur. Hücre ölümünün ölçülebilir bir belirlenmesi için, Trypan mavi dışlama, kristal mor boyama, MTT, veya TUNEL tayini istihdam edilebilir (bu durumda, orijinal kaplama bir kuyu ekleyin).
- Rekombinant proteinlerin downstream yolları üzerindeki etkisi: Test edilen proteinden etkilendiği bilinen downstream genlerinin belirlenmesi için PubMed kullanarak bir literatür araştırması yapın. Hedef genler için qRT-PCR astarları tasarlar ve tedavi edilen hücrelerden izole edilen RNA üzerinde qRT-PCR analizi ni gerçekleştirin(Şekil 2).
- Rekombinant protein ile tedavi edin.
- Tümörsfer medyasındaki hücreleri yeniden askıya alın (hacim pelet boyutuna bağlıdır) ve Trypan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri el ile sayar. İstenilen deney için gereken toplam hücre sayısını (96 iyi düşük ek plakanın her kuyusu için 100 hücre) belirleyin ve bunları uygun tümörsphere media hacminde seyreltin. Birden fazla tedavi yapıyorsanız, ayrı hücre tüpleri hazırlayın.
- Her tüpe uygun rekombinant protein konsantrasyonu ile davranın ve hücreleri 96 iyi ek li plakanın ayrı bir kuyusunda plakalayın. Tedavi, rekombinant proteinin yarılanma ömrüne bağlı olarak deney30 günlük bitiş noktasına kadar her kuyuda tekrarlanacaktır.
- Denemenin sonunda, verileri çözümlemek için 3.4.4 ve 3.6 adımlarını izleyin.
5. Aşırı ekspresyon plazmidleri ile tümörsphere tedavisi
- 3.1 ve 3.2 adımlarını yineleyin.
- Tedaviyeni bir tümör tipinde ayarlanıyorsa, önce aşağıdaki bölüm 5.3'ü kullanmak için en iyi plazmid konsantrasyonu belirleyin veya optimal DNA konsantrasyonu daha önce belirlenmişse, bölüm 5.4'e atlayın.
- Optimal plazmid konsantrasyonu belirleyin.
- Tümör hücreleri ortamda hücreleri resuspend (hacim pelet boyutuna bağlıdır) ve el ile Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak. %70-90 arasında bir kesit elde etmek için sayılan hücreleri plakalayın (hücre sayısı hücre büyüklüğü ve morfolojisine son derece bağlıdır). GFP-plazmid yapışık hücreler için transfeksiyon reaktifüretici protokolü aşağıdaki transfeksiyon verimliliğini test etmek için kullanılacaktır. Buna paralel olarak, işlenmemiş bir denetimi de test edin (Şekil 3A). 24 kuyu plakasında verimlilik testi yapın.
NOT: Askı lı hücrelere yapılan transfeksiyon verimli olmadığı ve hücre canlılığını olumsuz etkilediği için, yapışık hücreler transfeksiyon verimliliğini artırmak için kullanılır. - Transfeksiyondan sonra 48 saat hücreleri aşağıdaki parametreler için değerlendirin:
- Hücre sağkalım: parlak alan mikroskobu kullanarak, her kuyuda bulunan hücre sayısını karşılaştırın ve iyi tedavi edilmemiş hücrelerle karşılaştırın.
- GFP ifadesi: GFP pozitif olan hücrelerin yüzdesini her kuyudaki toplam hücre sayısıüzerinden sayar (Şekil 3B).
- Tümör hücreleri ortamda hücreleri resuspend (hacim pelet boyutuna bağlıdır) ve el ile Trypan mavi dışlama kullanarak canlı hücreleri saymak. %70-90 arasında bir kesit elde etmek için sayılan hücreleri plakalayın (hücre sayısı hücre büyüklüğü ve morfolojisine son derece bağlıdır). GFP-plazmid yapışık hücreler için transfeksiyon reaktifüretici protokolü aşağıdaki transfeksiyon verimliliğini test etmek için kullanılacaktır. Buna paralel olarak, işlenmemiş bir denetimi de test edin (Şekil 3A). 24 kuyu plakasında verimlilik testi yapın.
