Summary
Denne protokol beskriver en reproducerbar metode til isolering af mus rabdomyosarkom primære celler, tumorsphere dannelse og behandling, og allograft transplantation startende fra tumorspheres kulturer.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) er den mest almindeligt forekommende bløddelssarkom hos børn. Selv om en betydelig indsats har gjort det muligt at identificere fælles mutationer forbundet med RMS og tilladt diskrimination af forskellige RMS-undertyper, er der stadig store udfordringer for udviklingen af nye behandlinger for yderligere at forbedre prognosen. Selv om det identificeres ved ekspression af myogene markører, der er stadig betydelig kontrovers om, hvorvidt RMS har myogene eller ikke-myogene oprindelse, som cellen af oprindelse er stadig dårligt forstået. I nærværende undersøgelse, en pålidelig metode er fastsat for tumorsphere assay for mus RMS. Analysen er baseret på funktionelle egenskaber af tumorceller og gør det muligt at identificere sjældne populationer i tumoren med tumorigent funktioner. Også beskrevet er procedurer for afprøvning af rekombinante proteiner, integrere transfektering protokoller med tumorsphere assay, og evaluere kandidat gener involveret i tumor udvikling og vækst. Beskrevet yderligere er en procedure for allograft transplantation af tumorspheres til recipient mus for at validere tumorigent funktion in vivo. Samlet set giver den beskrevne metode pålidelig identifikation og afprøvning af sjældne RMS tumorigent populationer, der kan anvendes til RMS opstår i forskellige sammenhænge. Endelig kan protokollen udnyttes som en platform for narkotika screening og fremtidig udvikling af Therapeutics.
Introduction
Kræft er en heterogen sygdom; Endvidere, den samme type af tumor kan præsentere forskellige genetiske mutationer i forskellige patienter, og inden for en patient en tumor er sammensat af flere populationer af celler1. Heterogenitet udgør en udfordring i identifikationen af celler, der er ansvarlige for initiering og formerings kræft, men deres karakterisering er afgørende for udviklingen af effektive behandlinger. Begrebet tumor formerings celler (TPC), en sjælden population af celler, der bidrager til tumor udvikling, er tidligere blevet grundigt gennemgået2. Trods det faktum, at tpcs har været karakteriseret i flere typer af kræft, identifikation af markører for deres pålidelige isolation er fortsat en udfordring for flere tumortyper3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. derfor kan en metode, der ikke er baseret på molekylære markører, men snarere på TPC funktionelle egenskaber (høj selvfornyelse og evnen til at vokse i lav-fastgørelses forhold), kendt som tumorsphere formation assay, anvendes bredt til identifikation af TPCs fra de fleste tumorer. Vigtigere, denne analyse kan også anvendes til udvidelse af tpcs og dermed direkte anvendt til kræft Drug screening og undersøgelser af kræft resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en sjælden form for bløddelssarkom mest almindeligt hos små børn11. Althoug RMS kan histologisk identificeres gennem vurdering af ekspression af myogene markører, den RMS celle af oprindelse har ikke været enslydeligt karakteriseret på grund af de mange tumor undertyper og høj heterogenitet af tumor udviklingsmæssige stimuli. Nylige undersøgelser har faktisk medført en betydelig videnskabelig diskussion om, hvorvidt RMS er af myogene eller ikke-myogene oprindelser, hvilket tyder på, at RMS kan stamme fra forskellige celletyper afhængigt af konteksten12,13, 14 , 15 , 16 , 17. talrige undersøgelser af RMS cellelinjer er blevet udført ansætte tumorsphere formation assay til identifikation af veje involveret i tumor udvikling og karakterisering af markører forbundet med meget selv-fornyelse populationer 18 , 19 , 20 , 21.
Men på trods af tumorsphere formation assay potentiale til at identificere RMS celler af oprindelse, en pålidelig metode, der kan anvendes på primære RMS celler er endnu ikke blevet beskrevet. I denne sammenhæng, en nylig undersøgelse fra vores gruppe ansat en optimeret tumorsphere formation assay til identifikation af RMS celler af oprindelse i en Duchenne muskuløs dystrofi (DMD) musemodel22. Flere præ-tumgenic celletyper, isoleret fra muskelvæv, testes for deres evne til at vokse i lav-fastgørelse betingelser, gør det muligt at identificere muskel stamceller som celler af oprindelse for RMS i dystrofiske kontekster. Beskrevet her er en reproducerbar og pålidelig protokol for tumorsphere formation assay (figur 1), som er blevet anvendt med succes til identifikation af ekstremt sjældne cellepopulationer, der er ansvarlige for mus RMS udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opstaldning, behandling og ofring af mus blev udført efter den godkendte IACUC-protokol fra Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. klargøring af reagens
- Forbered 100 mL celle isolations medie: F10 medium suppleret med 10% heste serum (HS).
- Forbered 50 mL kollagenase type II opløsning: 1 g kollagenase type II pulver opløses i 50 mL celle isolations medie (Bemærk enhederne af enzymet pr. 1 mL medie, da antallet af enheder ændres afhængigt af partiet). Opløsningen og opbevares i a-20 °C-fryseren, indtil den er klar til brug.
Bemærk: hvert parti af kollagenase skal testes før brug, da enzymaktiviteten kan ændre sig på tværs af forskellige partier. - Forbered 10 mL pr. prøve af anden fordøjelsesvæske: celle isolations medier med 100 enheder/mL kollagenase type II opløsning og 2 enheder/mL dispase II frisk vægtet. Forbered umiddelbart før brug.
