Summary
Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.
Abstract
El rabdomiosarcoma (RMS) es el sarcoma de tejido blando más común en niños. Aunque los esfuerzos significativos han permitido la identificación de mutaciones comunes asociadas con la RMS y han permitido la discriminación de diferentes subtipos de SRM, todavía existen grandes desafíos para el desarrollo de nuevos tratamientos para mejorar aún más el pronóstico. Aunque se identifica por la expresión de marcadores miogénicos, todavía hay una controversia significativa sobre si el RMS tiene orígenes miogénicos o no miogénicos, ya que la célula de origen todavía se entiende mal. En el presente estudio, se proporciona un método fiable para el ensayo de tumoresfera para rmS de ratón. El ensayo se basa en las propiedades funcionales de las células tumorales y permite la identificación de poblaciones raras en el tumor con funciones tumorigénicas. También se describen los procedimientos para analizar proteínas recombinantes, integrar protocolos de transfección con el ensayo de tumoresfera y evaluar los genes candidatos implicados en el desarrollo y crecimiento tumoral. Además, se describe un procedimiento para el trasplante de tumoresferas de aloinjertos en ratones receptores para validar la función tumorigénica in vivo. En general, el método descrito permite la identificación y prueba fiables de poblaciones tumorigénicas RMS raras que se pueden aplicar a los RMS que surgen en diferentes contextos. Por último, el protocolo se puede utilizar como una plataforma para la detección de drogas y el desarrollo futuro de terapias.
Introduction
El cáncer es una enfermedad heterogénea; además, el mismo tipo de tumor puede presentar diferentes mutaciones genéticas en diferentes pacientes, y dentro de un paciente un tumor está compuesto por múltiples poblaciones de células1. La heterogeneidad presenta un desafío en la identificación de las células responsables de iniciar y propagar el cáncer, pero su caracterización es esencial para el desarrollo de tratamientos eficientes. La noción de células propagantes tumorales (TPC), una población rara de células que contribuyen al desarrollo tumoral, ha sido previamente ampliamente revisada2. A pesar de que los TPM se han caracterizado en múltiples tipos de cáncer, la identificación de marcadores para su aislamiento fiable sigue siendo un desafío para varios tipos de tumores3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. Por lo tanto, un método que no se basa en marcadores moleculares, sino más bien en las propiedades funcionales de TPC (alta auto-renovación y la capacidad de crecer en condiciones de baja fijación), conocido como el ensayo de formación de tumoresfera, puede ser ampliamente aplicado para el identificación de los TPC de la mayoría de los tumores. Es importante destacar que este ensayo también puede emplearse para la expansión de los Tpm y, por lo tanto, se aplica directamente a la detección de fármacos contra el cáncer y estudios sobre la resistencia al cáncer1,10.
El rabdomiosarcoma (RMS) es una forma rara de sarcoma de tejido blando más común en niños pequeñosde 11años. Althoug RMS se puede identificar histológicamente a través de la evaluación de la expresión de marcadores miogénicos, la célula de origen RMS no se ha caracterizado unívocamente debido a los múltiples subtipos tumorales y alta heterogeneidad de los estímulos de desarrollo tumoral. De hecho, estudios recientes han generado una discusión científica significativa sobre si el RMS es de origen miogénico o no miogénico, lo que sugiere que el RMS puede derivar de diferentes tipos de células dependiendo del contexto12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Se han realizado numerosos estudios sobre líneas celulares RMS empleando el ensayo de formación de tumoresfera para la identificación de vías implicadas en el desarrollo tumoral y caracterización de marcadores asociados a poblaciones altamente auto-renovables 18 , 19 , 20 , 21.
Sin embargo, a pesar del potencial del ensayo de formación de tumoresfera para identificar células RMS de origen, aún no se ha descrito un método confiable que pueda emplearse en células primarias de RMS. En este contexto, un estudio reciente de nuestro grupo empleó un ensayo optimizado de formación de tumoresfera para la identificación de las células RMS de origen en un ratón de distrofia muscular de Duchenne (DMD) modelo22. Múltiples tipos de células pretumigenas, aisladas de los tejidos musculares, se prueban por su capacidad para crecer en condiciones de baja fijación, permitiendo la identificación de células madre musculares como células de origen para RMS en contextos distróficos. Aquí se describe un protocolo reproducible y fiable para el ensayo de formación de la tumoresfera(Figura 1), que se ha empleado con éxito para la identificación de poblaciones celulares extremadamente raras que son responsables del desarrollo de RMS de ratón.
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Protocol
La vivienda, el tratamiento y el sacrificio de ratones se realizaron siguiendo el protocolo IACUC aprobado del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. Preparación de reactivos
- Preparar 100 ml de medios de aislamiento celular: Medio F10 complementado con 10% de suero de caballo (HS).
- Preparar 50 ml de solución de colagenasa tipo II: disolver 1 g de polvo de colagenasa tipo II en 50 ml de medios de aislamiento celular (tenga en cuenta las unidades de la enzima por 1 ml de medios, ya que el número de unidades cambia dependiendo del lote). Alícuota la solución y guárdela en un congelador de -20 oC hasta que esté lista para su uso.
NOTA: Cada lote de colagenasa debe ser probado antes de su uso, ya que la actividad enzimática puede cambiar en diferentes lotes. - Preparar 10 ml por muestra de segunda solución de digestión: medios de aislamiento de células con 100 unidades/ml de solución de colagenasa tipo II y 2 unidades/ml de dispase II recién ponderado. Prepárese inmediatamente antes de usar.