- Aşırı ekspresyon plazmid tedavisi
- Tümör hücre li media'daki hücreleri yeniden askıya alın (hacim pelet boyutuna bağlıdır) ve Trypan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri el ile sayar. 6 kuyu plakasının kuyubaşına 200.000 hücre sini koyun. Her kuyu bağımsız bir transfection olay için kullanılacaktır. Her kuyu, spesifik tümör tipi için geliştirilen kurulum kullanılarak transfeced olacaktır(Şekil 3A).
- Transfeksiyondan 24 saat sonra, her kuyuyu 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri sıcak hücre dekolmanı çözeltisinde kuluçkaya yatırın (kuyuyu örtmeye yetecek kadar). Bölüm 2.15'te belirtilen faktörlere bağlı olarak plakayı 37 °C'de 5-10 dakika süreyle kuvöze yerleştirin.
- Hücreler ayrıldığında, Trypan mavisi dışlamayı kullanarak her kuyudan bağımsız olarak türetilen hücreleri sayın. Farklı kuyulardan elde edilen hücreleri karıştırmamaya özen en iyi 6 iyi eki plakanın kuyubaşına 100.000 hücre yerleştirin. Tabağı 37 °C'de kuvöze yerleştirin ve bir hafta boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
NOT: Bu tetkik süresi 7 gündür, tümörküre oluşumunu sağlamak için yeterli bir süre ve tümörküre füzyonunu önlemek için. Tümörsphere füzyon 100.000 veya daha fazla hücre 1 hafta boyunca süspansiyon birlikte kaplanmış zaman belirgin hale gelen bir olgudur, hangi tümörküre oluşumu yeteneği nin değerlendirilmesi önyargı olabilir. Deneyin daha uzun kuluçka süresi gerektirmesi durumunda, hücre yoğunluğu ayarlanmalı veya tümörsphere füzyonu önlemek için kullanılan polimerik iskeleler26. - Denemenin sonunda, verileri çözümlemek için 3.5.2 ve 3.6 adımlarını izleyin.
6. Allogreft transplantasyonu için tümörfer hazırlığı
- Ekstrasellüler matriks (ECM) çözeltisi (allogreft başına 50 l) ve tümör hücreleri media'yı (allogreft başına 50 μL) buz üzerine yerleştirin.
- Tümörküreler allogreft transplantasyonları için kullanılabilir. Belirli bir hücre tipinden veya tedaviden elde edilen tüm tümör küreleri 15 mL veya 50 mL'lik bir tüpe (toplam ortam hacmine göre) bir araya getirin(Şekil 1D). Rt 5 dakika için 300 x g aşağı tümör küreleri spin. Tümör küreler üzerinde supernatant çıkarın ve steril 1x PBS 10 mL ile yıkayın.
- Tümör kürelerini rt'de 5 dakika boyunca 300 x g'de tekrar aşağı döndürün, 1x PBS'yi aspire edin ve hücre peletinin üstüne hücre ayırma çözeltisinin 500 μL'sini ekleyin, bu da dissosiasyon sürecini başlatır. 37 °C'de bir sallayarak su banyosu içine sindirim çözeltisi içinde tümörküreler inkübün ve sindirim ilerlemesini kontrol edin her 10 dakikada. Tümörkürelerin tek bir hücre çözeltisi halinde bölünmesine yardımcı olmak için, mekanik bozulma için hücreleri yukarı ve aşağı pipet. Sindirim işlemi 30 dakika kadar sürebilir.
NOT: Tümörküreler farklı primer RMS hücrelerinden elde edildiğinde kuluçka süresi önemli ölçüde değişse de, sindirim süresine ilişkin hücre canlılığında önemli bir azalma gözlenmemiştir. - Tek bir hücre solüsyonu elde edildiğinde, tümör hücrelerinin media (1:1, hücre dekolmanı çözeltisi: tümör hücreleri media) bir hacim ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika için 300 x g aşağı spin.
