Summary
Beskrevet her er en forenklet standard driftsprosedyre for mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering og analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige verktøy. Denne protokollen vil hjelpe forskere som er nye til mikrobiomet feltet så vel som de som krever oppdateringer på metoder for å oppnå bakteriell profilering på en høyere oppløsning.
Abstract
Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier som støtter fysiologiske funksjoner som mat metabolisme, energihøsting, og regulering av immunsystemet. Forstyrrelsene av sunne gut mikrobiomet har blitt foreslått å spille en rolle i utviklingen av inflammatoriske sykdommer, inkludert multippel sklerose (MS). Miljømessige og genetiske faktorer kan påvirke sammensetningen av mikrobiomet; Derfor identifisering av mikrobielle samfunn knyttet til en sykdom fenotype har blitt det første skrittet mot å definere mikrobiomet rolle i helse og sykdom. Bruk av 16S rRNA metagenomic sekvensering for profilering bakteriell samfunnet har bidratt i fremmarsj mikrobiomet forskning. Til tross for bred bruk, er det ingen enhetlig protokoll for 16S rRNA-baserte taksonomisk profilering analyse. En annen begrensning er det lav resolution av taksonomisk vervet på grunn av teknisk vanskeligheter som mindre sekvensering leser, likeledes idet bruk av bare videresende (R1) leser inne det final analyse på grunn av lav kvalitet av det omvendte (R2) leser. Det er behov for en forenklet metode med høy oppløsning for å karakterisere bakteriell mangfold i en gitt biospecimen. Fremskritt i sekvensering teknologi med evnen til sekvensen lengre leser i høy oppløsning har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene. Present sekvensering teknologi kombinert med en offentlig tilgjengelig metagenomic analyse rørledning som R-basert splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) har bidratt til å fremme mikrobiell profilering ved høy oppløsning, som DADA2 kan tildele sekvens på slekten og arter nivåer. Beskrevet her er en guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen av 16S rRNA genet, etterfulgt av analyse ved hjelp av fritt tilgjengelige analyseverktøy (dvs. DADA2, Phyloseq, og METAGENassist). Det antas at denne enkle og komplette arbeidsflyten vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.
Introduction
Bakterieflora refererer til en samling av mikroorganismer (bakterier, virus, Archaea, bacteriophages, og sopp) som lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til den kollektive Genova av bosatt mikroorganismer. Som bakterier er en av de mest tallrike mikrober hos mennesker og mus, denne studien er fokusert bare på bakteriell profilering. Den menneskelige gut er kolonisert av billioner av bakterier og hundrevis av bakterielle stammer1. Den normale gut bakterieflora spiller en viktig rolle i å opprettholde en sunn tilstand i verten ved å regulere funksjoner (dvs. vedlikehold av en intakt intestinal barriere, mat metabolisme, energi homeostase, hemming av kolonisering av patogene organismer, og regulering av immunresponser)2,3,4,5. Forstyrrelser av tarmen bakterieflora (gut dysbiosis) har vært knyttet til en rekke menneskelige sykdommer, inkludert gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, hjerneslag9, kreft10, diabetes8,11, revmatoid artritt12, allergi13, og sentrale nervesystemet-relaterte sykdommer som multippel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sykdom (AD)8,16. Derfor, i de senere årene, har det vært økende interesse for verktøy for å identifisere bakteriell sammensetning på ulike kroppens nettsteder. En pålitelig metode bør ha egenskaper som å være høy gjennomstrømming og lett å bruke, har evnen til å klassifisere bakteriell bakterieflora med høy oppløsning, og å være lave kostnader.
Kultur-baserte mikrobiologisk teknikker er ikke følsomme nok til å identifisere og karakterisere den komplekse gut mikrobiomet på grunn av svikt i flere tarmbakterier å vokse i kultur. Advent av sekvensering-basert teknologi, spesielt 16S rRNA-baserte metagenomic sekvensering, har overvunnet noen av disse utfordringene og forvandlet mikrobiomet forskning17. Avansert 16S rRNA-baserte sekvensering teknologi har bidratt i å etablere en kritisk rolle for tarmen mikrobiomet i menneskers helse. The Human Mikrobiomet Project, en National Institutes of Health initiativ18, og MetaHIT prosjektet (et europeisk initiativ)19 har begge bidratt i å etablere en grunnleggende rammeverk for mikrobiomet analyse. Disse initiativene hjalp kick-starte flere studier for å bestemme hvilken rolle tarmen mikrobiomet i menneskers helse og sykdom.