- Forbered 500 mL tumorceller medier: DMEM høj glukose suppleret med 20% FBS og 1% pen/STREP.
- Forbered 500 mL FACS buffer: 1x PBS suppleret med 2,5% v/v normal ged serum og 1 mM EDTA.
- Forbered 500 mL tumorsphere-medier: DMEM/F12 suppleret med 1% pen/STREP. Lige før brug tilsættes følgende vækstfaktorer: 1% N2-tillæg, 10 ng/mL EGF og 10 ng/mL β-FGF.
2. celle isolation og kultur
- Forbered en 10 cm plade indeholdende 5 mL celler isolations medier (en plade pr. tumorprøve) og Placer den i en inkubator ved 37 °C, indtil den er klar til at høste tumorvævet.
- RMS er blevet rapporteret til spontant udvikle i både mandlige og kvindelig musemodeller for Duchenne muskeldystrofi, såsom B10 MDX mus på omkring 18 måneder og i B6 MDX/mTR mus ved 9 måneder22,23. Bedøve musen, der udvikler RMS tumor ved hjælp af isoflurane, og ofre dyret gennem livmoderhals dislokation eller i henhold til IACUC retningslinjer for institutionen. Med en saks, lave et snit på huden i det område, hvor tumoren er lokaliseret, og (ved hjælp af pincet) trække huden væk fra det område af interesse. Ansætte en barberkniv, punktafgiftspligtige tumoren fra dyret.
- Veje 500 – 1000 mg af tumorvævet og placere det i pladen fremstillet i trin 2,1 (figur 1a).
Bemærk: større mængder af væv påvirker fordøjelsestrinene negativt og nedsætter det samlede udbytte. Hvis den høstede tumor er større end 1000 mg, opdele det i dele og prøve tilfældigt, indtil den ønskede vægt er nået. Stikprøveudtagning er nødvendig for at vurdere vævs heterogenitet. - Placer pladen indeholdende tumor væv i den sterile cellekultur hætte og hakkekød det med en barberkniv. Tumor væv fra RMS er heterogene; forskellige områder kan således udgøre en anden modstand mod nedskæringerne. Sørg for, at størrelserne af de resulterende hakkede stykker er ensartede for at sikre optimal fordøjelse.
Bemærk: RMS findes som blandinger af forskellige vævstyper (hovedsageligt fibrotisk, vaskulariseret og fedtvæv), der kan identificeres i hver tumor. Til 1) isolere en heterogen cellepopulation nøjagtigt rekapitulerer sammensætningen af den oprindelige tumor og 2) ikke bias isolations proceduren, udføre tilfældige prøveudtagning af det høstede væv. Celler fra forskellige områder af tumoren bør fordøjes og testes parallelt in vitro i den analyse, der er beskrevet i punkt 3. - Flyt det hakkede vævs-og celle isolations medie i et 15 mL centrifugeglas, vask pladen med 4 mL celle isolations medie, og Placer den i røret.
- Tilsæt 700 enheder/mL kollagenase opløsning til at fordøje vævet og inkubere i et ryste vandbad ved 37 °C for 1,5 h.
- Efter inkubation, spin ned i vævet ved 300 x g i 5 min ved rt. Aspirér supernatanten uden at forstyrre pellet, resuspension af pellet i 10 ml anden fordøjelses opløsning (dispase), og Inkuber i et ryste vandbad ved 37 °c i 30 min.
- Når den anden fordøjelse er afsluttet, pipet op og ned og passere cellesuspensionen gennem et 70 μm nylon filter på et 50 mL centrifugeglas. Tilsæt derefter 10 mL celle isolations medie til at vaske filteret og fortynde fordøjelses opløsningen, og spinde vævet ved 300 x g og rt i 5 min.
- Aspirér supernatanten og resuspension pellet i 20 mL tumorceller medier. Derefter overføres cellesuspensionen i en 15 cm cellekultur plade. Placer cellerne i inkubator ved 37 °C natten over. Denne plade vil blive identificeret som p0.
- Dagen efter isolation, ændre medierne. Dette trin er nødvendigt for at sikre fjernelse af snavs og døde celler, der kan have negativ indflydelse på cellens overlevelse.
- Vurder celle konfluency, når mediet er ændret, hvilket varierer fra 30% – 60% afhængigt af mængden af udgangsmateriale og Cellestørrelse. Lad cellerne vokse i inkubator, indtil de når 90% konfluency. Overvåg cellerne hver dag, og Skift medier hver 2. Den tid, det er nødvendigt for tumorceller til at blive flydende varierer afhængigt af flere parametre: tumor aggressivitet, genotype af tumoren, alder af musen, heterogenitet af vævet.
- For celle passaging skal du gøre følgende:
- Pre-Warm cellen løsrivelse løsning og tumorceller medier i et vandbad ved 37 °C.
- Cellerne vaskes med 1x steril PBS, og de inkuberes ved 37 °C i 10 mL løsrivelse af varm celle i 5-10 minutter.
- Når alle cellerne er udskilt fra pladen, tilsættes 10 mL varme tumorceller medier, flytte opløsningen til en 50 mL centrifuge tube og spin celler ned på 300 x g i 5 min ved rt.
- Resuspension cellerne i 5 – 10 mL tumorceller medier, afhængigt af pellet størrelse, og tælle levende celler ved hjælp Trypan blå (1:5 fortynding) at udelukke døde celler.