NOT: Şu andan itibaren tüm adımların buz üzerinde yapılması gerekmektedir. Döndükten sonra, tümör küreler tek hücre çözümleri gibi istikrarlı bir pelet oluşturmaz. Tümör kürelerinin yerinden çıkarmaması veya aspire edilmemesi için 1 mL'lik pipet kullanın ve sıvıyı hafifçe aspire edin. Sadece 1 mL kaldığında 200 μL'lik bir pipete geçin. - Soğuk tümör hücreleri ortamda ki hücreleri yeniden askıya alın (hacim pelet boyutuna bağlıdır), hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve Trypan mavisi dışlama kullanarak canlı hücreleri sayın. Allogreft için kullanılacak uygun hücre miktarını belirledikten sonra, soğuk tümör hücrelerinin media 50 μL toplam hacminde yeniden askıya. Soğuk tümör hücrelerinin ortamlarında bir pipet ucunu soğutun. Ucu soğuk olduğunda, 50 μL ECM çözeltisi almak ve hücreleri içeren tüpe eklemek için kullanın. Bu işlem sırasında tüpleri buzdan çıkarmayın.
NOT: Nakil için kullanılacak hücre sayısı test edilen tümör ve deneysel hedefe göre belirlenmelidir: daha fazla sayıda nakledilen hücre tümör gelişme süresini azaltacaktır (fare RMS tümör kürelerinden 20.000 hücre gösterilmiştir enjeksiyondan 6 hafta sonra tümörhaline gelişir). Farklı hücre hatları veya farklı tedaviler karşılaştırmak edebilmek için, hücrelerin aynı sayıda başlamak önemlidir. - Hücreler nakil için hazır olduğundan, enjeksiyona kadar buzda korunun. Hücre çözeltisinin aspirasyon üzerine katılaşmasını önlemek için, 29 G iğneli 0,5 mL'lik bir insülin şırıngasını buza yerleştirin.
- Akış ölçeri 200 mL/dk oksijene, izofluran buharlaştırıcıyı %2,5'e açın. 2 aylık erkek NOD/SCID fareyi indüksiyon odasına yerleştirerek anestezi edin. Fare uykuda görünene ve üreme yavaşladı kadar 2-3 dk bekleyin. İşleme başlamadan önce, önce farenin uyuduğunu bir ayak tutam ile onaylayın, sonra gözlere veteriner merhemuygulayın. Hayvanın sağ tarafını tıraş edin, önceden soğutulmuş şırıngadaki hücre çözeltisini aspire edin ve deri altı olarak tıraş alanına enjekte edin. Enjeksiyon doğru yapılırsa deri altında gözle görülür bir yumru oluşacaktır.
NOT: Hücre allogreftleri nakledilen hücrelerin ki ile aynı fare zorlanma sında yapılabilir. Örneğin, RMS hücreleri ilk olarak bir C57BL/6 fareden izole edilmişse, allogreft C57BL/6 farelerinde yapılabilir. Zorlanma farklı ise, o zaman immüneksik alıcı fareler reddedilmeyi önlemek için kullanılmalıdır. Alıcı farelerin yaşları da deneysel hedefe bağlı olarak ayarlanabilir. - Haftada bir kez tümör oluşumu için fareleri izleyin.
NOT: Allogreft transplantasyonundan elde edilen tümörün kimliğini doğrulamak için hücrelerin izole edildiği orijinal tümörle karşılaştırılmalıdır. Bu amaçla morfolojik özellikler ve miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ve daha kapsamlı RNAseq için histolojik analiz ler yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tümör küreleri tespiti
Hücre izolasyonu tümör dokusunda bulunan hücre popülasyonlarının maksimum heterojenliğini elde etmek için optimize edildi. İlk olarak, izole dokular morfolojik olarak farklı alanlar sunduğından, tek tip nadir hücre popülasyonlarını izole etme şansını artırmak için, tümörün birden fazla alanından örnekleme yapıldı(Şekil 1A, soldaki ilk panel). İkinci olarak, hasat edilen numunelerin mekanik ayrılması, kıyma doku boyutunda homojenlik korunurken, numuneler arasında mevcut olabilecek farklı dirençlere rağmen(Şekil 1A, soldan üçüncü ve dördüncü panel ). Başlangıç materyaline (tümörün agresifliği, yaşı ve farenin genotipine, tümörün konumuna) bağlı olarak, izolasyon sürecinin mekanik stresinden hücrelerin geri kazanımı 3-7 gün arasında değişebilir(Şekil 1A, sağdaki son panel). Hücre sağkalım ını ve büyümesini artırmak için, ortam izolasyondan sonraki gün ve her 2 günde bir değiştirilmelidir. Bu enkaz ve ölü hücreleri hücre canlılığı etkileyebilir izolasyon işlemi sırasında birikmiş kaldıracaktır. Tümörlü fersfer oluşumu tahlili, süspansiyon kültürlerine yerleştirildiğinde optimum canlılığı sağlamak için hücreler en az bir kez geçtikten sonra başlamalıdır(Şekil 1B, solda ilk panel). Ellerimizde, pasaj 2 (P2)(Şekil 1C, soldaki birinci ve ikinci panel) hücrelerden başlayarak optimal sonuçlar elde edilmiştir. Bu özel geçiş birden fazla testten sonra seçilmiştir. P0 hücreleri düşük bağlanma koşullarında kaplandığında, muhtemelen izolasyondan sonra hala mevcut olan hücresel enkaz nedeniyle, daha sonraki geçitlere göre düşük sayıda tümörküre oluşturmuşlardı. Daha sonraki pasajlarda, tümörküre oluşumunun farklı desenleri gözlendi ve kültürde çok sayıda pasajdan sonra ortaya çıkan seçilim atfedildi. Farklı hücre çizgileri karşılaştırıldığında, aynı geçitten başlamak için önerilmektedir.
