Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Mausrhabdomyosarkom Primärzellen, Tumorsphärenbildung und -behandlung und Allograft-Transplantation ausgehend von Tumorsphärenkulturen.
Abstract
Rhabdomyosarkom (RMS) ist das häufigste Weichteilsarkom bei Kindern. Obwohl erhebliche Anstrengungen die Identifizierung gemeinsamer Mutationen im Zusammenhang mit RMS ermöglicht haben und die Diskriminierung verschiedener RMS-Subtypen ermöglicht haben, bestehen nach wie vor große Herausforderungen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen, um die Prognose weiter zu verbessern. Obwohl durch die Expression myogener Marker identifiziert, gibt es immer noch erhebliche Kontroversen darüber, ob RMS myogene oder nicht-myogene Ursprünge hat, da die Ursprungszelle immer noch schlecht verstanden wird. In der vorliegenden Studie wird eine zuverlässige Methode für den Tumorsphären-Assay für Maus-RMS bereitgestellt. Der Assay basiert auf funktionellen Eigenschaften von Tumorzellen und ermöglicht die Identifizierung seltener Populationen im Tumor mit tumorgenen Funktionen. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Testen rekombinanter Proteine, zur Integration von Transfektionsprotokollen mit dem Tumorsphärentest und zur Bewertung von Kandidatengenen, die an der Tumorentwicklung und -wachstum beteiligt sind. Weiter beschrieben ist ein Verfahren zur Allograft-Transplantation von Tumorsphären in Empfängermäuse, um die tumorgene Funktion in vivozu validieren. Insgesamt ermöglicht die beschriebene Methode eine zuverlässige Identifizierung und Prüfung seltener RMS-Tumorenpopulationen, die auf RMS angewendet werden können, die in verschiedenen Kontexten auftreten. Schließlich kann das Protokoll als Plattform für das Screening von Arzneimitteln und die zukünftige Entwicklung von Therapeutika genutzt werden.
Introduction
Krebs ist eine heterogene Krankheit; darüber hinaus kann die gleiche Art von Tumor verschiedene genetische Mutationen bei verschiedenen Patienten darstellen, und innerhalb eines Patienten wird ein Tumor aus mehreren Populationen von Zellen1zusammengesetzt. Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der Identifizierung von Zellen dar, die für die Initiierung und Verbreitung von Krebs verantwortlich sind, aber ihre Charakterisierung ist für die Entwicklung effizienter Behandlungen von entscheidender Bedeutung. Der Begriff der Tumor-Vermehrungszellen (TPC), eine seltene Population von Zellen, die zur Tumorentwicklung beitragen, wurde zuvor ausführlich überprüft2. Trotz der Tatsache, dass TPCs bei mehreren Krebsarten charakterisiert wurden, bleibt die Identifizierung von Markern für ihre zuverlässige Isolierung eine Herausforderung für mehrere Tumortypen3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. So kann ein Verfahren, das sich nicht auf molekulare Marker stützt, sondern auf TPC-Funktionseigenschaften (hohe Selbsterneuerung und die Fähigkeit, unter Niedriganhaftungsbedingungen zu wachsen), bekannt als Tumorsphärenbildungstest, weit verbreitet für die Identifizierung von TPCs aus den meisten Tumoren. Wichtig ist, dass dieser Assay auch für die Erweiterung von TPCs eingesetzt werden kann und somit direkt auf Krebsmedikamenten-Screening und Studien zur Krebsresistenz1,10angewendet wird.
Rhabdomyosarkom (RMS) ist eine seltene Form von Weichteilsarkom am häufigsten bei kleinen Kindern11. Althoug RMS kann durch die Beurteilung der Expression myogener Marker histologisch identifiziert werden, die RMS-Ursprungszelle wurde aufgrund der multiplen Tumorsubtypen und der hohen Heterogenität der Tumorentwicklungsreize nicht eindeutig charakterisiert. Tatsächlich haben neuere Studien eine signifikante wissenschaftliche Diskussion darüber ausgelöst, ob RMS myogene oder nicht myogene Ursprünge hat, was darauf hindeutet, dass RMS je nach Kontext12,13 von verschiedenen Zelltypen stammen kann. 14 , 15 , 16 , 17. Zahlreiche Studien an RMS-Zelllinien wurden mit dem Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung von Pfaden durchgeführt, die an der Tumorentwicklung und der Charakterisierung von Markern beteiligt sind, die mit stark selbsterneuernden Populationen assoziiert sind. 18 , 19 , 20 , 21.
Trotz des Potenzials des Tumorsphärenbildungs-Assays zur Identifizierung von RMS-Ursprungszellen wurde jedoch noch keine zuverlässige Methode beschrieben, die auf primären RMS-Zellen angewendet werden kann. In diesem Zusammenhang verwendete eine aktuelle Studie unserer Gruppe einen optimierten Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung der RMS-Ursprungszellen in einem Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Mausmodell22. Mehrere prätumorogene Zelltypen, die aus Muskelgeweben isoliert sind, werden auf ihre Fähigkeit getestet, unter bedingungen mit geringer Anhaftung zu wachsen, was die Identifizierung von Muskelstammzellen als Ursprungszellen für RMS in dystrophischen Kontexten ermöglicht. Beschrieben wird hier ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für den Tumorsphärenbildungstest (Abbildung 1), das erfolgreich zur Identifizierung extrem seltener Zellpopulationen eingesetzt wurde, die für die Entwicklung von Maus-RMS verantwortlich sind.
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Protocol
Das Gehäuse, die Behandlung und das Opfer von Mäusen wurden nach dem genehmigten IACUC-Protokoll des Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute durchgeführt.
1. Reagenzzubereitung
- Bereiten Sie 100 ml Zellisolationsmedien vor: F10 Medium ergänzt mit 10% Pferdeserum (HS).
- 50 ml Kollagenase Typ II Lösung vorbereiten: 1 g Kollagenase Typ II Pulver in 50 ml Zellisolationsmedien auflösen (beachten Sie die Einheiten des Enzyms pro 1 ml Medium, da sich die Anzahl der Einheiten je nach Partie ändert). Aliquot die Lösung und lagern Sie in einem -20 °C Gefrierschrank, bis sie einsatzbereit sind.
HINWEIS: Jede Menge Kollagenase sollte vor der Anwendung getestet werden, da sich die Enzymaktivität über verschiedene Lose hinweg ändern kann. - Bereiten Sie 10 ml pro Probe der zweiten Verdauungslösung vor: Zellisolationsmedien mit 100 Einheiten/ml Kollagenase-Lösung Typ II und 2 Einheiten/ml Dispase II frisch gewichtet. Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor.
