Summary
इस प्रोटोकॉल माउस rabdomyosarcoma प्राथमिक कोशिकाओं, tumorsphere गठन और उपचार, और allograft प्रत्यारोपण tumorspheres संस्कृतियों से शुरू के अलगाव के लिए एक reproduible विधि का वर्णन करता है.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) बच्चों में सबसे आम नरम ऊतक सार्कोमा है. हालांकि महत्वपूर्ण प्रयासों आरएमएस के साथ जुड़े आम उत्परिवर्तनों की पहचान सक्षम है और विभिन्न RMS subtypes के भेदभाव की अनुमति दी, प्रमुख चुनौतियों अभी भी उपन्यास उपचार के विकास के लिए मौजूद आगे रोग का पूर्वानुमान में सुधार. हालांकि myogenic मार्करों की अभिव्यक्ति से पहचान की, वहाँ अभी भी है कि RMS myogenic या गैर-myogenic मूल है पर महत्वपूर्ण विवाद है, मूल की कोशिका के रूप में अभी भी खराब समझ में आ गया है. वर्तमान अध्ययन में, एक विश्वसनीय विधि माउस RMS के लिए tumorsphere परख के लिए प्रदान की जाती है. परख ट्यूमर कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों पर आधारित है और tumorigenic कार्यों के साथ ट्यूमर में दुर्लभ आबादी की पहचान की अनुमति देता है. इसके अलावा वर्णित पुनः संयोजक प्रोटीन के परीक्षण के लिए प्रक्रियाओं रहे हैं, ट्यूमर के साथ transfection प्रोटोकॉल को एकीकृत परख, और ट्यूमर के विकास और विकास में शामिल उम्मीदवार जीन का मूल्यांकन. आगे बताया गया है कि ट्यूमर के ट्यूमर के प्रत्यारोपण के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में एक प्रक्रिया है जो विवो मेंट्यूमरीजेनिक समारोह को मान्य करती है . कुल मिलाकर, वर्णित विधि विश्वसनीय पहचान और दुर्लभ RMS tumorigenic आबादी है कि विभिन्न संदर्भों में उत्पन्न होने वाले RMS के लिए लागू किया जा सकता है के परीक्षण की अनुमति देता है. अंत में, प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग और चिकित्सकीय के भविष्य के विकास के लिए एक मंच के रूप में उपयोग किया जा सकता है.
Introduction
कैंसर एक विषमांगी बीमारी है; इसके अलावा, ट्यूमर का एक ही प्रकार के विभिन्न रोगियों में विभिन्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों पेश कर सकते हैं, और एक रोगी के भीतर एक ट्यूमर कोशिकाओं की कई आबादी से बना है1. Heterogeneity शुरू करने और कैंसर के प्रचार के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं की पहचान में एक चुनौती प्रस्तुत करता है, लेकिन उनके लक्षण कुशल उपचार के विकास के लिए आवश्यक है. ट्यूमर प्रचार कोशिकाओं की धारणा (टीपीसी), कोशिकाओं की एक दुर्लभ आबादी है कि ट्यूमर के विकास में योगदान, पहले बड़े पैमाने पर2की समीक्षा की गई है. तथ्य यह है कि TPCs कैंसर के कई प्रकार में विशेषता है के बावजूद, उनके विश्वसनीय अलगाव के लिए मार्करों की पहचान कई ट्यूमर प्रकार3,4,5,6 के लिए एक चुनौती बनी हुई है , 7 , 8 , 9. इस प्रकार, एक विधि है कि आणविक मार्करों पर निर्भर नहीं करता है बल्कि टीपीसी कार्यात्मक गुणों पर भरोसा नहीं करता है (उच्च आत्म नवीनीकरण और कम लगाव की स्थिति में विकसित करने की क्षमता), tumorsphere गठन परख के रूप में जाना जाता है, व्यापक रूप से के लिए लागू किया जा सकता अधिकांश ट्यूमर से टीपीसी की पहचान। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परख को टीपीसी के विस्तार के लिए भी नियोजित किया जा सकता है और इस प्रकार सीधे कैंसर दवा स्क्रीनिंग और कैंसर प्रतिरोध1,10पर अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है .
Rabdomyosarcoma (RMS) नरम ऊतक सार्कोमा का एक दुर्लभ रूप है जो छोटे बच्चों में सबसे आम11. Althoug RMS myogenic मार्करों की अभिव्यक्ति के आकलन के माध्यम से histologically पहचान ासाकीय हो सकता है, मूल के आरएमएस सेल को कई ट्यूमर उपप्रकारों और ट्यूमर विकासात्मक उत्तेजनाओं की उच्च विषमता के कारण एकात्मक विशेषता नहीं की गई है। दरअसल, हाल के अध्ययनों के बारे में महत्वपूर्ण वैज्ञानिक चर्चा उत्पन्न की है कि RMS myogenic या गैर-myogenic मूल का है, सुझाव है कि RMS विभिन्न कोशिकाओं के संदर्भ के आधार पर विभिन्न प्रकार से प्राप्त कर सकते हैं12,13, 14 , 15 , 16 , 17आरएमएस सेल लाइनों पर कई अध्ययन ट्यूमर के विकास और अत्यधिक आत्म नवीनीकरण आबादी के साथ जुड़े मार्करों के लक्षण में शामिल रास्ते की पहचान के लिए ट्यूमर मंडल गठन परख को रोजगार प्रदर्शन किया गया है 18 , 19 , 20 , 21|
हालांकि, मूल के RMS कोशिकाओं की पहचान करने के लिए tumorsphere गठन परख की क्षमता के बावजूद, एक विश्वसनीय तरीका है कि प्राथमिक RMS कोशिकाओं पर नियोजित किया जा सकता है अभी तक वर्णित नहीं किया गया है. इस संदर्भ में, हमारे समूह से हाल ही में एक अध्ययन एक Duchenne मांसपेशियों dystrophy (DMD) माउस मॉडल22में मूल के RMS कोशिकाओं की पहचान के लिए एक अनुकूलित tumorsphere गठन परख कार्यरत हैं. एकाधिक पूर्व tumorigenic सेल प्रकार, मांसपेशियों के ऊतकों से अलग, उनकी क्षमता के लिए परीक्षण कर रहे हैं कम लगाव की स्थिति में विकसित करने के लिए, dystrophic संदर्भों में RMS के लिए मूल की कोशिकाओं के रूप में मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं की पहचान की अनुमति. यहाँ वर्णित tumorsphere गठन परख के लिए एक reproduible और विश्वसनीय प्रोटोकॉल है (चित्र 1),जो सफलतापूर्वक अत्यंत दुर्लभ सेल आबादी है कि माउस RMS विकास के लिए जिम्मेदार हैं की पहचान के लिए नियोजित किया गया है.
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Protocol
आवास, उपचार, और चूहों के बलिदान Sanford Burnham Prebys चिकित्सा डिस्कवरी संस्थान की मंजूरी दे दी IACUC प्रोटोकॉल के बाद प्रदर्शन किया गया.
1. अभिकर्मक तैयारी
- सेल अलगाव मीडिया के 100 एमएल तैयार: F10 मध्यम 10% घोड़े सीरम (एचएस) के साथ पूरक.