Tümör küreleri ve hücre kümeleri arasındaki ayrımcılık, tetkiklerin nicelleştirilmesi açısından temel öneme sahiptir. Şekil 1C (sağdaki son iki panel) tümörküre (solda) ve hücre kümesi (sağda) arasındaki morfolojik farklılıkları açıkça gösterir. Tümör küreler kendini yenilemek ve düşük bağlanma koşullarında büyümek için yüksek bir yeteneği olan tek bir hücreden türetilmiştir (TPCs her iki özelliği). Gerçekten de, tümörfer gelişimi tümörijenite potansiyelini gösterir. Ancak, bu titreşme tüm organizmadan elde edilen ipuçları bağımsız olarak in vitro yapılır; bu nedenle, hücrelerin in vivotümörijenik potansiyelini doğrulamak için allogreft transplantasyon deneyleri yapılmalıdır (Şekil 1D).
Rekombinant proteinlerin tedavisinin doğrulanması
Tümörküretedavisi ni ayarlamadan önce, ilgi proteininin tümör hücreleri üzerinde bir etki yi tetiklediği optimal konsantrasyon belirlenmelidir. Bunun için proteinin aşağı akım hedef genlerinin ifade düzeyinin değerlendirilmesi gereklidir(Şekil 2). QRT-PCR ile test etmek için hedef genleri belirlemeden önce PubMed üzerinde bir literatür araştırması yapıldı. İlgi proteininin farklı çıkış yollarını modüle ettiği gösterilmiş olması durumunda, bu yolların her biriyle ilişkili birden fazla genin seçimi yapılmalıdır. Örneğin, Flt3l (Fms benzeri tirozin kinaz 3) akut miyeloid lösemide STAT5 sinyalini modüle etmek için gösterilmiştir, p21 downstream ekspresyonu indükleyen, c-Myc, ve SiklinD1 (Şekil 2)27. Ayrıca, STAT3 sinyal yolu28aktivasyonu aracılık dendritik hücreler farklılaşması için Flt3l ekspresyonu gereklidir. STAT3 aktivitesini değerlendirmek için Socs3 ve CyclinD1 ekspresyonu kontrol edildi (Şekil 2). Sonuçların analizi, rekombinant protein tedavisinin test edilen genlerin bazıları (p21, CyclinD1 ve Socs3) üzerinde doza bağımlı bir etkisi olduğunu gösterirken, diğerleri etkilenmedi (c-Myc). Tedavi etkinliğinin güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için test edilen spesifik tümörde ilgi proteinine yanıt veren downstream genlerini belirlemek önemlidir.