- Bereiten Sie 500 ml Tumorzellen Medien: DMEM hohe Glukose ergänzt mit 20% FBS und 1% Stift/Strep.
- Bereiten Sie 500 ml FACS-Puffer vor: 1x PBS ergänzt mit 2,5% v/v normalem Ziegenserum und 1 mM EDTA.
- 500 ml Tumorsphärenmedien vorbereiten: DMEM/F12 ergänzt mit 1% Stift/Strep. Kurz vor der Verwendung, fügen Sie die folgenden Wachstumsfaktoren: 1% N2 Ergänzung, 10 ng/mL EGF, und 10 ng/ mL -FGF.
2. Zellisolation und Kultur
- Bereiten Sie eine 10 cm Platte mit 5 ml Zellisolationsmedien (eine Platte pro Tumorprobe) vor und legen Sie sie bei 37 °C in einen Inkubator, bis sie bereit ist, das Tumorgewebe zu ernten.
- ES wurde berichtet, dass sich RMS spontan sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mausmodellen für Duchenne-Muskeldystrophie entwickelt, wie Z. B10 mdx-Mäuse im Alter von etwa 18 Monaten und bei B6 mdx/mTR-Mäusen um 9 Monate22,23. Anästhetisieren Sie die Maus, die den RMS-Tumor mit Isofluran entwickelt, und opfern Sie das Tier durch zervikale Dislokation oder nach den IACUC-Richtlinien der Institution. Mit der Schere, machen Sie einen Schnitt auf der Haut in dem Bereich, wo der Tumor lokalisiert ist, und (mit Einer Pinzette) ziehen Sie die Haut weg aus dem Bereich des Interesses. Mit einer Rasierklinge, verbrauchen Sie den Tumor aus dem Tier.
- Wiegen Sie 500–1.000 mg des Tumorgewebes und legen Sie es in die in Schritt 2.1 hergestellte Platte (Abbildung 1A).
HINWEIS: Größere Mengen an Gewebe wirken sich negativ auf die Verdauungsschritte aus und verringern die Gesamtausbeute. Wenn der geerntete Tumor größer als 1000 mg ist, teilen Sie ihn in Teile und Proben nach dem Zufallsprinzip, bis das gewünschte Gewicht erreicht ist. Für die Bewertung der Gewebeheterogenität ist eine Zufällige Probenahme erforderlich. - Legen Sie die Platte mit Tumorgewebe in die sterile Zellkulturhaube und zerkleinern Sie sie mit einer Rasierklinge. Tumorgewebe von RMS ist heterogen; daher können verschiedene Bereiche unterschiedliche Widerstände gegen die Schnitte aufweisen. Stellen Sie sicher, dass die Größen der resultierenden Hackstücke einheitlich sind, um eine optimale Verdauung zu gewährleisten.
HINWEIS: RMS existiert als Mischungen verschiedener Gewebetypen (hauptsächlich fibrotisches, vaskularisiertes und fetthaltiges Gewebe), die in jedem Tumor identifiziert werden können. Um 1) isolieren Sie eine heterogene Zellpopulation genau rekapitulieren die Zusammensetzung des ursprünglichen Tumors und 2) nicht verzerrung das Isolationsverfahren, führen Sie zufällige Probenahme des geernteten Gewebes. Zellen aus verschiedenen Bereichen des Tumors sollten in dem in Abschnitt 3 beschriebenen Test parallel in vitro verdaut und getestet werden. - Bewegen Sie das Hackfleisch- und Zellisolationsmedium in ein 15 ml Zentrifugenrohr, waschen Sie die Platte mit 4 ml Zellisolationsmedien und legen Sie sie in das Rohr.
- 700 Einheiten/ml Kollagenaselösung hinzufügen, um das Gewebe zu verdauen und in einem schüttelenden Wasserbad bei 37 °C für 1,5 h zu brüten.
- Nach der Inkubation das Gewebe bei 300 x g für 5 min bei RT abdrehen. Den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören, das Pellet in 10 ml zweiter Verdauungslösung (Dispase) wieder aufhängen und in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C 30 min inkubieren.
- Sobald die zweite Verdauung abgeschlossen ist, pipet auf und ab und passieren Sie die Zellsuspension durch einen 70-m-Nylonfilter auf einem 50 ml Zentrifugenrohr. Fügen Sie dann 10 ml Zellisolationsmedien hinzu, um den Filter zu waschen und die Verdauungslösung zu verdünnen, und drehen Sie das Gewebe bei 300 x g und RT für 5 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 20 ml Tumorzellen medien. Dann die Zellsuspension in eine 15 cm Zellkulturplatte übertragen. Legen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in den Inkubator. Diese Platte wird als P0 identifiziert.
- Ändern Sie am Tag nach der Isolation die Medien. Dieser Schritt ist notwendig, um die Entfernung von Schutt und abgestorbenen Zellen sicherzustellen, die das Zellüberleben negativ beeinflussen können.
- Bewerten Sie die Zellkonfluenk, nachdem das Medium gewechselt wurde, das zwischen 30 % und 60 % liegt, abhängig von der Menge des Ausgangsmaterials und der Zellgröße. Lassen Sie die Zellen im Inkubator wachsen, bis sie 90% Konfluenz erreichen. Überwachen Sie zellen jeden Tag und wechseln Sie alle 2 Tage die Medien. Die Zeit, die für das Zusammenfluss von Tumorzellen erforderlich ist, hängt von mehreren Parametern ab: Tumoraggressivität, Genotyp des Tumors, Alter der Maus, Heterogenität des Gewebes.
- Gehen Sie für die Zelldurchlaufung wie folgt vor:
- Vorerwärmen die Zellablösung und Tumorzellen medien in einem Wasserbad bei 37 °C.
- Waschen Sie die Zellen mit 1x sterilem PBS und inkubieren Sie sie bei 37 °C in 10 ml warmer Zellablösung für 5–10 min.
- Wenn alle Zellen von der Platte gelöst sind, fügen Sie 10 ml warme Tumorzellen Medien hinzu, bewegen Sie die Lösung in ein 50 ml Zentrifugenrohr und drehen Sie Zellen bei 300 x g für 5 min bei RT.
- Setzen Sie die Zellen in 5–10 ml Tumorzellen medien, abhängig von der Pelletgröße, und zählen Sie lebende Zellen mit Trypan blau (1:5 Verdünnung), um abgestorbene Zellen auszuschließen.
- Platte 105 Zellen in 10 cm Platten oder 3 x 105 Zellen in 15 cm Platten. Die Zellverdoppelungszeit hängt von den in Schritt 2.10 beschriebenen Faktoren ab.
