Summary
Detta protokoll beskriver en reproducerbar metod för isolering av mus rabdomyosarkom primära celler, tumorsphere formation och behandling, och transplantatavstötning transplantation från tumorspheres kulturer.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) är den vanligaste mjukdelssarkom hos barn. Även om betydande insatser har möjliggjort identifiering av vanliga mutationer i samband med RMS och tillåten diskriminering av olika RMS-subtyper, finns det fortfarande stora utmaningar för utvecklingen av nya behandlingar för att ytterligare förbättra prognosen. Även identifieras genom uttrycket av myogena markörer, det finns fortfarande betydande kontrovers om huruvida RMS har Myogenic eller icke-Myogenic ursprung, som cellen ursprung är fortfarande dåligt förstått. I den aktuella studien finns en tillförlitlig metod för tumorsphere-analysen för mus RMS. Analysen är baserad på funktionella egenskaper tumörceller och gör det möjligt att identifiera sällsynta populationer i tumören med tumörframkallande funktioner. Beskrivs också är procedurer för att testa rekombinanta proteiner, integrera transfektion protokoll med tumorsphere assay, och utvärdera kandidat gener involverade i tumörutveckling och tillväxt. Beskrivs vidare är ett förfarande för transplantatavstötning transplantation av tumorspheres till mottagar möss att validera tumörframkallande funktion in vivo. Sammantaget ger den beskrivna metoden tillförlitlig identifiering och testning av sällsynta RMS-tumorigena populationer som kan tillämpas på RMS som uppstår i olika sammanhang. Slutligen kan protokollet utnyttjas som en plattform för läkemedels screening och framtida utveckling av Therapeutics.
Introduction
Cancer är en heterogen sjukdom; Dessutom, samma typ av tumör kan presentera olika genetiska mutationer hos olika patienter, och inom en patient en tumör består av flera populationer av celler1. Heterogenitet utgör en utmaning i identifieringen av celler som ansvarar för att initiera och sprida cancer, men deras karakterisering är avgörande för utvecklingen av effektiva behandlingar. Begreppet tumör föröknings celler (TPC), en sällsynt population av celler som bidrar till tumörutveckling, har tidigare utförligt granskats2. Trots det faktum att tpcs har karakteriserats i flera typer av cancer, är identifieringen av markörer för deras pålitliga isolering en utmaning för flera tumörtyper3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. sålunda, en metod som inte förlitar sig på molekylära markörer utan snarare på TPC funktionella egenskaper (hög självförnyelse och förmågan att växa i låg-tillbehör villkor), känd som tumorsphere formation assay, kan tillämpas i stor utsträckning för identifiering av TPCs från de flesta tumörer. Viktigt, denna analys kan också användas för utbyggnad av tpcs och därmed direkt tillämpas på cancer Drug screening och studier om cancer resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) är en sällsynt form av mjukdelssarkom vanligast hos små barn11. Althoug RMS kan histologiskt identifieras genom bedömning av uttrycket av myogena markörer, har RMS-cellen av ursprung inte univokala kännetecknas på grund av de multipla tumör subtyper och hög heterogenitet av tumörutveckling stimuli. Nyligen genomförda studier har genererat en betydande vetenskaplig diskussion om huruvida RMS är av myogent eller icke-myogent ursprung, vilket tyder på att RMS kan härledas från olika celltyper beroende på sammanhanget12,13, fjorton , 15 , 16 , 17. ett flertal studier på RMS cellinjer har utförts med hjälp av tumorsphere formation analys för identifiering av vägar som är involverade i tumörutveckling och karakterisering av markörer i samband med mycket självförnyelse populationer 18 , 19 , 20 , 21.
Men trots tumorsphere formation assay potential för att identifiera RMS-celler ursprung, en tillförlitlig metod som kan användas på primära RMS-celler har ännu inte beskrivits. I detta sammanhang, en nyligen studie från vår grupp anställd en optimerad tumorsphere formation analys för identifiering av RMS-celler ursprung i en Duchennes muskeldystrofi (DMD) musmodell22. Flera pre-tumorigena celltyper, isolerade från muskelvävnad, testas för sin förmåga att växa i låg-tillbehör villkor, så att identifieringen av muskelstamceller som celler av ursprung för RMS i dystrofa sammanhang. Beskrivs här är ett reproducerbart och tillförlitligt protokoll för tumorsphere formation assay (figur 1), som har framgångsrikt använts för identifiering av extremt sällsynta cellpopulationer som är ansvariga för mus RMS utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hus, behandling och uppoffring av möss utfördes efter det godkända IACUC-protokollet från Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. beredning av reagens
- Förbered 100 mL cell isoleringsmaterial: F10 medium kompletterat med 10% häst serum (HS).
- Bered 50 mL av kollagenastyp II-lösning: Lös upp 1 g kollagenastyp II-pulver i 50 mL cell isoleringsmaterial (notera enzymets enheter per 1 mL media, eftersom antalet enheter ändras beroende på partiet). Alikvot lösningen och förvara i en-20 ° c frys tills den är klar för användning.
Anmärkning: varje parti kollagenas bör testas före användning, eftersom enzymaktiviteten kan förändras i olika partier. - Förbered 10 ml per prov av andra digestionslösning: celler isolerings medier med 100 enheter/ml av kollagenas typ II lösning och 2 enheter/ml av dispas II nyligen viktad. Förbered dig omedelbart före användning.