Plazmid transfeksiyonu için protokolün optimizasyonu
Plazmid transfeksiyonu ve daha ileri tümörsfer oluşumu testi için etkili bir protokol oluşturmak için transfeksiyonun yapışık tümör hücreleri üzerindeki etkileri test edilmiştir(Şekil 3A). Üreticinin protokolüne göre transfeksiyon reaktifi tedavisi yapıldı ve iki farklı miktarda reaktif test edildi. Verimlilik bir GFP muhabiri plazmid istihdam değerlendirildi. Elimizde, daha düşük miktarda reaktif kullanarak daha yüksek bir transfeksiyon verimi gözlemledik (Şekil 3A). Gerçekten de daha yüksek konsantrasyonlar, 48 saat başlayarak ve transfeksiyon zamanından itibaren 72 saat sonra daha belirgin hale, artan hücre ölümüne yol açar. Aynı transfeksiyon protokolü, tedavinin başlamasından 24 saat sonra ölü hücre ve hücresel enkaz birikimi belirgin hale geldi, hücresel canlılık azalmış gösteren, süspansiyon hücrelerde verimli değildi. Bu teknik zorluğu aşmak için iki adımlık bir protokol kullanılmıştır: yapışık hücrelerüzerinde transfeksiyon yapmak, tedaviden sonra 24 saat ayırmak ve 7 gün daha süspansiyon içinde plaka. Kontrol tümörküreleri gerçekten de deneyin sonunda GFP'yi ifade ediyorlardı(Şekil 3B).
Şekil 1: Tümör hücre izolasyonu, tümörküre türasyonu ve transplantasyon. (A) Protokolün 2. Protokolün her önemli adımı özetlenir. (B) Protokolün 3. Protokolün her önemli adımı özetlenir. (C) Soldan: düşük büyütme (ölçek çubuğu = 50 μm) ve yüksek büyütme (ölçek çubuğu = 50 μm) geçit 2 (P2) de izole tümör hücrelerinin parlak alan görüntüsü; süspansiyon kültüründe 30 gün sonra tümör hücrelerinden elde edilen bir tümörkürenin parlak alan görüntüsü (ölçek çubuğu = 250 μm) ve süspansiyon kültüründe 30 gün sonra tümör hücrelerinden oluşan bir hücre kümesinin parlak alan görüntüsü (ölçek çubuğu = 50 μm). (D) Protokolün 6. Protokolün her önemli adımı özetlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Rekombinant protein konsantrasyonunun belirlenmesi için aşağı akım hedef genlerin doğrulanması. Flt3l tedavi konsantrasyonunun değerlendirilmesi için qRT-PCR sonuçları. İki yönlü ANOVA yapıldı. Tedavi edilmeyen kontrolile karşılaştırma için önem gösterilir. (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tümör kürelerinin transfeksiyon protokolünün kurulması. (A) Transfeksiyon reaktifinin düşük (üst) veya yüksek (alt) konsantrasyonu (24 kuyu plakasında 0,75 μL veya 1,5 μL) (ölçek çubuğu = 50 μm) ile tedavi edilen tümör hücrelerinin temsili parlak alan ve floresan görüntüleri. (B) GFP plazmid ile tedavi edilen hücrelerden oluşan tümör kürelerinin temsili görüntüsü, süspansiyondaki hücrelerin kaplamasından 7 gün sonra (ölçek çubuğu = 50 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör klojen iyotlar, FACS izolasyonu ve tümörsphere formasyon testi: tümör klojeni tahlilleri, tümör klojeni tahlilleri ve tümörsphere oluşumu tahlillerinden TBM'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için birden fazla yöntem kullanılmıştır. Tümör klojenisi titreti ilk olarak 1971 yılında tanımlanmıştır, kök hücre çalışmaları için kullanılan, ve sadece daha sonra kanser biyolojisi29uygulanan,30. Bu yöntem yumuşak jeller kültürlerde kısıtlamalar olmadan genişletmek için kanser kök hücreleri içsel özelliği dayanmaktadır31. Gelişiminden bu yana, bu yöntem yaygın olarak birden fazla amaç için kanser araştırmalarında kullanılmıştır, tümör hücre heterojenite çalışmaları da dahil olmak üzere, hücre büyümesi hormonal tedavinin etkisi, ve tümör direnci çalışmaları31. Bugüne kadar, bu test hala kanserlerin birden fazla türleri için tümör başlatan hücrelerin belirlenmesi için istihdam edilmektedir32.