En rekke grupper har vist gut dysbiosis hos pasienter med inflammatoriske sykdommer12,14,15,20,21,22. Til tross for tilværelse vidt anvendt for taksonomisk profilering på grunn av evnen å multiplex og lav omkostningene, der er nei uniform protokoller for 16S rRNA-basert taksonomisk profilering. En annen begrensning er den lave oppløsningen av taksonomisk oppdrag på grunn av mindre sekvensering leser (150 BP eller 250 BP) og bruk av bare fremover sekvensering lese (R1) på grunn av lav kvalitet omvendt sekvensering leser (R2). Men fremskritt i sekvensering teknologi har bidratt til å overvinne noen av disse utfordringene, for eksempel muligheten til å sekvens lenger leser bruker sammenkoblet-end leser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nåværende sekvensering teknologien kan sekvensen 600 BP god kvalitet leser, som tillater sammenslåing av R1 og R2 leser. Disse fusjonerte lenger R1 og R2 leser tillate bedre taksonomisk oppgaver, spesielt med Open-Access R-baserte splittende Amplicon denoising Algorithm-2 (DADA2) plattform. DADA2 bruker amplicon-baserte tilordninger i stedet for taksonomisk-tilordninger (OTU) basert på 97% likhet som brukes av QIIME23. ASV-kamper resulterer i en eksakt sekvens kamp i databasen innen 1 – 2 nukleotider, noe som fører til oppdrag på slekten og Arts nivå. Dermed har kombinasjonen av lengre, god kvalitet sammenkoblet-end leser og bedre taksonomisk oppdrag verktøy (for eksempel DADA2) forvandlet mikrobiomet studier.
Forutsatt her er en steg-for-steg guide for å utføre bakteriell profilering ved hjelp av to-trinns forsterkning av v3-v4 regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjelp av DADA2, Phyloseq, og METAGENassist rørledninger. For denne studien, Human leukocytter antigen (HLA) klasse II transgene mus brukes, som enkelte HLA klasse II alleler er koblet med en predisposisjon for autoimmune sykdommer som MS20,24,25. Men betydningen av HLA klasse II gener i å regulere sammensetningen av gut bakterieflora er ukjent. Det er hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekylet vil påvirke gut mikrobiell samfunnet ved å velge for spesifikke bakterier. Major histocompatibility Complex (MHC) klasse II knockout mus (AE. ko) eller mus uttrykker menneskelige HLA-DQ8 molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 ble brukt for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i forme tarmen mikrobielle samfunnet. Det antas at denne komplette og forenklede arbeidsflyten med R-baserte dataanalyse vil tjene som et utmerket verktøy for forskere interessert i å utføre mikrobiomet profilering studier.
Generering av mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgene mus med en C57BL/6J bakgrunn har blitt beskrevet tidligere26. Avføringsprøver er samlet fra mus av begge kjønn (8 – 12 ukers alder). Mus ble tidligere avlet og vedlikeholdt i University of Iowa dyr anlegget i henhold til NIH og institusjonelle retningslinjer. Forurensning kontroll strategier som avvenning av mus inne i en laminær Flow kabinett, endring av hansker mellom ulike stammer av mus, og riktig vedlikehold av mus er kritiske skritt for profilering av gut mikrobiomet.
Riktig personlig verneutstyr (PPE) anbefales sterkt under hele prosedyren. Passende negativ kontroller bør inkluderes når du utfører DNA-isolasjon, PCR1 og PCR2 forsterkning, og sekvensering trinn. Bruk av sterile, DNase frie, RNase frie og pyrogene forsyninger anbefales. Utpekte pipettehjelper for mikrobiomet arbeid og filtrerte pipette tips bør brukes gjennom hele protokollen. Bakterieflora analyse består av sju trinn: 1) avføringsprøve samling og prosessering; 2) utvinning av DNA; 3) 16S rRNA gen forsterkning; 4) DNA bibliotek konstruksjon ved hjelp av indeksert PCR; 5) opprydding og kvantifisering av indeksert PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og sekvens analyse. Et skjematisk diagram over alle protokoll trinnene er vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Iowa.
1. avførings sample innsamling og håndtering
- Sterilisere skille boksene (se tabell over materialer, supplerende figur 1) med 70% etanol.
- Forhånds etikett mikrosentrifugen rør (én per mus) med eksempel-ID og behandlingsgruppe (hvis aktuelt).
- Plasser musene i sterilisert skille bokser og la dem defekt normalt i opptil 1 time.
- Samle avførings pellets i en tom, pre-merket 1,5 mL mikrosentrifugen tube ved hjelp av sterile tang og Lukk røret sikkert. Sterilisere pinsett etter innsamling fra hver mus.
- Plasser mikrosentrifugen røret som inneholder avførings pellets i en-80 ° c fryser til videre behandling.
Merk: Skille boksene er fordelaktige fordi de tillater samtidig innsamling av avføringsprøver fra flere mus (opptil 12) på en gang.
2. ekstraksjon av DNA
- Fjern avførings prøvene (mus eller menneske) fra fryseren og Tin ved romtemperatur (RT).
Merk: Det er tilrådelig å tine menneskelige avføringsprøver over natten ved 4 ° c etter behov for å samle 200 mg eller det nødvendige beløpet fra lager prøver. - Bruk 200 mg av Start materialer og eluere DNA til et endelig volum på 50 μL.
- Inkluder en DNA-isolasjon Kit blank der ingen avføringsprøven er lagt til, men er behandlet gjennom alle DNA utvinning trinn.