- Plade 105 celler i 10 cm plader eller 3 x 105 celler i 15 cm plader. Celle fordoblings tiden varierer afhængigt af de faktorer, som er beskrevet i trin 2,10.
3. Tumorsphere afberegning
- Brug tumorceller ved passage P1 eller P2 for at undgå cellemarkering gennem flere passager (figur 1b). For at frigøre celler fra pladen skal du først vaske skålen med 1x PBS, uden at forstyrre cellerne, og derefter dække dem ved hjælp af cellernes løsrivelse (5 mL for en 10 cm plade eller 10 mL for en 15 cm plade) og placere dem i inkubator i 5 – 10 min.
- Bekræft, at cellerne er udskilte ved at kigge på pladen under en lys-felt mikroskop, tilsæt 1:1 volumen af tumorceller medier (Cell løsrivelse løsning: tumorceller medier), placere cellen suspension i et centrifugeglas og spin cellerne ned på 300 x g for 5 min på RT.
- Resuspendere celler i enten FACS buffer (afsnit 3,4) eller tumorspheres medier (afsnit 3,5), i henhold til den metode, der anvendes til plating.
- Plating celler gennem flow flowcytometer
- Resuspendere celler i FACS buffer (mængden afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp Trypan blå udelukkelse. Sørg for, at den endelige celle koncentration er 107 celler/mL (100 ΜL af FACS buffer pr. 106 celler). Tilsæt 1 μL fx-cyklus violet plet pr. 106 celler for at diskriminere levende fra døde celler under celle sortering. Forbered en ufarvet kontrol, hvor fx Cycle violet plet ikke tilsættes til cellerne.
Bemærk: koncentrationen er optimeret til effektiv farvning og hastighed under sortering. En lavere celle koncentration vil resultere i en længere sortering tid, mens en højere koncentration vil påvirke farvning. - Ansætte den ufarvede kontrol, oprette en FACS Gate adskillelse levende (fx Cycle violet-) fra døde (fx Cycle violet+) celler. Derefter ansætte fluorescerende-aktiverede celle sortering (med 450/50 filter bånd pass) til adskillelse og optælling af levende/døde celler og til plating det ønskede antal levende celler i hver brønd af 96 godt lav-vedhæftnings plader. Hver brønd af pladen skal fyldes med 200 μL af tumorspheres medier, før du starter sorteringen.
Bemærk: da TPCs er en sjælden delpopulation inden for hele tumoren, optimerer protokollen ved plating 100 celler/godt fra mus RMS til at observere dannelsen af tumorspheres i suspension kultur. Celle nummeret pr brønd bør justeres for den specifikke tumor testet. - Placer cellerne i inkubator indtil afslutningen af forsøget. Prøv ikke at forstyrre pladen, medmindre det er nødvendigt. For et 30 dages eksperiment skal hver brønd genopfyldes med medier og en passende andel af vækstfaktorer hver uge (medierne har tendens til at fordampe, og vækstfaktorerne er ikke effektive efter 1 uge).
- Efter endt eksperiment, manuelt skærm plader under en lys-felt mikroskop til at identificere tumorspheres (Se trin 3,6).
Bemærk: et tidspunkt på 30 dage blev optimeret til nemt at detektere mus RMS tumorspheres størrelser spænder fra 50 – 300 μm diameter. Tidspunktet bør justeres afhængigt af aggressivitet af den testede tumor og dens proliferativ sats.
- Resuspendere celler i FACS buffer (mængden afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp Trypan blå udelukkelse. Sørg for, at den endelige celle koncentration er 107 celler/mL (100 ΜL af FACS buffer pr. 106 celler). Tilsæt 1 μL fx-cyklus violet plet pr. 106 celler for at diskriminere levende fra døde celler under celle sortering. Forbered en ufarvet kontrol, hvor fx Cycle violet plet ikke tilsættes til cellerne.
- Plating celler manuelt
- Resuspendere celler i tumorsphere medier (mængden afhænger af pellet) og manuelt tælle levende celler ved hjælp af trypan og et blå (1:10 fortynding). Beregn celle koncentrationen i røret og pladen det korrekte antal celler i en 96 godt lav vedhæftnings plade. Placer cellerne i inkubator indtil afslutningen af forsøget. Prøv ikke at forstyrre pladen, medmindre det er nødvendigt for at genopbygge medier og vækstfaktorer, som beskrevet i trin 3.4.3.
- Efter endt eksperiment, skærm plader manuelt under en lys-felt mikroskop til at identificere tumorspheres eller ved hjælp af Celigo software, som tidligere beskrevet i Kessel et al.24 se trin 3,6 nedenfor.
- Bemærk, at to separate udlæsninger kan evalueres som resultat af denne analyse: antal og størrelse af dannet tumorspheres.
Bemærk: når mere end én celle er belagt i en brønd, kan enten tumorspheres eller celle klynger dannes (figur 1c, tredje og fjerde paneler). Celle klynger er små cellulære aggregater, der danner i suspension kultur, der forbedrer cellens overlevelse og er karakteriseret ved en uregelmæssig form. Tumorspheres er store og har en mere kompakt struktur med en kugleformet form. De stammer fra en enkelt celle, der har evnen til at overleve i en forankring-uafhængig måde og formere sig med en høj sats25. Plating celler gennem flow flowcytometer eller manuelt kan bruges synonymt, afhængigt af de tilgængelige kapaciteter i laboratoriet. Desuden er det muligt at anvende lav-vedhæftnings plader af forskellig størrelse end 96 brønd plader og afhænger af det ønskede resultat. Faktisk bør vurderingen af tumorsphere frekvens gøres med 96 godt lave vedhæftnings plader, mens Initial screening for vurdering af celler tumorigent potentiale vil give hurtigere og pålidelige resultater på 6 godt lav-vedhæftnings plader.