FACS izolasyonu, ilgi üzerine hücrelerin yüzeyinde bulunan moleküler belirteçlerin önceden bilinmesine dayanır. TBM'lerin hem sıvı hem de katı tümörlerden izole edilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, insan akut miyeloid löseminin (AML) ilk tanımlaması Dr. Dick'in grubu tarafından, toplu AML hücrelerinde bulunan belirteçlerin bilgisine dayalı FACS fraksiyonu ve transplantasyon tahlilleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir9. Benzer bir yaklaşım kullanarak, Dr Clarke grubu izole meme kanseri başlatan hücreleri3. Tümörsphere formasyon uyrumu tsay TPCs belirlenmesi ve çalışması için kullanılan farklı bir yaklaşımdır. Bu yöntem ilk beyin tümörlerinden kanser kök hücrelerini belirlemek için geliştirilmiştir33. İlginçtir, başlangıçta nöral kök hücre büyümesi lehine bilinen aynı koşullar kullanılarak test edildi, böylece de TPCs ile ilişkili kendini yenileme özelliği lehine33. Ayrıca, tümörsfer oluşumu tdc'lerin ankrajdan bağımsız bir şekilde büyüme kapasitesine dayanır.
Yukarıda açıklanan üç yaklaşım, her yöntemin sınırlamalarını aşacak şekilde TPC popülasyonlarını izole etme ve moleküler olarak karakterize etme olasılığını artırmak için paralel olarak kullanılabilir. Örneğin, FACS, saf hücre popülasyonları izole büyük avantajı getirerek rağmen, kuvvetle henüz tüm kanser türleri için bilinen yüzey belirteçleri kullanımına dayanır. Bu nedenle, kullanımı bilinen işaretleri ifade TPTs izolasyon ile sınırlıdır. Tümör klojeni ve tümörsfer oluşumu tahlilleri hem hücresel özelliklere dayalı, TPCs ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu yöntemlerin her ikisi de yeni ya da henüz çalışılmayan kanserler üzerine çalışmaların ilk satırı olarak kullanılabilir. Ayrıca, bu iki yöntem genişleme ve ilgi hücre nüfusunun zenginleşmesini sağlayabilir, moleküler belirteçlerin belirlenmesini kolaylaştıran, ve hem kanser direnci ve ilaç tarama çalışmaları için izin. Bu bağlamda, tümörküre oluşumu teşrisi daha avantajlıdır, çünkü bu küresel yapılar tümör dokularında (kürelerin merkezindeki hipoksik alanlar) mevcut çevreyi daha iyi yeniden oluştururlar34. Nitekim, daha önce 3D kültürleri ilaç tedavileri sonucu tahmin etmek için daha güvenilir olduğu gösterilmiştir34. Tümörküreler kültürden sonra geri kazanılabilir ve allogreft deneyleri için kullanılabilir: tümörkürelerin tek hücre çözümlerine dönüştürülmesi ve alıcı farelere nakli, yeni gelen tümörijenik kapasitenin in vivo değerlendirilmesi için izin verecektir toplu tümör hücrelerine göre tpcs tespit.
Başarılı bir tümör heterojenite bir başlangıç hücresel malzeme temsilcisi elde etmek için, ilk doku rasgele örnekleme gerçekleştirmek için önemlidir. RMS izole tümörlerde açıkça ayırt edilebilir fibrotik, yağlı veya yüksek vaskülarize alanlar ile karakterizedir, böylece, bu hücresel çeşitliliği korumak için, doku her alanın toplanması gerekecektir. Ayrıca, sindirim işlemi sırasında hücrelerin hayatta kalma şansını artırmak için, toplanan dokunun misli eşit boyutlu parçalar neden ihtiyacı var: küçük parçalar hücrelerin canlılık azalma indükleyen aşırı sindirilmiş olması daha olasıdır. Bu özellikle farklı morfolojisi ve RMS sertliği nedeniyle sıkıcı olabilir.
Tümörlü küre oluşumu testisonucunun sayısallaştırılması için gerçek tümörküreler ile hücresel kümeleri ayırt etmek kritik öneme sahiptir(Şekil 1C, sağdaki son iki panel). Bir tümörküre hücre kompozisi ayırt etmek mümkün değildir katı küresel yapıdır; buna karşılık, bir hücre kümesinde, tek hücre kolayca ayırt edilebilir. Hücre kümeleri yuvarlak bir şekil üstlenmeyebilir ve 50-250 μm25arasında değişen tümör küreleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha küçüktür.