Merk: En bestemt DNA isolasjons sett (se tabell over materialer) ble brukt, fordi den inneholder spesifikke reagenser for å fjerne hemme materialer som biosolids, ufordøyd plantemateriale, og måltema forbindelser fra lysert røde blodlegemer tilstede i menneske og mus krakk Prøver. - Plasser perle røret i en homogenisator (se tabell over materialer) og homogenisere prøvene for 45 s ved RT og en hastighet på 4,5 m/s.
Merk: Bead-vibrerende homogenisator fra enhver produsent kan brukes. Men, det anbefales å standardisere metoden, spesielt hastigheten og varigheten av homogenisering, når du bruker perle-juling homogenisator fra en annen leverandør. - Isoler DNA fra individuelle mus avføringsprøver ved hjelp av en bakteriell DNA isolasjons sett etter produsentens protokoll (se tabell over materialer) med mindre modifikasjoner. Kvantifisere det isolerte DNA ved å laste 1 μL av DNA på en fluorimeter eller på den høye følsomheten elektroforese chip (se tabell over materialer).
Merk: Den forventede utbytte av DNA kan variere fra 500-2500 ng når du starter med 200 mg av avføring prøven. - Juster konsentrasjonen av DNA til 4 – 20 ng/μL ved hjelp av eluering buffer. Requantify DNA (som gjort i trinn 2,5) før du går videre til 16S rRNA gen forsterkning (PCR1), hvis PCR1 ikke utføres på samme dag.
3.16S rRNA Gene forsterkning (PCR1)
- Sett opp 16S rRNA gen forsterkning (PCR1) i en 96 brønn PCR plate med et 25 μL reaksjons volum.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette legger du til 12,5 μL av 2x Hi-Fi polymerase enzym blanding inkludert buffer, i tillegg til dNTPs (se tabell over materialer): 40 ng av DNA i opptil 10,5 μL total volum (Juster det totale volumet med PCR-grade vann): 1 μL (hver) av forover og omvendt grunning ved 1 μM konsentrasjon.
Merk: Sekvenser av primere er som følger:
Forward primer = 5 '-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' omvendt primer = 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. Inkluder et sett som er tomt fra trinn 2,3 (sett reagens kontroll) i PCR-platen. - Forsegle PCR-platen og sentrifuge ved 1 000 x g ved 20 ° c i 1 min i en bordplate sentrifuge (se tabell over materialer) og utføre PCR i en termisk cycler som er programmert for: 95 ° c i 3 min; 25 sykluser på 1) 95 ° c i 30 s, 2) 55 ° c i 30 s, 3) 72 ° c for 30 s; siste utvidelse ved 72 ° c i 5 min; og hold ved 4 ° c.
Merk: Selv om denne 16S rRNA gen forsterknings metoden skal fungere med ulike typer biospecimens, anbefales det å standardisere antall forsterknings sykluser når du starter et nytt prosjekt. - Bekreft størrelsen på PCR1 produkt ved å laste 1 μL av DNA på en høy følsomhet elektroforese chip. Alternativt kan du kjøre 5 μL av 16S rRNA-forsterket produkt på en 1,5% agarose gel for å bekrefte 550 BP av PCR1 produktet.
Merk: Rensing av 16S rRNA forsterket produkt er valgfritt og avhenger av DNA isolasjons settet/metoden som brukes. Hvis du bruker en in-House DNA isolasjons metode, PCR1 produktet kan rengjøres utnytte en mikrobiomet DNA rensing kit som per produsentens protokoll (se tabell over materialer). DNA-isolasjons settet som brukes her, gir et ultrarent DNA og krever ikke rensing av PCR1-produktet.
4. DNA bibliotek Construction bruke indeksert PCR (PCR2)
-
Plasser index 1 og index 2 Barcoded primere i en spesiell rack (se tabell over materialer) for 96 biblioteker.
- Ordne index 1 primer i kolonne 1-12 og index 2 primer i rader A-H av den spesielle rack.
- Tilsett 2,5 μL av indeks 1 i kolonne 1 – 12 og index 2 primer i rader A – H ved hjelp av flerkanals pipetter. Plasser den nye hetten (se tabell av materialer) på index 1 og index 2 adoptert primere og oppbevar den i en-20 ° c fryser.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette legger du til 12,5 μL av 2x High Fidelity polymerase enzym blanding som inneholder en buffer, i tillegg til dNTPs (se tabell over materialer); 5 μL av PCR-grade vann og 2,5 μL av 16S rRNA-forsterket produkt.
Merk: Legg til unike indekser i hvert utvalg for multipleksing av mer enn 96 biblioteker i én enkelt kjøring, som beskrevet i Kiernan et al.27. Den nåværende protokollen bruker adaptere fra et kommersielt sett (for eksempel Nextera XT index Kit) i henhold til produsentens instruksjon i metoden 16S metagenomics sekvensering (for eksempel Illumina). - Forsegle og sentrifuger den indekserte PCR-platen ved 1 000 x g ved 20 ° c i 1 min og utføre PCR i en termisk cycler programmert for: 95 ° c i 3 min; 8 sykluser på 1) 95 ° c i 30 s, 2) 55 ° c i 30 s, 3) 72 ° c for 30 s; og endelig forlengelse ved 72 ° c i 5 min.
