Summary
このプロトコルは、マウス横紋筋肉腫原発細胞の単離、腫瘍球形成および治療、および腫瘍球培養から始まる同種移植片移植のための再現可能な方法を説明する。
Abstract
横紋筋肉腫(RMS)は、小児で最も一般的な軟部組織肉腫である。RMSに関連する一般的な変異の同定を可能にし、異なるRMSサブタイプの判別を可能にする多大な努力がなされたが、予後をさらに改善するための新しい治療法の開発には大きな課題が依然として存在する。筋原性マーカーの発現によって同定されるが、RMSが筋原性または非筋原起源を有するかどうかについては、起源の細胞がまだ十分に理解されていないため、依然として重大な論争がある。本研究では、マウスRMSに対する腫瘍球アッセイに対して信頼性の高い方法が提供される。アッセイは腫瘍細胞の機能特性に基づいており、腫瘍機能を有する腫瘍中の稀な集団の同定を可能にする。また、組換えタンパク質の検査、トランスフェクションプロトコルと腫瘍球アッセイの統合、腫瘍の発達および増殖に関与する候補遺伝子の評価の手順についても説明します。さらに説明する、生体内で腫瘍属機能を検証するレシピエントマウスへの腫瘍球の同種移植移植の手順である。全体的に、記載された方法は、異なる文脈で生じるRMSに適用することができる希少なRMS腫瘍属集団の信頼性の高い同定および試験を可能にする。最後に、このプロトコルは、薬物スクリーニングおよび治療の将来の開発のためのプラットフォームとして利用することができる。
Introduction
癌は不均一な病気です。さらに、同じタイプの腫瘍は、異なる患者に異なる遺伝子変異を提示することができ、患者内で腫瘍は細胞1の複数の集団によって構成される。異種性は、がんの発症と伝播を担う細胞の同定に課題を提示しますが、効率的な治療法の開発にはその特徴付けが不可欠です。腫瘍伝播細胞(TPC)の概念は、腫瘍の発達に寄与する稀な細胞集団であり、以前に広範囲に見直された2.TPCは複数のタイプの癌で特徴付けられてきたにもかかわらず、信頼性の高い単離のためのマーカーの同定は、いくつかの腫瘍タイプ3、4、5、6のための挑戦のままである,7,8,9.したがって、分子マーカーに依存せず、むしろTPC機能特性(高い自己再生および低アタッチメント条件下で成長する能力)に依存しない方法は、腫瘍球形成アッセイとして知られており、ほとんどの腫瘍からのTPCの同定。重要なことに、このアッセイはTPCの拡大にも用いられ、したがって癌薬物スクリーニングおよび癌耐性1、10に関する研究に直接適用することができる。
横紋筋肉腫(RMS)は、幼児11で最も一般的な軟部組織肉腫のまれな形態である。Althoug RMSは、筋原性マーカーの発現の評価を通じて組織学的に同定することができ、起源のRMS細胞は、腫瘍発達刺激の複数の腫瘍サブタイプおよび高い不均一性のために単元的に特徴付けられていない。実際、最近の研究では、RMSが筋原性または非筋原起源のどちらであるかに関する重要な科学的議論が生じ、RMSは文脈12、13に応じて異なる細胞タイプから派生する可能性があることを示唆している。14歳,15歳,16歳,17.RMS細胞株に関する多数の研究は、腫瘍の発達に関与する経路の同定および高度自己再生集団に関連するマーカーの特徴付けのための腫瘍球形成アッセイを用いて行われている。18歳,19歳,20歳,21.
しかしながら、発産元のRMS細胞を同定する腫瘍球形成アッセイの可能性にもかかわらず、一次RMS細胞に用いることができる信頼性の高い方法はまだ説明されていない。この文脈において、我々のグループからの最近の研究は、デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)マウスモデル22における起源のRMS細胞の同定のための最適化された腫瘍球形成アッセイを採用した。筋肉組織から単離された複数の腫瘍形成前細胞型は、低アタッチメント条件で増殖する能力について試験され、ジストロフィー性コンテキストにおけるRMSの起源細胞としての筋肉幹細胞の同定を可能にする。ここで説明する腫瘍球形成アッセイ(図1)の再現性と信頼性の高いプロトコルは、マウスRMS開発を担う極めて稀な細胞集団の同定に成功している。
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Protocol
マウスのハウジング、治療、および犠牲は、サンフォードバーナム・プレビーズ医学発見研究所の承認されたIACUCプロトコルに従って行われた。
1. 試薬の調製
- 100 mLの細胞単離培地を調記:F10培地に10%の馬血清(HS)を補充した。
- 50mLのコラゲナーゼ型II溶液を調製する:50mLの細胞単離培地にコラゲナーゼ型II粉末を1g溶解させる(ロットによって単位数が異なるため、1mL当たりの酵素の単位に注意する)。溶液をアリコートし、使用する準備ができるまで-20 °C冷凍庫に保管してください。
注:酵素活性が異なるロット間で変化する可能性があるため、使用前にコラゲナーゼのすべてのロットをテストする必要があります。 - 第2消化溶液の試料10mLを調味する:コラゲナーゼ型II溶液100単位/mLの細胞単離培地と2単位/mLのジスパーゼIIを加重した。使用直前に準備してください。
- 腫瘍細胞培地の500 mLを調味する:DMEM高グルコースは20%FBSおよび1%のペン/ストレップを補充した。
- FACSバッファーの500 mLを準備する:1x PBSは2.5%v/v正常ヤギ血清および1 mM EDTAを補充した。
- 腫瘍球培地の500 mLを調剤:DMEM/F12は1%のペン/ストレップを補充した。使用直前に、次の成長因子を追加します: 1% N2 サプリメント, 10 ng/mL EGF, 10 ng/mL β-FGF.