- Förbered 500 mL av tumörceller media: DMEM höga glukos kompletteras med 20% FBS och 1% penna/STREP.
- Bered 500 mL FACS-buffert: 1x PBS kompletterad med 2,5% v/v normalt get serum och 1 mM EDTA.
- Förbered 500 mL av tumorsphere media: DMEM/F12 kompletterat med 1% penna/STREP. Strax före användning, tillsätt följande tillväxtfaktorer: 1% N2 tillägg, 10 ng/mL EGF, och 10 ng/mL β-FGF.
2. cell isolering och-kultur
- Förbered en 10 cm platta som innehåller 5 mL av celler isolerings medier (en platta per tumör prov) och placera den i en inkubator vid 37 ° c tills redo att skörda tumör vävnad.
- RMS har rapporterats spontant utvecklas i både manliga och kvinnliga musmodeller för Duchennes muskeldystrofi, såsom B10 MDX-möss vid cirka 18 månaders ålder och i B6 MDX/mTR möss av 9 månader22,23. Anesthetize musen som utvecklar RMS tumör med isofluran, och offra djuret genom cervikal dislokation eller enligt IACUC riktlinjer för institutionen. Med sax, göra ett snitt på huden i det område där tumören är lokaliserad, och (med pincett) dra bort huden från området av intresse. Anställa ett rakblad, punktskatter tumören från djuret.
- Väg 500 – 1000 mg av tumör vävnaden och placera den i plattan beredd i steg 2,1 (figur 1a).
Obs: större mängder vävnad negativt påverka digestionsstegen och minska den totala avkastningen. Om den skördade tumören är större än 1000 mg, dela upp den i delar och prov slumpmässigt tills önskad vikt uppnås. Slumpmässig provtagning är nödvändig för att utvärdera vävnadens heterogenitet. - Placera plattan som innehåller tumör vävnader i den sterila cellkulturen huva och skräpa den med ett rakblad. Tumör vävnad från RMS är heterogena; Således kan olika områden uppvisar olika motståndskraft mot nedskärningarna. Se till att storleken på den resulterande malet bitar är enhetliga för att säkerställa optimal matsmältning.
Anmärkning: RMS finns som blandningar av olika vävnadstyper (främst fibrotiska, vascularized, och fettvävnader) som kan identifieras i varje tumör. Till 1) isolera en heterogen cellpopulation exakt går igenom sammansättningen av den ursprungliga tumören och 2) inte bias isolerings förfarandet, utföra slumpmässiga provtagning av skördad vävnad. Celler från olika delar av tumören bör smältas och testas parallellt in vitro i analysen som beskrivs i avsnitt 3. - Flytta malet vävnad och cell isoleringsmaterial i en 15 mL Centrifugera röret, tvätta plattan med 4 mL cell isolering media och placera den i röret.
- Tillsätt 700 enheter/mL kollagenaslösning för att smälta vävnaden och inkubera i en skakning vattenbad vid 37 ° c för 1,5 h.
- Efter inkubering, snurra ner vävnaden vid 300 x g i 5 min vid RT. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten, Omsuspendera pelleten i 10 ml andra digestionslösning (dispase), och inkubera i en skakning vattenbad vid 37 ° c i 30 min.
- När den andra matsmältningen är klar, Pipettera upp och ner och passera cellsuspensionen genom ett 70 μm nylonfilter på en 50 mL centrifug röret. Tillsätt sedan 10 mL cell isolerings medier för att tvätta filtret och späd rötnings lösningen, och snurra ner vävnaden vid 300 x g och RT i 5 min.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera pelleten i 20 mL tumör cells medier. Överför sedan cellsuspensionen i en 15 cm cellkultur tallrik. Placera cellerna i inkubatorn vid 37 ° c över natten. Denna skylt kommer att identifieras som P0.
- Ändra mediet dagen efter isoleringen. Detta steg är nödvändigt för att säkerställa avlägsnande av skräp och döda celler som kan inverka negativt på cellernas överlevnad.
- Bedöm cell confluency efter att mediet har ändrats, vilket varierar mellan 30% – 60% beroende på mängden startmaterial och Cellstorlek. Låt cellerna växa i inkubatorn tills de når 90% confluency. Övervaka celler varje dag och ändra Media varje 2 dagar. Den tid som krävs för tumörceller att bli konflytande varierar beroende på flera parametrar: tumör aggressivitet, genotyp av tumören, ålder av musen, heterogenitet av vävnaden.
- Gör följande för cell passaging:
- Pre-Warm cell avlossning lösning och tumörceller media i ett vattenbad vid 37 ° c.
- Tvätta cellerna med 1x steril PBS och inkubera dem vid 37 ° c i 10 mL varm cell avskiljnings lösning för 5 – 10 min.
- När alla celler är fristående från plattan, tillsätt 10 mL varma tumörceller media, flytta lösningen i en 50 mL Centrifugera röret och snurra celler ner på 300 x g för 5 min vid RT.
- Omsuspendera cellerna i 5 – 10 mL av tumörceller media, beroende på pelleten storlek, och räkna levande celler med Trypan blå (1:5 utspädning) att utesluta döda celler.