- Preparar 500 ml de medios de células tumorales: DMEM de glucosa alta suplementada con 20% FBS y 1% pluma/estreptococo.
- Preparar 500 mL de tampón FACS: 1x PBS complementado con 2,5% v/v de suero normal de cabra y 1 mM edtA.
- Preparar 500 ml de medios de tumoresfera: DMEM/F12 complementado con 1% pluma/estreptococo. Justo antes de su uso, añadir los siguientes factores de crecimiento: 1% N2 suplemento, 10 ng /ml EGF, y 10 ng/mL -FGF.
2. Aislamiento celular y cultura
- Preparar una placa de 10 cm que contenga 5 ml de medios de aislamiento de células (una placa por muestra de tumor) y colocarla en una incubadora a 37 oC hasta que esté lista para cosechar el tejido tumoral.
- Se ha informado que RMS se desarrolla espontáneamente en modelos de ratón masculino y femenino para la distrofia muscular de Duchenne, como ratones B10 mdx alrededor de los 18 meses de edad y en ratones B6 mdx/mTR por 9 meses22,23. Anestesiar el ratón que desarrolla el tumor RMS usando isoflurano, y sacrificar al animal a través de la dislocación cervical o de acuerdo con las directrices de la IACUC de la institución. Con tijeras, haz una incisión en la piel en el área donde se localiza el tumor, y (usando pinzas) aleja la piel del área de interés. Empleando una cuchilla de afeitar, extirpa el tumor del animal.
- Pesar 500–1,000 mg del tejido tumoral y colocarlo en la placa preparada en el paso 2.1(Figura 1A).
NOTA: Grandes cantidades de tejido afectan negativamente los pasos de digestión y disminuyen el rendimiento general. Si el tumor cosechado es mayor que 1000 mg, divídalo en partes y muestree aleatoriamente hasta que se alcance el peso deseado. El muestreo aleatorio es necesario para evaluar la heterogeneidad tisular. - Coloque la placa que contiene tejidos tumorales en la capucha de cultivo celular estéril y picarla con una cuchilla de afeitar. El tejido tumoral de RMS es heterogéneo; por lo tanto, diferentes áreas pueden presentar diferentes resistencias a los cortes. Asegúrese de que los tamaños de las piezas picadas resultantes sean uniformes para garantizar una digestión óptima.
NOTA: El RMS existe como mezclas de diferentes tipos de tejido (principalmente fibrosas, vascularizadas y grasas) que se pueden identificar en cada tumor. Para 1) aislar una población celular heterogénea recapitulando con precisión la composición del tumor original y 2) no sesgar el procedimiento de aislamiento, realizar muestreo aleatorio del tejido cosechado. Las células de diferentes áreas del tumor deben digerirse y probarse en paralelo in vitro en el ensayo descrito en la sección 3. - Mueva el tejido picado y los medios de aislamiento celular en un tubo centrífugo de 15 ml, lave la placa con 4 ml de medios de aislamiento celular y colóquela en el tubo.
- Añadir 700 unidades/ml de solución de colagenasa para digerir el tejido e incubar en un baño de agua temblorosa a 37oC durante 1,5 h.
- Después de la incubación, espíe el tejido a 300 x g durante 5 min a RT. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet, resuspender el pellet en 10 ml de segunda solución de digestión (dispensa), e incubar en un baño de agua agitada a 37 oC durante 30 minutos.
- Una vez completada la segunda digestión, entuba hacia arriba y hacia abajo y pasa la suspensión celular a través de un filtro de nylon de 70 m en un tubo centrífugo de 50 ml. Luego agregue 10 ml de medios de aislamiento celular para lavar el filtro y diluir la solución de digestión, y gire hacia abajo el tejido a 300 x g y RT durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 20 ml de medios de células tumorales. A continuación, transfiera la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 15 cm. Coloque las células en la incubadora a 37 oC durante la noche. Esta placa se identificará como P0.
- El día después del aislamiento, cambie los medios. Este paso es necesario para asegurar la eliminación de escombros y células muertas que pueden influir negativamente en la supervivencia celular.
- Evalúe la confluencia celular después de cambiar el medio, que oscila entre el 30% y el 60% dependiendo de la cantidad de material inicial y el tamaño de la celda. Dejar las células creciendo en la incubadora hasta que alcancen el 90% de confluencia. Supervise las celdas todos los días y cambie los medios cada 2 días. El tiempo necesario para que las células tumorales se vuelvan confluentes varía dependiendo de múltiples parámetros: agresividad tumoral, genotipo del tumor, edad del ratón, heterogeneidad del tejido.
- Para el paso celular, haga lo siguiente:
- Precalentar previamente la solución de desprendimiento celular y los medios de las células tumorales en un baño de agua a 37 oC.
- Lavar las células con 1 PBS estéril e incubarlas a 37 oC en 10 ml de solución de desprendimiento de células calientes durante 5-10 min.
- Cuando todas las células estén separadas de la placa, agregue 10 ml de medios de células tumorales calientes, mueva la solución a un tubo centrífugo de 50 ml y espíe las células hacia abajo a 300 x g durante 5 minutos en RT.
- Resuspenda las células en 5-10 ml de medios de células tumorales, dependiendo del tamaño del pellet, y cuente las células vivas usando azul Trypan (1:5 dilución) para excluir las células muertas.
- Placa 105 células en placas de 10 cm o 3 x 105 celdas en placas de 15 cm. El tiempo de duplicación de celdas varía dependiendo de los factores detallados en el paso 2.10.