- Bekreft 630 grunn størrelse for det indekserte PCR-produktet ved å laste 1 μL av DNA på en høy følsomhet elektroforese chip. Alternativt kan du kjøre 5 μL av indeksert PCR-produkt på en 1,5% agarose gel for å bekrefte størrelsen og intensiteten på produktet.
5. opprydding av indeksert PCR (PCR2) og kvantifisering
- Pool 5 μL av PCR2-amplicon som bruker flerkanals Pipetter fra hver brønn i et flerkanals reservoar brett uten synlig DNase, RNase, humant DNA og Pyrogen-bakterier (se tabell over materialer).
- Overfør det grupperte produktet fra beholderen for flere kanaler inn i en tom, forhånds merket 1,5 mL mikrosentrifugen tube og Vortex for å mikse.
- Rens PCR2 produkt ved hjelp av standard magnetiske perler Kit (se tabell over materialer) i henhold til produsentens instruksjon. Forsegle og lagre de resterende 20 μL av PCR2 i samme plate ved-80 ° c for videre bruk, om nødvendig.
- Forbered fersk 80% etanol ved å tilsette 4 mL 100% etanol til 1 mL PCR grade vann.
- Likevekt magnet perlen til RT og Vortex for 30 s for å spre perlene jevnt.
- Vortex kort og spinne ned de samlede PCR2 amplicon prøvene.
- Tilsett 80 μL av magnetiske perler i en pre-merket, steril 1,5 mL mikrosentrifugen rør med 80 μL av sammenslåtte PCR-produkter, deretter Vortex og spinner ned kort for å jevnt resuspend magnetiske perler.
- Ruge innholdet på RT uten å forstyrre rørene i 15 minutter.
- Plasser røret med DNA og magnetiske perler på et magnetisk stativ (se tabell over materialer) i 5 min.
- Fjern og kast 150 μL av supernatanten forsiktig.
- Tilsett 200 μL av ferskt tilberedte 80% etanol uten å forstyrre perlene og ruge i 30 s.
- Fjern forsiktig og kast alle supernatanten.
- Gjenta trinn 5.11 – 5.12. Fjern gjenværende volum med en P10-pipette. La perlene lufttørke i 15 minutter, med indeksen PCR-slangen igjen på det magnetiske stativet.
- Fjern fra det magnetiske stativet. Tilsett 33 μL av eluering buffer (eluering buffer i DNA-settet er akseptabelt). Vortex godt, og utføre et raskt spinn for å fjerne eventuell gjenværende væske på siden. Ruge for 2 min og plasser på det magnetiske stativet i 5 min.
- Overfør 30 μL av supernatanten (rene PCR-produkter) til en forhånds merket 1,5 mL mikrosentrifugen slange.
- Kvantifisere renset bassenget ved å laste 1 μL av renset bassenget på en fluorimeter eller høy følsomhet elektroforese chip, da dette vil være nødvendig under sekvensering. Utfør MiSeq som beskrevet nedenfor.
6. MiSeq sekvensering
- Opprett et eksempel ark som inneholder prøve spesifikk strekkodeinformasjon for metagenomics arbeidsflyt og demultiplexing på MiSeq-instrumentet (se tabell over materialer). Last opp dette eksempel arket til programvaren (for eksempel Illumina Experiment Manager).
- Fortynne de grupperte bibliotekene fra trinn 5,15 til 4 nM.
- Denaturere grupperte biblioteker ved å kombinere 5 μL av bibliotek utvalget på 4 nM med 5 μL av ferskt tilberedte 0,2 M NaOH i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Vortex kort for å mikse, sentrifuge kort og ruge i 5 minutter ved ambient RT.
- Tilsett 990 μL av iskald hybridisering buffer (HB-buffer) og Pipetter forsiktig for å blande. Dette vil gi en 20 pM biblioteket.
- Kombiner 2 μL av kontroll biblioteket på 10 nM med 3 μL av EBT-buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, med 0,1% mellom 20) for å gi et kontroll bibliotek på 4 nM. Tilsett 5 μL av ferskt tilberedte 0,2 N NaOH og Vortex kort for å blande. Ruge i 5 minutter ved RT.
-
Tilsett 990 μL iskald hybridisering buffer (HB-buffer) og Pipetter forsiktig for å blande. Dette vil gi 20 pM kontroll biblioteker.
Merk: denaturert 20 pM kontroll biblioteker kan oppbevares ved-20 ° c opp til 4 uker. Etter 4 uker har klynge tallene en tendens til å avta.- Kombiner 210 μL av 20 pM-biblioteket med 40 μL av 20 pM kontroll bibliotek (endelig konsentrasjon = ~ 18%), og tilsett 350 μL av HB buffer. Last biblioteket på en endelig konsentrasjon på 7 pM.
Merk: Inn datadetaljer bør justeres som per kjøre ytelse.