4. Tumorsphere behandling med rekombinante proteiner
- Gentag trin 3,1 og 3,2.
- Hvis du indstiller en behandling med rekombinante proteiner, skal du først bestemme den bedste koncentration til brug efter pkt. 4,3, eller hvis den optimale koncentration tidligere er fastlagt, skal du springe til afsnit 4,4.
- Bestemme den rekombinante protein behandlings koncentration.
- Resuspendere cellerne i tumorsphere medier (lydstyrken afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp af Trypan blå udelukkelse. Beregn celle koncentrationen i røret og pladen 100.000 celler i en 6 godt lav vedhæftnings plade. Plade to brønde pr hver koncentration testet og to brønde for ubehandlet kontrol (figur 2). Protein koncentrationer, der skal testes, er baseret på litteratursøgning.
- Behandle hver brønd af suspension celler med en anden proteinkoncentration og placere cellerne i inkubator for 48 h (tid, der er nødvendig for at kunne evaluere virkningen af behandlingen på både cellens levedygtighed og på ekspression af downstream Target gener). Vurder derefter følgende parametre:
- Cell overlevelse: ved hjælp af en lys-felt mikroskop samt sammenligning med ubehandlet kontrol, check celle morfologi. Raske celler vises lyse og reflekterende under mikroskopet, mens overdreven celledød vil fremkalde ophobning af snavs i medierne. For en kvantificerbar bestemmelse af celledød, Trypan blå udelukkelse, krystalviolet farvning, MTT, eller TUNEL assay kan anvendes (i dette tilfælde tilføje en brønd til den oprindelige plating).
- Effekt af rekombinante proteiner på downstream-veje: Udfør en litteratursøgning ved hjælp af PubMed til identifikation af de downstream-gener, der vides at være påvirket af det testede protein. Design QRT-PCR primere for målgener, og Udfør QRT-PCR-analyse på RNA isoleret fra de behandlede celler (figur 2).
- Behandl med rekombinant protein.
- Resuspendere cellerne i tumorsphere medier (lydstyrken afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp af Trypan blå udelukkelse. Bestem det samlede antal celler, der er nødvendige for det ønskede eksperiment (100 celler pr. brønd af en 96 godt lav fastgørelsesplade) og fortynde dem i den relevante tumorsphere medie volumen. Hvis du udfører mere end én behandling, forberede separate celle rør.
- Behandl hvert rør med den passende koncentration af rekombinant protein og plade cellerne i en separat brønd af 96 godt lav-vedhæftnings plade. Behandlingen vil blive gentaget på hver brønd afhængigt af halveringstiden for det rekombinante protein indtil det 30 dages endepunkt for forsøget.
- I slutningen af eksperimentet skal du følge trin 3.4.4 og 3,6 for at analysere dataene.
5. Tumorsphere behandling med overekspression plasmider
- Gentag trin 3,1 og 3,2.
- Hvis du konfigurerer behandlingen på en ny tumortype, skal du først bestemme den bedste koncentration af plasmid til brug efter afsnit 5,3, eller hvis den optimale DNA-koncentration tidligere er fastlagt, skal du springe til afsnit 5,4.
- Bestemme optimal plasmid koncentration.
- Resuspendere celler i tumorceller medier (lydstyrken afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp Trypan blå udelukkelse. Plade de optalte celler for at opnå en konfluency fra 70%-90% (celle nummer er meget afhængig af Cellestørrelse og morfologi). Gfp-plasmid vil blive anvendt til at teste transfektering effektivitet efter producentens protokol af transfektering reagens til vedsiddende celler. Parallelt hermed testes også en ubehandlet kontrol (figur 3a). Udfør en effektivitetstest i en 24-brønd plade.
Bemærk: Vedlæg celler bruges til at forbedre transfektering effektivitet, som transfektering udført på suspension celler er ikke effektiv og negativt påvirker cellens levedygtighed. - 48 h efter transfektering vurdere cellerne for følgende parametre:
- Cell overlevelse: ved hjælp af en lys-felt mikroskop, sammenligne antallet af celler til stede i hver-brønd og sammenligne det med de ubehandlede celler godt.
- GFP-udtryk: Tæl procentdelen af celler, der er GFP-positive, over det samlede antal celler i hver brønd (figur 3b).
- Resuspendere celler i tumorceller medier (lydstyrken afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp Trypan blå udelukkelse. Plade de optalte celler for at opnå en konfluency fra 70%-90% (celle nummer er meget afhængig af Cellestørrelse og morfologi). Gfp-plasmid vil blive anvendt til at teste transfektering effektivitet efter producentens protokol af transfektering reagens til vedsiddende celler. Parallelt hermed testes også en ubehandlet kontrol (figur 3a). Udfør en effektivitetstest i en 24-brønd plade.
- Overekspression plasmid behandling
- Resuspendere cellerne i tumor celle medier (lydstyrken afhænger af pellet størrelse) og manuelt tælle levende celler ved hjælp af Trypan blå udelukkelse. Plade 200.000 celler pr brønd af en 6 brønd plade. Hver brønd vil blive brugt til en uafhængig transfektering begivenhed. Hver brønd vil blive transficeret ved hjælp af den opsætning, der er udviklet til den specifikke tumortype (figur 3a).