3. Tumorsphärenableitung
- Verwenden Sie Tumorzellen an Durchgang P1 oder P2, um die Zellauswahl durch mehrere Passagen zu vermeiden (Abbildung 1B). Um Zellen von der Platte zu lösen, waschen Sie die Schale zunächst mit 1x PBS, ohne die Zellen zu stören, dann bedecken Sie sie mit Einer Zellablösung (5 ml für eine 10 cm Platte oder 10 ml für eine 15 cm Platte) und legen Sie sie 5–10 min im Brutkasten.
- Bestätigen Sie, dass Zellen durch betrachten die Platte unter einem Hellfeldmikroskop getrennt werden, fügen Sie 1:1 Volumen der Tumorzellen Medien (Zellablösung:Tumorzellen Medien), legen Sie die Zellsuspension in einem Zentrifugenrohr und drehen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei RT.
- Resuspend Zellen in FACS-Puffer (Abschnitt 3.4) oder Tumorsphären Medien (Abschnitt 3.5), nach der Methode für die Beschichtung verwendet.
- Beschichtung von Zellen durch Durchflusszytometer
- Resuspend-Zellen im FACS-Puffer (die Menge hängt von der Pelletgröße ab) und zählen Sie lebende Zellen manuell mit Trypan-Blauausschluss. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Zellkonzentration 107 Zellen/ml beträgt (100 l FACS-Puffer pro 106 Zellen). Fügen Sie 1 L Fx Cycle Violet Fleck pro 106 Zellen hinzu, um lebend von abgestorbenen Zellen während der Zellsortierung zu unterscheiden. Bereiten Sie eine unbefleckte Kontrolle vor, bei der den Zellen kein Fx Cycle Violet-Fleck hinzugefügt wird.
HINWEIS: Die Konzentration ist für eine effiziente Färbung und Geschwindigkeit während der Sortierung optimiert. Eine niedrigere Zellkonzentration führt zu einer längeren Sortierzeit, während eine höhere Konzentration die Färbung beeinflusst. - Mit der ungefärbten Steuerung, richten Sie ein FACS-Tor segregieren lebend (Fx Cycle Violet-) von toten (Fx Cycle Violet+) Zellen. Verwenden Sie dann die fluoreszierende Zellsortierung (mit 450/50 Filterbandpass) zur Trennung und Anzahl von lebenden/toten Zellen und zur Beschichtung der gewünschten Anzahl von lebenden Zellen in jedem Brunnen der 96 gut anbringenden Platten. Jeder Brunnen der Platte muss vor Beginn der Sortierung mit 200 L Tumorsphärenmedien gefüllt werden.
HINWEIS: Da TPCs eine seltene Subpopulation innerhalb des gesamten Tumors sind, optimieren Sie das Protokoll, indem Sie 100 Zellen/Well aus Maus-RMS plattieren, um die Bildung von Tumorsphären in der Suspensionskultur zu beobachten. Die Zellzahl pro Brunnen sollte für den spezifischen tumor getestet angepasst werden. - Legen Sie Zellen bis zum Ende des Experiments in den Inkubator. Versuchen Sie nicht, die Platte zu stören, es sei denn, notwendig. Für ein 30-Tägiges Experiment sollte jeder Brunnen jede Woche mit Medien und einem angemessenen Anteil an Wachstumsfaktoren aufgefüllt werden (Medien neigen dazu, zu verdampfen und Wachstumsfaktoren sind nach 1 Woche nicht wirksam).
- Nach Abschluss des Experiments werden Die Platten manuell unter einem Hellfeldmikroskop abschirmt, um Tumorsphären zu identifizieren (siehe Schritt 3.6).
HINWEIS: Ein Zeitpunkt von 30 Tagen wurde optimiert, um RmS-Tumorsphären von Mausgrößen von 50 bis 300 m Durchmesser einfach zu erkennen. Der Zeitpunkt sollte in Abhängigkeit von der Aggressivität des getesteten Tumors und seiner proliferativen Rate angepasst werden.
- Resuspend-Zellen im FACS-Puffer (die Menge hängt von der Pelletgröße ab) und zählen Sie lebende Zellen manuell mit Trypan-Blauausschluss. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Zellkonzentration 107 Zellen/ml beträgt (100 l FACS-Puffer pro 106 Zellen). Fügen Sie 1 L Fx Cycle Violet Fleck pro 106 Zellen hinzu, um lebend von abgestorbenen Zellen während der Zellsortierung zu unterscheiden. Bereiten Sie eine unbefleckte Kontrolle vor, bei der den Zellen kein Fx Cycle Violet-Fleck hinzugefügt wird.
- Beschichtungszellen manuell
- Stellen Sie Zellen in Tumorsphärenmedien (die Menge hängt vom Pellet ab) und zählen Sie lebende Zellen manuell mit Trypanblau (1:10 Verdünnung). Berechnen Sie die Zellkonzentration in der Röhre und Platte die richtige Anzahl von Zellen in einer 96 gut niedrigen Anbauplatte. Legen Sie Zellen bis zum Ende des Experiments in den Inkubator. Versuchen Sie nicht, die Platte zu stören, es sei denn, dies ist für die Auffüllung von Medien und Wachstumsfaktoren erforderlich, wie in Schritt 3.4.3 beschrieben.
- Nach Abschluss des Experiments werden Siebplatten manuell unter einem Hellfeldmikroskop zur Identifizierung von Tumorsphären oder mit der Celigo-Software, wie zuvor in Kessel et al.24 beschrieben, siehe Schritt 3.6 unten.
- Beachten Sie, dass zwei separate Auslesungen als Ergebnis dieses Testes ausgewertet werden können: Anzahl und Größe der gebildeten Tumorsphären.
HINWEIS: Wenn mehr als eine Zelle in einem Brunnen plattiert ist, können sich entweder Tumorsphären oder Zellcluster bilden(Abbildung 1C, dritte und vierte Tafeln). Zellcluster sind kleine zelluläre Aggregate, die sich in der Suspensionskultur bilden, die das Zellüberleben verbessern und durch eine unregelmäßige Form gekennzeichnet sind. Tumorsphären sind groß und haben eine kompaktere Struktur mit einer Sphäroidform. Sie stammen aus einer einzelzelle, die in der Lage ist, in einer verankerungsunabhängigen Weise zu überleben und sich mit einer hohen Rate zu vermehren25. Beschichtungszellen durch Durchflusszytometer oder manuell können austauschbar verwendet werden, abhängig von den im Labor verfügbaren Fähigkeiten. Darüber hinaus ist der Einsatz von Niedrigbefestigungsplatten in einer Größe von unterschiedlich als 96 Wellplatten möglich und abhängig vom gewünschten Ergebnis. Tatsächlich sollte die Bewertung der Tumorsphärenhäufigkeit unter Verwendung von 96 gut niedrigen Befestigungsplatten durchgeführt werden, während ein erstes Screening zur Bewertung von Tumorenpotenzialen schnellere und zuverlässige Ergebnisse auf 6 gut niedrigen Befestigungsplatten liefern wird.