- कोलैजानाप्रकार II समाधान के 50 एमएल तैयार करें: सेल आइसोलेशन मीडिया के 50 एमएल में कोलैजानेस प्रकार II पाउडर के 1 ग्राम को भंग करें (मीडिया के प्रति 1 एमएल एंजाइम की इकाइयों को नोट करें, क्योंकि इकाइयों की संख्या बहुत के आधार पर बदलती है)। Alicot समाधान और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में दुकान जब तक उपयोग के लिए तैयार है.
नोट: collagenase के हर बहुत उपयोग से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए, एंजाइम गतिविधि के बाद से विभिन्न बहुत सारे भर में बदल सकते हैं. - दूसरा पाचन समाधान के नमूने के प्रति 10 एमएल तैयार करें: कोशिकाओं अलगाव मीडिया के साथ 100 इकाइयों / कोलैजानेस प्रकार द्वितीय समाधान के एमएल और 2 इकाइयों / उपयोग से पहले तुरंत तैयार करें.
- ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया के 500 एमएल तैयार: DMEM उच्च ग्लूकोज 20% FBS और 1% कलम /
- एफएसीएस बफर के 500 एमएल तैयार करें: 1x पीबीएस 2.5% v/v सामान्य बकरी सीरम और 1 एमएम EDTA के साथ पूरक।
- 500 एमएल tumorsphere मीडिया के तैयार: DMEM/F12 1% कलम के साथ पूरक / बस का उपयोग करने से पहले, निम्नलिखित वृद्धि कारक जोड़ें: 1% N2 पूरक, 10 ng/mL EGF, और 10 ng/mL $-FGF.
2. सेल अलगाव और संस्कृति
- कोशिकाओं अलगाव मीडिया के 5 एमएल युक्त एक 10 सेमी प्लेट तैयार करें (ट्यूमर नमूना प्रति एक प्लेट) और ट्यूमर ऊतक फसल के लिए तैयार जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में जगह है।
- आरएमएस को दुचेने पेशीय डिस्ट्रोफी के लिए पुरुष और मादा माउस मॉडल दोनों में सहज रूप से विकसित होने की सूचना मिली है, जैसे बी 10 mdx चूहों की उम्र के लगभग 18 महीने और B6 mdx/mTR चूहों में 9 महीने22,23. माउस है कि isoflurane का उपयोग कर RMS ट्यूमर विकसित करता है, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से या संस्था के IACIC दिशा निर्देशों के अनुसार पशु बलिदान Anesthetize. कैंची के साथ, क्षेत्र में त्वचा पर एक चीरा बनाने के लिए जहां ट्यूमर स्थानीयकृत है, और (चिमटी का उपयोग करके) त्वचा को ब्याज के क्षेत्र से दूर खींचते हैं। एक उस्तरा ब्लेड रोजगार, जानवर से ट्यूमर आबकारी.
- ट्यूमर ऊतक के 500-1,000 मिलीग्राम वजन और यह चरण 2-1 में तैयार प्लेट में जगह(चित्र 1A) .
नोट: ऊतक की बड़ी मात्रा नकारात्मक पाचन चरणों को प्रभावित और समग्र उपज में कमी. काटा ट्यूमर से बड़ा है, तो 1000 मिलीग्राम, यह भागों और नमूना बेतरतीब ढंग से विभाजित जब तक वांछित वजन तक पहुँच गया है। यादृच्छिक नमूना ऊतक विषमता के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है. - बाँझ सेल संस्कृति हुड में ट्यूमर के ऊतकों युक्त प्लेट प्लेस और यह एक उस्तरा ब्लेड के साथ कीमा। आरएमएस से ट्यूमर ऊतक विषमांगी है; इस प्रकार, विभिन्न क्षेत्रों में कटौती के लिए अलग प्रतिरोध पेश कर सकते हैं. सुनिश्चित करें कि परिणामस्वरूप कीमा बनाया टुकड़े के आकार इष्टतम पाचन सुनिश्चित करने के लिए एक समान हैं।
नोट: RMS विभिन्न ऊतक प्रकार के मिश्रण के रूप में मौजूद है (मुख्य रूप से फाइब्रोटिक, संवहनी, और फैटी ऊतकों) कि हर ट्यूमर में पहचाना जा सकता है. 1) को अलग एक विषम कोशिका जनसंख्या सही मूल ट्यूमर की संरचना recapitulating और 2) नहीं अलगाव प्रक्रिया पूर्वाग्रह, काटा ऊतक की यादृच्छिक नमूना प्रदर्शन. ट्यूमर के विभिन्न क्षेत्रों से कोशिकाओं को पचाया जाना चाहिए और खंड 3 में वर्णित परख में इन विट्रो में समानांतर में परीक्षण किया जाना चाहिए। - कीमा बनाया हुआ ऊतक और सेल अलगाव मीडिया को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ले जाएं, प्लेट को 4 एमएल सेल आइसोलेशन मीडिया से धोएं और इसे ट्यूब में रखें।
- ऊतक को पचाने के लिए कोलैडेनेस समाधान की 700 इकाइयां/एमएल जोड़ें और 1.5 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ऊतक को स्पिन करें, गोली को परेशान किए बिना सुपरनेंट को प्रेरित करें, दूसरे पाचन समाधान (डिपेस) के 10 एमएल में गोली को फिर से भर दें, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में इनक्यूबेशन करें।
- एक बार दूसरा पाचन पूरा हो गया है, ऊपर और नीचे pipet और एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 70 डिग्री m नायलॉन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन पारित. फिर फिल्टर धोने और पाचन समाधान को पतला करने के लिए सेल आइसोलेशन मीडिया के 10 एमएल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 300 x g और आरटी पर ऊतक को स्पिन करें।
- supernatant प्रेरित और ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया के 20 एमएल में गोली resuspend. फिर एक 15 सेमी सेल संस्कृति प्लेट में सेल निलंबन हस्तांतरण. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस प्लेट की पहचान P0 के रूप में की जाएगी।
- अलगाव के बाद दिन, मीडिया बदल जाते हैं. यह कदम मलबे और मृत कोशिकाओं को हटाने सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है जो सेल अस्तित्व को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं।
- मीडिया के परिवर्तित होने के बाद सेल संगम का आकलन करें, जो प्रारंभिक सामग्री और सेल आकार की मात्रा के आधार पर 30%-60% से होती है. इनक्यूबेटर में बढ़ रही कोशिकाओं को तब तक छोड़ दें जब तक कि वे 90% संगम तक न पहुंच जाएं। हर दिन कोशिकाओं की निगरानी करें और हर 2 दिन मीडिया बदलें। ट्यूमर कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय confluent बनने के लिए कई मापदंडों के आधार पर बदलता है: ट्यूमर आक्रामकता, ट्यूमर के जीनोटाइप, माउस की उम्र, ऊतक की विषमता.
- सेल पासिंग के लिए, निम्न कार्य करें:
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में सेल टुकड़ी समाधान और ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया पूर्व गर्म।
- 1x बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और 5-10 मिनट के लिए गर्म सेल टुकड़ी समाधान के 10 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- जब सभी कोशिकाओं को प्लेट से अलग कर रहे हैं, गर्म ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया के 10 एमएल जोड़ने के लिए, एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाधान ले जाएँ और स्पिन कोशिकाओं को 300 x g पर नीचे के लिए 5 मिनट RT में.
- ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया के 5-10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित, गोली के आकार के आधार पर, और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए Trypan नीले (1:5 कमजोर पड़ने) का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती.
- प्लेट 10 सेमी प्लेटों में 105 कोशिकाओं या 3 x 105 कोशिकाओं में 15 सेमी प्लेटों. सेल दोहरीकरण समय चरण 2.10 में विस्तृत कारकों के आधार पर भिन्न होता है।
3. ट्यूमर मंडल व्युत्पत्ति
- कई मार्गों के माध्यम से सेल चयन से बचने के लिए मार्ग P1 या P2 पर ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करें (चित्र 1B) . प्लेट से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पहले 1x पीबीएस के साथ पकवान धोने, कोशिकाओं को परेशान किए बिना, फिर उन्हें सेल टुकड़ी समाधान (5 एमएल एक 10 सेमी प्लेट के लिए 10 सेमी प्लेट या 10 एमएल के लिए) का उपयोग करकवर करें और उन्हें 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
- पुष्टि करें कि कोशिकाओं को एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत थाली को देखकर अलग कर रहे हैं, ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया (सेल टुकड़ी समाधान: ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया) की 1:1 मात्रा जोड़ने के लिए, एक centrifuge ट्यूब में सेल निलंबन जगह है और 5 के लिए 300 x ग्राम पर नीचे कोशिकाओं स्पिन आरटी पर मिनट.
- या तो FACS बफर (अनुभाग 3.4) या tumorspheres मीडिया (अनुभाग 3.5) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित, चढ़ाना के लिए इस्तेमाल विधि के अनुसार.
- प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से कोशिकाओं चढ़ाना
- FACS बफर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित (राशि गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. सुनिश्चित करें कि अंतिम सेल सांद्रता 107 कोशिकाओं/एमएल (100 डिग्री सेल्सियस प्रति 106 कोशिकाओं पर एफएसएएस बफर) है। सेल छँटाई के दौरान मृत कोशिकाओं से लाइव भेदभाव करने के लिए प्रति 106 कोशिकाओं पर 1 $L Fx चक्र वायलेट दाग जोड़ें। एक बेदाग नियंत्रण तैयार करें जिसमें कोशिकाओं में Fx Cycle वायलेट दाग नहीं जोड़ा जाता है।
नोट: एकाग्रता छँटाई के दौरान कुशल धुंधला और गति के लिए अनुकूलित है। एक कम सेल एकाग्रता एक लंबे समय तक छँटाई समय में परिणाम होगा, जबकि एक उच्च एकाग्रता धुंधला प्रभावित करेगा. - बेदाग नियंत्रण को रोजगार, मृत (Fx चक्र वायलेट+ )कोशिकाओं से जिंदा (Fx चक्र वायलेट-) अलग एक FACS गेट की स्थापना की। फिर, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (450/50 फिल्टर बैंड पास के साथ) को अलग करने और लाइव/डेड कोशिकाओं की गिनती के लिए और 96 अच्छी तरह से कम-अनुलग्नक प्लेटों के प्रत्येक कुएं में लाइव कोशिकाओं की वांछित संख्या चढ़ाना के लिए रोजगार। थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से छँटाई शुरू करने से पहले tumorspheres मीडिया के 200 $L से भरा जाना चाहिए.
नोट: यह देखते हुए कि TPCs पूरे ट्यूमर के भीतर एक दुर्लभ subpopulation हैं, 100 कोशिकाओं चढ़ाना द्वारा प्रोटोकॉल का अनुकूलन / अच्छी तरह से प्रति सेल संख्या विशिष्ट ट्यूमर परीक्षण के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. - प्रयोग के अंत तक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखें। जब तक आवश्यक न हो प्लेट को परेशान न करें। एक 30 दिन के प्रयोग के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया और विकास कारकों का एक उचित अनुपात हर हफ्ते के साथ मंगाया जाना चाहिए (मीडिया लुप्त हो जाते हैं और विकास कारक 1 सप्ताह के बाद प्रभावी नहीं हैं).
- प्रयोग के पूरा होने के बाद, मैन्युअल रूप से ट्यूमर की पहचान करने के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत प्लेटें स्क्रीन (चरण 3.6 देखें).
नोट: 30 दिनों का एक timepoint आसानी से व्यास के 50-300 डिग्री मीटर से लेकर आकार के माउस RMS tumorspheres का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था. समय बिंदु का परीक्षण ट्यूमर की आक्रामकता और इसकी proliferative दर के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए.
- FACS बफर में कोशिकाओं को पुन: निलंबित (राशि गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. सुनिश्चित करें कि अंतिम सेल सांद्रता 107 कोशिकाओं/एमएल (100 डिग्री सेल्सियस प्रति 106 कोशिकाओं पर एफएसएएस बफर) है। सेल छँटाई के दौरान मृत कोशिकाओं से लाइव भेदभाव करने के लिए प्रति 106 कोशिकाओं पर 1 $L Fx चक्र वायलेट दाग जोड़ें। एक बेदाग नियंत्रण तैयार करें जिसमें कोशिकाओं में Fx Cycle वायलेट दाग नहीं जोड़ा जाता है।
- मैन्युअल रूप से कोशिकाओं चढ़ाना
- tumorsphere मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (राशि गोली पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से trypan नीले (1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती). ट्यूब में सेल एकाग्रता की गणना और एक 96 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट में कोशिकाओं की उचित संख्या थाली. प्रयोग के अंत तक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को रखें। थाली परेशान करने के लिए जब तक मीडिया और विकास कारकों की भरपाई के लिए आवश्यक नहीं की कोशिश करो, के रूप में चरण 3.4.3 में वर्णित.
- प्रयोग के पूरा होने के बाद, एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल रूप से स्क्रीन प्लेटें ट्यूमर की पहचान करने के लिए या Celigo सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, के रूप में पहले Kessel एट अल में वर्णित24 नीचे कदम 3.6 देखें.
- ध्यान दें कि दो अलग readouts इस परख के परिणाम के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है: संख्या और गठन tumorspheres के आकार.
नोट: जब एक से अधिक सेल एक अच्छी तरह से में चढ़ाया जाता है, या तो tumorspheres या सेल समूहों फार्म कर सकते हैं (चित्र 1C, तीसरे और चौथे पैनलों). सेल समूहों छोटे सेलुलर समुच्चय कि निलंबन संस्कृति है कि सेल अस्तित्व को बढ़ाने और एक अनियमित आकार की विशेषता है में फार्म कर रहे हैं. Tumorspheres बड़े होते हैं और एक गोलभॉइड आकार के साथ एक अधिक कॉम्पैक्ट संरचना है। वे एक एकल कोशिका से प्राप्त होते हैं जिसमें लंगर-स्वतंत्र तरीके से जीवित रहने की क्षमता होती है और उच्च दर25पर बढ़ जाता है। प्रवाह cytometer के माध्यम से कोशिकाओं चढ़ाना या मैन्युअल रूप से interchangeably इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रयोगशाला में उपलब्ध क्षमताओं पर निर्भर करता है. इसके अलावा, 96 अच्छी तरह से प्लेटों से अलग आकार के कम संलग्न प्लेटों को रोजगार संभव है और आवश्यक परिणाम पर निर्भर है. वास्तव में, tumorsphere आवृत्ति का आकलन 96 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेटें रोजगार किया जाना चाहिए, जबकि कोशिकाओं tumorigenic क्षमता के आकलन के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग 6 अच्छी तरह से कम संलग्न प्लेटों पर तेजी से और विश्वसनीय परिणाम उपज होगी.
4. रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के साथ Tumorsphere उपचार
- चरण 3.1 और 3.2 दोहराएँ.
- रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के साथ एक उपचार की स्थापना करते हैं, तो पहले निम्नलिखित अनुभाग 4.3 का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा एकाग्रता निर्धारित, या इष्टतम एकाग्रता पहले से निर्धारित किया गया है, तो अनुभाग 4.4 करने के लिए छोड़ दें।
- पुनः संयोजक प्रोटीन उपचार एकाग्रता निर्धारित करें.
- tumorsphere मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (मात्रा गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. एक 6 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट में ट्यूब और प्लेट 100,000 कोशिकाओं में सेल एकाग्रता की गणना. प्रत्येक सांद्रता के अनुसार दो कुओं को प्लेट करें और अनुपचारित नियंत्रण के लिए दो कुएँ (चित्र 2) । प्रोटीन सांद्रता का परीक्षण किया जा करने के लिए साहित्य खोज पर आधारित हैं.
- एक अलग प्रोटीन एकाग्रता के साथ निलंबन कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से इलाज और 48 एच के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं जगह (समय दोनों सेल व्यवहार्यता पर और बहाव लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक) के लिए। उसके बाद, निम्न पैरामीटर का आकलन करें:
- सेल अस्तित्व: एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ ही अनुपचारित नियंत्रण के साथ तुलना का उपयोग कर, सेल आकारिकी की जाँच करें। स्वस्थ कोशिकाओं उज्ज्वल दिखाई देते हैं और माइक्रोस्कोप के नीचे चिंतनशील, जबकि अत्यधिक सेल मौत मीडिया में मलबे के संचय के लिए प्रेरित करेगा. सेल मौत की एक परिमाणात्मक निर्धारण के लिए, Trypan नीले बहिष्करण, क्रिस्टल बैंगनी धुंधला, MTT, या TUNEL परख नियोजित किया जा सकता है (इस मामले में, मूल चढ़ाना के लिए एक अच्छी तरह से जोड़ने).
- डाउनस्ट्रीम रास्ते पर पुनः संयोजक प्रोटीन का प्रभाव: परीक्षण प्रोटीन से प्रभावित होने के लिए जाना जाता downstream जीन की पहचान के लिए PubMed का उपयोग कर एक साहित्य खोज प्रदर्शन करते हैं. लक्ष्य जीनों के लिए क्यूआरटी-पीसीआर प्राइमर डिज़ाइन करें, और उपचारित कोशिकाओं से पृथक आरएनए पर क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण करें (चित्र 2)।
- रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के साथ इलाज.
- tumorsphere मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (मात्रा गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. वांछित प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण (100 कोशिकाओं प्रत्येक अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट के प्रति) और उन्हें उचित tumorsphere मीडिया की मात्रा में पतला. यदि एक से अधिक उपचार प्रदर्शन, अलग सेल ट्यूब तैयार करते हैं.
- रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की उचित एकाग्रता के साथ प्रत्येक ट्यूब का इलाज और 96 अच्छी तरह से कम संलग्न प्लेट की एक अलग अच्छी तरह से कोशिकाओं को प्लेट. उपचार प्रत्येक अच्छी तरह से पुनः संयोजक प्रोटीन के आधे जीवन पर निर्भर करता है जब तक प्रयोग के 30 दिन समापन बिंदु पर दोहराया जाएगा.
- प्रयोग के अंत में, डेटा का विश्लेषण करने के लिए 3.4.4 और 3.6 चरणों का पालन करें.
5. overexpression प्लाज्मिड के साथ Tumorsphere उपचार
- चरण 3.1 और 3.2 दोहराएँ.
- यदि एक नए ट्यूमर प्रकार पर उपचार की स्थापना, पहले निम्नलिखित अनुभाग 5.3 का उपयोग करने के लिए प्लाज्मिड का सबसे अच्छा एकाग्रता निर्धारित, या इष्टतम डीएनए एकाग्रता पहले से निर्धारित किया गया है, अनुभाग 5.4 के लिए छोड़ दें।
- इष्टतम प्लाज्मिड एकाग्रता का निर्धारण करें।
- ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (मात्रा गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. 70%-90% (सेल संख्या सेल आकार और आकारिकी में अत्यधिक निर्भर है) से एक संगम प्राप्त करने के लिए गिना कोशिकाओं प्लेट. GFP-प्लास्मिड अनुयायी कोशिकाओं के लिए transfection अभिकर्मक के निर्माता प्रोटोकॉल के बाद transfection दक्षता का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जाएगा। समांतर में अनुपचारित नियंत्रण का भी परीक्षण किया जाता है (चित्र 3क)। एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक दक्षता परीक्षण प्रदर्शन.
नोट: अनुलग्न कोशिकाओं transfection दक्षता बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है, निलंबन कोशिकाओं पर प्रदर्शन transfection कुशल नहीं है और नकारात्मक सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है के रूप में. - 48 ज transfection निम्नलिखित मापदंडों के लिए कोशिकाओं का आकलन करने के बाद:
- सेल अस्तित्व: एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, प्रत्येक अच्छी तरह से में मौजूद कोशिकाओं की संख्या की तुलना करें और यह इलाज कोशिकाओं को अच्छी तरह से तुलना करें।
- GFP व्यंजक: प्रत्येक कुएं में कक्षों की कुल संख्या में GFP धनात्मक कक्षों का प्रतिशत गिनें (चित्र 3B)।
- ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (मात्रा गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. 70%-90% (सेल संख्या सेल आकार और आकारिकी में अत्यधिक निर्भर है) से एक संगम प्राप्त करने के लिए गिना कोशिकाओं प्लेट. GFP-प्लास्मिड अनुयायी कोशिकाओं के लिए transfection अभिकर्मक के निर्माता प्रोटोकॉल के बाद transfection दक्षता का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जाएगा। समांतर में अनुपचारित नियंत्रण का भी परीक्षण किया जाता है (चित्र 3क)। एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक दक्षता परीक्षण प्रदर्शन.