- 24 h efter transfection vaskes hver brønd med 1x PBS og inkuberer cellerne i en varm celle løsrivnings løsning (nok til at dække brønden). Pladen placeres i inkubator ved 37 °C i 5 – 10 minutter, afhængigt af de faktorer, som er beskrevet i punkt 2,15.
- Når cellerne er udskillet, tælle cellerne afledt af hver enkelt godt uafhængigt ved hjælp af Trypan blå udelukkelse. Placer 100.000 celler pr. brønd af en 6 godt lav vedhæftnings plade, og sørg for ikke at blande celler afledt af forskellige brønde. Anbring pladen i inkubator ved 37 °C, og Efterlad uforstyrret i en uge.
Bemærk: varigheden af denne analyse er 7 dage, en tilstrækkelig tid til at tillade tumorsphere dannelse samtidig forhindre tumorsphere fusion. Tumorsphere fusion er et fænomen, der bliver tydeligt, når 100.000 eller flere celler er belagt sammen i suspension i over 1 uge, hvilket kan bias vurderingen af Tumorsphere dannelse evne. I tilfælde af at forsøget kræver længere inkubationstid, bør celletætheden justeres eller polymere stilladser bruges til at undgå tumorsphere fusion26. - I slutningen af eksperimentet skal du følge trinene 3.5.2 og 3,6 for at analysere dataene.
6. Tumorsphere forberedelse til allotransplantations transplantation
- Placer ekstracellulære matrix (ECM) opløsning (50 μL pr. allograft) og tumorceller medier (50 μL per allograft) på is.
- Tumorspheres kan anvendes til allograft transplantationer. Alle tumorspheres, der er fremstillet af en bestemt celletype eller-behandling, samles i et 15 mL-eller 50 mL-rør (i henhold til det totale medie volumen) (figur 1d). Drej tumorspheres ned ved 300 x g i 5 minutter ved rt. Fjern supernatanten over tumorspheres og vask dem med 10 ml STERIL 1x PBS.
- Spin tumorspheres ned igen ved 300 x g i 5 minutter ved rt, Aspirer 1x PBS, og tilsæt 500 μl til 1 ml celle løsningsmiddel løsning på toppen af celle pellet, som starter dissociations processen. Inkuber tumorspheres i fordøjelsesvæsken i et ryste vandbad ved 37 °C og kontroller progressionen af fordøjelsen hver 10 min. For at hjælpe tumorspheres dissociation i en enkelt celle opløsning, pipetter cellerne op og ned for mekanisk afbrydelse. Fordøjelsesprocessen kan tage op til 30 min.
Bemærk: trods det faktum, at inkubationstiden varierer betydeligt, når tumorspheres er afledt af forskellige primære RMS-celler, blev der aldrig observeret et signifikant fald i cellernes levedygtighed i forhold til fordøjelsestid. - Når en enkelt celle opløsning er opnået, tilsættes et volumen af tumorceller medier (1:1, Cell løsrivelse løsning: tumorceller medier) og spin det ned på 300 x g i 5 min ved 4 °c.
Bemærk: fra dette tidspunkt skal alle trinene udføres på is. Efter spinding, tumorspheres ikke danner en stabil pellet som de enkelte celler løsninger gør. For at sikre, at du ikke afbruger eller aspirerer tumorspheres, skal du bruge en 1 mL pipette og forsigtigt aspirere væsken. Flyt til en 200 μL pipette, når der kun er 1 mL tilbage. - Resuspendere celler i kolde tumorceller medier (lydstyrken vil afhænge af pellet størrelse), placere cellerne på is og tælle levende celler ved hjælp Trypan blå udelukkelse. Efter bestemmelse af den korrekte mængde af celler til brug for allograft, resuspension dem i et samlet volumen på 50 μL kold tumorceller medier. Afkøl en pipettespids i kolde tumorceller medier. Når spidsen er kold, skal du bruge den til at tage 50 μL ECM-opløsning og tilføje den til røret, der indeholder cellerne. Fjern ikke rørene fra isen under denne proces.
Bemærk: antallet af celler, der skal bruges til transplantationen, skal bestemmes i henhold til den testede tumor og eksperimentelle mål: et større antal transplanterede celler vil nedsætte tiden for tumor udvikling (20.000 celler fra mus RMS tumorspheres har vist sig at udvikle sig til en tumor 6 uger efter injektion). At være i stand til at sammenligne forskellige cellelinjer eller forskellige behandlinger, er det vigtigt at starte fra det samme antal celler. - Da cellerne nu er klar til transplantation, opretholde på is indtil injektion. Sæt en loft 0,5 mL insulin sprøjte med en 29 G nål på is for at forhindre, at celle opløsningen bliver solid ved aspiration.
- Tænd for flowmeteret til 200 mL/min oxygen og isofluran fordamper til 2,5%. Anæstetize en 2 måneder gammel mandlig NOD/SCID mus ved at placere den inde i induktions kammeret. Vent 2 – 3 min indtil musen vises i søvn og avl er bremset. Før du starter proceduren, skal du først bekræfte gennem en fod knivspids, at musen er i søvn, derefter anvende dyrlæge salve på øjnene. Barberer den højre side af dyret, Aspirér celle opløsningen i den forkølede sprøjte, og Injicer dem subkutant i det barberede område. En synlig bump under huden vil danne, hvis injektionen udføres korrekt.