3. Derivación de la tumoresfera
- Utilice células tumorales en el paso P1 o P2 para evitar la selección celular a través de múltiples pasajes(Figura 1B). Para separar las células de la placa, primero lave el plato con 1pbS, sin perturbar las células, luego cúbralas usando solución de desprendimiento celular (5 ml para una placa de 10 cm o 10 ml para una placa de 15 cm) y colóquelas en la incubadora durante 5-10 min.
- Confirme que las células se separan mirando la placa bajo un microscopio de campo brillante, agregue 1:1 volumen de medios de células tumorales (solución de desprendimiento celular: medios de células tumorales), coloque la suspensión celular en un tubo de centrífuga y gire las células hacia abajo a 300 x g durante 5 min en RT.
- Resuspender las células en el búfer FACS (sección 3.4) o en los medios de tumoresferas (sección 3.5), según el método utilizado para el chapado.
- Células de chapado a través del cytómetro de flujo
- Resuspenda las celdas en el búfer FACS (la cantidad depende del tamaño del pellet) y cuente manualmente las celdas vivas usando la exclusión azul de Trypan. Asegúrese de que la concentración final de la célula es de 107 celdas/ml (100 ml de búfer FACS por 106 celdas). Agregue 1 l de mancha violeta del ciclo Fx por cada 106 células para discriminar el vivo de las células muertas durante la clasificación celular. Prepare un control sin mancha en el que la mancha Violeta del Ciclo Fx no se agregue a las celdas.
NOTA: La concentración está optimizada para una tinción y velocidad eficientes durante la clasificación. Una concentración celular más baja dará lugar a un tiempo de clasificación más largo, mientras que una concentración más alta afectará a la tinción. - Empleando el control sin mancha, configure una puerta FACS segregando viva (Fx Cycle Violet-) de las celdas muertas (Fx Cycle Violet+). A continuación, emplee la clasificación de celdas activadas fluorescentes (con paso de banda de filtro 450/50) para la separación y el recuento de células vivas/muertas y para enchapar el número deseado de células vivas en cada pozo de las 96 placas de baja fijación de pozo. Cada pozo de la placa debe llenarse con 200 ml de medios tumorales antes de iniciar la clasificación.
NOTA: Dado que los TPC son una subpoblación rara dentro de todo el tumor, optimice el protocolo enchapando 100 células/bien de RMS de ratón para observar la formación de tumoresferas en el cultivo de suspensión. El número de células por pozo debe ajustarse para el tumor específico analizado. - Coloque las células en la incubadora hasta el final del experimento. Trate de no molestar la placa a menos que sea necesario. Para un experimento de 30 días, cada pozo debe ser reabastecido con medios de comunicación y una proporción adecuada de factores de crecimiento cada semana (los medios tienden a evaporarse y los factores de crecimiento no son efectivos después de 1 semana).
- Después de completar el experimento, las placas de prueba manualmente bajo un microscopio de campo brillante identifican las tumoresferas (ver paso 3.6).
NOTA: Se ha optimizado un plazo de 30 días para detectar fácilmente las tumoresferas RMS de ratón de tamaños que van de 50 a 300 m de diámetro. El punto de tiempo debe ajustarse en función de la agresividad del tumor probado y su tasa proliferativa.
- Resuspenda las celdas en el búfer FACS (la cantidad depende del tamaño del pellet) y cuente manualmente las celdas vivas usando la exclusión azul de Trypan. Asegúrese de que la concentración final de la célula es de 107 celdas/ml (100 ml de búfer FACS por 106 celdas). Agregue 1 l de mancha violeta del ciclo Fx por cada 106 células para discriminar el vivo de las células muertas durante la clasificación celular. Prepare un control sin mancha en el que la mancha Violeta del Ciclo Fx no se agregue a las celdas.
- Células de chapado manualmente
- Resuspender las células en los medios de tumoresfera (la cantidad depende del pellet) y contar manualmente las células vivas usando el azul trypan (1:10 dilución). Calcular la concentración de celda en el tubo y placar el número adecuado de células en una placa de fijación baja de 96 pocillos. Coloque las células en la incubadora hasta el final del experimento. Trate de no perturbar la placa a menos que sea necesario para reponer los medios y factores de crecimiento, como se describe en el paso 3.4.3.
- Después de completar el experimento, las placas de pantalla manualmente bajo un microscopio de campo brillante para identificar tumores o el uso del software Celigo, como se describe anteriormente en Kessel et al.24 Véase el paso 3.6 a continuación.
- Tenga en cuenta que se pueden evaluar dos lecturas separadas como resultado de este ensayo: número y tamaño de las tumoresferas formadas.
NOTA: Cuando se chapa más de una celda en un pozo, pueden formarse tumoresferas o cúmulos celulares(Figura 1C, paneles tercero y cuarto). Los cúmulos celulares son pequeños agregados celulares que se forman en el cultivo de suspensión que mejoran la supervivencia celular y se caracterizan por una forma irregular. Las tumoresferas son grandes y tienen una estructura más compacta con forma esferoide. Derivan de una sola célula que tiene la capacidad de sobrevivir de una manera independiente del anclaje y proliferan a una alta tasa25. Las células de chapado a través del citómetro de flujo o manualmente se pueden utilizar indistintamente, dependiendo de las capacidades disponibles en el laboratorio. Además, el uso de placas de baja fijación de tamaño diferente de 96 placas de pozo es posible y depende del resultado requerido. De hecho, la evaluación de la frecuencia de la tumoresfera debe realizarse empleando 96 placas de fijación bien bajas, mientras que el cribado inicial para la evaluación del potencial tumorígeno de las células producirá resultados más rápidos y fiables en 6 placas de baja fijación de pozo.