- Tallrik 105 celler i 10 cm plattor eller 3 x 105 celler i 15 cm plattor. Cell fördubblings tiden varierar beroende på de faktorer som beskrivs i steg 2,10.
3. tumorsphere härledning
- Använd tumörceller vid passage P1 eller P2 för att undvika cell val genom flera passager (figur 1b). För att lossa celler från plattan, först tvätta skålen med 1x PBS, utan att störa cellerna, sedan täcka dem med hjälp av cell avlossning lösning (5 mL för en 10 cm tallrik eller 10 mL för en 15 cm tallrik) och placera dem i inkubatorn för 5 – 10 min.
- Bekräfta att cellerna är fristående genom att titta på plattan under en ljus-fält Mikroskop, tillsätt 1:1 volym av tumörceller media (cell avlossning lösning: tumörceller Media), placera cellsuspensionen i en centrifug röret och snurra cellerna ner på 300 x g för 5 min vid RT.
- Omsuspendera celler i antingen FACS buffert (avsnitt 3,4) eller tumorspheres media (avsnitt 3,5), enligt den metod som används för plätering.
- Plating celler genom flödescytometer
- Omsuspendera celler i FACS-bufferten (mängden beror på pelletstorleken) och räkna manuellt levande celler med hjälp av Trypan blå uteslutning. Kontrollera att den slutliga cellkoncentrationen är 107 celler/mL (100 μl FACS-buffert per 106 celler). Tillsätt 1 μL av FX Cycle Violet fläck per 106 celler att diskriminera levande från döda celler under cell sortering. Förbered en obefläckade kontroll där FX Cycle Violet fläcken inte läggs till cellerna.
Obs: koncentrationen är optimerad för effektiv färgning och hastighet vid sortering. En lägre cell koncentration kommer att resultera i en längre sorterings tid, medan en högre koncentration kommer att påverka färgning. - Anställa den obefläckade kontroll, inrätta en FACS Gate segregera Alive (FX cykel violett-) från döda (FX Cycle Violet+) celler. Sedan anställa fluorescerande-aktiverad cell sortering (med 450/50 filter band pass) för separation och räkning av levande/döda celler och för plätering önskat antal levande celler i varje brunn på 96 väl låg infästning plattor. Varje brunn av plattan måste fyllas med 200 μL av tumorspheres Media innan du påbörjar sorteringen.
Obs: med tanke på att TPCs är en sällsynt subpopulation inom hela tumören, optimera protokollet genom plätering 100 celler/väl från mus RMS att observera bildandet av tumorspheres i suspension kultur. Cellnumret per brunn bör justeras för den specifika tumörtestad. - Placera celler i inkubatorn till slutet av experimentet. Försök att inte störa plattan om det inte är nödvändigt. För en 30 dagars experiment, varje brunn bör fyllas på med media och en lämplig andel tillväxtfaktorer varje vecka (Media tenderar att avdunta och tillväxtfaktorer är inte effektiva efter 1 vecka).
- Efter avslutad experiment, manuellt skärm plåtar under ett ljust fält Mikroskop för att identifiera tumorspheres (se steg 3,6).
Obs: en tidpunkten på 30 dagar var optimerad för att enkelt upptäcka mus RMS tumorspheres av storlekar från 50 – 300 μm diameter. Den tidpunkten bör justeras beroende på aggressivitet av tumören testas och dess proliferativ takt.
- Omsuspendera celler i FACS-bufferten (mängden beror på pelletstorleken) och räkna manuellt levande celler med hjälp av Trypan blå uteslutning. Kontrollera att den slutliga cellkoncentrationen är 107 celler/mL (100 μl FACS-buffert per 106 celler). Tillsätt 1 μL av FX Cycle Violet fläck per 106 celler att diskriminera levande från döda celler under cell sortering. Förbered en obefläckade kontroll där FX Cycle Violet fläcken inte läggs till cellerna.
- Pläteringsceller manuellt
- Omsuspendera celler i tumorsphere media (mängden beror på pelleten) och räkna manuellt levande celler med trypan blå (1:10 utspädning). Beräkna cellkoncentrationen i röret och platta rätt antal celler i en 96 väl låg fästplatta. Placera celler i inkubatorn till slutet av experimentet. Försök att inte störa plattan om det inte är nödvändigt för påfyllning av media och tillväxtfaktorer, enligt beskrivningen i steg 3.4.3.
- Efter avslutad experiment, skärm plåtar manuellt under ett ljus-fält Mikroskop för att identifiera tumorspheres eller använda Celigo programvara, som tidigare beskrivits i Kessel et al.24 se steg 3,6 nedan.
- Observera att två separata avläsningar kan utvärderas som resultat av denna analys: antal och storlek på bildade tumorspheres.
Anmärkning: när mer än en cell är klädd i en brunn, antingen tumorspheres eller cell kluster kan bildas (figur 1c, tredje och fjärde paneler). Cell kluster är små cellulära aggregat som bildas i suspension kultur som förbättrar cellöverlevnad och kännetecknas av en oregelbunden form. Tumorspheres är stora och har en mer kompakt struktur med en sfäroid form. De härrör från en enda cell som har förmågan att överleva på ett förankrings oberoende sätt och förgöra sig på en hög hastighet25. Plating celler genom flödescytometer eller manuellt kan användas omväxlande, beroende på de funktioner som finns i laboratoriet. Dessutom är det möjligt att anställa låg infästnings plåtar av stora storlekar än 96-plattor och beroende på vilket resultat som krävs. I själva verket bör bedömningen av tumorsphere frekvens göras med 96 väl låga fästplattor, medan inledande screening för bedömning av celler tumörframkallande potential kommer att ge snabbare och pålitliga resultat på 6 väl låg infästning plattor.