2. 細胞の単離と培養
- 5 mLの細胞分離培地(腫瘍試料1枚につき1枚)を含む10cmプレートを調製し、腫瘍組織を収穫する準備ができるまで37°Cのインキュベーターに入れます。
- RMSは、生後約18ヶ月のB10 mdxマウスおよびB6 mdx/mTRマウスの9ヶ月22、23年までに、デュシェンヌ筋ジストロフィーの雄マウスと雌マウスの両方で自発的に発症することが報告されている。イソルランを用いてRMS腫瘍を発症するマウスを麻酔し、子宮頸部脱臼または施設のIACUCガイドラインに従って動物を犠牲にする。はさみで、腫瘍が局在する領域の皮膚に切開を行い、(ピンセットを使用して)皮膚を目的の領域から引き離します。かみそり刃を用いて、動物から腫瘍を切除する。
- 腫瘍組織の500~1,000mgの重量を量り、ステップ2.1(図1A)で調製したプレートに入れる。
注:組織の大きな量は、消化ステップに悪影響を与え、全体的な収率を低下させる。採取した腫瘍が1000mgより大きい場合は、所望の重量に達するまでランダムに部品とサンプルに分割します。ランダムサンプリングは、組織の不均一性を評価するために必要です。 - 生殖細胞培養フードに腫瘍組織を含むプレートを入れ、かみそり刃でミンチします。RMSからの腫瘍組織は不均一である;したがって、異なる領域は、カットに異なる抵抗を提示する可能性があります。最適な消化を確保するために、得られるミンチ片のサイズが均一であることを確認してください。
注:RMSは、すべての腫瘍で同定することができる異なる組織タイプ(主に線維性、血管化、および脂肪組織)の混合物として存在する。1)元の腫瘍の組成を正確に要約する不均一な細胞集団を単離し、2)単離手順に偏らない、採取した組織のランダムサンプリングを行う。腫瘍の異なる領域からの細胞は、セクション3に記載のアッセイにおいてインビトロで並列に消化され、試験されるべきである。 - 15 mL遠心管でひき傷組織および細胞単離培地を移動し、4 mLの細胞分離培地でプレートを洗浄し、チューブに入れます。
- 700単位/mLのコラゲナーゼ溶液を加えて組織を消化し、37°Cで1.5時間揺れる水浴でインキュベートします。
- インキュベーション後、RTで300 x gで組織を5分間スピンダウンし、ペレットを乱さずに上清を吸引し、第2消化液(ジスパーゼ)の10mLでペレットを再濁させ、30分間37°Cで振水浴でインキュベートする。
- 2回目の消化が完了したら、ピペを上下に動かし、50 mL遠心チューブ上の70 μmナイロンフィルターを通してセルサスペンションを通過させます。次に、10 mLの細胞分離培養培養液を加えてフィルターを洗浄し、消化液を希釈し、組織を300xgとRTで5分間スピンダウンします。
- 上清を吸引し、腫瘍細胞培中の20mLでペレットを再中断する。次いで、細胞懸濁液を15cm細胞培養プレートに移す。細胞を一晩37°Cのインキュベーターに入れます。このプレートはP0として識別されます。
- 分離の翌日、メディアを変更します。このステップは、細胞の生存に悪影響を及ぼす可能性のある破片や死んだ細胞の除去を確実にするために必要です。
- 培地変更後の細胞合流率を評価し、開始物質の量と細胞サイズに応じて30%~60%の範囲を評価します。細胞は90%の合流に達するまでインキュベーターで成長したままにしておきます。毎日セルを監視し、2 日ごとにメディアを変更します。腫瘍細胞がコンフルエントになるのに必要な時間は、腫瘍の攻撃性、腫瘍の遺伝子型、マウスの年齢、組織の不均一性など、複数のパラメータによって異なります。
- セルの通過には、次の操作を行います。
- 37°Cの水浴中の細胞剥離液および腫瘍細胞培中を予め温めます。
- 1x滅菌PBSで細胞を洗浄し、5〜10分間の暖かい細胞剥離溶液の10 mLで37°Cでそれらをインキュベートします。
- すべての細胞がプレートから切り離されると、10 mLの温かい腫瘍細胞培地を加え、溶液を50mL遠心管に移動させ、RTで5分間300xgで細胞をスピンします。
- ペレットサイズに応じて腫瘍細胞培地の5~10mLで細胞を再中断し、トリパンブルー(1:5希釈)を用いて生細胞をカウントして死細胞を排除する。
- 10 cm版の版10の5細胞か15 cm版の3 x 105細胞。セルの倍増時間は、ステップ 2.10 で詳述されている因子によって異なります。
3. 腫瘍球の誘導
- P1またはP2の腫瘍細胞を使用して、複数の通路を通る細胞選択を避ける(図1B)。プレートから細胞を取り外すには、まず1x PBSで皿を洗い、次に細胞剥離液(10cmプレートの場合は5mL、15cmプレートの場合は10mL)で覆い、インキュベーターに5~10分間置きます。
- 明視野顕微鏡でプレートを見て細胞が剥離していることを確認し、腫瘍細胞培地(細胞剥離液:腫瘍細胞培地)を1:1体加え、遠心管に細胞懸濁液を入れ、細胞を300xgで5分の5に回転させる。 RTで分。