- Kombiner 210 μL av 20 pM-biblioteket med 40 μL av 20 pM kontroll bibliotek (endelig konsentrasjon = ~ 18%), og tilsett 350 μL av HB buffer. Last biblioteket på en endelig konsentrasjon på 7 pM.
- Ruge prøver for 2 min ved 96 ° c. Sett på isen i 5 min. Last 600 μL av det siste bassenget i riktig brønn på MiSeq-kassettene.
Merk: Avsnitt 6 ovenfor kan utføres ved genomisk/DNA kjerne anlegg.
7. data behandling og sekvens analyse
- Bruk R-programvare (versjon 3,5) for DADA2 databehandling og analyser. For trinn 7.1 – 7.4 bruker du programvaren for åpen tilgang, som beskrevet i den tidligere utviklede DADA2-opplæringen, som du finner på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >.
Merk: En lett brukbare R-skript er vedlagt som en tilleggsfil 2, og brukere må endre navnet og kilden til sekvensering filer (f. eks, SAMPLENAME_R1_001. FASTQ og SAMPLENAME_R2_001. fastq). - Visualiser kvalitet profiler av forover og bakover leser ved hjelp av plotQualityProfile kommandoen.
- Trim nukleotider fra forover og bakover leser basert på kvaliteten tomten. Disse parameterne er angitt av parameteren truncLen i DADA2.
Merk: Her er 280 brukt som lengde terskelen som videre leser vil bli forkastet, og 260 brukes som lengde terskelen som omvendt leser vil bli forkastet. - Behandle rå 16S data som fastq filer av DADA2 rørledningen som beskrevet i den elektroniske opplæringen (finnes på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >) til å fusjonere R1 og R2 leser og form amplicon sekvens varianter (ASVs), som deretter brukes til å tildele med Silva referansedatabasen23.
Merk: en sample amplicon sekvens variant tabell som er generert fra DADA2-pipeline er inkludert som tilleggsfil 3. Enten en Greengene eller Silva referansedatabase kan brukes, da ingen forskjeller i bakteriell klassifisering ble funnet ved hjelp av en av disse databasene. - Generer en brukerdefinert tilordningsfil som inneholder metadataene (dvs. genotype, kjønn, behandling osv.) for hver prøve. Et eksempel på en metadata-fil er inkludert som tilleggsfil 4.
- Beregn Alpha mangfold (Shannon Index) og beta mangfold ved hjelp av Principal koordinater analyse (PCA) basert på rarefied OTU teller med Phyloseq28 som beskrevet i online opplæring, fant på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >.
- Utfør følgende analyse i METAGENassist29.
Merk: Utfør differensial overflod analyse ved hjelp av Wilcoxon rang-sum test på slekten nivå. Varme kart og differensielt rike dyr er fremhevet ved hjelp METAGENassist29, en offentlig tilgjengelig og web-basert analyse rørledning.- Last opp taksonomisk overflod tabellen (CSV-format) og velg prøver i kolonnen.
- Last opp Tilordningsfilen (CSV-format), og velg eksempler på rad.
- Velg Alternativer for å fjerne variabler med over 50% nuller, og Utelat ikke-tilordnede og tilordnet leser.
- Velg Alternativer for å normalisere rader etter sum og logg normalisere kolonner.
- Lag en vulkan, PCA, eller PLSDA tomten ved å klikke på samme i venstre kolonne og klikk Fjern eksempler navn for å gjøre grafen.
- Utfør en t-test (hvis bare to grupper) eller Anova (hvis større enn to grupper) for å visualisere funksjoner (bakterier) som varierer mellom grupper. Klikk valgte funksjoner for å visualisere bestemte bakterier som er forskjellige fra grupper.
- Klikk på Dendrogram eller varme kart for å opprette respektive plott. Ytterligere analyse, for eksempel prøve visualisering av grupper eller t-test/Anova-baserte topp 25-funksjoner, kan utføres.
- Klikk på RandomForest for å lage grafer som viser funksjoner som kan brukes til klassifisering. Klikk kategorien varians øverst for å opprette grafer for de beste funksjonene som er forskjellige mellom/blant grupper. Klikk på funksjonsdetaljer for å se en liste over bakterier som er forskjellige blant gruppene, og klikk på hver bakterie for å lage et grafisk sammendrag av det samme.
- Klikk kategorien avvikende øverst for å visualisere eksempler som er outliers.
- Til slutt, falle i staver dataoverføre og velge enten den ene eller den andre av 1) en zip arkiv inneholder alle analyse utført eller 2) det ønsket vise egenskaper å dataoverføre. Denne filen bør lagres som et unikt navn og må pakkes før bruk.
Merk: For detaljerte statistiske tester utført under mikrobiomet analyse, se verkene til Chen et al. og Hugerth et al.14,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som MHC klasse II molekyler (HLA hos mennesker) er sentrale aktører i adaptive immunrespons og vise sterke assosiasjoner med en predisposisjon for MS24,25,26, var det hypotetisk gjennomsnitt at HLA klasse II molekyl ville påvirke gut mikrobiell komposisjon. Derfor mus mangler MHC klasse II genet (AE. KO) eller uttrykke menneskelige HLA-DQ8 genet (HLA-DQ8) ble benyttet for å forstå viktigheten av HLA klasse II molekyler i utformingen av tarmen mikrobielle samfunnet.