4. Tumorsphärenbehandlung mit rekombinanten Proteinen
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2.
- Wenn Sie eine Behandlung mit rekombinanten Proteinen einrichten, bestimmen Sie zunächst die beste Konzentration nach Abschnitt 4.3, oder wenn die optimale Konzentration zuvor bestimmt wurde, und fahren Sie mit Abschnitt 4.4 über.
- Bestimmen Sie die rekombinante Proteinbehandlungskonzentration.
- Unterbrechen Sie die Zellen in Tumorsphärenmedien (das Volumen hängt von der Pelletgröße ab) und zählen Sie lebende Zellen manuell mit Trypan-Blauausschluss. Berechnen Sie die Zellkonzentration in der Röhre und Platte 100.000 Zellen in einer 6 gut niedrigen Befestigungsplatte. Platte zwei Brunnen pro getesteter Konzentration und zwei Brunnen für unbehandelte Kontrollen (Abbildung 2). Die zu testenden Proteinkonzentrationen basieren auf der Literaturrecherche.
- Behandeln Sie jeden Brunnen von Suspensionszellen mit einer anderen Proteinkonzentration und legen Sie die Zellen 48 h in den Inkubator (Zeit, die notwendig ist, um die Wirkung der Behandlung sowohl auf die Zelllebensfähigkeit als auch auf die Expression nachgeschalteter Zielgene bewerten zu können). Bewerten Sie dann die folgenden Parameter:
- Zellüberleben: Mit einem Hellfeldmikroskop sowie dem Vergleich mit unbehandelten Kontrollen die Zellmorphologie überprüfen. Gesunde Zellen erscheinen hell und reflektierend unter dem Mikroskop, während übermäßiger Zelltod die Ansammlung von Schmutz in den Medien induziert. Für eine quantifizierbare Bestimmung des Zelltodes können Trypan-Blau-Ausschluss, kristallviolette Färbung, MTT oder TUNEL-Assay verwendet werden (in diesem Fall fügen Sie eine gut zur ursprünglichen Beschichtung hinzu).
- Wirkung rekombinanter Proteine auf nachgeschaltete Pfade: Führen Sie eine Literaturrecherche mit PubMed durch, um die nachgeschalteten Gene zu identifizieren, von der bekannt ist, dass sie von dem getesteten Protein betroffen sind. Entwerfen Sie qRT-PCR-Primer für die Zielgene und führen Sie qRT-PCR-Analysen an der aus den behandelten Zellen isolierten RNA durch (Abbildung 2).
- Mit rekombinantem Protein behandeln.
- Unterbrechen Sie die Zellen in Tumorsphärenmedien (das Volumen hängt von der Pelletgröße ab) und zählen Sie lebende Zellen manuell mit Trypan-Blauausschluss. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die für das gewünschte Experiment benötigt werden (100 Zellen pro Bohrkörper einer 96 gut niedrigen Anbauplatte) und verdünnen Sie sie im entsprechenden Tumorsphärenmedienvolumen. Wenn Sie mehr als eine Behandlung durchführen, bereiten Sie separate Zellröhren vor.
- Behandeln Sie jede Röhre mit der entsprechenden Konzentration von rekombinantem Protein und platten Sie die Zellen in einem separaten Brunnen von 96 gut mit geringer Anhaftungsplatte. Die Behandlung wird an jedem Brunnen in Abhängigkeit von der Halbwertszeit des rekombinanten Proteins bis zum 30-tägigen Endpunkt des Experiments wiederholt.
- Führen Sie am Ende des Experiments die Schritte 3.4.4 und 3.6 aus, um die Daten zu analysieren.
5. Tumorsphärenbehandlung mit Überexpressionsplasmiden
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 und 3.2.
- Wenn Sie die Behandlung auf einen neuen Tumortyp einrichten, bestimmen Sie zunächst die beste Konzentration von Plasmid, um den folgenden Abschnitt 5.3 zu verwenden, oder wenn die optimale DNA-Konzentration zuvor bestimmt wurde, und fahren Sie mit Abschnitt 5.4 über.
- Bestimmen Sie die optimale Plasmidkonzentration.
- Resuspend Zellen in Tumorzellen Medien (das Volumen hängt von der Pelletgröße) und manuell zählen lebende Zellen mit Trypan blauen Ausschluss. Plate die gezählten Zellen, um eine Konfluenz von 70%–90% zu erreichen (Zellzahl ist stark abhängig von Zellgröße und Morphologie). GFP-Plasmid wird verwendet, um die Transfektionseffizienz nach dem Herstellerprotokoll des Transfektionsreagenzes für anhängliche Zellen zu testen. Parallel dazu testen Sie auch eine unbehandelte Steuerung (Abbildung 3A). Führen Sie einen Effizienztest in einer 24-Well-Platte durch.
HINWEIS: Haftende Zellen werden verwendet, um die Transfektionseffizienz zu verbessern, da die Transfektion an Suspensionszellen nicht effizient ist und sich negativ auf die Zelllebensfähigkeit auswirkt. - 48 h nach Transfektion bewerten Zellen für die folgenden Parameter:
- Zellüberleben: Vergleichen Sie mit einem Hellfeldmikroskop die Anzahl der Zellen, die in jedem Brunnen vorhanden sind, und vergleichen Sie sie gut mit den unbehandelten Zellen.
- GFP-Expression: Zählen Sie den Prozentsatz der Zellen, die GFP-positiv sind, über die Gesamtzahl der Zellen in jedem Brunnen (Abbildung 3B).
- Resuspend Zellen in Tumorzellen Medien (das Volumen hängt von der Pelletgröße) und manuell zählen lebende Zellen mit Trypan blauen Ausschluss. Plate die gezählten Zellen, um eine Konfluenz von 70%–90% zu erreichen (Zellzahl ist stark abhängig von Zellgröße und Morphologie). GFP-Plasmid wird verwendet, um die Transfektionseffizienz nach dem Herstellerprotokoll des Transfektionsreagenzes für anhängliche Zellen zu testen. Parallel dazu testen Sie auch eine unbehandelte Steuerung (Abbildung 3A). Führen Sie einen Effizienztest in einer 24-Well-Platte durch.
- Überexpression-Plasmidbehandlung
- Unterbrechen Sie die Zellen in Tumorzellmedien (das Volumen hängt von der Pelletgröße ab) und zählen Sie lebende Zellen manuell mit Trypan-Blauausschluss. Platte 200.000 Zellen pro Brunnen einer 6-Well-Platte. Jeder Brunnen wird für ein unabhängiges Transfektionsereignis verwendet. Jeder Brunnen wird mit dem für den spezifischen Tumortyp entwickelten Setup transfiziert (Abbildung 3A).