4. tumorsphere behandling med rekombinanta proteiner
- Upprepa steg 3,1 och 3,2.
- Om inrättande av en behandling med rekombinanta proteiner, först bestämma den bästa koncentrationen att använda enligt avsnitt 4,3, eller om den optimala koncentrationen har fastställts tidigare, hoppa till avsnitt 4,4.
- Bestämma den rekombinanta proteinbehandlingens koncentration.
- Omsuspendera cellerna i tumorsphere media (volymen beror på pellets storlek) och räkna manuellt levande celler med Trypan blå uteslutning. Beräkna cellkoncentrationen i röret och plattan 100 000 celler i en 6 väl låg fästplatta. Platta två brunnar per testad koncentration och två brunnar för obehandlade kontroller (figur 2). Proteinkoncentrationer som ska testas baseras på litteratursökning.
- Behandla varje brunn av suspensions celler med en annan proteinkoncentration och placera cellerna i inkubatorn för 48 h (tid som krävs för att kunna utvärdera effekten av behandlingen på både cellviabilitet och uttrycket av nedströms målgener). Bedöm sedan följande parametrar:
- Cellöverlevnad: med hjälp av en ljus-fält Mikroskop samt jämförelse med obehandlade kontroller, kontrollera cellmorfologi. Friska celler verkar ljusa och reflekterande under mikroskopet, medan överdriven celldöd kommer att framkalla ansamling av skräp i media. För en kvantifierbar bestämning av celldöd, Trypan blå uteslutning, Crystal Violet färgning, MTT, eller TUNEL assay kan användas (i detta fall, tillsätt en väl till den ursprungliga pläteringen).
- Effekt av rekombinanta proteiner på nedströms vägar: utför en litteratursökning med PubMed för identifiering av de nedströms gener som är kända för att påverkas av det testade proteinet. Designa qRT-PCR-primers för målgenerna och utför qRT-PCR-analys på det RNA som isolerats från de behandlade cellerna (figur 2).
- Behandla med rekombinant protein.
- Omsuspendera cellerna i tumorsphere media (volymen beror på pellets storlek) och räkna manuellt levande celler med Trypan blå uteslutning. Bestäm det totala antalet celler som behövs för det önskade experimentet (100 celler per varje brunn på en 96 väl låg fästplatta) och späd dem i lämplig tumorsphere Media volym. Om du utför mer än en behandling, Förbered separata cell rör.
- Behandla varje tub med lämplig koncentration av rekombinant protein och platta cellerna i en separat brunn på 96 väl låg infästning plattan. Behandlingen kommer att upprepas på varje brunn beroende på halveringstiden för det rekombinanta proteinet fram till 30 dagars slutpunkt för experimentet.
- I slutet av experimentet följer du stegen 3.4.4 och 3,6 för att analysera data.
5. tumorsphere behandling med överuttryck plasmider
- Upprepa steg 3,1 och 3,2.
- Om inrättande av behandling på en ny tumörtyp, först bestämma den bästa koncentrationen av plasmid att använda enligt avsnitt 5,3, eller om den optimala DNA-koncentrationen har tidigare fastställts, hoppa till avsnitt 5,4.
- Fastställa optimal plasmid koncentration.
- Omsuspendera celler i tumörceller media (volymen beror på pellets storlek) och manuellt räkna levande celler med Trypan blå uteslutning. Platta de räknade cellerna för att uppnå en sammanlänkning från 70% – 90% (cell nummer är mycket beroende av Cellstorlek och morfologi). GFP-plasmid kommer att användas för att testa transfektionseffektiviteten efter tillverkarens protokoll för transfektionsreagenset för adherenta celler. Parallellt, testa också en obehandlad kontroll (figur 3a). Utför ett effektivitetstest i en 24-välsplattan.
Obs: anhängare celler används för att förbättra transfektion effektivitet, som transfektion utförs på suspension celler är inte effektivt och negativt påverkar cellernas lönsamhet. - 48 h efter transfektion Bedöm celler för följande parametrar:
- Cell överlevnad: med hjälp av en ljus-fält Mikroskop, jämföra antalet celler som finns i varje brunn och jämföra den med de obehandlade cellerna väl.
- GFP-uttryck: räkna procentandelen celler som är GFP-positiva över det totala antalet celler i varje brunn (figur 3b).
- Omsuspendera celler i tumörceller media (volymen beror på pellets storlek) och manuellt räkna levande celler med Trypan blå uteslutning. Platta de räknade cellerna för att uppnå en sammanlänkning från 70% – 90% (cell nummer är mycket beroende av Cellstorlek och morfologi). GFP-plasmid kommer att användas för att testa transfektionseffektiviteten efter tillverkarens protokoll för transfektionsreagenset för adherenta celler. Parallellt, testa också en obehandlad kontroll (figur 3a). Utför ett effektivitetstest i en 24-välsplattan.