- overexpression प्लाज्मिड उपचार
- ट्यूमर सेल मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (मात्रा गोली आकार पर निर्भर करता है) और मैन्युअल रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 200,000 कोशिकाओं प्लेट. प्रत्येक अच्छी तरह से एक स्वतंत्र transfection घटना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. प्रत्येक कुएं को विशिष्ट ट्यूमर प्रकार के लिए विकसित किए गए सेट-अप का उपयोग करके ट्रांसफेक्टेड किया जाएगा (चित्र 3क)।
- transfection के बाद 24 ज, 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोने और गर्म सेल टुकड़ी समाधान में कोशिकाओं को इनक्यूबेट (अच्छी तरह से कवर करने के लिए). खंड 2ण्15 में विस्तृत कारकों के आधार पर प्लेट को 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
- जब कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, प्रत्येक एक अच्छी तरह से स्वतंत्र रूप से Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर से व्युत्पन्न कोशिकाओं की गिनती. एक 6 अच्छी तरह से कम लगाव प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 100,000 कोशिकाओं प्लेस, विभिन्न कुओं से व्युत्पन्न कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित नहीं कर रही है. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्लेट रखें और एक सप्ताह के लिए अबाधित छोड़ दें।
नोट: इस परख की अवधि 7 दिन है, ट्यूमर संलयन को रोकने के दौरान ट्यूमर के गठन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय है। Tumorsphere संलयन एक घटना है कि स्पष्ट हो जाता है जब 100,000 या अधिक कोशिकाओं को एक साथ निलंबन में 1 सप्ताह के लिए चढ़ाया जाता है, जो tumorsphere गठन की क्षमता के आकलन पूर्वाग्रह कर सकते हैं. इस घटना में कि प्रयोग लंबे समय तक ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है, सेल घनत्व समायोजित किया जाना चाहिए या polymeric पाड़ tumorsphere संलयन26से बचने के लिए इस्तेमाल किया. - प्रयोग के अंत में, डेटा का विश्लेषण करने के लिए 3.5.2 और 3.6 चरणों का पालन करें.
6. एलोग्रैफ्ट प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमरस्फीयर तैयारी
- बर्फ पर एक्स्ट्रासेल्यूलर मैट्रिक्स (ईसीएम) समाधान (50 डिग्री एल प्रति एलोग्रैफ्ट) और ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया (50 डिग्री एल प्रति एलोग्रैफ्ट) को बर्फ पर रखें।
- ट्यूमर मंडलों एलोग्रैफ्ट प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक 15 एमएल या 50 एमएल ट्यूब (मीडिया की कुल मात्रा के अनुसार)(चित्र 1D)में एक विशिष्ट सेल प्रकार या उपचार से प्राप्त सभी tumorspheres एक साथ खींचो। RT में 5 मिनट के लिए 300 x g पर नीचे tumorspheres स्पिन. tumorspheres पर supernatant निकालें और बाँझ 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ उन्हें धो लो.
- RT में 5 मिनट के लिए 300 x g पर फिर से ट्यूमर को स्पिन करें, 1x पीबीएस को प्रेरित करें, और सेल गोली के शीर्ष पर सेल टुकड़ी समाधान के 1 एमएल में 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, जो वियोजन प्रक्रिया शुरू करता है। पाचन समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में ट्यूमर इनक्यूबेट करें और हर 10 मिनट में पाचन की प्रगति की जांच करें। एक एकल सेल समाधान में tumorspheres वियोजन में मदद करने के लिए, यांत्रिक विघटन के लिए कोशिकाओं को ऊपर और नीचे pippette. पाचन प्रक्रिया में 30 मिनट तक का समय लग सकता है।
नोट: इस तथ्य के बावजूद कि ऊष्मायन समय काफी भिन्न होता है जब ट्यूमर मंडल विभिन्न प्राथमिक आरएमएस कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, पाचन समय के संबंध में सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी कभी नहीं देखी गई थी। - जब एक एकल सेल समाधान प्राप्त किया जाता है, ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया (1:1, सेल टुकड़ी समाधान: ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया) की एक मात्रा जोड़ें और यह 300 x g पर नीचे स्पिन के लिए 5 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस.
नोट: पर इस समय से, सभी चरणों बर्फ पर प्रदर्शन किया जा करने की जरूरत है. कताई के बाद, tumorspheres एकल कोशिकाओं समाधान के रूप में एक स्थिर गोली फार्म नहीं है. सुनिश्चित करें कि दूर या tumorspheres aspirate नहीं करने के लिए, एक 1 एमएल पाइपेट का उपयोग करें और धीरे से तरल aspirate. केवल 1 एमएल रहता है जब एक 200 $L pipette करने के लिए ले जाएँ। - ठंडे ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (मात्रा गोली आकार पर निर्भर करेगा), बर्फ पर कोशिकाओं जगह है और Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं गिनती. allograft के लिए उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की उचित मात्रा का निर्धारण करने के बाद, उन्हें ठंड ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया के 50 डिग्री एल की कुल मात्रा में resuspend. ठंड ट्यूमर कोशिकाओं मीडिया में एक पिपेट टिप शांत. जब टिप ठंडा हो जाए, तो इसका उपयोग ईसीएम विलयन के 50 डिग्री सेल्सियस को लें और इसे कोशिकाओं वाली नली में जोड़ें। इस प्रक्रिया के दौरान बर्फ से ट्यूब ों को न निकालें।
नोट: प्रत्यारोपण के लिए उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की संख्या ट्यूमर परीक्षण और प्रयोगात्मक लक्ष्य के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए: प्रत्यारोपित कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या ट्यूमर विकास के समय में कमी होगी (माउस RMS tumorspheres से 20,000 कोशिकाओं को दिखाया गया है इंजेक्शन के 6 सप्ताह बाद ट्यूमर में विकसित करना। विभिन्न सेल लाइनों या विभिन्न उपचार की तुलना करने में सक्षम होने के लिए, यह कोशिकाओं की एक ही संख्या से शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है. - के रूप में कोशिकाओं को अब प्रत्यारोपण के लिए तैयार हैं, इंजेक्शन तक बर्फ पर बनाए रखें. बर्फ पर एक 29 जी सुई के साथ एक छाया हुआ 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज प्लेस, आकांक्षा पर ठोस बनने से सेल समाधान को रोकने के लिए.
- प्रवाहमापी को 200 एमएल/मिनट ऑक्सीजन पर चालू करें तथा इसोफ्लुरेन वाष्पित्र को 2.5% तक चालू करें। एक 2 महीने पुराने पुरुष NOD / SCID माउस यह प्रेरण कक्ष के अंदर रखकर एनेस्थेटाइज करें। 2-3 मिनट रुको जब तक माउस सो प्रकट होता है और प्रजनन धीमा हो गया है. प्रक्रिया शुरू करने से पहले, पहले एक पैर चुटकी के माध्यम से पुष्टि करें कि माउस सो रहा है, फिर आंखों पर पशु मरहम लागू करें। जानवर के दाईं ओर दाढ़ी, पूर्व ठंडा सिरिंज में सेल समाधान aspirate, और उन्हें मुंडा क्षेत्र में subcutaneously सुई. इंजेक्शन सही ढंग से किया जाता है, तो त्वचा के नीचे एक दृश्य टक्कर के रूप में होगा।
नोट: सेल allografts प्रतिरोपित कोशिकाओं की है कि के रूप में एक ही माउस तनाव में किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, RMS कक्ष मूल रूप से C57BL/6 माउस से अलग किए गए थे, तो allograft C57BL/6 चूहों में किया जा सकता है। यदि तनाव अलग है, तो इम्यूनोडेफिडेफिकेश प्राप्तकर्ता चूहों को अस्वीकृति से बचने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। प्राप्तकर्ता चूहों की उम्र भी प्रयोगात्मक लक्ष्य के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. - सप्ताह में एक बार ट्यूमर गठन के लिए चूहों की निगरानी करें।
नोट: allograft प्रत्यारोपण से व्युत्पन्न ट्यूमर की पहचान को मान्य करने के लिए, यह मूल ट्यूमर जिसमें से कोशिकाओं को अलग किया गया करने के लिए तुलना की जानी चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, आकृतिक सुविधाओं और myogenic मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अधिक व्यापक RNAseQ प्रदर्शन किया जा सकता है.