- 24 h nach der Transfektion, waschen Sie jeden Brunnen mit 1x PBS und inkubieren Sie die Zellen in warmer Zellablösung (genug, um den Brunnen zu bedecken). Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C für 5–10 min, abhängig von den Faktoren in Abschnitt 2.15.
- Wenn Zellen getrennt werden, zählen Sie die Zellen, die von jedem einzelnen Brunnen abgeleitet werden, unabhängig voneinander mit Trypan-Blauausschluss. Platzieren Sie 100.000 Zellen pro Brunnen einer 6 gut niedrigen Befestigungsplatte, um sicherzustellen, dass Zellen, die aus verschiedenen Brunnen gewonnen wurden, nicht gemischt werden. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator und lassen Sie sie eine Woche ungestört.
HINWEIS: Die Dauer dieses Assays beträgt 7 Tage, eine ausreichende Zeit, um die Tumorsphärenbildung zu ermöglichen und gleichzeitig eine Tumorsphärenfusion zu verhindern. Tumorsphärenfusion ist ein Phänomen, das offensichtlich wird, wenn 100.000 oder mehr Zellen zusammen in Suspension für mehr als 1 Woche plattiert werden, was die Beurteilung der Tumorsphärenbildungsfähigkeit verzerrt. Für den Fall, dass das Experiment längere Inkubationszeit erfordert, sollte die Zelldichte angepasst oder polymere Gerüste verwendet werden, um Tumorsphärenfusion zu vermeiden26. - Führen Sie am Ende des Experiments die Schritte 3.5.2 und 3.6 aus, um die Daten zu analysieren.
6. Tumorsphärenpräparation für Allograft-Transplantation
- Setzen Sie extrazelluläre Matrix (ECM) Lösung (50 l pro Allograft) und Tumorzellen Medien (50 l pro Allograft) auf Eis.
- Tumorsphären können für Allograft-Transplantationen verwendet werden. Ziehen Sie alle Tumorsphären, die aus einem bestimmten Zelltyp oder einer bestimmten Behandlung gewonnen werden, in ein 15 ml oder 50 ml Rohr (entsprechend dem Gesamtvolumen der Medien) zusammen (Abbildung 1D). Drehen Sie die Tumorsphären bei 300 x g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand über den Tumorsphären und waschen Sie sie mit 10 ml sterilem 1x PBS.
- Drehen Sie die Tumorsphären bei 300 x g für 5 min bei RT wieder nach unten, aspirieren Sie die 1x PBS, und fügen Sie 500 l zu 1 ml Zellablösung auf dem Zellpellet hinzu, was den Dissoziationsprozess startet. Tumorsphären in Verdauungslösung in ein schüttelendes Wasserbad bei 37 °C inkubieren und alle 10 min das Fortschreiten der Verdauung überprüfen. Um Tumorsphären zu helfen, sich in eine einzellige Lösung zu dissoziieren, pipette die Zellen nach oben und unten für mechanische Störungen. Der Verdauungsprozess kann bis zu 30 min dauern.
HINWEIS: Trotz der Tatsache, dass die Inkubationszeit erheblich variiert, wenn Tumorsphären aus verschiedenen primären RMS-Zellen abgeleitet werden, wurde nie eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit im Verhältnis zur Verdauungszeit beobachtet. - Wenn eine Einzelzelllösung erhalten ist, fügen Sie ein Volumen von Tumorzellenmedien (1:1, Zellablösung: Tumorzellenmedien) hinzu und drehen Sie sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt müssen alle Schritte auf Eis ausgeführt werden. Nach dem Spinnen bilden Tumorsphären kein stabiles Pellet wie die Einzelzellenlösungen. Um sicherzustellen, dass die Tumorsphären nicht verdrängt oder angesaugt werden, verwenden Sie eine 1 ml Pipette und saugen Sie die Flüssigkeit vorsichtig an. Wechseln Sie zu einer 200-L-Pipette, wenn nur noch 1 ml übrig sind. - Resuspend Zellen in kalten Tumorzellen Medien (das Volumen hängt von der Pelletgröße ab), legen Sie die Zellen auf Eis und zählen lebende Zellen mit Trypan blauen Ausschluss. Nach der Bestimmung der richtigen Menge an Zellen für die Allograft verwenden, resuspendieren sie in einem Gesamtvolumen von 50 l von kalten Tumorzellen Medien. Abkühlen einer Pipettenspitze in kalten Tumorzellen Medien. Wenn die Spitze kalt ist, verwenden Sie sie, um 50 L ECM-Lösung zu nehmen und in das Rohr mit den Zellen hinzuzufügen. Entfernen Sie die Rohre dabei nicht vom Eis.
ANMERKUNG: Die Anzahl der Zellen, die für die Transplantation verwendet werden sollen, sollte nach dem tumorgeprüften und experimentellen Ziel bestimmt werden: Eine größere Anzahl transplantierter Zellen verringert die Zeit der Tumorentwicklung (20.000 Zellen aus Maus-RMS-Tumorsphären haben gezeigt, dass 6 Wochen nach der Injektion zu einem Tumor entwickeln). Um verschiedene Zelllinien oder verschiedene Behandlungen vergleichen zu können, ist es wichtig, von der gleichen Anzahl von Zellen aus zu beginnen. - Da die Zellen nun für die Transplantation bereit sind, auf Eis bis zur Injektion warten. Legen Sie eine gekapselte 0,5 ml Insulinspritze mit einer 29 G Nadel auf Eis, um zu verhindern, dass die Zelllösung bei Aspiration fest wird.
- Schalten Sie den Durchflussmesser auf 200 ml/min Sauerstoff und den Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % ein. Anästhetisieren Sie eine 2 Monate alte männliche NOD/SCID-Maus, indem Sie sie in die Induktionskammer legen. Warten Sie 2–3 min, bis die Maus schläft und die Zucht verlangsamt wurde. Vor Beginn des Eingriffs, bestätigen Sie zunächst durch eine Fußprise, dass die Maus schläft, dann tierarzt Salbe auf die Augen anwenden. Rasieren Sie die rechte Seite des Tieres, aspirieren Sie die Zelllösung in der vorgekühlten Spritze und injizieren Sie sie subkutan in den rasierten Bereich. Eine sichtbare Beule unter der Haut bildet sich, wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird.