- Överuttryck plasmid behandling
- Omsuspendera cellerna i tumör cell media (volymen beror på pellets storlek) och manuellt räkna levande celler med Trypan blå uteslutning. Platta 200 000 celler per brunn av en 6 brunn pläterar. Varje brunn kommer att användas för en oberoende transfektion händelse. Varje brunn kommer att överföras med hjälp av den uppsättning som utvecklats för den specifika tumör typen (figur 3a).
- 24 h efter transfektion, tvätta varje brunn med 1x PBS och inkubera cellerna i varm cell avlossning lösning (tillräckligt för att täcka brunnen). Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° c i 5 – 10 min, beroende på faktorer som beskrivs i avsnitt 2,15.
- När celler är frånkopplad, räkna cellerna som härleds från varje enskilt väl med hjälp av Trypan blå uteslutning. Placera 100 000 celler per brunn av en 6 väl låg fästplatta, att se till att inte blanda celler som härrör från olika brunnar. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° c och lämna ostörd i en vecka.
Obs: varaktigheten av denna analys är 7 dagar, en tillräcklig tid att tillåta tumorsphere formation samtidigt förhindra tumorsphere fusion. Tumorsphere fusion är ett fenomen som blir uppenbart när 100 000 eller fler celler är pläterade tillsammans i suspension i över 1 vecka, vilket kan bias bedömningen av tumorsphere formation förmåga. I händelse av att experimentet kräver längre inkubationstid, bör CELLTÄTHETEN justeras eller polymera ställningar används för att undvika tumorsphere fusion26. - I slutet av experimentet, Följ steg 3.5.2 och 3,6 för att analysera data.
6. tumorsphere förberedelse för transplantattransplantat
- Placera extracellulär matrix (ECM) lösning (50 μL per allograft) och tumörceller media (50 μL per allograft) på is.
- Tumorspheres kan användas för transplantations transplantationer. Dra ihop alla tumorsfärer som erhålls från en specifik celltyp eller behandling i en 15 mL eller 50 mL tub (enligt den totala volymen av media) (figur 1d). Snurra tumorspheres ner på 300 x g i 5 min vid RT. ta bort supernatanten över tumorspheres och tvätta dem med 10 ml steril 1x PBS.
- Snurra tumorspheres ner igen på 300 x g för 5 min vid RT, aspirera 1x PBS, och tillsätt 500 μl till 1 ml cell lös ande lösning ovanpå cellen pelleten, som startar dissociation processen. Inkubera tumorspheres i matsmältningssystemet i en skakning vattenbad vid 37 ° c och kontrollera utvecklingen av matsmältningen varje 10 min. För att hjälpa tumorspheres dissociation i en enda cell lösning, Pipettera cellerna upp och ner för mekaniska störningar. Digestionsprocessen kan ta upp till 30 minuter.
Anmärkning: trots att inkubationstiden varierar avsevärt när tumorspheres härleds från olika primära RMS-celler, observerades aldrig en signifikant minskning av cellernas lönsamhet i förhållande till digestionstid. - När en enda cell lösning erhålls, tillsätt en volym av tumörceller media (1:1, cell avlossning lösning: tumörceller Media) och snurra den ner på 300 x g för 5 min vid 4 ° c.
Obs: från denna tid på, alla steg måste utföras på is. Efter spinning, tumorspheres inte bildar en stabil pellet som Single cells lösningar gör. För att vara säker på att inte ta bort eller aspirera tumorspheres, Använd en 1 mL pipett och försiktigt aspirera vätskan. Flytta till en 200 μL pipett när endast 1 mL återstår. - Omsuspendera celler i kalla tumörceller media (volymen kommer att bero på pellets storlek), placera cellerna på isen och räkna levande celler med Trypan blå uteslutning. Efter bestämning av rätt mängd celler att använda för allograft, Omsuspendera dem i en total volym av 50 μL av kalla tumörceller media. Kyl ner en pipett spets i kalla tumörceller media. När spetsen är kall, Använd den för att ta 50 μL av ECM-lösningen och tillsätt den till röret som innehåller cellerna. Ta inte bort rören från isen under denna process.
Anmärkning: antalet celler som ska användas för transplantation bör bestämmas enligt den tumörtestade och experimentella mål: ett större antal transplanterade celler kommer att minska tiden för tumörutveckling (20 000 celler från mus RMS tumorspheres har visat sig utvecklas till en tumör 6 veckor efter injektion). För att kunna jämföra olika cellinjer eller olika behandlingar är det viktigt att utgå från samma antal celler. - Som celler är nu redo för transplantation, upprätthålla på is tills injektionen. Placera en utjämnade 0,5 mL insulinspruta med en 29 G nål på is, för att förhindra att cell lösningen blir solid vid aspiration.
- Slå på flödesmätaren till 200 ml/min syre och isofluran spridare till 2,5%. Anesthetize en 2 månader gammal hane NOD/SCID mus genom att placera den inuti induktions kammaren. Vänta 2 – 3 min tills musen visas i sömnen och häckningen har avtagit. Innan du påbörjar proceduren, först bekräfta genom en fot nypa att musen är sovande, sedan tillämpa vet salva på ögonen. Raka den högra sidan av djuret, aspirera på cell lösningen i den förkylda sprutan, och injicera dem subkutant i det rakade området. En synlig bula under huden kommer att bildas om injektionen utförs på rätt sätt.