Bemærk: celle allotransplantater kan udføres i samme musestamme som i de transplanterede celler. For eksempel, hvis de RMS celler oprindeligt blev isoleret fra en C57BL/6 mus, allograft kan udføres i C57BL/6 mus. Hvis stammen er anderledes, bør immundefekt recipient mus udnyttes for at undgå afvisning. Alderen på modtager mus kan også justeres afhængigt af det eksperimentelle mål. - Overvåg musene for tumordannelse en gang om ugen.
Bemærk: for at validere identiteten af tumoren afledt af allograft transplantation, bør det sammenlignes med den oprindelige tumor, hvorfra cellerne blev isoleret. Til dette formål, histologisk analyse for morfologiske egenskaber og ekspression af myogenic markører samt mere omfattende RNAseq kan udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorspheres registrering
Celle isolation blev optimeret for at opnå den maksimale heterogenitet af cellepopulationer til stede i tumorvævet. For det første, da isolerede væv præsenterede morfologisk ulige områder, for at øge chancerne for at isolere ensartede sjældne cellepopulationer, blev prøvetagning udført fra flere områder af tumoren (figur 1a, første panel til venstre). For det andet blev der udført mekanisk dissociation af de høstede prøver, samtidig med at homogeniteten i den hakkede vævs størrelse bevares, på trods af forskellige modstande, der kan have været til stede på tværs af prøverne (figur 1a, tredje og fjerde panel fra venstre ). Afhængigt af udgangsmaterialet (tumor aggressivitet, alder og genotype af mus, tumor placering), genopretning af cellerne fra den mekaniske stress af isolations processen kan variere, spænder fra 3-7 dage (figur 1a, sidste panel til højre). For at øge celle overlevelse og vækst, bør medierne ændres dagen efter isolation og derefter hver 2 dage. Dette vil fjerne snavs og døde celler akkumuleret under isolations processen, der kan påvirke cellelevedygtighed. Tumorsphere formation assay bør starte efter cellerne er blevet urerne mindst én gang for at sikre optimal levedygtighed, når de placeres i suspension kulturer (figur 1b, første panel til venstre). I vores hænder, optimale resultater blev opnået begyndende med celler fra passage 2 (P2) (figur 1c, første og andet panel til venstre). Denne specifikke passage blev valgt efter flere tests. Når p0 celler blev belagt i lav-fastgørelse betingelser, de dannede et lavt antal tumorspheres sammenlignet med senere passager, muligvis på grund af cellulære snavs stadig til stede efter isolation. I senere passager, forskellige mønstre af tumorsphere formation blev observeret og tilskrives udvælgelsen, der opstår efter talrige passager i kulturen. Når forskellige cellelinjer sammenlignes, foreslås det at starte fra samme passage.
Diskrimination mellem tumorspheres og celle klynger er af grundlæggende betydning for kvantificering af analysen. Figur 1c (de sidste to paneler til højre) viser tydeligt de morfologiske forskelle mellem en tumorsphere (venstre) og en celle klynge (højre). Tumorspheres stammer fra en enkelt celle, der har en høj evne til at selv forny og vokse i lav-Attachment betingelser (begge funktioner af TPCs). Faktisk, tumorsphere udvikling indikerer tumorigenicitet potentiale. Denne analyse udføres dog in vitro uafhængigt af de signaler, der stammer fra hele organismen. for at validere cellernes tumorigent potentiale in vivobør der udføres allografiske transplantations forsøg (figur 1d).
Validering af rekombinant proteiner behandling
Før du konfigurerer tumorspheres behandling, bør den optimale koncentration, hvormed det protein af interesse udløser en effekt på tumorceller bestemmes. For at gøre dette er det nødvendigt at vurdere graden af ekspression af proteinets downstream-målgener (figur 2). En litteratursøgning på PubMed blev udført før bestemmelse af målgener til at teste gennem qRT-PCR. I tilfælde af at det er påvist, at det protein, der er af interesse, moduerer forskellige downstream-veje, bør der foretages udvælgelse af flere gener i forbindelse med hver af disse veje. For eksempel, Flt3l (FMS-lignende tyrosinkinase 3) har vist sig at moduere STAT5 signalering i akut myeloid leukæmi, inducerende downstream-ekspression af P21, c-MYC, og CyclinD1 (figur 2)27. Desuden er udtryk for Flt3l påkrævet for dendritiske celler differentiering medierende aktivering af STAT3 signalerings pathway28. For at vurdere STAT3 aktivitet blev Socs3 og CyclinD1 udtryk kontrolleret (figur 2). Analyse af resultaterne viste en dosisafhængig effekt af rekombinant protein behandling på nogle af de testede gener (P21, CyclinD1 og Socs3), mens andre ikke blev påvirket (c-MYC). Det er vigtigt at bestemme downstream-gener, der reagerer på det protein af interesse i den specifikke tumor testet for pålidelig vurdering af behandlingens effektivitet.