- めっきに使用する方法に従って、FACSバッファー(セクション3.4)または腫瘍球培中(セクション3.5)のいずれかの細胞を再中断します。
- フローサイトメーターを介しためっき細胞
- FACS バッファー内の細胞を再中断 (量はペレットサイズに依存) し、Trypan 青の除外を使用して生細胞を手動でカウントします。最終的な細胞濃度が 107セル/mL (106セルあたり FACS バッファーの 100 μL) であることを確認します。細胞選別中に死んだ細胞から生きているを区別するために、106細胞あたりのFxサイクルバイオレット染色の1 μLを追加します。Fx Cycle バイオレット汚れが細胞に追加されない無染色コントロールを準備します。
注:濃度は、ソート中に効率的な染色と速度のために最適化されています。細胞濃度が低いと選別時間が長くなりますが、濃度が高いほど染色に影響します。 - 無染色コントロールを採用し、死んだ(Fxサイクルバイオレット+)細胞から生きたFACSゲート分離(Fxサイクルバイオレット-)を設定する。次に、蛍光活性化細胞選別(450/50フィルターバンドパス付き)を採用して、生細胞の分離と数を決定し、96ウェルの低アタッチメントプレートの各ウェルに所望の数の生細胞をめっきします。プレートの各ウェルは、選別を開始する前に、腫瘍球培地の200 μLで満たす必要があります。
注:TPCが腫瘍全体の中でまれな亜集団であることを考えると、マウスRMSから100個/ウェルをめっきしてプロトコルを最適化し、懸濁培養における腫瘍球の形成を観察する。ウェル当たりの細胞数は、試験された特定の腫瘍に合わせて調整する必要があります。 - 実験が終わるまで細胞をインキュベーターに入れる。必要な場合を除き、プレートの邪魔をしないようにしてください。30日間の実験では、各井戸は、メディアと毎週の成長因子の適切な割合で補充されるべきである(培温は蒸発する傾向があり、成長因子は1週間後に有効ではない)。
- 実験終了後、明視野顕微鏡下でプレートを手動でスクリーニングし、腫瘍球を同定する(ステップ3.6参照)。
注:30日のタイムポイントは、直径50~300μmのサイズのマウスRMS腫瘍球を容易に検出するように最適化されました。タイムポイントは、テストされた腫瘍の攻撃性およびその増殖速度に応じて調整されるべきである。
- FACS バッファー内の細胞を再中断 (量はペレットサイズに依存) し、Trypan 青の除外を使用して生細胞を手動でカウントします。最終的な細胞濃度が 107セル/mL (106セルあたり FACS バッファーの 100 μL) であることを確認します。細胞選別中に死んだ細胞から生きているを区別するために、106細胞あたりのFxサイクルバイオレット染色の1 μLを追加します。Fx Cycle バイオレット汚れが細胞に追加されない無染色コントロールを準備します。
- 手動でめっきセル
- 腫瘍球培地中の細胞を再中断(量はペレットに依存)し、トリパンブルー(1:10希釈)を使用して生細胞を手動でカウントします。チューブ内の細胞濃度を計算し、96ウェル低アタッチメントプレート内の細胞の適切な数をプレートします。実験が終わるまで細胞をインキュベーターに入れる。ステップ 3.4.3 で説明されているように、メディアと成長因子を補充するために必要な場合を除き、プレートを乱しないようにしてください。
- 実験の完了後、スクリーンプレートを明視野顕微鏡下で手動で腫瘍球を同定するか、またはCeligoソフトウェアを使用して、Kesselet.24で前述したように、以下のステップ3.6を参照してください。
- このアッセイの結果として2つの別々の読み出しが評価できることに注意してください: 形成された腫瘍球の数および大きさ。
注:ウェルに複数の細胞がめっきされている場合、腫瘍球または細胞クラスターのいずれかが形成される可能性があります(図1C、3番目および4番目のパネル)。細胞クラスターは、細胞生存を高める懸濁培養中に形成される小さな細胞凝集体であり、不規則な形状を特徴とする。腫瘍球は大きく、球状形状のよりコンパクトな構造を有する。彼らは、アンカレッジに依存しない方法で生き残る能力を持ち、高いレート25で増殖する能力を持つ単一の細胞から派生します。フローサイトメーターを介しためっき細胞は、実験室で利用可能な機能に応じて、交換可能に使用することができます。さらに、96ウェルプレートとは異なるサイズの低アタッチメントプレートを採用することが可能であり、必要な結果に依存します。実際、腫瘍球頻度の評価は96の低い付着板を用いて行われるべきであるのに対し、腫瘍発生性細胞の評価のための初期スクリーニングは、6ウェル低アタッチメントプレート上でより速く、信頼できる結果をもたらす。
4. 組換えタンパク質による腫瘍球処理
- 手順 3.1 と 3.2 を繰り返します。