Avføringsprøver ble samlet fra AE. KO (n = 16) og HLA-DQ8 (n = 12) transgene mus, bakteriell DNA ble ekstrahert, og v3-v4-regionen i 16S rRNA-genet ble forsterket. Amplicon størrelse (550 BP) ble bekreftet ved å kjøre prøvene på en 1,5% agarose gel (figur 2a, Lanes 1–6). Ytterligere bekreftelse av 16S rRNA amplicon størrelse (550 BP) ble utført ved lasting 1 μL av PCR1 produktet på en høy følsomhet elektroforese chip (figur 2b, Lanes 1–7).
En elektroferogrammet ble generert fra 16S rRNA PCR produkt, som viste peak regioner med fragmenter størrelse ~ 550 BP (figur 2C). Doble indekser og sekvensering adaptere ble vedlagt ved hjelp av indekserte PCR (PCR2) som tilordnet en unik identitet til hver prøve og tillatte multipleksing av mange eksempler i en enkelt MiSeq-sekvensering kjøres. Bekreftelse av indeksert PCR ble utført av agarose gel elektroforese (figur 2a, Lanes 7–12) og en høy følsomhet elektroforese chip (figur 2b, Lanes 8–12), figur 2D]. Alle prøvene fra PCR2 ble samlet, renset, og lastet opp på en neste generasjons Sequencer som ga frem R1 og omvendt R2 leser av god kvalitet (Figur 3). Median innhentet leser etter kvalitets filtrering og trimming var 88 125 (utvalg av 9597 – 111848).
Community økologi analyse ble utført ved hjelp av DADA2 analyse rørledning og visualisere med Phyloseq og METAGENassist å demonstrere forskjeller i Alpha mangfold (Figur 4) og beta mangfold (figur 5), samt forskjeller på arter og Arts nivåer mellom grupper. DADA2 analyse genererte en overflod tabell med komma-separerte-verdier i CSV-format, som ble brukt for videre nedstrøms analyse ved hjelp av en Web-basert plattform (dvs. Phyloseq og/eller METAGENassist). Analyse av alfa-og beta mangfoldet ble utført basert på brukerdefinerte kategorier som er oppført i en tilordningsfil.
Shannon mangfold analyse avdekket en generell lavere Alpha mangfold for AE. KO mus sammenlignet med HLA-DQ8 transgene mus (Figur 3). Ordinasjon med analyse av hoved koordinater viste en distinkt romlig klynge mellom AE. KO mus og HLA-DQ8 transgene mus (figur 5). En overflod bord fra DADA2 ble også brukt til å utføre en omfattende metagenomic analyse ved hjelp av åpen tilgang til programvare METAGENassist29. Heat kart-basert Clustering av bakteriell overflod (slekten nivå) (figur 6a) og en boks tomten for bestemte bakterier som viser forskjellene mellom to grupper (figur 6b) ble generert utnytte en METAGENassist rørledning.
Heat kart analyse viste at enkelte bakterier som Allobacullum, Desufovibrio, og Rikenella var mer rikelig i HLA-DQ8 transgene mus. I kontrast var Biolophila mer rikelig i AE. ko mus (figur 6b). Relativ forekomster av individuelle bakterier (Bilophila og Rikenella) vises i en representativ boks plot (figur 6b). I alt viser dataene at AE. KO-mus har et distinkt mikrobiell samfunn sammenlignet med HLA-DQ8 transgene mus, med et fravær av spesifikke bakterier i AE. KO mus. Dataene tyder også på at MHC klasse II molekyler spiller en viktig rolle i overflod av visse bakterier. Oppsummert vil denne enkle og detaljerte protokollen hjelpe forskere som er nye til mikrobiomet feltet samt de som trenger oppdateringer på metoder for å oppnå høyere taksonomisk oppløsning.