Optimering af protokollen for plasmid transfektering
For at etablere en effektiv protokol for plasmid transfektering og yderligere tumorsphere formation analyse, blev virkningerne af transfektering på veddige tumorceller testet (figur 3a). Transfection reagens behandling blev udført efter fabrikantens protokol, og to forskellige mængder af reagenset blev testet. Effektiviteten blev vurderet ved ansættelse af en GFP-reporter plasmid. I vores hænder observerede vi en højere transfektering effektivitet ved hjælp af lavere mængder af reagenset (figur 3a). Faktisk højere koncentrationer føre til øget celledød, starter ved 48 h og bliver mere tydelig efter 72 h fra tidspunktet for transfection. Den samme transfektering protokol var ikke effektiv i celler i suspension, som ophobning af døde celler og cellulære snavs blev tydeligt 24 h efter begyndelsen af behandlingen, hvilket indikerer nedsat cellulære levedygtighed. For at overvinde denne tekniske udfordring blev der anvendt en protokol med to trin: Udfør transfektering på veddige celler, frigør dem 24 timer efter behandlingen, og plade dem i suspension i 7 dage mere. Kontrol tumorspheres var faktisk udtryk for GFP ved afslutningen af forsøget (figur 3b).
Figur 1: tumor celle isolation, tumorsphere afderisering, og transplantation. (A) skematisk gengivelse af afsnit 2 i protokollen (tumor celle isolation). Hvert centralt trin i protokollen opsummeres. (B) skematisk gengivelse af afsnit 3 i protokollen (tumorspheres derisering). Hvert centralt trin i protokollen opsummeres. (C) fra venstre: lyse felt billede af isolerede tumorceller ved passage 2 (P2) ved lav forstørrelse (Scale bar = 50 μm) og høj forstørrelse (skala bar = 50 μm); Bright-felt billede af en tumorsphere afledt af tumorceller efter 30 dage i suspension kultur (Scale bar = 250 μm), og lyse-felt billede af en celle klynge dannet af tumorceller efter 30 dage i suspension kultur (skala bar = 50 μm). D) skematisk gengivelse af afsnit 6 i protokollen (tumorsphere allograft transplantation). Hvert centralt trin i protokollen opsummeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: validering af downstream-målgener til bestemmelse af rekombinant proteinkoncentration. qRT-PCR resultater for vurdering af Flt3l behandling koncentration. To-vejs ANOVA blev udført. Der er vist betydning for sammenligningen med ikke-behandlet kontrol. (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Opsætning af tumorspheres transfektering protokol. A) repræsentative lyse felter og fluorescerende billeder af tumorceller behandlet med lav (top) eller høj (bund) koncentration af transfektering reagens (0,75 μl eller 1,5 μl i 24 brønd plader) (Scale bar = 50 μm). (B) repræsentativt billede af tumorspheres dannet af gfp plasmid-behandlede celler, 7 dage efter plating cellerne i suspension (Scale bar = 50 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder har været anvendt til isolation og karakterisering af TPCs fra tumor heterogene cellepopulationer: tumor clonogenic assays, FACS isolation, og tumorsphere formation assay. Tumor clonogenic assay blev først beskrevet i 1971, anvendes til stamcelle undersøgelser, og først efterfølgende anvendes til kræft biologi29,30. Denne metode er baseret på kræft stamceller iboende egenskab til at ekspandere uden begrænsninger i bløde gels kulturer31. Siden sin udvikling, denne metode har været meget anvendt i kræftforskning til flere formål, herunder tumor celle heterogenitet undersøgelser, effekten af hormonelle behandling på cellevækst, og tumor resistens undersøgelser31. Til dato, denne analyse er stadig ansat til identifikation af tumor initierende celler for flere typer af kræft32.
FACS isolation er baseret på forudgående kendskab til molekylære markører til stede på overfladen af celler på interesse. Det har været meget udnyttet til isolering af TPCs fra både flydende og solide tumorer. For eksempel, den første identifikation af human akut myeloid leukæmi (AML) initierende celler blev udført af Dr. Dick gruppe ved at udnytte FACS fraktionering og transplantation assays baseret på viden om markører til stede på bulk AML celler9. Udnytte en lignende tilgang, Dr. Clarke's gruppe isoleret brystkræft initiere celler3. Tumorsphere formation assay er en anden tilgang, der anvendes til identifikation og undersøgelse af TPCs. Denne metode blev først udviklet til at identificere kræft stamceller fra hjernen tumorer33. Interessant, det blev oprindeligt testet ved hjælp af de samme betingelser kendt for at favorisere neurale stamceller vækst, og dermed favoriserer selvfornyelse ejendom også forbundet med TPCs33. Desuden er tumorsphere formation afhængig af kapaciteten af TPCs til vækst i en forankring-uafhængig måde.
De tre ovenfor beskrevne tilgange kan anvendes parallelt for at øge sandsynligheden for at isolere og molekylært karakterisere TPCs populationer, overvinde begrænsningerne af hver metode. For eksempel, FACS, på trods af at bringe den store fordel ved at isolere ren cellepopulationer, stærkt afhængig af brugen af overflade markører, der endnu ikke er kendt for alle kræfttyper. Således er dens anvendelse begrænset til isolering af TPCs udtrykker kendte markører. Tumor clonogenic og tumorsphere formation assays er begge baseret på cellulære egenskaber, kendt for at være forbundet med TPCs. Begge disse metoder kan anvendes som den første linje af undersøgelser om nye eller endnu ikke har studeret kræft. Desuden kan disse to metoder sikre ekspansion og berigelse af celle populationen af interesse, lette identifikationen af molekylære markører, og giver mulighed for både kræft resistens og Drug screening undersøgelser. I denne sammenhæng, tumorsphere formation assay er mere fordelagtigt, da disse sfæroide strukturer bedre genskabe miljøet til stede i tumor væv (hypoxic områder i midten af sfærer)34. Faktisk, det har været tidligere vist, at 3D-kulturer er mere pålidelige til forudsigelse af narkotika behandlinger resultat34. Tumorspheres kan inddrives efter kultur, og anvendes til allograft eksperimenter: fordøjelsen af Tumorspheres i enkeltceller opløsninger og transplantation til recipient mus vil give mulighed for in vivo vurdering af tumorigent kapacitet af nyligt identificerede Tpc'er, sammenlignet med bulk tumorceller.