- 組換えタンパク質を用いて治療を設定する場合は、まず次のセクション4.3を使用する最適な濃度を決定するか、または最適な濃度が以前に決定されている場合は、セクション4.4にスキップします。
- 組換えタンパク質治療濃度を決定します。
- 腫瘍球培中の細胞を再中断し(体積はペレットサイズに依存する)、トリパンブルーの除外を使用して生細胞を手動でカウントする。チューブとプレート100,000細胞中の細胞濃度を6ウェル低アタッチメントプレートで計算します。試験した各濃度につき2つのウェルと未処理のコントロール用の2つのウェルをプレート(図2)。試験されるタンパク質濃度は文献検索に基づいています。
- 異なるタンパク質濃度を有する懸濁細胞の各ウェルを処理し、48時間のインキュベーターに細胞を置く(細胞の生存率と下流標的遺伝子の発現の両方に対する治療の効果を評価するために必要な時間)。次に、次のパラメーターを評価します。
- 細胞生存:明視野顕微鏡を使用して、未処理のコントロールとの比較を使用して、細胞形態をチェックします。健康な細胞は顕微鏡下で明るく反射的に見えますが、過度の細胞死はメディアに破片の蓄積を誘発します。細胞死の定量化可能な決定のために、トリパンブルー排除、結晶紫色染色、MTT、またはTUNELアッセイを採用することができる(この場合、元のめっきに1つを加える)。
- 組換えタンパク質が下流経路に及ぼす影響:PubMedを使用して文献検索を実行し、テストされたタンパク質の影響を受ける可能性が高いと知られている下流遺伝子の同定を行います。標的遺伝子のqRT-PCRプライマーを設計し、処理細胞から単離したRNAに対してqRT-PCR解析を行う(図2)。
- 組換えタンパク質で治療します。
- 腫瘍球培中の細胞を再中断し(体積はペレットサイズに依存する)、トリパンブルーの除外を使用して生細胞を手動でカウントする。目的の実験に必要な細胞の総数(96ウェル低アタッチメントプレートの各ウェルあたり100細胞)を決定し、適切な腫瘍球培地量で希釈します。複数の処理を行う場合は、別々の細胞管を調調す。
- 組換えタンパク質の適切な濃度で各チューブを処理し、96ウェル低アタッチメントプレートの別々のウェルに細胞をプレートします。治療は、実験の30日間のエンドポイントまで組換えタンパク質の半減期に応じて、各ウェルで繰り返されます。
- 実験の最後に、手順 3.4.4 および 3.6 に従ってデータを分析します。
5. 過剰発現プラスミドによる腫瘍球処理
- 手順 3.1 と 3.2 を繰り返します。
- 新しい腫瘍タイプで治療を設定する場合は、まず、次のセクション5.3を使用するプラスミドの最適濃度を決定するか、または最適なDNA濃度が以前に決定されている場合は、セクション5.4にスキップします。
- 最適なプラスミド濃度を決定します。
- 腫瘍細胞培中の細胞を再中断し(体積はペレットサイズに依存する)、トリパンブルーの除外を使用して生細胞を手動でカウントする。カウントされた細胞をプレート化して、70%~90%の合流を達成します(細胞数は細胞サイズと形態に大きく依存します)。GFP-プラスミドは、付着細胞用トランスフェクション試薬の製造プロトコルに従ってトランスフェクション効率をテストするために採用されます。並行して、未処理のコントロールもテストします(図3A)。24ウェルプレートで効率試験を行います。
注:付着細胞は、懸濁細胞に対して行われるトランスフェクションが効率的ではなく、細胞の生存率に悪影響を及ぼすため、トランスフェクション効率を高めるために使用される。 - トランスフェクション後48時間は、次のパラメータの細胞を評価します。
- 細胞生存率:明視野顕微鏡を用いて、各ウェルに存在する細胞の数を比較し、未処理細胞とよく比較する。
- GFP 式: 各ウェル内のセルの総数に対して GFP 陽性であるセルのパーセンテージをカウントします (図 3B)。
- 腫瘍細胞培中の細胞を再中断し(体積はペレットサイズに依存する)、トリパンブルーの除外を使用して生細胞を手動でカウントする。カウントされた細胞をプレート化して、70%~90%の合流を達成します(細胞数は細胞サイズと形態に大きく依存します)。GFP-プラスミドは、付着細胞用トランスフェクション試薬の製造プロトコルに従ってトランスフェクション効率をテストするために採用されます。並行して、未処理のコントロールもテストします(図3A)。24ウェルプレートで効率試験を行います。
- 過剰発現プラスミド治療
- 腫瘍細胞培中の細胞を再中断し(体積はペレットサイズに依存する)、トリパンブルーの除外を使用して生細胞を手動でカウントする。6ウェルプレートのウェル当たり200,000細胞をプレート。各ウェルは、独立したトランスフェクションイベントに使用されます。各ウェルは、特定の腫瘍型に対して開発されたセットアップを用いてトランスフェクトされる(図3A)。