Obs: cell organtransplantationer kan utföras i samma mus stam som de transplanterade cellerna. Om RMS-cellerna till exempel ursprungligen isolerades från en C57BL/6-mus kan allograften utföras på C57BL/6-möss. Om stammen är olika, då immunobristfällig mottagar möss bör utnyttjas för att undvika avstötning. Åldern på mottagar möss kan också justeras beroende på experimentellt mål. - Övervaka möss för tumör bildning en gång per vecka.
Anmärkning: för att validera identiteten av tumören som härrör från transplantat transplantation, det bör jämföras med den ursprungliga tumören från vilken cellerna isolerades. För detta ändamål kan histologisk analys för morfologiska egenskaper och uttryck av myogena markörer samt mer omfattande RNAseq utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorspheres upptäckt
Cell isolering optimerades för att få maximal heterogenitet av cellpopulationer som finns i tumörvävnad. Först, eftersom isolerade vävnader presenteras morfologiskt olika områden, för att öka chanserna att isolera enhetliga sällsynta cellpopulationer, provtagning utfördes från flera områden av tumören (figur 1a, första panelen till vänster). För det andra utfördes mekanisk dissociation av skördade prover samtidigt som homogenitet bibehålls i den malda vävnads storleken, trots olika resistansen som kan ha förekommit över proverna (figur 1a, tredje och fjärde panelen från vänster ). Beroende på utgångsmaterialet (tumör aggressivitet, ålder och genotyp av mus, tumör plats), återhämtning av cellerna från den mekaniska stressen i isolerings processen kan variera, allt från 3-7 dagar (figur 1a, sista panelen till höger). För att öka cellernas överlevnad och tillväxt, media bör ändras dagen efter isoleringen och sedan var 2 dagar. Detta kommer att ta bort skräp och döda celler ackumulerade under isolerings processen som kan påverka cellernas lönsamhet. Tumorsphere formation assay bör starta efter att cellerna har blint minst en gång för att säkerställa optimal lönsamhet när de placeras i suspensions kulturer (figur 1b, första panelen till vänster). I våra händer erhölls optimala resultat från och med celler från passage 2 (P2) (figur 1c, första och andra panelen till vänster). Denna specifika passage valdes efter flera tester. När P0 celler var pläterade i låg-tillbehör förhållanden, bildade de ett lågt antal tumorspheres jämfört med senare passager, möjligen på grund av cellulära skräp fortfarande närvarande efter isoleringen. I senare passager, olika mönster av tumorsphere formation observerades och tillskrivs urvalet som sker efter många passager i kulturen. När olika cellinjer jämförs, föreslås det att utgå från samma passage.
Diskriminering mellan tumorsfärer och cell kluster är av grundläggande betydelse för kvantifiering av analysen. Figur 1c (de två sista panelerna till höger) visar tydligt de morfologiska skillnaderna mellan en tumorsphere (till vänster) och ett cell kluster (höger). Tumorspheres härrör från en enda cell som har en hög förmåga att själv förnya och växa i låg infästning villkor (båda dragen av TPCs). I själva verket indikerar tumorsphere utveckling tumorigenicitet potential. Denna analys utförs dock in vitro oberoende av de ledtrådar som härrör från hela organismen. för att validera cellernas tumorigena potential in vivobör organtransplantationer transplantations experiment utföras (figur 1d).
Validering av rekombinanta proteiner behandling
Innan du ställer in tumorspheres behandling, den optimala koncentrationen vid vilken proteinet av intresse utlöser en effekt på tumörceller bör bestämmas. För att göra detta krävs en bedömning av uttrycksnivån för proteiners underordnade målgener (figur 2). En litteraturstudie på PubMed utfördes innan målgenerna bestämde sig för att testa genom qRT-PCR. I händelse av att det protein av intresse har visat sig modulera olika nedströms vägar, bör val av flera gener som är associerade med var och en av dessa vägar utföras. Till exempel, Flt3l (FMS-liknande tyrosin Kinas 3) har visat sig modulera STAT5 signalering i akut myeloisk leukemi, inducera nedströms uttryck av P21, c-MYC, och CyclinD1 (figur 2)27. Dessutom är uttrycket av Flt3l krävs för dendritiska celler differentiering medla aktivering av STAT3 signalering väg28. För att bedöma STAT3 aktivitet, Socs3 och CyclinD1 uttryck kontrollerades (figur 2). Analys av resultaten visade en dosberoende effekt av rekombinant proteinbehandling på några av de testade generna (P21, CyclinD1 och Socs3), medan andra inte påverkades (c-MYC). Det är viktigt att bestämma de nedströms gener som svarar på proteinet av intresse i den specifika tumören testas för tillförlitlig bedömning av behandlingens effektivitet.