HINWEIS: Zellallografts können in der gleichen Maus-Stamm wie die der transplantierten Zellen durchgeführt werden. Wenn die RMS-Zellen z. B. ursprünglich aus einer C57BL/6-Maus isoliert wurden, kann das Allograft in C57BL/6-Mäusen durchgeführt werden. Wenn der Stamm anders ist, sollten immundefizienten Empfängermäuse verwendet werden, um eine Abstoßung zu vermeiden. Das Alter der Empfängermäuse kann auch je nach Versuchsziel angepasst werden. - Überwachen Sie die Mäuse einmal pro Woche auf Tumorbildung.
HINWEIS: Um die Identität des Tumors zu validieren, der aus einer Allograft-Transplantation gewonnen wurde, sollte er mit dem ursprünglichen Tumor verglichen werden, von dem die Zellen isoliert wurden. Zu diesem Ziel kann eine histologische Analyse für morphologische Merkmale und Expression myogener Marker sowie umfassendere RNAseq durchgeführt werden.
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Representative Results
Tumorsphären-Erkennung
Die Zellisolation wurde optimiert, um die maximale Heterogenität der im Tumorgewebe vorhandenen Zellpopulationen zu erhalten. Erstens, da isolierte Gewebe morphologisch unterschiedliche Bereiche präsentierten, um die Chancen der Isolierung einheitlicher seltener Zellpopulationen zu erhöhen, wurde eine Probenahme aus mehreren Bereichen des Tumors durchgeführt(Abbildung 1A, erstes Panel auf der linken Seite). Zweitens wurde die mechanische Dissoziation der geernteten Proben unter Beibehaltung der Homogenität in der Größe des Hackfleisches durchgeführt, trotz unterschiedlicher Resistenzen, die in den Proben vorhanden gewesen sein können(Abbildung 1A,dritte und vierte Tafel von links ). Je nach Ausgangsmaterial (Tumoraggressivität, Alter und Genotyp der Maus, Tumorposition) kann die Rückgewinnung der Zellen von der mechanischen Belastung des Isolationsprozesses variieren, von 3-7 Tagen(Abbildung 1A, letztes Panel rechts). Um das Überleben und Wachstum der Zellen zu verbessern, sollten die Medien am Tag nach der Isolation und dann alle 2 Tage gewechselt werden. Dadurch werden die während des Isolationsprozesses angesammelten Trümmer und abgestorbenen Zellen entfernt, die sich auf die Zelllebensfähigkeit auswirken könnten. Tumorsphärenbildung Assay sollte beginnen, nachdem die Zellen mindestens einmal durchzogen wurden, um eine optimale Lebensfähigkeit zu gewährleisten, wenn sie in Suspensionskulturen platziert werden(Abbildung 1B, erstes Panel auf der linken Seite). In unseren Händen wurden optimale Ergebnisse erzielt, beginnend mit Zellen aus Durchgang 2 (P2) (Abbildung 1C, erste und zweite Platte auf der linken Seite). Diese spezifische Passage wurde nach mehreren Tests ausgewählt. Wenn P0-Zellen unter niedrig anhaftungsarmen Bedingungen plattiert wurden, bildeten sie eine geringe Anzahl von Tumorsphären im Vergleich zu späteren Passagen, möglicherweise aufgrund von Zellablagerungen, die nach der Isolierung noch vorhanden sind. In späteren Passagen wurden verschiedene Muster der Tumorsphärenbildung beobachtet und der Selektion zugeschrieben, die nach zahlreichen Passagen in der Kultur auftritt. Wenn verschiedene Zelllinien verglichen werden, wird vorgeschlagen, von der gleichen Passage zu beginnen.
Die Diskriminierung zwischen Tumorsphären und Zellclustern ist von grundlegender Bedeutung für die Quantifizierung des Assays. Abbildung 1C (letzte beiden Tafeln rechts) zeigt deutlich die morphologischen Unterschiede zwischen einer Tumorsphäre (links) und einem Zellhaufen (rechts). Tumorsphären stammen von einer einzelnen Zelle, die eine hohe Fähigkeit zur Selbsterneuerung und wachstumsfähigkeit bei niedrigen Befestigungsbedingungen (beide Merkmale von TPCs) hat. Tatsächlich deutet die Tumorsphärenentwicklung auf das Tumorenizitätspotenzial hin. Dieser Test wird jedoch in vitro unabhängig von den Hinweisen durchgeführt, die vom gesamten Organismus abgeleitet werden; Um also das tumorgene Potenzial der Zellen in vivozu validieren, sollten Allografts-Transplantationsexperimente durchgeführt werden (Abbildung 1D).
Validierung der Behandlung rekombinanter Proteine
Vor der Einrichtung der Tumorsphärenbehandlung sollte die optimale Konzentration bestimmt werden, bei der das Protein von Interesse eine Wirkung auf Tumorzellen auslöst. Dazu ist eine Bewertung des Expressionsgrads der nachgelagerten Zielgene des Proteins erforderlich (Abbildung 2). Eine Literaturrecherche auf PubMed wurde durchgeführt, bevor die Zielgene ermittelt wurden, die über qRT-PCR getestet werden sollen. Für den Fall, dass das Protein von Interesse gezeigt hat, dass es verschiedene nachgeschaltete Pfade moduliert, sollte die Auswahl mehrerer Gene durchgeführt werden, die mit jedem dieser Pfade verbunden sind. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Flt3l (Fms-ähnliche Tyrosinkinase 3) STAT5-Signalisierung bei akuter myeloischer Leukämie moduliert und die nachgeschaltete Expression von p21, c-Myc und CyclinD1 (Abbildung 2)27induzieren. Darüber hinaus ist die Expression von Flt3l für dendritische Zellen Differenzierung zur Vermittlung der Aktivierung des STAT3-Signalwegs28erforderlich. Um die STAT3-Aktivität zu bewerten, wurden die Expressionen Socs3 und CyclinD1 überprüft (Abbildung 2). Die Analyse der Ergebnisse zeigte eine dosisabhängige Wirkung der rekombinanten Proteinbehandlung auf einige der getesteten Gene (p21, CyclinD1 und Socs3), während andere nicht betroffen waren (c-Myc). Es ist wichtig, die nachgeschalteten Gene zu bestimmen, die auf das Protein von Interesse in dem spezifischen Tumor reagieren, der für eine zuverlässige Bewertung der Behandlungswirksamkeit getestet wurde.