4. Tratamiento de la tumoresfera con proteínas recombinantes
- Repita los pasos 3.1 y 3.2.
- Si se establece un tratamiento con proteínas recombinantes, primero determine la mejor concentración a utilizar después de la sección 4.3, o si se ha determinado previamente la concentración óptima, vaya a la sección 4.4.
- Determinar la concentración de tratamiento con proteínas recombinantes.
- Resuspenda las células en los medios de tumoresfera (el volumen depende del tamaño del pellet) y cuente manualmente las células vivas mediante la exclusión azul de Trypan. Calcule la concentración celular en el tubo y la placa 100.000 células en una placa de unión de 6 pocillos bien bajas. Placa dos pozos por cada concentración probada y dos pozos para controles no tratados(Figura 2). Las concentraciones de proteínas a probar se basan en la búsqueda de literatura.
- Tratar cada pozo de células de suspensión con una concentración de proteína sin diferente y colocar las células en la incubadora durante 48 h (tiempo necesario para poder evaluar el efecto del tratamiento tanto en la viabilidad celular como en la expresión de genes diana aguas abajo). A continuación, evalúe los siguientes parámetros:
- Supervivencia celular: utilizando un microscopio de campo brillante, así como comparación con controles no tratados, comprobar la morfología celular. Las células sanas aparecen brillantes y reflectantes bajo el microscopio, mientras que la muerte celular excesiva inducirá la acumulación de escombros en los medios. Para una determinación cuantificable de la muerte celular, se puede emplear la exclusión de color azul de Trypan, la tinción violeta cristalina, MTT o el ensayo TUNEL (en este caso, agregue uno bien al revestimiento original).
- Efecto de las proteínas recombinantes en las vías posteriores: realizar una búsqueda de literatura utilizando PubMed para la identificación de los genes aguas abajo que se sabe que se ven afectados por la proteína probada. Diseñar imprimaciones qRT-PCR para los genes de destino y realizar análisis qRT-PCR en el ARN aislado de las células tratadas(Figura 2).
- Tratar con proteína recombinante.
- Resuspenda las células en los medios de tumoresfera (el volumen depende del tamaño del pellet) y cuente manualmente las células vivas mediante la exclusión azul de Trypan. Determinar el número total de células necesarias para el experimento deseado (100 células por cada pozo de una placa de unión de 96 bien-bajo) y diluirlas en el volumen de medios de tumoresfera apropiado. Si realiza más de un tratamiento, prepare tubos celulares separados.
- Tratar cada tubo con la concentración adecuada de proteína recombinante y placar las células en un pozo separado de 96 placas de baja fijación de pozo. El tratamiento se repetirá en cada pozo dependiendo de la vida media de la proteína recombinante hasta la variable de 30 días del experimento.
- Al final del experimento, siga los pasos 3.4.4 y 3.6 para analizar los datos.
5. Tratamiento de la tumoresfera con plásmidos de sobreexpresión
- Repita los pasos 3.1 y 3.2.
- Si se establece el tratamiento en un nuevo tipo de tumor, primero determine la mejor concentración de plásmido para usar en la sección 5.3, o si se ha determinado previamente la concentración óptima de ADN, vaya a la sección 5.4.
- Determinar la concentración óptima de plásmido.
- Resuspender células en los medios de las células tumorales (el volumen depende del tamaño del pellet) y contar manualmente las células vivas mediante la exclusión azul de Trypan. Placa las células contadas para lograr una confluencia de 70% a 90% (el número de celda es altamente dependiente en el tamaño de la célula y la morfología). El GFP-plásmido se empleará para probar la eficiencia de la transfección siguiendo el protocolo del fabricante del reactivo de transfección para células adherentes. En paralelo, pruebe también un control no tratado(Figura 3A). Realice una prueba de eficiencia en una placa de 24 pocillos.
NOTA: Las células adherentes se utilizan para mejorar la eficiencia de la transfección, ya que la transfección realizada en las células de suspensión no es eficiente y afecta negativamente a la viabilidad celular. - 48 h después de la transfección evaluar las células para los siguientes parámetros:
- Supervivencia celular: utilizando un microscopio de campo brillante, comparar el número de células presentes en cada pozo y compararlo con las células no tratadas bien.
- Expresión GFP: cuente el porcentaje de celdas que son GFP positivas sobre el número total de celdas en cada pozo(Figura 3B).
- Resuspender células en los medios de las células tumorales (el volumen depende del tamaño del pellet) y contar manualmente las células vivas mediante la exclusión azul de Trypan. Placa las células contadas para lograr una confluencia de 70% a 90% (el número de celda es altamente dependiente en el tamaño de la célula y la morfología). El GFP-plásmido se empleará para probar la eficiencia de la transfección siguiendo el protocolo del fabricante del reactivo de transfección para células adherentes. En paralelo, pruebe también un control no tratado(Figura 3A). Realice una prueba de eficiencia en una placa de 24 pocillos.
- Tratamiento de plásmido sobreexpresión
- Resuspenda las células en los medios celulares tumorales (el volumen depende del tamaño del pellet) y cuente manualmente las células vivas mediante la exclusión azul de Trypan. Placa 200.000 células por pozo de una placa de 6 pocillos. Cada pozo se utilizará para un evento de transfección independiente. Cada pozo será transinfectado utilizando la configuración desarrollada para el tipo de tumor específico(Figura 3A).