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Representative Results
ट्यूमरकाईका पता लगाने
कोशिका अलगाव ट्यूमर ऊतक में मौजूद सेल आबादी की अधिकतम विषमता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। सबसे पहले, के बाद से अलग ऊतकों morphologically भिन्न क्षेत्रों प्रस्तुत, वर्दी दुर्लभ सेल आबादी अलग करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, नमूना ट्यूमर के कई क्षेत्रों से किया गया था (चित्र 1A,बाईं ओर पहला पैनल). दूसरा, काटा नमूनों की यांत्रिक वियोजन किया गया था, जबकि कीमा बनाया ऊतक आकार में एकरूपता बनाए रखने, विभिन्न प्रतिरोध है कि नमूने भर में मौजूद हो सकता है के बावजूद (चित्र 1A, बाएं से तीसरे और चौथे पैनल ). प्रारंभिक सामग्री (ट्यूमर आक्रामकता, उम्र और माउस के जीनोटाइप, ट्यूमर स्थान) के आधार पर, अलगाव प्रक्रिया के यांत्रिक तनाव से कोशिकाओं की वसूली भिन्न हो सकती है, 3-7 दिनों से लेकर(चित्र 1A,दाईं ओर अंतिम पैनल)। सेल अस्तित्व और विकास को बढ़ाने के लिए, मीडिया अलगाव के बाद दिन और फिर हर 2 दिन बदल जाना चाहिए. यह अलगाव प्रक्रिया है कि सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है के दौरान जमा मलबे और मृत कोशिकाओं को हटा देगा. ट्यूमर मंडल गठन परख के बाद कोशिकाओं को कम से कम एक बार पारित किया गया है जब निलंबन संस्कृतियों में रखा इष्टतम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए शुरू किया जाना चाहिए (चित्र 1B, बाईं ओर पहला पैनल). हमारे हाथों में, इष्टतम परिणाम मार्ग 2 (P2) से कोशिकाओं के साथ शुरू प्राप्त किए गए (चित्र 1C, बाईं ओर पहले और दूसरे पैनल). इस विशिष्ट मार्ग कई परीक्षण के बाद चुना गया था. जब P0 कोशिकाओं को कम संलग्न स्थितियों में चढ़ाया गया था, वे बाद में मार्ग की तुलना में tumorspheres की एक कम संख्या का गठन, संभवतः सेलुलर मलबे के कारण अभी भी अलगाव के बाद मौजूद. बाद के मार्ग में, tumorsphere गठन के विभिन्न पैटर्न मनाया गया और चयन है कि संस्कृति में कई अंश के बाद होता है के लिए जिम्मेदार ठहराया. जब विभिन्न सेल लाइनों की तुलना कर रहे हैं, यह एक ही मार्ग से शुरू करने के लिए सुझाव दिया है.
tumorspheres और सेल समूहों के बीच भेदभाव परख के परिमाणीकरण के लिए मौलिक महत्व का है. चित्र 1C (दाएं पर पिछले दो पैनलों) स्पष्ट रूप से एक tumorsphere (बाएं) और एक सेल क्लस्टर (दाएं) के बीच आकृति विज्ञान मतभेद से पता चलता है. Tumorspheres एक एकल सेल है कि स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए एक उच्च क्षमता है और कम लगाव की स्थिति में विकसित (TPCs के दोनों सुविधाओं) से प्राप्त. वास्तव में, tumorsphere विकास tumorigenicity क्षमता इंगित करता है. हालांकि, इस परख पूरे जीव से प्राप्त संकेतों से स्वतंत्र रूप से इन विट्रो में किया जाता है; इस प्रकार, विवो मेंकोशिकाओं की ट्यूमरीजनक्षमता को मान्य करने के लिए, एलोग्रैफ्ट्स प्रत्यारोपण प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए (चित्र 1D)।
रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उपचार का सत्यापन
tumorspheres उपचार की स्थापना से पहले, इष्टतम एकाग्रता जिस पर ब्याज का प्रोटीन ट्यूमर कोशिकाओं पर एक प्रभाव से चलाता है निर्धारित किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए प्रोटीन के डाउनस्ट्रीम टारगेट जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन आवश्यक है(चित्र 2)। PubMed पर एक साहित्य खोज लक्ष्य जीन निर्धारित करने के लिए QRT-पीसीआर के माध्यम से परीक्षण करने से पहले किया गया था. घटना में है कि ब्याज की प्रोटीन अलग बहाव रास्ते modulate करने के लिए दिखाया गया है, इन रास्ते में से प्रत्येक के साथ जुड़े कई जीन का चयन किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, Flt3l (Fms की तरह tyrosine kinase 3) घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया में STAT5 संकेत नगम को मॉड्युलेट करने के लिए दिखाया गया है, p21 के बहाव अभिव्यक्ति को प्रेरित, सी-माइक, और CyclinD1 (चित्रा 2)27. इसके अलावा, Flt3l की अभिव्यक्ति डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं भेदभाव STAT3 संकेतन मार्ग28के सक्रियण मध्यस्थता के लिए आवश्यक है। STAT3 गतिविधि का आकलन करने के लिए, Socs3 और CyclinD1 अभिव्यक्ति की जाँच की गई(चित्र 2) . परिणामों के विश्लेषण परीक्षण जीन में से कुछ पर पुनः संयोजक प्रोटीन उपचार की एक खुराक निर्भर प्रभाव दिखाया (p21, CyclinD1, और Socs3), जबकि दूसरों को प्रभावित नहीं थे (c-Myc). यह उपचार प्रभावशीलता के विश्वसनीय आकलन के लिए परीक्षण विशिष्ट ट्यूमर में ब्याज की प्रोटीन के लिए उत्तरदायी downstream जीन निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
प्लाज्मिड ट्रांसफेक्शन के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन
प्लाज्मिड ट्रांसफेक्शन और आगे ट्यूमरस्फीयर गठन परख के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए, अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं पर ट्रांसफेक्शन के प्रभाव का परीक्षण किया गया (चित्र 3क)। Transfection अभिकर्मक उपचार निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद किया गया था, और अभिकर्मक के दो अलग अलग मात्रा में परीक्षण किया गया। दक्षता का मूल्यांकन एक जीएफपी रिपोर्टर प्लाज्मिड को रोजगार देते हुए किया गया था। हमारे हाथों में, हमने अभिकर्मक की कम मात्रा का उपयोग करते हुए उच्च संक्रमण दक्षता देखी (चित्र 3क)। वास्तव में उच्च सांद्रता वृद्धि हुई सेल मौत के लिए नेतृत्व, 48 एच से शुरू करने और transfection के समय से 72 एच के बाद अधिक स्पष्ट होता जा रहा है. एक ही transfection प्रोटोकॉल निलंबन में कोशिकाओं में कुशल नहीं था, मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे के संचय के रूप में स्पष्ट हो गया 24 एच उपचार की शुरुआत के बाद, कम सेलुलर व्यवहार्यता का संकेत. इस तकनीकी चुनौती को दूर करने के लिए, एक दो कदम प्रोटोकॉल कार्यरत था: अनुयायी कोशिकाओं पर transfection प्रदर्शन, उन्हें 24 एच उपचार के बाद अलग, और उन्हें 7 और दिनों के लिए निलंबन में थाली. नियंत्रण ट्यूमर वास्तव में प्रयोग के अंत में GFP व्यक्त कर रहे थे (चित्र 3B) .