Optimering av protokollet för plasmid transfektion
För att upprätta ett effektivt protokoll för plasmid transfektion och ytterligare tumorsphere formation assay, effekterna av transfektion på anhängare tumörceller testades (figur 3a). Behandling med transfektionsreagens utfördes efter tillverkarens protokoll och två olika mängder av reagensen testades. Effektivitet bedömdes anställa en GFP reporter plasmid. I våra händer observerade vi en högre transfektionseffektivitet med lägre mängder av reagensen (figur 3a). Faktiskt högre koncentrationer leda till ökad celldöd, börjar vid 48 h och blir mer uppenbar efter 72 h från tiden för transfektion. Samma transfection protokoll var inte effektivt i celler i suspension, som ackumulering av döda celler och cellulära skräp blev uppenbart 24 h efter början av behandlingen, vilket tyder på minskad cellulär lönsamhet. För att övervinna denna tekniska utmaning, var ett två steg protokoll anställd: utföra transfektion på anhängare celler, lossa dem 24 h efter behandlingen, och platta dem i suspension för 7 dagar. Kontroll tumorspheres uttryckte verkligen GFP i slutet av experimentet (figur 3b).
Figur 1: tumör cells isolering, tumorsphere-härledning och transplantation. (A) schematisk representation av avsnitt 2 i protokollet (tumör cells isolering). Varje nyckelsteg i protokollet summeras. B schematisk representation av avsnitt 3 i protokollet tumorspheres härledning. Varje nyckelsteg i protokollet summeras. (C) från vänster: Bright-fältet bild av isolerade tumörceller vid passage 2 (P2) vid låg förstoring (Scale bar = 50 μm) och hög förstoring (Scale bar = 50 μm); Ljust-sätta in avbildar av en tumorsphere som härledas från tumörceller efter 30 dagar i upphängning kultur (fjäll bommar för = 250 μm), och ljust-sätta in avbildar av ett cell kluster bildat från tumörceller efter 30 dagar i upphängning kultur (fjäll bomma för = 50 μm). D schematisk representation av avsnitt 6 i protokollet tumorsphere transplantatavstötning transplantation. Varje nyckelsteg i protokollet summeras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: validering av underordnade målgener för bestämning av rekombinant proteinkoncentration. qRT-PCR-resultat för bedömning av Flt3l behandlings koncentration. Tvåvägsanova utfördes. Betydelse visas för jämförelsen med icke-behandlad kontroll. (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: ställa in protokollet tumorspheres transfektion. A) representativa ljus fälts-och fluorescerande bilder av tumörceller som behandlats med låg (övre) eller hög (nedre) koncentration av transfektionsreagens (0,75 μl eller 1,5 μl i 24 väl plattor) (skalbar = 50 μm). B representativ bild av tumorsfärer bildade av GFP plasmid-behandlade celler, 7 dagar efter plätering cellerna i suspensionen (Scale bar = 50 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera metoder har använts för isolering och karakterisering av tpcs från tumör heterogena cellpopulationer: tumör klonogena assays, FACS isolering och tumorsphere formation assay. Tumören klonogena analysen beskrevs första gången i 1971, används för stamcells studier, och först därefter tillämpas på cancerbiologi29,30. Denna metod är baserad på cancer stamcells inneboende egenskapen att expandera utan begränsningar i mjuka geler kulturer31. Sedan dess utveckling, denna metod har använts i stor utsträckning i cancerforskning för flera ändamål, inklusive tumör cell heterogenitet studier, effekten av hormonell behandling på celltillväxt, och tumör resistens studier31. Hittills, denna analys är fortfarande anställd för identifiering av tumör initiera celler för flera typer av cancer32.
FACS isolation bygger på förkunskaper om molekylära markörer som finns på cellernas yta på intresse. Det har varit allmänt utnyttjas för isolering av TPCs från både flytande och solida tumörer. Till exempel, den första identifieringen av Human akut myeloisk leukemi (AML) initiera celler utfördes av Dr dick ' s grupp genom att utnyttja FACS fraktionering och transplantations analyser baserat på kunskapen om de markörer som finns på bulk AML-celler9. Använda en liknande strategi, Dr Clarke grupp isolerade bröstcancer initierar celler3. Tumorsphere formation assay är en annan metod som används för identifiering och undersökning av TPCs. Denna metod utvecklades först för att identifiera cancer stamceller från hjärntumörer33. Intressant, det var initialt testats med samma villkor kända för att gynna neurala stamceller tillväxt, vilket gynnar självförnyelse fastighet också förknippas med TPCs33. Dessutom förlitar sig tumorsphere formation på TPCs förmåga att växa på ett förankrings oberoende sätt.
De tre ovan beskrivna metoder kan användas parallellt för att öka sannolikheten för att isolera och molekylärt karakterisera tpcs populationer, övervinna begränsningarna av varje metod. Till exempel, FACS, trots att få den stora fördelen av att isolera ren cellpopulationer, starkt beroende av användningen av ytan markörer som ännu inte är kända för alla cancertyper. Sålunda, dess användning är begränsad till isolering av TPCs uttrycker kända markörer. Tumör klonogena och tumorsphere formation analyser är båda baserade på cellulära egenskaper, kända för att vara förknippade med tpcs. Båda dessa metoder kan användas som den första raden av studier på nya eller ännu inte studerat cancer. Dessutom kan dessa två metoder säkerställa expansion och berikning av cellpopulationen av intresse, underlätta identifieringen av molekylära markörer, och möjliggör både cancer resistens och Drug screening studier. I detta sammanhang är tumorsphere formation assay mer fördelaktigt, eftersom dessa sfäriska strukturer bättre återskapa miljön finns i tumör vävnader (hypoxiska områden i mitten av sfärerna)34. Faktum är att det tidigare har visat att 3D-kulturer är mer tillförlitliga för att förutsäga läkemedelsbehandlingar utfall34. Tumorspheres kan återvinnas efter kultur, och används för transplantatavstötning experiment: nedbrytning av tumorspheres i enskilda celler lösningar och transplantation till mottagar möss kommer att möjliggöra in vivo bedömning av den tumorigena kapaciteten hos nyligen identifierade TPCs, jämfört med bulk tumörceller.