- 24 h después de la transfección, lavar cada poca con 1x PBS e incubar las células en solución de desprendimiento de células calientes (suficiente para cubrir el pozo). Colocar la placa en la incubadora a 37oC durante 5-10 min, dependiendo de los factores detallados en la sección 2.15.
- Cuando las celdas se separan, cuente las celdas derivadas de cada pozo de forma independiente mediante la exclusión azul de Trypan. Coloque 100.000 celdas por pozo de una placa de unión de 6 pozos bien bajo, asegurándose de no mezclar células derivadas de diferentes pozos. Colocar la placa en la incubadora a 37oC y dejar la sin perturbar durante una semana.
NOTA: La duración de este ensayo es de 7 días, un tiempo suficiente para permitir la formación de tumoresferas mientras se previene la fusión de la tumoresfera. La fusión de la tumoresfera es un fenómeno que se hace evidente cuando 100.000 o más células se ensaparan juntas en suspensión durante más de 1 semana, lo que puede sesgar la evaluación de la capacidad de formación de la tumoresfera. En el caso de que el experimento requiera un tiempo de incubación más largo, se debe ajustar la densidad celular o utilizar andamios poliméricos para evitar la fusión de la tumoresfera26. - Al final del experimento, siga los pasos 3.5.2 y 3.6 para analizar los datos.
6. Preparación de la tumoresfera para el trasplante de aloinjerto
- Colocar la solución de matriz extracelular (ECM) (50 l por aloinjerto) y los medios de las células tumorales (50 s por aloinjerto) sobre el hielo.
- Las tumoresferas se pueden utilizar para trasplantes de aloinjertos. Juntar todas las tumoresferas obtenidas de un tipo de célula específico o tratamiento en un tubo de 15 ml o 50 ml (según el volumen total de medios)(Figura 1D). Gire las tumoresferas a 300 x g durante 5 minutos en RT. Retire el sobrenadante sobre las tumoresferas y lávelas con 10 ml de PBS estéril 1x.
- Gire las tumoresferas hacia abajo de nuevo a 300 x g durante 5 minutos en RT, aspirar el 1x PBS, y añadir 500 l a 1 ml de solución de desprendimiento celular en la parte superior del pellet celular, que inicia el proceso de disociación. Incubar tumoresferas en solución digestiva en un baño de agua temblorosa a 37 oC y comprobar la progresión de la digestión cada 10 minutos. Para ayudar a las tumoresferas a disociar en una solución de una sola célula, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo para una interrupción mecánica. El proceso de digestión puede tardar hasta 30 minutos.
NOTA: A pesar de que el tiempo de incubación varía considerablemente cuando las tumoresferas se derivan de diferentes células primarias de RMS, nunca se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en relación con el tiempo de digestión. - Cuando se obtiene una solución de una sola célula, agregue un volumen de medios de células tumorales (1:1, solución de desprendimiento celular: medios de células tumorales) y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min a 4 oC.
NOTA: A partir de este momento, todos los pasos deben realizarse sobre hielo. Después de girar, las tumoresferas no forman un pellet estable como lo hacen las soluciones de células individuales. Para asegurarse de no desalojar o aspirar las tumoresferas, utilice una pipeta de 1 ml y aspire suavemente el líquido. Muévete a una pipeta de 200 ml cuando solo quede 1 ml. - Resuspender las células en los medios de las células tumorales frías (el volumen dependerá del tamaño del pellet), colocar las células en el hielo y contar las células vivas usando la exclusión azul de Trypan. Después de determinar la cantidad adecuada de células a utilizar para el aloinjerto, resuspenderlas en un volumen total de 50 s de medios de células tumorales frías. Enfríe una punta de pipeta en los medios de las células tumorales frías. Cuando la punta esté fría, úsela para tomar 50 ml de solución de ECM y agréguela al tubo que contiene las células. No retire los tubos del hielo durante este proceso.
NOTA: El número de células a utilizar para el trasplante debe determinarse de acuerdo con el objetivo experimental y analizado del tumor: un mayor número de células trasplantadas disminuirá el tiempo de desarrollo del tumor (se ha demostrado que 20.000 células de las tumorasmas del ratón desarrollarse en un tumor 6 semanas después de la inyección). Para poder comparar diferentes líneas celulares o diferentes tratamientos, es importante comenzar desde el mismo número de células. - Como las células están listas para el trasplante, manténgase en hielo hasta la inyección. Coloque una jeringa de insulina de 0,5 ml tapada con una aguja de 29 G sobre hielo, para evitar que la solución celular se vuelva sólida tras la aspiración.
- Encienda el caudalímetro a oxígeno de 200 ml/min y el vaporizador de isoflurano al 2,5%. Anestetiza un ratón NOD/SCID macho de 2 meses colocándolo dentro de la cámara de inducción. Espere de 2 a 3 minutos hasta que el ratón aparezca dormido y la cría se haya ralentizado. Antes de iniciar el procedimiento, primero confirme a través de un pellizco para el pie que el ratón está dormido, luego aplique pomada de veterinario en los ojos. Atener el lado derecho del animal, aspirar la solución celular en la jeringa preenfriada, e inyectarlos por vía subcutánea en el área de afeitado. Se formará una protuberancia visible debajo de la piel si la inyección se realiza correctamente.
NOTA: Los aloinjertos celulares se pueden realizar en la misma tensión del ratón que la de las células trasplantadas. Por ejemplo, si las células RMS se aislaron originalmente de un ratón C57BL/6, el aloinjerto se puede realizar en ratones C57BL/6. Si la cepa es diferente, entonces se deben utilizar ratones receptores inmunodeficientes para evitar el rechazo. Las edades de los ratones receptores también se pueden ajustar dependiendo del objetivo experimental. - Supervise la formación de tumores a los ratones una vez por semana.