Figur 1: Flow diagram av gut mikrobiomet sekvensering. Alle trinnene i den mikrobiomet sekvensering (Sample samling til mikrobiomet dataanalyse) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:16S rRNA gen forsterkning og kvalitetskontroll analyse av v3-v4-regionen. (A) representant agarose gel elektroforese bilde av 16S AMPLICON (PCR1, størrelse 550 BP) og indeksert PCR (PCR2, størrelse = 630 BP) fra AE. ko mus (Lanes 1 – 3 og 7 – 9) og HLA-DQ8 transgene mus (felt 4 – 6 og 10 – 12). (B) representativt gel bilde av 16S AMPLICON (PCR1, størrelse = 550 BP) og indekserte PCR (PCR2, størrelse = 630 BP) av AE. ko mus (Lanes 1 – 3 og 8 – 10) og HLA-DQ8 transgene mus (felt 4 – 7 og 11 – 12) løst ved elektroforese. (C) representative Elektroferogrammet av 16S AMPLICON (PCR1) viste en topp-regionen inneholder fragmenter som var størrelse ~ 550 BP. (D) REPRESENTATIVE elektroferogrammet av indekserte PCR (PCR2) viste en topp-regionen bestående av fragmenter størrelse ~ 630 BP. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kvalitets profil for videre lesning (R1, topp) for to representative prøver og tilsvarende omvendte lyder (R2, bunn) for de samme prøvene. Analysen ble utført ved hjelp av en DADA2 rørledning, der x-aksen viser lese lengde (0 – 300 baser) og y-aksen viser kvaliteten på leser. Grønn linje representerer median kvalitetspoeng, mens den oransje linjen representerer kvartiler av kvalitetspoeng fordelingen ved hver base posisjon. Forward leser (R1) alltid viste bedre kvalitet enn omvendt leser (R2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: alpha mangfold tiltak (Shannon mangfold) av AE. ko mus og HLA-DQ8 transgene mus. Hver prikk representerer α-mangfoldet (Shannon mangfold) i en prøve fra en enkelt mus. Shannon mangfold var generelt lavere for AE. KO mus sammenlignet med HLA-DQ8 transgene mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ordinasjon med delvis minst kvadrater-basert dimensjons analyse plott. Plottet viser et klart skille mellom AE. KO mus og HLA-DQ8 transgene mus. Hver prikk representerer bakteriell sammensetning i et utvalg, og prikkete solformørkelser indikerer 80% tillit intervaller. PLS-DA tomter ble generert ved hjelp METAGENassist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: AE. ko-mus som viser distinkt mikrobiell samfunn sammenlignet med HLA-DQ8 transgene mus, med et fravær av spesifikke bakterier i AE. ko mus. (A) varme kart kombinert med agglomerative hierarkisk Clustering viser den relative overflod av bakterier (slekten nivå). (B) Box Plot viser en normalisert relativ overflod av to representative bakterier (Bilophila og RIKENELLA) i AE. ko og HLA-DQ8 transgene mus. Begge tomter ble generert ved hjelp METAGENassist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: representative bilde av deleboksen for innsamling av avføringsprøver fra flere mus om gangen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 2: DADA2 R-script for generering overflod tabellen fra rå sekvenser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Representative slekten overflod tabell (CSV-format). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Representativ tilordningsfil (CSV-format). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokollen er enkel, med lett-å-følge trinn for å utføre mikrobiomet profilering bruker 16S rRNA metagenomic sekvensering fra et stort antall biospecimens av interesse. Neste generasjons sekvensering har transformert mikrobiell økologi studier, spesielt i Human og pre-klinisk sykdom modeller31,32. Den største fordelen med denne teknikken er dens evne til å lykkes analysere komplekse mikrobielle komposisjoner (culturable og ikke-culturable mikrober) i en gitt biospecimen på et høyt gjennomstrømmingsnivå og til en lav kostnad32. Imidlertid er flere faktorer (dvs. batch effekter, utvalg av primere for 16S rRNA genet, og sekvens dataanalyse) fortsatt et stort hinder i utbredt bruk av denne teknologien.
Avansert 16S rRNA-baserte MiSeq sekvensering teknologier (2x300bp)33 tillate sekvensering av ~ 600 nukleotider ut av 1 500 nukleotid-lange 16S rRNA genet av bakterier, som overvant den tidligere flaskehalsen av korte sekvensering leser. Primere spesifikk for en annen region av rRNA som v1-v2, v3-v5, eller v6-v9 kan brukes med hver region-spesifikke primere viser noen bias for over-eller under-deteksjon av bestemte dyr34,35. Noen grupper foretrekker v1-v2 regionen21, som viser en økt bias for underdetection , men for enkelte Bacteroidetes arter. Andre grupper foretrekker i motsetning v4-, v3-v4-og v3-v5-regionene, som viser den minst partisk klassifiseringen av bakterielle dyr som er15,20,36,37.
Den nåværende protokollen bruker primere spesifikk for v3-v4 regioner av 16S rRNA genet, som det dekker lengre regionen 16S rRNA med to hypervariable regioner (v3 og v4) sammenlignet med v4 alene. I tillegg tillater v3-v4 spesifikke amplicon sammenslåing av både fremover (R1) og Reverse (R2) leser, noe som fører til bedre oppløsning av bakteriell klassifisering. Til tross for det v3-v5 område skaffer lengere leser og dekker flere hypervariable områder (v3, v4, og V5), det er en utfordrende å møtes R1 og R2 leser på grunn av nei/liten overlappe områder imellom R1 og R2 leser. Derfor har en rekke studier brukt data bare fra R1 leser for bakteriell klassifisering når du utfører 16S rRNA metagenomic sekvensering bruker v3-v5 region14.