- トランスフェクション後24時間、1x PBSで各ウェルを洗浄し、温かい細胞剥離溶液(ウェルを覆うのに十分)で細胞をインキュベートする。セクション2.15に詳述されている要因に応じて、37°Cの37°Cにプレートを5〜10分間置きます。
- セルをデタッチする場合は、Trypan ブルーの除外を使用して、各単一のウェルから派生したセルを個別にカウントします。6ウェル低アタッチメントプレートのウェルあたり100,000細胞を配置し、異なるウェルに由来する細胞を混合しないようにします。プレートを37°Cのインキュベーターに置き、1週間邪魔をしないままにします。
注:このアッセイの持続時間は7日間であり、腫瘍球融合を防止しながら腫瘍球形成を可能にするのに十分な時間である。腫瘍球融合は、10万以上の細胞を1週間以上懸濁液で一緒にめっきすると明らかになる現象であり、腫瘍球形成能の評価に偏りを与える可能性がある。実験により長いインキュベーション時間が必要な場合には、腫瘍球融合26を回避するために使用される細胞密度を調整するか、またはポリマー足場にする必要があります。 - 実験の最後に、手順 3.5.2 と 3.6 に従ってデータを分析します。
6. 同種移植用腫瘍球製剤
- 細胞外マトリックス(ECM)溶液(同種移植片当たり50μL)および腫瘍細胞培地(同種移植片当たり50μL)を氷上に配置する。
- 腫瘍球は、同種移植片移植に使用することができる。特定の細胞型または治療から得られたすべての腫瘍球を15 mLまたは50 mLチューブにまとめます(培中の総体積に応じて)(図1D)。RTで300 x gで腫瘍球を300 x gで5分間スピンし、腫瘍球の上清を取り除き、無菌1x PBSの10 mLで洗います。
- RTで300 x gで再び300 x gで腫瘍球をスピンし、1x PBSを吸引し、500 μLを細胞ペレットの上に1mLの細胞剥離溶液を加え、解離プロセスを開始する。消化液中の腫瘍球を37°Cの揺振水浴にインキュベートし、消化の進行を10分ごとに確認します。腫瘍球が単一の細胞溶液に解離するのを助けるために、機械的な破壊のために細胞を上下にピペットする。消化プロセスは最大30分かかる場合があります。
注:腫瘍球が異なる一次RMS細胞から導出されるとインキュベーション時間がかなり異なるという事実にもかかわらず、消化時間との関係における細胞生存率の有意な減少は認められなかった。 - 単一細胞溶液が得られたら、腫瘍細胞培地の体積(1:1、細胞剥離液:腫瘍細胞培地)を加え、4°Cで5分間300xgでスピンダウンする。
注:この時間から、すべてのステップは氷上で実行する必要があります。紡糸後、腫瘍球は単一細胞溶液のように安定なペレットを形成しない。腫瘍球を取り除いたり吸引したりしないようにするには、1 mLピペットを使用し、液体を穏やかに吸引します。1 mL だけが残っている場合は、200 μL ピペットに移動します。 - 冷たい腫瘍細胞培地中の細胞を再中断し(体積はペレットサイズに依存する)、氷の上に細胞を置き、トリパンブルーの除外を使用して生細胞を数える。同種移植片に使用する細胞の適切な量を決定した後、冷たい腫瘍細胞培養の合計体積50μLでそれらを再中断する。冷たい腫瘍細胞培中のピペット先端を冷やします。先端が冷たい場合は、50 μLのECM溶液を取り、細胞を含むチューブに追加するためにそれを使用します。このプロセス中に氷からチューブを取り外さしないでください。
注:移植に使用する細胞の数は、腫瘍のテストと実験目標に従って決定されるべきである:移植された細胞の数が多いほど腫瘍の発達の時間が減少する(マウスRMS腫瘍球から20,000細胞が示されている)注射後6週間で腫瘍に発症する)。異なる細胞株または異なる治療を比較できるようにするためには、同じ数の細胞から開始することが重要です。 - 細胞は移植の準備ができているので、注射まで氷の上に維持します。氷の上に29Gの針で覆われた0.5 mLインスリン注射器を置き、細胞溶液が吸引時に固体になるのを防ぎます。
- 流量計を200mL/分酸素にし、イソファリン気化器を2.5%にします。誘導室内に入れて生後2ヶ月の雄のNOD/SCIDマウスを麻酔する。マウスが眠りに表示され、繁殖が遅くなるまで2-3分待ちます。手順を開始する前に、まず、マウスが眠っていることを足のピンチを通して確認し、次に目に獣医のチントを適用します。動物の右側を剃り、予め冷却された注射器で細胞溶液を吸引し、それらを皮下に剃った領域に注入する。注射が正しく行われれば、皮膚の下に目に見えるバンプが形成されます。
注:細胞同種移植片は、移植された細胞と同じマウス株で行うことができる。例えば、RMS細胞がもともとC57BL/6マウスから単離された場合、同種移植片はC57BL/6マウスで行うことができる。株が異なる場合は、拒絶反応を避けるために免疫不全のレシピエントマウスを利用する必要があります。レシピエントマウスの年齢は、実験目標に応じて調整することもできる。 - 週に1回、マウスの腫瘍形成を監視する。