NOTA: Para validar la identidad del tumor derivado del trasplante de aloinjerto, debe compararse con el tumor original del que se aislaron las células. Para ello, se puede realizar un análisis histológico de las características morfológicas y la expresión de marcadores miogénicos, así como un ARN más completo.
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Representative Results
Detección de tumoresferas
El aislamiento celular se optimizó para obtener la máxima heterogeneidad de las poblaciones celulares presentes en el tejido tumoral. En primer lugar, dado que los tejidos aislados presentaban áreas morfológicamente diferentes, para aumentar las posibilidades de aislar poblaciones uniformes de células raras, se realizó un muestreo de múltiples áreas del tumor(Figura 1A,primer panel a la izquierda). En segundo lugar, se realizó una disociación mecánica de las muestras cosechadas manteniendo la homogeneidad en el tamaño del tejido picado, a pesar de las diferentes resistencias que pueden haber estado presentes en las muestras(Figura 1A,tercer y cuarto panel a la izquierda ). Dependiendo del material de partida (agresividad tumoral, edad y genotipo del ratón, ubicación del tumor), la recuperación de las células de la tensión mecánica del proceso de aislamiento puede variar, que van desde 3-7 días(Figura 1A,último panel a la derecha). Para mejorar la supervivencia celular y el crecimiento, los medios deben cambiarse el día después del aislamiento y luego cada 2 días. Esto eliminará los desechos y células muertas acumulados durante el proceso de aislamiento que podrían afectar a la viabilidad celular. El ensayo de formación de tumoresfera debe comenzar después de que las células se hayan pasado al menos una vez para garantizar una viabilidad óptima cuando se colocan en cultivos de suspensión(Figura 1B,primer panel a la izquierda). En nuestras manos, se obtuvieron resultados óptimos a partir del paso 2 (P2)(Figura 1C,primer y segundo panel a la izquierda). Este pasaje específico fue elegido después de varias pruebas. Cuando las células P0 fueron chapadas en condiciones de baja fijación, formaron un bajo número de tumoresferas en comparación con pasajes posteriores, posiblemente debido a los desechos celulares todavía presentes después del aislamiento. En pasajes posteriores, se observaron diferentes patrones de formación de la tumoresfera y se atribuyeron a la selección que se produce después de numerosos pasajes en la cultura. Cuando se comparan diferentes líneas de celda, se sugiere comenzar desde el mismo pasaje.
La discriminación entre las tumoresferas y los cúmulos celulares es de importancia fundamental para la cuantificación del ensayo. Figura 1C (últimos dos paneles a la derecha) muestra claramente las diferencias morfológicas entre una tumoresfera (izquierda) y un cúmulo celular (derecha). Las tumorferas derivan de una sola célula que tiene una alta capacidad para autorenovarse y crecer en condiciones de baja fijación (ambas características de los TPC). De hecho, el desarrollo de la tumoresfera indica potencial de tumoridad. Sin embargo, este ensayo se realiza in vitro independientemente de las señales derivadas de todo el organismo; por lo tanto, para validar el potencial tumorigénico de las células in vivo, se deben realizar experimentos de trasplante de aloinjertos(Figura 1D).
Validación del tratamiento de proteínas recombinantes
Antes de configurar el tratamiento de las tumoresferas, se debe determinar la concentración óptima a la que la proteína de interés desencadena un efecto sobre las células tumorales. Para ello, es necesario evaluar el nivel de expresión de los genes diana posteriores de la proteína (Figura 2). Se realizó una búsqueda de literatura en PubMed antes de determinar los genes de destino para probar a través de qRT-PCR. En el caso de que se haya demostrado que la proteína de interés modula diferentes vías aguas abajo, se debe realizar la selección de múltiples genes asociados con cada una de estas vías. Por ejemplo, se ha demostrado que Flt3l (Fms-like tyrosine quinasa 3) modula la señalización STAT5 en leucemia mieloide aguda, induciendo la expresión aguas abajo de p21, c-Myc y CyclinD1(Figura 2)27. Además, se requiere la expresión de Flt3l para la diferenciación de las células dendríticas mediando la activación de la vía de señalización STAT328. Para evaluar la actividad de STAT3, se comprobaron la expresión Socs3 y CyclinD1 (Figura 2). El análisis de los resultados mostró un efecto dependiente de la dosis del tratamiento con proteínas recombinantes en algunos de los genes analizados (p21, CyclinD1 y Socs3), mientras que otros no se vieron afectados (c-Myc). Es importante determinar los genes aguas abajo que responden a la proteína de interés en el tumor específico probado para una evaluación fiable de la eficacia del tratamiento.
Optimización del protocolo para la transfección de plásmidos
Para establecer un protocolo eficaz para la transfección de plásmido y el ensayo de formación de tumores adicionales, se probaron los efectos de la transfección en las células tumorales adherentes(Figura 3A). El tratamiento con reactivos de transfección se realizó siguiendo el protocolo del fabricante, y se probaron dos cantidades diferentes del reactivo. Se evaluó la eficiencia empleando a un plásmido reportero de la GFP. En nuestras manos, observamos una mayor eficiencia de transfección utilizando cantidades más bajas del reactivo(Figura 3A). De hecho, las concentraciones más altas conducen a un aumento de la muerte celular, a partir de 48 h y a ser más evidentes después de 72 h desde el momento de la transfección. El mismo protocolo de transfección no fue eficiente en las células en suspensión, ya que la acumulación de células muertas y desechos celulares se hizo evidente 24 h después del comienzo del tratamiento, lo que indica una disminución de la viabilidad celular. Para superar este desafío técnico, se empleó un protocolo de dos pasos: realizar la transfección en células adherentes, separarlas 24 horas después del tratamiento, y placarlas en suspensión durante 7 días más. Las tumoresferas de control estaban expresando GFP al final del experimento(Figura 3B).