चित्रा 1: ट्यूमर सेल अलगाव, tumorsphere व्युत्पत्ति, और प्रत्यारोपण. (ए) प्रोटोकॉल (ट्यूमर सेल अलगाव) की धारा 2 के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल के प्रत्येक कुंजी चरण संक्षेप है. (बी) प्रोटोकॉल (tumorspheres व्युत्पत्ति) की धारा 3 के Schematic प्रतिनिधित्व. प्रोटोकॉल के प्रत्येक कुंजी चरण संक्षेप है. (C) बाएं से: मार्ग 2 (च्2) पर पृथक ट्यूमर कोशिकाओं की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि कम आवर्धन (स्केल बार र् 50 उ) और उच्च आवर्धन (स्केल बार र् 50 उ); निलंबन संस्कृति में 30 दिनों के बाद ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न ट्यूमर के उज्ज्वल क्षेत्र छवि (स्केल बार - 250 डिग्री मी), और निलंबन संस्कृति में 30 दिनों के बाद ट्यूमर कोशिकाओं से गठित एक सेल क्लस्टर के उज्ज्वल क्षेत्र छवि (स्केल बार ] 50 डिग्री मी)। (डी) प्रोटोकॉल (ट्यूमरस्फीयर एलोग्रेफ्ट ट्रांसप्लांटेशन) की धारा 6 का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल के प्रत्येक कुंजी चरण संक्षेप है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: रिकॉमबिनेंट प्रोटीन सांद्रता के निर्धारण के लिए डाउनस्ट्रीम लक्ष्य जीनों का सत्यापन। Flt3l उपचार एकाग्रता के आकलन के लिए क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम। दो तरह से ANOVA प्रदर्शन किया गया था. महत्व गैर-उपचारित नियंत्रण के साथ तुलना के लिए दिखाया गया है। (*p और lt; 0.05; **p और lt; 0.01; **p और lt; 0.001; n ] 3). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: tumorspheres transfection प्रोटोकॉल की स्थापना की. (क) कम (ऊपर) या उच्च (नीचे) ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक की एकाग्रता के साथ इलाज किया ट्यूमर कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों के प्रतिनिधि (0.75 डिग्री सेल्सियस या 24 अच्छी तरह से प्लेटों में 1.5 $L) (स्केल बार $ 50 $m)। (बी) GFP प्लाज्मिड-उपचार कोशिकाओं से बने tumorspheres के प्रतिनिधि छवि, निलंबन में कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 7 दिन (स्केल बार $ 50 डिग्री मी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
कई तरीकों अलगाव और ट्यूमर विषम कोशिका आबादी से TPCs की विशेषता के लिए नियोजित किया गया है: ट्यूमर clonogenic परख, FACS अलगाव, और ट्यूमर मंडल गठन परख. ट्यूमर क्लोनोजेनिक परख पहले 1971 में वर्णित किया गया था, स्टेम सेल के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया, और केवल बाद में कैंसर जीव विज्ञान के लिए लागू29,30. इस विधि के कैंसर स्टेम कोशिकाओं आंतरिक संपत्ति पर आधारित है नरम जैल संस्कृतियों31में बाधाओं के बिना विस्तार करने के लिए . इसके विकास के बाद से, इस विधि व्यापक रूप से कई प्रयोजनों के लिए कैंसर अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है, ट्यूमर सेल विषमता अध्ययन सहित, सेल के विकास पर हार्मोनल उपचार के प्रभाव, और ट्यूमर प्रतिरोध अध्ययन31. तारीख करने के लिए, इस परख अभी भी कैंसर के कई प्रकार के लिए कोशिकाओं की शुरुआत ट्यूमर की पहचान के लिए कार्यरत है32.
FACS अलगाव ब्याज पर कोशिकाओं की सतह पर मौजूद आणविक मार्करों के पूर्व ज्ञान पर आधारित है. यह व्यापक रूप से दोनों तरल और ठोस ट्यूमर से TPCs के अलगाव के लिए उपयोग किया गया है. उदाहरण के लिए, मानव घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया की पहली पहचान (एएमएल) कोशिकाओं की शुरुआत थोक एएमएल कोशिकाओं9पर मौजूद मार्करों के ज्ञान के आधार पर FACS भिन्नीकरण और प्रत्यारोपण परख का उपयोग करके डॉ डिक के समूह द्वारा किया गया था। इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग, डॉ क्लार्क के समूह अलग स्तन कैंसर की शुरुआत कोशिकाओं3. Tumorsphere गठन परख एक अलग TPCs की पहचान और अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता दृष्टिकोण है. इस विधि को सबसे पहले ब्रेन ट्यूमर33से कैंसर स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था . दिलचस्प है, यह शुरू में एक ही तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विकास के पक्ष में जाना जाता शर्तों का उपयोग कर परीक्षण किया गया था, इस प्रकार स्वयं नवीनीकरण संपत्ति भी TPCs33के साथ जुड़े पक्ष. इसके अलावा, tumorsphere गठन एक लंगर स्वतंत्र तरीके से विकास के लिए TPCs की क्षमता पर निर्भर करता है.
ऊपर वर्णित तीन दृष्टिकोण को अलग करने की संभावना को बढ़ाने के लिए समानांतर में इस्तेमाल किया जा सकता है और आणविक TPCs आबादी की विशेषता, प्रत्येक विधि की सीमाओं पर काबू पाने. उदाहरण के लिए, FACS, शुद्ध सेल आबादी अलग करने के महान लाभ लाने के बावजूद, दृढ़ता से सतह मार्करों है कि अभी तक सभी प्रकार के कैंसर के लिए नहीं जाना जाता है के उपयोग पर निर्भर करता है. इस प्रकार, इसका उपयोग ज्ञात मार्करों व्यक्त TPCs के अलगाव तक ही सीमित है. ट्यूमर क्लोनोजेनिक और tumorsphere गठन परख दोनों सेलुलर गुणों पर आधारित हैं, TPCs के साथ जुड़े होने के लिए जाना जाता है. इन दोनों तरीकों को नए या अभी तक नहीं अध्ययन कैंसर पर अध्ययन की पहली पंक्ति के रूप में नियोजित किया जा सकता है. इसके अलावा, इन दो तरीकों के विस्तार और ब्याज की सेल आबादी के संवर्धन सुनिश्चित कर सकते हैं, आणविक मार्करों की पहचान की सुविधा, और दोनों कैंसर प्रतिरोध और दवा स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए अनुमति. इस संदर्भ में, ट्यूमर मंडल गठन परख अधिक फायदेमंद है, क्योंकि इन स्फीरॉइड संरचनाओं बेहतर ट्यूमर ऊतकों में मौजूद पर्यावरण विश्राम (क्षेत्रों के केंद्र में hypoxic क्षेत्रों)34. वास्तव में, यह पहले से पता चला है कि 3 डी संस्कृतियों दवा उपचार परिणाम34की भविष्यवाणी के लिए और अधिक विश्वसनीय हैं. Tumorspheres संस्कृति के बाद बरामद किया जा सकता है, और allograft प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया: एकल कोशिकाओं समाधान में tumorspheres के पाचन और प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपण के लिए नए के tumorigenic क्षमता के vivo मूल्यांकन में के लिए अनुमति देगा की पहचान TPCs, थोक ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में.