För att framgångsrikt få en start cellulära material representant för tumör heterogenitet, är det viktigt att först utföra slumpmässiga provtagning av vävnaden. RMS kännetecknas av fibrotiska, feta, eller mycket vaskulariserad områden som är klart urskiljbara i isolerade tumörer, således, för att bibehålla denna cellulära mångfald, kommer insamling av varje område av vävnaden krävas. Dessutom, för att öka chanserna för celler överlevnad under digestionsprocessen, malning av den insamlade vävnaden måste resultera i jämnt stora bitar: mindre fragment är mer benägna att översmälta inducera minskning av cellernas lönsamhet. Detta kan vara särskilt tråkigt på grund av olika morfologi och stelhet i RMS.
För kvantifiering av resultatet av tumorsphere formation assay, är det av avgörande betydelse att skilja mellan verkliga tumorspheres och cellulära kluster (figur 1c, de två sista panelerna till höger). En tumorsphere är solid sfäroid struktur där det inte är möjligt att diskriminera cell composiiton; i ett cell kluster kan däremot enstaka celler lätt diskrimineras. Cell kluster får inte anta en rundad form och är betydligt mindre jämfört med tumorspheres, vilket sträcker sig mellan 50-250 μm25.
För att uppnå tumorspheres transplantation, att få en enhetlig enda celler lösning är ett centralt steg. I själva verket, med tanke på den snäva struktur och stora storleken på en tumorsphere, nedbrytning av cellerna blir ett stort begränsande steg i beredningen av en enda cellsuspension som ytterligare används för transplantation. Flera cykler av enzymatisk nedbrytning kombinerat med mekanisk dissociation är därför nödvändiga för fullständig dissociation av tumorspheres. För att bekräfta utvecklingen av dissociation och ett lyckat resultat, måste lösningen övervakas under ett ljust fält Mikroskop.
Trots de många fördelar som tumorsphere formation analys, tumorspheres har visat att inte komma från varje typ av tumör eller från alla kommersiellt tillgängliga cellinjer. I dessa fall kan analysen inte användas som standard för bestämning av cell tumorigenicitet och kvantifiering av TPCs inom en heterogen population. En annan begränsning av denna analys är associerad med det faktum att olika tumörtyper kräver olika odlings-och dissociation villkor; Därför krävs tidskrävande optimering och felsökning av båda protokollen för varje tumörtyp eller cellinje. Dessutom kan fusion av flera tumorspheres förekomma i kulturen, vilket gör bedömningen av deras storlek och siffror oklara.
Trots att tumorsphere formation analysen tidigare har använts i RMS studier, det har främst tillämpats på kommersiellt tillgängliga RMS-celllinjer för att identifiera de molekylära vägar som är involverade i tumör bildning och utveckling18, 20,21. Med tanke på den heterogena vävnad sammansättningen, de många subtyper av tumörer och olika utvecklingssammanhang som RMS har sitt ursprung, anställning av RMS cellinjer begränsar tillämpningen av denna analys för identifiering av både celler av ursprung och utvecklings ledtrådar som leder till tumörutveckling in vivo.
Ett försök att utveckla ett effektivt protokoll för tumorsphere härledning, med början från mänskliga sarkom prover, har tidigare visat dåliga resultat. Tumorspheres utvecklades från endast 10% av proverna35. Sålunda, det finns ett behov av en reproducerbar och tillförlitlig analys för isolering av primära RMS-celler och tumorsphere utveckling. Som svar på detta behov, den beskrivna tumorsphere formation analysen var optimerad för att användas i primära cellkulturer. Utvecklingen av detta protokoll är det första steget mot att besvara stora frågor på området (dvs. hur RMS-celler i Origin skiljer sig åt beroende på miljö sammanhang). Mer detaljerat, beskrivs här är ett reproducerbart protokoll för isolering av primära tumörceller från RMS vävnader, bildandet av tumorspheres, tumorsphere behandling (båda utförs med rekombinanta proteiner eller överuttryck plasmider), och transplantatavstötning transplantations experiment.
Sammanfattningsvis är tumorsphere formation analysen en väletablerad och mångsidig metod för identifiering av TPCs i olika typer av tumörer, berika cellerna med ökad självförnyelse kapacitet och förmågan att växa i en Anchorage-oberoende Sätt. Denna analys är baserad på funktionella egenskaper hos de cellpopulationer som studeras och inte på tidigare kunskaper om molekylära markörer; Sålunda, det kan tillämpas som ett undersökande verktyg för ett brett spektrum av tumörer typer. Dessutom gör isolering av sällsynta cellpopulationer uppnås med tumorsphere kulturer denna in vitro -analys en idealisk plattform för cancer drogtester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, och NIH pilot Grant inom NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 till A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