Figura 1: Aislamiento de células tumorales, derivación de la tumoresfera y trasplante. (A) Representación esquemática de la sección 2 del protocolo (aislamiento de células tumorales). Se resume cada paso clave del protocolo. (B) Representación esquemática de la sección 3 del protocolo (derivación de tumoresferas). Se resume cada paso clave del protocolo. (C) Desde la izquierda: imagen de campo brillante de células tumorales aisladas en el paso 2 (P2) con bajo aumento (barra de escala de 50 m) y aumento alto (barra de escala a 50 m); imagen de campo brillante de una tumoresfera derivada de células tumorales después de 30 días en el cultivo de suspensión (barra de escala de 250 m) y la imagen de campo brillante de un cúmulo de células formada a partir de células tumorales después de 30 días en el cultivo de suspensión (barra de escala de 50 m). (D) Representación esquemática de la sección 6 del protocolo (trasplante de aloinjerto de tumoresfera). Se resume cada paso clave del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Validación de genes diana aguas abajo para la determinación de la concentración de proteína recombinante. resultados qRT-PCR para la evaluación de la concentración del tratamiento con Flt3l. Se realizó ANOVA bidireccional. La importancia se muestra para la comparación con el control no tratado. (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n á 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración del protocolo de transfección de las tumoresferas. (A) Imágenes representativas de campo brillante y fluorescentes de células tumorales tratadas con baja (superior) o alta (abajo) concentración de reactivo de transfección (0,75 ml o 1,5 l en 24 placas de pozo) (barra de escala a 50 m). (B) Imagen representativa de las tumoresferas formadas a partir de células tratadas con plásmido, 7 días después de la platinado de las células en suspensión (barra de escala de 50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han empleado múltiples métodos para el aislamiento y caracterización de los TPC de las poblaciones de células heterogéneas tumorales: ensayos clonogénicos tumorales, aislamiento FACS y ensayo de formación de tumoresfera. El ensayo clonogénico tumoral fue descrito por primera vez en 1971, utilizado para estudios con células madre, y sólo se aplicó posteriormente a la biología del cáncer29,30. Este método se basa en la propiedad intrínseca de las células madre cancerosas para expandirse sin restricciones en los cultivos de geles blandos31. Desde su desarrollo, este método ha sido ampliamente utilizado en la investigación del cáncer para múltiples propósitos, incluyendo estudios de heterogeneidad de células tumorales, efecto del tratamiento hormonal en el crecimiento celular, y estudios de resistencia tumoral31. Hasta la fecha, este ensayo todavía se emplea para la identificación de células de inicio de tumores para múltiples tipos decánceres 32.
El aislamiento FACS se basa en el conocimiento previo de los marcadores moleculares presentes en la superficie de las células sobre el interés. Ha sido ampliamente utilizado para el aislamiento de los TPC de tumores líquidos y sólidos. Por ejemplo, la primera identificación de las células de iniciación de la leucemia mieloide aguda humana (LMA) fue realizada por el grupo del Dr. Dick utilizando ensayos de fraccionamiento y trasplante FACS basados en el conocimiento de los marcadores presentes en células AML a granel9. Utilizando un enfoque similar, el grupo del Dr. Clarke aisló el cáncer de mama que inicia las células3. El ensayo de formación de tumoresfera es un enfoque diferente utilizado para la identificación y el estudio de los TPC. Este método fue desarrollado por primera vez para identificar las células madre cancerosas de los tumores cerebrales33. Curiosamente, fue probado inicialmente utilizando las mismas condiciones conocidas para favorecer el crecimiento de células madre neurales, favoreciendo así la propiedad de auto-renovación también asociada con tpCs33. Además, la formación de la tumoresfera depende de la capacidad de los TPC para crecer de manera independiente del anclaje.
Los tres enfoques descritos anteriormente se pueden utilizar en paralelo para mejorar la probabilidad de aislar y caracterizar molecularmente las poblaciones de Los TPC, superando las limitaciones de cada método. Por ejemplo, el FACS, a pesar de traer la gran ventaja de aislar las poblaciones de células puras, depende firmemente del uso de marcadores superficiales que aún no son conocidos por todos los tipos de cáncer. Por lo tanto, su uso se limita al aislamiento de los Tpm que expresan marcadores conocidos. Los ensayos de formación de tumores clonogénicos y tumores se basan en propiedades celulares, que se sabe que están asociadas con los TPC. Ambos métodos pueden ser empleados como la primera línea de estudios sobre cánceres nuevos o aún no estudiados. Además, estos dos métodos pueden garantizar la expansión y el enriquecimiento de la población celular de interés, facilitando la identificación de marcadores moleculares y permitiendo tanto la resistencia al cáncer como los estudios de detección de fármacos. En este contexto, el ensayo de formación de la tumoresfera es más ventajoso, ya que estas estructuras esferoides recrean mejor el ambiente presente en los tejidos tumorales (áreas hipoxicas en el centro de las esferas)34. De hecho, se ha demostrado anteriormente que los cultivos 3D son más fiables para predecir el resultado de los tratamientos farmacológicos34. Las tumoresferas pueden recuperarse después del cultivo y utilizarse para experimentos de aloinjerto: la digestión de las tumoresferas en soluciones de células individuales y el trasplante en ratones receptores permitirán una evaluación in vivo de la capacidad tumorigénica de TPC identificados, en comparación con las células tumorales a granel.