For med succes at få en begyndende cellulære materiale repræsentative for tumor heterogenitet, det er afgørende at først udføre tilfældige prøvetagning af vævet. RMS er karakteriseret ved fibrotiske, fede, eller meget velvaskuleret områder, som er klart adskiller sig i isolerede tumorer, således, at opretholde denne cellulære mangfoldighed, indsamling af hvert område af vævet vil være påkrævet. Desuden, at øge chancerne for celler overlevelse under fordøjelsesprocessen, hakning af det indsamlede væv skal resultere i jævnt mellemstore stykker: mindre fragmenter er mere tilbøjelige til at blive over fordøjet inducerende reduktion af cellernes levedygtighed. Dette kan være særligt kedeligt på grund af den mangfoldige morfologi og stivhed af RMS.
Til kvantificering af resultatet af tumorsphere formation assay, er det af afgørende betydning at skelne mellem reelle tumorspheres og cellulære klynger (figur 1c, sidste to paneler til højre). En tumorsphere er solid sfæroide struktur, hvor det ikke er muligt at diskriminere cellen composiiton; i modsætning hertil kan enkeltceller i en celle klynge let diskrimineres. Celle klynger kan ikke antage en afrundet form og er betydeligt mindre i forhold til tumorspheres, hvilket spænder mellem 50-250 μm25.
For at opnå tumorspheres transplantation er opnåelse af en ensartet enkelt celle løsning et vigtigt skridt. I betragtning af den stramme struktur og store størrelse af en tumorsphere, fordøjelsen af cellerne bliver et vigtigt begrænsende trin i forberedelsen af en enkelt cellesuspension, der er yderligere ansat til transplantation. Flere cyklusser af enzymatisk fordøjelse kombineret med mekanisk dissociation er derfor nødvendige for fuldstændig dissociation af tumorspheres. For at bekræfte forløbet af dissociation og et vellykket udfald, skal opløsningen overvåges under et lys-felt mikroskop.
På trods af de mange fordele, som tumorsphere formation assay, tumorspheres har vist sig ikke at stamme fra alle typer af tumor eller fra alle kommercielt tilgængelige cellelinjer. I disse tilfælde kan analysen ikke anvendes som standard for bestemmelse af cellernes tumorigenicitet og kvantificering af TPCs i en heterogen population. En anden begrænsning af denne analyse er forbundet med det faktum, at forskellige tumortyper kræver forskellige vækst og dissociation betingelser; således, det kræver tidskrævende optimering og fejlfinding af begge protokoller for hver tumortype eller cellelinje. Desuden kan fusion af flere tumorspheres forekomme i kulturen, hvilket gør vurderingen af deres størrelser og tal uklar.
På trods af at tumorsphere formation assay tidligere er blevet udnyttet i RMS-undersøgelser, har det hovedsagelig været anvendt til kommercielt tilgængelige RMS cellelinjer til at identificere de molekylære veje involveret i tumordannelse og udvikling18, 20,21. I betragtning af den heterogene vævs sammensætning, de talrige undertyper af tumorer og forskellige udviklingsmæssige sammenhænge, som RMS stammer fra, begrænser ansættelse af RMS-cellelinjer anvendelsen af denne analyse til identifikation af begge oprindelsesceller og udviklingsmæssige signaler, der fører til tumor udvikling in vivo.
Et forsøg på at udvikle en effektiv protokol for tumorsphere derisering, begyndende fra humane sarkom prøver, har tidligere vist dårlige resultater. Tumorspheres blev faktisk udviklet fra kun 10% af prøverne35. Der er således behov for en reproducerbar og pålidelig analyse til isolering af primære RMS-celler og tumorsphere udvikling. Som reaktion på dette behov, den beskrevne tumorsphere formation assay blev optimeret til at være ansat i primær cellekulturer. Udviklingen af denne protokol er det første skridt i retning af at besvare vigtige spørgsmål på området (dvs. hvordan RMS-celler er forskellige afhængigt af den miljømæssige kontekst). Mere detaljeret, beskrevet her er en reproducerbar protokol til isolering af primære tumorceller fra RMS væv, dannelse af tumorspheres, tumorsphere behandling (begge udført med rekombinante proteiner eller over ekspression plasmider), og allograft transplantations eksperimenter.
Konklusionen er, at tumorsphere formation assay er en veletableret og alsidig metode til identifikation af TPCs i forskellige typer af tumorer, berigende cellerne med øget selv fornyelseskapacitet og evnen til at vokse i en forankring-uafhængig Måde. Denne analyse er baseret på funktionelle karakteristika for de cellepopulationer, der undersøges, og ikke på den tidligere viden om molekylære markører; således, det kan anvendes som en sonderende værktøj til en bred vifte af tumorer typer. Desuden, isolering af sjældne cellepopulationer opnået med tumorsphere kulturer gør dette in vitro -assay en ideel platform for kræft dopingtest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, og NIH pilot Grant i NIC Cancer Center support Grant P30CA030199 til A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -H., Yu, C. -C., Wang, B. -Y., Chang, W. -W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