Tümör küreleri naklini gerçekleştirmek için tek tip bir hücre solüsyonu elde etmek önemli bir adımdır. Gerçekten de, sıkı yapısı ve bir tümörkürenin büyük boyutu göz önüne alındığında, hücrelerin sindirimi daha fazla transplantasyon için istihdam edilen tek bir hücre süspansiyon hazırlanmasında önemli bir sınırlayıcı adım haline gelir. Bu nedenle tümör kürelerinin tamamen dissociasyonu için mekanik dissosilasyonla birlikte birden fazla enzimatik sindirim döngüsü gereklidir. Dissociation ilerleme ve başarılı bir sonuç onaylamak için, çözüm parlak alan mikroskop altında izlenmesi gerekir.
Tümörküre oluşumu nun sağladığı çoklu avantajlara rağmen, tümör kürelerinin her türlü tümörden veya ticari olarak mevcut tüm hücre hatlarından kaynaklanmadığı gösterilmiştir. Bu olgularda, heterojen popülasyoniçinde hücre tümörüklerinin belirlenmesi ve TBM'lerin sayısallaştırılması için standart olarak test kullanılamaz. Bu tözbir başka sınırlama farklı tümör tipleri farklı büyüme ve dissosilasyon koşulları gerektiren gerçeği ile ilişkilidir; bu nedenle, her tümör tipi veya hücre hattı için her iki protokolün de zaman alan optimizasyonu ve sorun giderme gerektirmesini gerektirir. Ayrıca kültürde birden fazla tümörkürenin füzyonu oluşabilir ve bu da boyut ve sayılarının değerlendirilmesi nde belirsizdir.
Tümörsfer formasyonu tetkik daha önce RMS çalışmalarında kullanılmıştır olmasına rağmen, tümör oluşumu ve gelişimi nde rol oynayan moleküler yolları belirlemek için ağırlıklı olarak ticari rms hücre hatları uygulanmıştır18, 20,21. Heterojen doku bileşimi, tümörlerin çok sayıda alt tipleri ve RMS'nin ortaya çıktığı çeşitli gelişimsel bağlamlar göz önüne alındığında, RMS hücre hatlarının istihdamı, bu tazyikin her iki köken hücresinin de tanımlanması için uygulanmasını sınırlar ve in vivotümör gelişimine yol açan gelişimsel ipuçları .
İnsan sarkomu örneklerinden başlayarak tümörküre türasyonu için etkili bir protokol geliştirme girişimi, daha önce kötü sonuçlar göstermiştir. Nitekim, tümörküreler örneklerin sadece% 1035geliştirilmiştir. Bu nedenle, primer RMS hücrelerinin izolasyonu ve tümörsphere gelişimi için tekrarlanabilir ve güvenilir bir tetkik için ihtiyaç vardır. Bu ihtiyaca cevap olarak, tanımlanan tümörsphere formasyon uytması birincil hücre kültürlerinde kullanılacak şekilde optimize edildi. Bu protokolün geliştirilmesi, alandaki önemli soruları yanıtlamaya yönelik ilk adımdır (örneğin, rms kökenli hücrelerin çevresel içeriğe bağlı olarak nasıl farklılık gösterdiği). Daha ayrıntılı olarak, burada açıklanan RMS dokularından primer tümör hücrelerinin izolasyonu için tekrarlanabilir bir protokol, tümör kürelerin oluşumu, tümörsphere tedavisi (her ikisi de rekombinant proteinler veya aşırı ekspresyon plazmidleri ile yapılan), ve allograft transplantasyon deneyleri.
Sonuç olarak, tümörküre oluşumu tsay tümörlerin farklı tipte TPM'lerin belirlenmesi için iyi kurulmuş ve çok yönlü bir yöntemdir, artan kendini yenileme kapasitesi ve ankraj bağımsız büyüme yeteneği ile hücreleri zenginleştiren şekilde. Bu test, incelenmekte olan hücre popülasyonlarının işlevsel özelliklerine dayanır ve moleküler belirteçlerin önceki bilgisine değil; bu nedenle, tümör tipleri geniş bir yelpazede için bir keşif aracı olarak uygulanabilir. Ayrıca, tümörsphere kültürleri ile elde nadir hücre popülasyonlarının izolasyon bu in vitro testi kanser ilaç testi için ideal bir platform yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ellison Medical Foundation hibe AG-NS-0843-11 ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA030199 a.S. içinde NIH Pilot Grant tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