Para obtener con éxito un material celular inicial representativo de la heterogeneidad tumoral, es fundamental realizar primero un muestreo aleatorio del tejido. Los RMS se caracterizan por áreas fibrosas, grasas o altamente vascularizadas que son claramente distinguibles en tumores aislados, por lo tanto, para mantener esta diversidad celular, se requerirá la recolección de cada área del tejido. Por otra parte, para aumentar las posibilidades de supervivencia de las células durante el proceso de digestión, el picado del tejido recogido necesita resultar en piezas de tamaño uniforme: los fragmentos más pequeños son más propensos a ser sobredigeridos induciendo la reducción de la viabilidad de las células. Esto puede ser particularmente tedioso debido a la diversa morfología y rigidez de la RMS.
Para la cuantificación del resultado del ensayo de formación de tumoresfera, es de vital importancia distinguir entre las tumoresferas reales y los cúmulos celulares(Figura 1C,dos últimos paneles a la derecha). Una tumoresfera es una estructura esferoide sólida en la que no es posible discriminar la composición celular; por el contrario, en un clúster de células, las células individuales pueden ser fácilmente discriminadas. Los cúmulos de células pueden no asumir una forma redondeada y son significativamente más pequeños en comparación con las tumoresferas, que oscilan entre 50-250 m25.
Para lograr el trasplante de tumoresferas, obtener una solución uniforme de células únicas es un paso clave. De hecho, dada la estructura estrecha y el gran tamaño de una tumoresfera, la digestión de las células se convierte en un paso limitante importante en la preparación de una suspensión de una sola célula que se emplea aún más para el trasplante. Por lo tanto, son necesarios ciclos múltiples de digestión enzimática combinados con disociación mecánica para la disociación completa de las tumoresferas. Para confirmar el progreso de la disociación y un resultado exitoso, la solución debe ser monitoreada bajo un microscopio de campo brillante.
A pesar de las múltiples ventajas proporcionadas por el ensayo de formación de la tumoresfera, se ha demostrado que las tumoresferas no se originan en todos los tipos de tumor o en todas las líneas celulares disponibles comercialmente. En estos casos, el ensayo no puede emplearse como norma para determinar la tumorigenidad celular y la cuantificación de los Tpm dentro de una población heterogénea. Otra limitación de este ensayo se asocia con el hecho de que los diferentes tipos de tumores requieren diferentes condiciones de crecimiento y disociación; por lo tanto, requiere una optimización y solución de problemas que consumen mucho tiempo de ambos protocolos para cada tipo de tumor o línea celular. Además, la fusión de múltiples tumoresferas puede ocurrir en el cultivo, por lo que la evaluación de sus tamaños y números no está claro.
A pesar del hecho de que el ensayo de formación de tumoresfera se ha utilizado previamente en estudios de RMS, se ha aplicado principalmente a las líneas celulares RMS disponibles comercialmente para identificar las vías moleculares implicadas en la formación y desarrollo de tumores18, 20,21. Dada la composición tisular heterogénea, los numerosos subtipos de tumores y diversos contextos de desarrollo de los que procede el RMS, el empleo de líneas celulares RMS limita la aplicación de este ensayo para la identificación de células de origen y señales de desarrollo que conducen al desarrollo tumoral in vivo.
Un intento de desarrollar un protocolo eficiente para la derivación de la tumoresfera, a partir de muestras de sarcoma humano, ha mostrado previamente malos resultados. De hecho, las tumoresferas se desarrollaron a partir de sólo el 10% de las muestras35. Por lo tanto, es necesario un ensayo reproducible y fiable para el aislamiento de las células primarias del SME y el desarrollo de la tumoresfera. En respuesta a esta necesidad, el ensayo de formación de tumoresfera descrito fue optimizado para ser empleado en cultivos celulares primarios. El desarrollo de este protocolo es el primer paso para responder a las principales preguntas en el campo (es decir, cómo las células RMS de origen difieren dependiendo del contexto ambiental). Con más detalle, se describe aquí un protocolo reproducible para el aislamiento de células tumorales primarias de los tejidos RMS, la formación de tumoresferas, el tratamiento de la tumoresfera (ambos realizados con proteínas recombinantes o plásmidos de sobreexpresión) y el aloinjerto experimentos de trasplante.
En conclusión, el ensayo de formación de tumores es un método bien establecido y versátil para la identificación de Los TPC en diferentes tipos de tumores, enriqueciendo las células con mayor capacidad de autorenovación y la capacidad de crecer en un anclaje independiente Manera. Este ensayo se basa en las características funcionales de las poblaciones celulares que se están estudiando y no en el conocimiento previo de los marcadores moleculares; por lo tanto, se puede aplicar como una herramienta exploratoria para una amplia gama de tipos de tumores. Además, el aislamiento de las poblaciones de células raras lograda con los cultivos de tumoresfera hace de este ensayo in vitro una plataforma ideal para las pruebas de drogas contra el cáncer.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la beca AG-NS-0843-11 de Ellison Medical Foundation y la Beca Piloto NIH dentro de la Subvención de Apoyo del Centro OnCI para el Cáncer P30CA030199 a A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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