注:同種移植片移植に由来する腫瘍の同一性を検証するには、細胞が単離された元の腫瘍と比較する必要があります。この目的のために、形態学的特徴および筋原性マーカーの発現に関する組織学的分析およびより包括的なRNAseqを行うことができる。
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Representative Results
腫瘍球検出
細胞単離は、腫瘍組織に存在する細胞集団の最大不均一性を得るために最適化された。まず、単離された組織は形態的に異なる領域を提示するので、均一な希少細胞集団を単離する可能性を高めるために、腫瘍の複数の領域からサンプリングを行った(図1A、左の第1パネル)。第二に、採取したサンプルの機械的解離は、サンプル全体に存在する可能性のある異なる抵抗にもかかわらず、ミンチ組織サイズの均質性を維持しながら行った(図1A、左から3番目および第4パネル)).出発物質(腫瘍の攻撃性、マウスの年齢および遺伝子型、腫瘍位置)に応じて、単離プロセスの機械的ストレスからの細胞の回復は、3〜7日(図1A、右側の最後のパネル)の範囲で変化してもよい。細胞の生存と増殖を高めるために、培養は単離の翌日に変更し、その後2日ごとに変更する必要があります。これにより、細胞の生存率に影響を与える可能性のある分離プロセス中に蓄積された破片や死んだ細胞が除去されます。腫瘍球形成アッセイは、懸濁培養物に入れたときに最適な生存率を確保するために細胞を少なくとも1回通過した後に開始すべきである(図1B、左側の最初のパネル)。我々の手の中では、通路2(P2)からの細胞から始めて最適な結果が得られた(図1C、左の第1および第2パネル)。この特定の一節は、複数のテストの後に選択されました。P0細胞を低付着状態でめっきした場合、後の通過に比べて腫瘍球の数が少なく、単離後に細胞破片が存在する可能性が高い。後の通路では、腫瘍球形成の異なるパターンが観察され、培養中の多数の通路の後に生じる選択に起因する。異なる細胞株を比較すると、同じ通路から開始することが示唆される。
腫瘍球と細胞クラスターの間の判分は、アッセイの定量化にとって根本的に重要である。図 1C(右の最後の2つのパネル)は、腫瘍球(左)と細胞クラスター(右)の形態学的な違いを明確に示しています。腫瘍球は、自己更新し、低アタッチメント条件(TPCの両方の特徴)で成長する高い能力を有する単一細胞から派生する。実際、腫瘍球の発達は腫瘍発生性の可能性を示す。しかし、このアッセイは、生物全体から派生した手がかりとは独立してインビトロで行われる。したがって、生体内における細胞の腫瘍原性を検証するために、同種移植片移植実験を行うべきである(図1D)。
組換えタンパク質治療の検証
腫瘍球治療を設定する前に、目的のタンパク質が腫瘍細胞に影響を与える最適な濃度を決定する必要があります。そのうえで、タンパク質の下流標的遺伝子の発現レベルの評価が必要です(図2)。pubMedに関する文献検索は、qRT-PCRを介してテストする標的遺伝子を決定する前に行われた。目的のタンパク質が異なる下流経路を調節することが示された場合には、これらの経路のそれぞれに関連する複数の遺伝子の選択を行う必要があります。例えば、Flt3l(Fms様チロシンキナーゼ3)は、急性骨髄性白血病におけるSTAT5シグナル伝達を調節し、p21、c-Myc、およびCyclinD1(図2)27の下流発現を誘導することが示されている。また、Flt3lの発現は、STAT3シグナル伝達経路28の活性化を媒知り媒振する樹状細胞分化のために必要とされる。STAT3の活動を評価するために、Socs3とCyclinD1式をチェックした(図2)。結果の分析は、試験された遺伝子の一部(p21、CyclinD1、およびSocs3)に対する組換えタンパク質治療の用量依存効果を示したが、他のものは影響を受けなかった(c-Myc)。治療効果の信頼性の高い評価のためにテストされた特定の腫瘍における目的のタンパク質に応答する下流遺伝子を決定することが重要です。
プラスミドトランスフェクションのためのプロトコルの最適化
プラスミドトランスフェクションおよびさらなる腫瘍球形成アッセイに対する効率的なプロトコルを確立するために、付着性腫瘍細胞に対するトランスフェクションの効果を試験した(図3A)。トランスフェクション試薬処理は、メーカーのプロトコルに従って行われ、2つの異なる量の試薬を試験した。効率は、GFPレポータープラスミドを用いて評価した。我々の手の中では、より少な量の試薬を用いてより高いトランスフェクション効率を観察した(図3A)。確かに高濃度は、48時間から始まり、トランスフェクションの時間から72時間後により明らかになる、増加した細胞死につながる。死細胞と細胞破片の蓄積が治療開始後24時間明らかになり、細胞生存率の低下を示すため、同じトランスフェクションプロトコルは懸濁液中の細胞において効率的ではなかった。この技術的な課題を克服するために、付着細胞にトランスフェクションを行い、治療後24時間を切り離し、さらに7日間懸濁液でプレートするという2つのステッププロトコルが採用されました。対照腫瘍球は、実験の最後にGFPを発現した(図3B)。