Optimierung des Protokolls für Diepidtransfektion
Um ein effizientes Protokoll für die Plasmidtransfektion und weiteren Tumorsphärenbildungstest zu etablieren, wurden die Auswirkungen der Transfektion auf anhängliche Tumorzellen getestet (Abbildung 3A). Die Transfektionsreagenzbehandlung wurde nach dem Herstellerprotokoll durchgeführt, und es wurden zwei verschiedene Mengen des Reagenzes getestet. Die Effizienz wurde mit einem GFP-Reporterplasmid bewertet. In unseren Händen beobachteten wir eine höhere Transfektionseffizienz mit geringeren Mengen des Reagenzes (Abbildung 3A). Tatsächlich führen höhere Konzentrationen zu einem erhöhten Zelltod, beginnend bei 48 h und werden nach 72 h ab dem Zeitpunkt der Transfektion deutlicher. Das gleiche Transfektionsprotokoll war in Zellen in Suspension nicht effizient, da die Ansammlung abgestorbener Zellen und zellulärer Trümmer 24 h nach Beginn der Behandlung sichtbar wurde, was auf eine verminderte Zelllebensfähigkeit hindeutet. Um diese technische Herausforderung zu meistern, wurde ein zweistufiges Protokoll verwendet: Transfektion auf anhaftenden Zellen durchführen, sie 24 h nach der Behandlung lösen und sie für 7 weitere Tage in Suspension plattieren. Kontrolltumorsphären drückten am Ende des Experiments tatsächlich GFP aus (Abbildung 3B).
Abbildung 1: Tumorzellisolierung, Tumorsphärenableitung und Transplantation. (A) Schematische Darstellung von Abschnitt 2 des Protokolls (Tumorzellisolierung). Jeder wichtige Schritt des Protokolls wird zusammengefasst. (B) Schematische Darstellung von Abschnitt 3 des Protokolls (Tumorsphärenableitung). Jeder wichtige Schritt des Protokolls wird zusammengefasst. (C) Von links: Hellfeldbild isolierter Tumorzellen in Durchgang 2 (P2) bei geringer Vergrößerung (Skalenbalken = 50 m) und hoher Vergrößerung (Skalenbalken = 50 m); Hellfeldbild einer Tumorsphäre, die aus Tumorzellen nach 30 Tagen in der Suspensionskultur abgeleitet wurde (Skala bar = 250 m), und Hellfeldbild eines Zellclusters, der aus Tumorzellen nach 30 Tagen in der Suspensionskultur gebildet wurde (Skala bar = 50 m). (D) Schematische Darstellung von Abschnitt 6 des Protokolls (Tumorsphäre-Allograft-Transplantation). Jeder wichtige Schritt des Protokolls wird zusammengefasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Validierung nachgelagerter Zielgene zur Bestimmung der rekombinanten Proteinkonzentration. qRT-PCR-Ergebnisse zur Beurteilung der Flt3l-Behandlungskonzentration. Zwei-Wege-ANOVA wurde durchgeführt. Für den Vergleich mit der nicht behandelten Steuerung wird die Signifikanz angezeigt. (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Einrichten des Transfektionsprotokolls für Tumorsphären. (A) Repräsentative Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von Tumorzellen, die mit einer niedrigen (oberen) oder hohen (unteren) Konzentration des Transfektionsreagenzes (0,75 l oder 1,5 l in 24 Wellplatten) behandelt wurden (Skala bar = 50 m). (B) Repräsentatives Bild von Tumorsphären, die aus GFP-Plasmid-behandelten Zellen gebildet wurden, 7 Tage nach der Beschichtung der Zellen in Suspension (Skala bar = 50 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mehrere Methoden wurden für die Isolierung und Charakterisierung von TPCs aus Tumor heterogenen Zellpopulationen eingesetzt: Tumor-Clonogene-Assays, FACS-Isolation und Tumorsphärenbildung. Der Tumor-Clonogen-Assay wurde erstmals 1971 beschrieben, für Stammzellstudien verwendet und erst später auf die Krebsbiologieangewendet 29,30. Diese Methode basiert auf der intrinsischen Eigenschaft der Krebsstammzellen, um sich ohne Einschränkungen in weichen Gelkulturen zu erweitern31. Seit seiner Entwicklung, Diese Methode ist weit verbreitet in der Krebsforschung für mehrere Zwecke verwendet worden, einschließlich Tumorzell Heterogenität Studien, Wirkung der hormonellen Behandlung auf das Zellwachstum, und Tumorresistenz Studien31. Bis heute wird dieser Test noch für die Identifizierung von Tumor-Initiierungszellen für mehrere Arten von Krebsverwendet 32.
Die FACS-Isolierung basiert auf Vorkenntnissen molekularer Marker, die auf der Oberfläche von Zellen auf Interesse vorhanden sind. Es wurde weit verbreitet für die Isolierung von TPCs von flüssigen und soliden Tumoren verwendet. Zum Beispiel wurde die erste Identifizierung der menschlichen akuten myeloischen Leukämie (AML) anitiierenden Zellen von Dr. Dicks Gruppe durchgeführt, indem FACS-Fraktionierungs- und Transplantationstests verwendet wurden, die auf dem Wissen der Marker basieren, die auf Bulk-AML-Zellen9vorhanden sind. Mit einem ähnlichen Ansatz isolierte Dr. Clarkes Gruppe Brustkrebs, derZellenanimieren datising 3 . Tumorsphärenbildung Assay ist ein anderer Ansatz für die Identifizierung und Untersuchung von TPCs verwendet. Diese Methode wurde zuerst entwickelt, um Krebsstammzellen aus Hirntumoren zu identifizieren33. Interessanterweise wurde es ursprünglich mit den gleichen Bedingungen getestet, die bekanntermaßen das Wachstum neuronaler Stammzellen begünstigen, wodurch die Selbsterneuerungseigenschaft begünstigt wurde, die auch mit TPCs33assoziiert ist. Darüber hinaus beruht die Tumorsphärenbildung auf der Fähigkeit von TPCs, auf verankerungsunabhängige Weise zu wachsen.
Die drei oben beschriebenen Ansätze können parallel verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, TPCs Populationen zu isolieren und molekular zu charakterisieren, wodurch die Grenzen jeder Methode überwindet werden. FaCS beispielsweise, obwohl es den großen Vorteil der Isolierung reiner Zellpopulationen mit sich bringt, setzt stark auf die Verwendung von Oberflächenmarkern, die noch nicht für alle Krebsarten bekannt sind. Daher beschränkt sich seine Verwendung auf die Isolierung von TPCs, die bekannte Marker exdrücken. Tumor clonogene und Tumorsphärenbildung Assays basieren beide auf zellulären Eigenschaften, bekannt, mit TPCs verbunden sein. Beide Methoden können als erste Studienreihe zu neuen oder noch nicht untersuchten Krebsarten eingesetzt werden. Darüber hinaus können diese beiden Methoden die Ausdehnung und Anreicherung der zellgebundenen Zellpopulation gewährleisten, die Identifizierung molekularer Marker erleichtern und sowohl Krebsresistenz- als auch Arzneimittelscreening-Studien ermöglichen. In diesem Zusammenhang ist der Tumorsphärenbildungstest vorteilhafter, da diese Sphäroidstrukturen die Umgebung in Tumorgeweben (hypoxische Bereiche in der Mitte der Sphären) besser nachbilden34. Tatsächlich hat sich bisher gezeigt, dass 3D-Kulturen zuverlässiger für die Vorhersage von Medikamentenbehandlungen Ergebnis34. Tumorsphären können nach der Kultur zurückgewonnen und für Allograft-Experimente verwendet werden: Die Verdauung von Tumorsphären in Einzelzellenlösungen und die Transplantation in Empfängermäuse ermöglichen eine in vivo-Bewertung der tumorigenen Kapazität von identifizierte TPCs im Vergleich zu Massentumorzellen.