सफलतापूर्वक ट्यूमर विषमता के एक प्रारंभिक सेलुलर सामग्री प्रतिनिधि प्राप्त करने के लिए, यह पहले ऊतक के यादृच्छिक नमूना प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है. RMS फाइब्रोटिक, फैटी, या अत्यधिक संवहनी क्षेत्रों जो स्पष्ट रूप से अलग ट्यूमर में भेद कर रहे हैं द्वारा विशेषता है, इस प्रकार, इस सेलुलर विविधता को बनाए रखने के लिए, ऊतक के प्रत्येक क्षेत्र के संग्रह की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, पाचन प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के अस्तित्व की संभावना को बढ़ाने के लिए, एकत्र किए गए ऊतक के खनन के परिणामस्वरूप समान आकार के टुकड़े की आवश्यकता होती है: छोटे टुकड़ों को कोशिकाओं की व्यवहार्यता में कमी को अधिक पचाने की संभावना होती है। यह आरएमएस की विविध आकृति विज्ञान और कठोरता के कारण विशेष रूप से थकाऊ हो सकता है।
tumorsphere गठन परख के परिणाम के परिमाण के लिए, यह महत्वपूर्ण महत्व का है असली tumorspheres और सेलुलर समूहों के बीच अंतर (चित्र 1C, सही पर पिछले दो पैनलों). एक tumorsphere ठोस गोलाभ संरचना है जिसमें यह सेल composiiton भेदभाव करने के लिए संभव नहीं है; इसके विपरीत, एक सेल क्लस्टर में, एकल कोशिकाओं को आसानी से भेदभाव किया जा सकता है. सेल क्लस्टर एक गोल आकार ग्रहण नहीं कर सकते हैं और ट्यूमर मंडलों की तुलना में काफी छोटे हैं, जो 50-250 डिग्री25के बीच सीमा.
tumorspheres प्रत्यारोपण को प्राप्त करने के लिए, एक समान एकल कोशिकाओं समाधान प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. दरअसल, तंग संरचना और एक tumorsphere के बड़े आकार को देखते हुए, कोशिकाओं के पाचन एक एकल सेल निलंबन है कि आगे प्रत्यारोपण के लिए कार्यरत है की तैयारी में एक प्रमुख सीमित कदम बन जाता है. एंजाइमी पाचन के एकाधिक चक्र यांत्रिक वियोजन के साथ संयुक्त इस प्रकार tumorspheres के पूर्ण वियोजन के लिए आवश्यक हैं. वियोजन की प्रगति और एक सफल परिणाम की पुष्टि करने के लिए, समाधान एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत नजर रखी जानी चाहिए।
tumorsphere गठन परख द्वारा प्रदान की कई फायदे के बावजूद, tumorspheres ट्यूमर के हर प्रकार से या सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों से उत्पन्न करने के लिए नहीं दिखाया गया है. इन मामलों में, परख एक विषम आबादी के भीतर सेल tumorigenicity और TPCs के परिमाण का निर्धारण करने के लिए मानक के रूप में नियोजित नहीं किया जा सकता है. इस परख का एक और सीमा तथ्य यह है कि विभिन्न ट्यूमर प्रकार अलग बढ़ रही है और वियोजन की स्थिति की आवश्यकता के साथ जुड़ा हुआ है; इस प्रकार, यह समय लेने वाली अनुकूलन और प्रत्येक ट्यूमर प्रकार या सेल लाइन के लिए दोनों प्रोटोकॉल के समस्या निवारण की आवश्यकता है. इसके अलावा, कई tumorspheres के संलयन संस्कृति में हो सकता है, उनके आकार और संख्या अस्पष्ट का आकलन कर रही है.
तथ्य यह है कि tumorsphere गठन परख पहले RMS अध्ययन में उपयोग किया गया है के बावजूद, यह मुख्य रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध RMS सेल लाइनों के लिए लागू किया गया है ट्यूमर गठन और विकास में शामिल आणविक रास्ते की पहचान18, 20,21. विषम ऊतक संरचना को देखते हुए, ट्यूमर के कई उपप्रकार और विविध विकासात्मक संदर्भों जिसमें से आरएमएस उत्पन्न होता है, आरएमएस सेल लाइनों के रोजगार मूल के दोनों कोशिकाओं की पहचान के लिए इस परख के आवेदन को सीमित करता है और विकास संकेत है कि विवो मेंट्यूमर के विकास के लिए नेतृत्व |
एक प्रयास tumorsphere व्युत्पत्ति के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए, मानव सार्कोमा नमूने से शुरू, पहले खराब परिणाम दिखाया गया है. वास्तव में, tumorspheres नमूने35के केवल 10% से विकसित किए गए थे. इस प्रकार, प्राथमिक RMS कोशिकाओं और tumorsphere विकास के अलगाव के लिए एक reproduible और विश्वसनीय परख के लिए एक की जरूरत है. इस जरूरत के जवाब में, वर्णित tumorsphere गठन परख प्राथमिक सेल संस्कृतियों में नियोजित किया जा करने के लिए अनुकूलित किया गया था. इस प्रोटोकॉल के विकास के क्षेत्र में प्रमुख सवालों का जवाब देने की दिशा में पहला कदम है (यानी, कैसे मूल के RMS कोशिकाओं पर्यावरण के संदर्भ के आधार पर अलग). अधिक विस्तार में, यहाँ वर्णित RMS ऊतकों से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक reproduible प्रोटोकॉल है, tumorspheres के गठन, tumorsphere उपचार (दोनों रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या overexpression प्लाज्मिड के साथ प्रदर्शन), और allograft प्रत्यारोपण प्रयोगों.
अंत में, tumorsphere गठन परख ट्यूमर के विभिन्न प्रकार में TPCs की पहचान के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और बहुमुखी विधि है, वृद्धि हुई आत्म नवीनीकरण क्षमता और एक लंगर स्वतंत्र में विकसित करने की क्षमता के साथ कोशिकाओं को समृद्ध तरीके. यह परख कोशिका आबादी का अध्ययन किया जा रहा है और आणविक मार्करों के पिछले ज्ञान पर नहीं की कार्यात्मक विशेषताओं पर आधारित है; इस प्रकार, यह ट्यूमर प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक खोजउपकरण उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, tumorsphere संस्कृतियों के साथ हासिल दुर्लभ सेल आबादी के अलगाव इस इन विट्रो परख कैंसर दवा परीक्षण के लिए एक आदर्श मंच बनाता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम एलिसन मेडिकल फाउंडेशन अनुदान एजी-एनएस-0843-11 द्वारा समर्थित किया गया था, और एनसीआई कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30CA030199 के भीतर NIH पायलट अनुदान ए एस करने के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin - Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
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