図1:腫瘍細胞単離、腫瘍球の誘導、および移植。(A)プロトコルのセクション2の概略表現(腫瘍細胞単離)。プロトコルの各主要なステップが要約されます。(B)プロトコルのセクション3の概略表現(腫瘍球誘導)。プロトコルの各主要なステップが要約されます。(C)左から:低倍率(スケールバー= 50μm)と高倍率(スケールバー=50μm)での通過2(P2)における単離腫瘍細胞の明視野画像。懸濁培養中30日後に腫瘍細胞に由来する腫瘍球の明視野画像(スケールバー=250μm)、及び懸濁培養中30日後に腫瘍細胞から形成された細胞クラスターの明視野画像(スケールバー=50μm)。(D)プロトコルのセクション6の概略表現(腫瘍球同種移植移植)。プロトコルの各主要なステップが要約されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組換えタンパク質濃度の決定のための下流標的遺伝子の検証Flt3l処理濃度の評価に関するqRT-PCR結果双方向分散分析を行った。非処理コントロールとの比較に有意性が示される。(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; n = 3)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:腫瘍球透過プロトコルの設定。(A)トランスフェクション試薬の低(上)または高(下)濃度(24ウェルプレートで0.75μLまたは1.5μL)で処理された腫瘍細胞の代表的な明視野および蛍光画像(スケールバー= 50 μm)。(B)GFPプラスミド処理細胞から形成された腫瘍球の代表的な画像は、細胞を懸濁液中でめっきした後7日目(スケールバー=50μm)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
腫瘍異種細胞集団からのTPCの単離および特性解析には、腫瘍クロノゲンアッセイ、FACS単離、腫瘍球形成アッセイなど、複数の方法が採用されています。腫瘍クロノジェニックアッセイは、1971年に最初に記載され、幹細胞研究に用いられ、その後癌生物学29,30にのみ適用された。この方法は、がん幹細胞本体性に基づいて、軟式ゲル培養31に制約なく膨張する。その開発以来、この方法は、腫瘍細胞の不均一性研究、細胞増殖に対するホルモン治療の効果、および腫瘍耐性研究31を含む複数の目的のために癌研究に広く使用されてきた。現在までに、このアッセイは、複数のタイプの癌32に対する腫瘍開始細胞の同定のためにまだ用いられている。
FACSの単離は、目的の細胞の表面に存在する分子マーカーの事前知識に基づいています。それは液体および固体腫瘍からのTPCの単離のために広く利用されている。例えば、ヒト急性骨髄性白血病(AML)開始細胞の最初の同定は、バルクAML細胞上に存在するマーカーの知識に基づくFACS分画および移植アッセイを利用してDickのグループによって行われた9。同様のアプローチを利用して、クラーク博士のグループは、細胞3を分離乳癌を分離した。腫瘍球形成アッセイは、TPCの同定および研究に用いられる別のアプローチである。この方法は、脳腫瘍33から癌幹細胞を同定するために最初に開発された。興味深いことに、最初は神経幹細胞の増殖を支持することが知られているのと同じ条件を用いて試験され、したがってTPC33に関連する自己再生特性も好む。さらに、腫瘍球の形成は、アンカーに依存しない方法で成長するTPCの能力に依存しています。
上記の3つのアプローチは、各方法の限界を克服し、TPC集団を分離して分子的に特徴付ける確率を高めるために並行して使用することができる。例えば、FACSは、純粋な細胞集団を分離するという大きな利点をもたらすにもかかわらず、すべての癌タイプでまだ知られていない表面マーカーの使用に強く依存している。したがって、その使用は、既知のマーカーを発現するTPCの分離に限定される。腫瘍クロノジェニックおよび腫瘍球形成アッセイは、いずれも細胞特性に基づいており、TPCと関連することが知られている。これらの方法は両方とも、新しいまたはまだ研究されていない癌に関する研究の最初の行として採用することができます。さらに、これら2つの方法は、目的の細胞集団の拡大と濃縮を確実にし、分子マーカーの同定を容易にし、癌耐性および薬物スクリーニング研究の両方を可能にする。この文脈では、腫瘍球形成アッセイはより有利であり、これらの球状構造は腫瘍組織に存在する環境をより良く再現するので(球の中心に低酸素領域)34。実際、3D培養は薬物治療の結果を予測するための信頼性が高い34.腫瘍球は培養後に回収でき、同種移植片実験に用いられる:腫瘍球を単細胞溶液に消化し、レシピエントマウスに移植すると、新たに腫瘍原性の生体内評価が可能になるバルク腫瘍細胞と比較して、同定されたTPC。