Um erfolgreich ein startzelluläres Material zu erhalten, das für die Tumorheterogenität repräsentativ ist, ist es wichtig, zuerst eine zufällige Probenahme des Gewebes durchzuführen. RMS zeichnen sich durch fibrotische, fettige oder stark vaskularisierte Bereiche aus, die bei isolierten Tumoren deutlich unterscheidbar sind, so dass zur Aufrechterhaltung dieser zellulären Vielfalt die Erfassung jedes Bereichs des Gewebes erforderlich ist. Um die Überlebenschancen der Zellen während des Verdauungsprozesses zu erhöhen, muss das Zerkleinern des gesammelten Gewebes zu gleichmäßig großen Stücken führen: kleinere Fragmente sind eher überdaut, was zu einer Verringerung der Zelllebensfähigkeit führt. Dies kann aufgrund der vielfältigen Morphologie und Steifigkeit von RMS besonders mühsam sein.
Für die Quantifizierung des Ergebnisses des Tumorsphärenbildungstestes ist es von entscheidender Bedeutung, zwischen realen Tumorsphären und zellulären Clustern zu unterscheiden(Abbildung 1C, die letzten beiden Panels rechts). Eine Tumorsphäre ist eine feste Sphäroidstruktur, in der es nicht möglich ist, das Zellkomposiiton zu unterscheiden; Im Gegensatz dazu können in einem Zellcluster einzelne Zellen leicht diskriminiert werden. Zellcluster nehmen möglicherweise keine abgerundete Form an und sind im Vergleich zu Tumorsphären, die zwischen 50-250 m25liegen, deutlich kleiner.
Um eine Transplantation von Tumorsphären zu erreichen, ist die Erzielung einer einheitlichen Einzelzellenlösung ein wichtiger Schritt. In der Tat, angesichts der engen Struktur und der großen Größe einer Tumorsphäre, Verdauung der Zellen wird ein wichtiger einschränkender Schritt bei der Vorbereitung einer Einzelzellsuspension, die weiter für die Transplantation verwendet wird. Mehrere Zyklen der enzymatischen Verdauung in Kombination mit mechanischer Dissoziation sind daher für die vollständige Dissoziation von Tumorsphären notwendig. Um den Fortschritt der Dissoziation und ein erfolgreiches Ergebnis zu bestätigen, muss die Lösung unter einem Hellfeldmikroskop überwacht werden.
Trotz der vielfältigen Vorteile des Tumorsphärenbildungs-Assays haben tumorsphären nicht jede Art von Tumor oder aus allen handelsüblichen Zelllinien. In diesen Fällen kann der Assay nicht als Standard für die Bestimmung der Zelltumorigenität und Quantifizierung von TPCs innerhalb einer heterogenen Population verwendet werden. Eine weitere Einschränkung dieses Assays ist mit der Tatsache verbunden, dass verschiedene Tumortypen unterschiedliche Wachstums- und Dissoziationsbedingungen erfordern; Daher erfordert es eine zeitaufwändige Optimierung und Fehlerbehebung beider Protokolle für jeden Tumortyp oder jede Zelllinie. Darüber hinaus kann die Verschmelzung mehrerer Tumorsphären in der Kultur auftreten, wodurch die Bewertung ihrer Größe und Anzahl unklar wird.
Trotz der Tatsache, dass der Tumorsphärenbildungstest zuvor in RMS-Studien verwendet wurde, wurde es hauptsächlich auf kommerziell erhältliche RMS-Zelllinien angewendet, um die molekularen Pfade zu identifizieren, die an der Tumorbildung und -entwicklung beteiligt sind18, 20,21. Angesichts der heterogenen Gewebezusammensetzung, der zahlreichen Subtypen von Tumoren und der vielfältigen Entwicklungskontexte, aus denen RMS stammt, schränkt die Verwendung von RMS-Zelllinien die Anwendung dieses Assays zur Identifizierung sowohl von Ursprungszellen als auch Entwicklungshinweise, die zu einer Tumorentwicklung in vivoführen.
Der Versuch, ein effizientes Protokoll für die Tumorsphärenableitung zu entwickeln, ausgehend von menschlichen Sarkomproben, hat zuvor schlechte Ergebnisse gezeigt. Tatsächlich wurden Tumorsphären nur aus 10% der Proben35entwickelt. Daher ist ein reproduzierbarer und zuverlässiger Assay zur Isolierung von primären RMS-Zellen und zur Tumorsphärenentwicklung erforderlich. Als Reaktion auf diesen Bedarf wurde der beschriebene Tumorsphärenbildungstest für den Einsatz in primären Zellkulturen optimiert. Die Entwicklung dieses Protokolls ist der erste Schritt zur Beantwortung wichtiger Fragen vor Ort (d. h. wie sich die Ursprungszellen von RMS je nach Umgebungskontext unterscheiden). Im Detail, hier beschrieben ist ein reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von primären Tumorzellen aus RMS-Geweben, Bildung von Tumorsphären, Tumorsphärenbehandlung (beide mit rekombinanten Proteinen oder Überexpressionsplasmiden durchgeführt), und Allograft Transplantationsexperimente.
Zusammenfassend ist der Tumorsphärenbildungstest eine etablierte und vielseitige Methode zur Identifizierung von TPCs in verschiedenen Tumorarten, die die Zellen mit erhöhter Selbsterneuerungskapazität und der Fähigkeit, in einer verankerungsunabhängigen art. Dieser Test basiert auf funktionellen Eigenschaften der untersuchten Zellpopulationen und nicht auf den Vorkenntnissen molekularer Marker; Somit kann es als exploratives Werkzeug für eine Vielzahl von Tumortypen eingesetzt werden. Darüber hinaus macht die Isolierung seltener Zellpopulationen, die mit Tumorsphärenkulturen erreicht werden, diesen In-vitro-Assay zu einer idealen Plattform für Krebsmedikamententests.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11 und den NIH Pilot Grant im Rahmen des NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 an A.S. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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