Riktig biospecimen lagring og håndtering er avgjørende for mikrobiomet analyse for å hindre nedbrytning av bakteriell DNA eller miljøforurensning38. Langtidsoppbevaring av biospecimen ved RT eller 4 ° c kan føre til overvekst av visse bakterier eller sopp. Prøvene kan enten fryses umiddelbart eller transporteres ved 4 ° c (i 1 – 3 dager), deretter frosset. Biospecimen kan også lagres direkte i konserveringsmidler som nukleinsyre syre stabiliserings løsning (f.eks. RNA-senere), 95% etanol eller et kommersielt lagringssett. Den generelle konsensus er at en av disse lagrings metodene ikke forårsaker signifikante forskjeller i bakterielle fellesskaps profiler39,40. Selv om en løsning med konserveringsmidler tillater lagring og transport på RT, kan ikke disse prøvene brukes til RNA-baserte analyser, metabolitten-analyser eller eksperimenter med avføring. Disse spørsmålene har vært diskutert i detalj andre steder39,40.
En av de kritiske trinnene i denne protokollen er bruk av en perle-juling-basert metode for mekanisk forstyrrelse av gram-positive bakterier og Archaea. En tidligere studie viste høyest bakteriell mangfold ved hjelp av bead-juling-basert metode i forhold til andre metoder for cellelyse41. En ufullstendig bakteriell lyse eller forurensning under DNA-ekstraksjon kan innføre skjevhet i tarmen mikrobiomet data42. Et annet viktig poeng å vurdere er forurensning på grunn av laboratoriereagenser inkludert i kits kalt kitome43,44,45. Prøver med stor biomasse og rikt bakterie mangfold som jord eller avføring viser mindre av disse problemene sammenlignet med prøver med lavere biomasse som hud. Derfor bør en vann avsugs kontroll inkluderes med hver ekstraksjon og behandles med andre prøver for å identifisere innføringen av potensiell forurensning på grunn av DNA-ekstraksjon43,44,45.
I mikrobiomet analyse kan mangfoldet i et utvalg måles med Alpha-mangfold, et mål på rikdom av arter, eller beta mangfold, som anslår dissimilarities mellom prøver/grupper. Populære metoder for måling av α-mangfoldet inkluderer UniFrac (vektet og unweighted) kombinert med multivariabel statistiske teknikker som hoved koordinat analyse (PCoA) eller Brey-Curtis dissimilarity. Mens UniFrac er basert på Fylogenetiske avstander, Brey-Curtis dissimilarity analyse utnytter bakteriell overflod for generering tomter. I dybden beskrivelser om α-og β-mangfoldet iare diskutert andre steder30,46,47. En rekke statistiske metoder kan utnyttes til å sammenligne forskjeller i mikrobiell samfunn mellom grupper14,48. Det anbefales å bruke justerte p-verdier i stedet for rå p-verdier for å korrigere for flere tester14.
Det er en rekke bioinformatikk programvare for å analysere målrettede sekvensering data uavhengig49. Den foreslåtte protokollen bruker R-basert åpen kildekode programvarepakker, som tillater brukervennlig og rask profilering av bakterielle dyr gjennom R-baserte DADA2 rørledninger. Overflod tabellen generert fra DADA2 kan brukes til nedstrøms analyse ved hjelp phyloseq og METAGENassist. DADA2 rørledning er fordelaktig over QIIME fordi den ikke krever spesielle funksjoner (dvs. installasjon av virtuelle maskiner eller docker beholdere), som trenger relativt store databehandlingsressurser og spesiell teknisk ekspertise. Spesielt for nybegynnere til 16S analyse, R er tiltalende, som det er gratis og tillater brukere å dra nytte av tilgjengelige online opplæringsprogrammer og analyse skript som er enkle å utføre. Viktigere, disse analyseverktøy krever relativt små beregningsorientert ressurser og kan kjøres på en PC, Macintosh, eller Linux-basert plattform. I tillegg kan METAGENassist bruke overflod tabeller generert fra DADA2 rørledninger så vel som biologisk observasjon Matrix (BIOM) filer generert fra QIIME/MG-RAST å utføre analyser som PCA, delvis minst firkanter discriminant analyse (PLS-DA), vulkan tomter, t-tester (sammenligne to grupper), Anova (sammenligne tre eller flere grupper), varmekartet tomter, tilfeldig skog analyse, etc. METAGENassist ble funnet meget brukervennlig.
Oppsummert beskriver denne protokollen en enkel 16S rRNA metagenomic profilering rørledning, med en detaljert guide på prøven samling, DNA utvinning, metagenomic biblioteket forberedelse, sekvensering på Illumina MiSeq, og brukervennlige dataanalyse ved hjelp av fritt tilgjengelige plattformer (dvs. DADA2, phyloseq og METAGENassist). Selv 16S rRNA metagenomic-baserte taksonomisk profilering er pålitelig for karakterisering av bakterier til stede i særdeleshet biospecimens, hagle metagenomic sekvensering kan være en bedre tilnærming for detaljert metabolsk Pathway analyse og belastning-spesifikke bakteriell identifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A. M. mottatt royalties fra Mayo Clinic (betalt av Evelo biovitenskap) som en av de oppfinnere av en teknologi som krever bruk av Prevotella histicola for behandling av autoimmune sykdommer.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust Medical Research Initiative Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al.
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