腫瘍の不均一性を代表する開始細胞材料を正常に得るためには、まず組織のランダムサンプリングを行うことが重要である。RMSは、単離された腫瘍で明確に区別可能である線維性、脂肪、または高度血管化領域によって特徴付けられており、したがって、この細胞多様性を維持するために、組織の各領域の収集が必要となる。さらに、消化過程で細胞が生存する可能性を高めるために、採取された組織のミンチは、均一なサイズの断片をもたらす必要があります:小さな断片は、細胞の生存率の低下を誘発する過剰消化される可能性が高くなります。これは、RMSの多様な形態と剛性のために特に退屈な場合があります。
腫瘍球形成アッセイの結果を定量化するためには、実際の腫瘍球と細胞クラスターを区別することが極めて重要である(図1C、右側の最後の2つのパネル)。腫瘍球は、細胞コンポジトンを区別することができない固体スフェロイド構造である。対照的に、セル クラスタでは、単一のセルを簡単に判別できます。細胞クラスターは丸みを帯びた形状を想定しておらず、50~250 μm25の範囲である腫瘍球と比較すると有意に小さい。
腫瘍球移植を達成するためには、均一な単一細胞溶液を得ることが重要なステップである。実際、腫瘍球の構造が堅く、大きな大きさを考えると、細胞の消化は、移植のためにさらに採用される単一細胞懸濁液の調製における主要な制限ステップとなる。したがって、腫瘍球の完全な解離には、機械的解離と組み合わせた酵素消化の複数のサイクルが必要です。解離の進行と成功した結果を確認するには、溶液を明視野顕微鏡で監視する必要があります。
腫瘍球形成アッセイによって提供される複数の利点にもかかわらず、腫瘍球は、あらゆるタイプの腫瘍またはすべての市販の細胞株から起因するものではないことが示されている。これらの場合、異種集団内の細胞腫瘍発生性およびTPCの定量化を決定するための標準としてアッセイを採用することはできません。このアッセイのもう一つの制限は、異なる腫瘍タイプが異なる成長および解離条件を必要とするという事実に関連しています。したがって、各腫瘍タイプまたは細胞株に対して、両方のプロトコルの最適化とトラブルシューティングに時間がかかります。さらに、培養中に複数の腫瘍球の融合が起こり、その大きさや数の評価が不明確になる。
腫瘍球形成アッセイは、以前にRMS研究で利用されてきたという事実にもかかわらず、主に市販のRMS細胞株に適用され、腫瘍形成および発達に関与する分子経路を同定する18、 20、21.不均一組織組成、RMSの起源である腫瘍の多数のサブタイプおよび多様な発達コンテキストを考えると、RMS細胞株の雇用は、起源の両方の細胞の同定のためのこのアッセイの適用を制限する。生体内の腫瘍発達につながる発達の手がかり.
ヒト肉腫サンプルから始まる腫瘍球由来の効率的なプロトコルを開発する試みは、以前に悪い結果を示している。実際、腫瘍球は、サンプル35のわずか10%から開発された。したがって、一次RMS細胞および腫瘍球の発達の単離のための再現性と信頼性の高いアッセイが必要である。この必要性に応じて、記載された腫瘍球形成アッセイは、一次細胞培養に用いられるように最適化された。このプロトコルの開発は、フィールドの主要な質問に答える第一歩です(すなわち、起源のRMS細胞が環境コンテキストによってどのように異なるか)。より詳細に説明する、RMS組織からの原発性腫瘍細胞の単離、腫瘍球の形成、腫瘍球治療(組換えタンパク質または過剰発現プラスミドの両方で行われる)、および同種移植片の再現可能なプロトコルである。移植実験。
結論として、腫瘍球形成アッセイは、異なるタイプの腫瘍におけるTPCの同定のための確立された多目的な方法であり、自己再生能力の増加とアンカレッジに依存しない成長能力を有する細胞を豊かにする方法。このアッセイは、研究されている細胞集団の機能特性に基づいており、分子マーカーの以前の知識に基づいていません。従って、それは腫瘍のタイプの広い範囲のための探索的な用具として適用することができる。さらに、腫瘍球培養で達成される希少細胞集団の単離は、このインビトロアッセイを癌薬物検査のための理想的なプラットフォームにします。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、エリソン医療財団助成金AG-NS-0843-11とNCIがんセンターサポート助成金P30CA030199内のNIHパイロット助成金によってA.S.に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
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