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Biology

Microbiota विश्लेषण दो कदम पीसीआर और अगली पीढ़ी के 16S rRNA जीन अनुक्रमण का उपयोग

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/59980
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2,3,4
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

Summary

यहाँ वर्णित 16S rRNA metagenomic अनुक्रमण और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर विश्लेषण का उपयोग microbiome रूपरेखा के लिए एक सरलीकृत मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया है. इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो microbiome क्षेत्र के लिए नए हैं और साथ ही तरीकों पर अद्यतन की आवश्यकता होती है एक उच्च संकल्प पर बैक्टीरियल प्रोफाइलिंग प्राप्त करने में मदद मिलेगी.

Abstract

मानव आंत बैक्टीरिया के अरबों है कि इस तरह के खाद्य चयापचय, ऊर्जा कटाई, और प्रतिरक्षा प्रणाली के विनियमन के रूप में शारीरिक कार्यों का समर्थन द्वारा उपनिवेश है. स्वस्थ आंत microbiome के क्षोभ एकाधिक काठिन्य (एमएस) सहित भड़काऊ रोगों के विकास में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है. पर्यावरण ीय और आनुवंशिक कारक माइक्रोबायोम की संरचना को प्रभावित कर सकते हैं; इसलिए, एक रोग phenotype के साथ जुड़े माइक्रोबियल समुदायों की पहचान स्वास्थ्य और रोग में microbiome की भूमिका को परिभाषित करने की दिशा में पहला कदम बन गया है. जीवाणु समुदाय की रूपरेखा के लिए 16S आरएनए मेटेनोमिक अनुक्रमण के उपयोग से माइक्रोबायोम अनुसंधान को आगे बढ़ाने में मदद मिली है। इसके व्यापक उपयोग के बावजूद, 16S rRNA-आधारित वर्गीकरण रूपरेखा विश्लेषण के लिए कोई एक समान प्रोटोकॉल नहीं है। एक अन्य सीमा इस तरह के छोटे अनुक्रमण पढ़ता है के रूप में तकनीकी कठिनाइयों के कारण वर्गीकरण असाइनमेंट के कम संकल्प है, साथ ही केवल आगे का उपयोग (R1) रिवर्स की कम गुणवत्ता के कारण अंतिम विश्लेषण में पढ़ता है (R2) पढ़ता है. एक दिए गए biospecimen में जीवाणु विविधता की विशेषता के लिए उच्च संकल्प के साथ एक सरलीकृत विधि की जरूरत है. अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति अनुक्रम करने की क्षमता के साथ अब उच्च संकल्प पर पढ़ता है इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने में मदद मिली है. वर्तमान अनुक्रमण प्रौद्योगिकी इस तरह के आर आधारित Divisive Amplicon Denoising एल्गोरिथ्म-2 (DADA2) के रूप में एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध metagenomic विश्लेषण पाइप लाइन के साथ संयुक्त उच्च संकल्प पर अग्रिम माइक्रोबियल प्रोफाइलिंग में मदद मिली है, के रूप में DADA2 जीनस पर अनुक्रम आवंटित कर सकते हैं और प्रजातियों के स्तर। यहाँ वर्णित 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र के दो कदम प्रवर्धन का उपयोग कर जीवाणु रूपरेखा प्रदर्शन के लिए एक गाइड है, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण के बाद (यानी, DADA2, Phylosek, और METAGENassist). ऐसा माना जाता है कि यह सरल और पूर्ण कार्यप्रवाह माइक्रोबायोम प्रोफाइलिंग अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम करेगा।

Introduction

माइक्रोबायोटा एक विशेष वातावरण में रहने वाले सूक्ष्मजीवों (बैक्टीरिया, वायरस, आर्किया, बैक्टीरियोफेज और कवक) के संग्रह को संदर्भित करता है, और माइक्रोबायोम निवासी सूक्ष्मजीवों के सामूहिक जीनोम को संदर्भित करता है। चूंकि बैक्टीरिया मनुष्यों और चूहों में सबसे प्रचुर मात्रा में रोगाणुओं में से एक है, यह अध्ययन केवल बैक्टीरियल प्रोफाइलिंग पर केंद्रित है। मानव आंत को खरबों बैक्टीरिया और सैकड़ों जीवाणु उपभेदों1द्वारा बसाया जाता है . सामान्य आंत microbiota कार्यों को विनियमित करने के द्वारा मेजबान में एक स्वस्थ राज्य को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (यानी, एक बरकरार आंतों बाधा के रखरखाव, खाद्य चयापचय, ऊर्जा homeostasis, रोगजनक जीवों द्वारा उपनिवेशन के निषेध, और प्रतिरक्षा अनुक्रियाओं का विनियमन)2,3,4,5. आंत microbiota (गट डिस्बिओसिस) की compositional क्षुब्धता जठरांत्र संबंधीविकारों 6, मोटापा7,8, स्ट्रोक9, कैंसर10सहित मानव रोगों की एक संख्या से जोड़ा गया है , मधुमेह8,11, रूमेटोइड गठिया12, एलर्जी13, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से संबंधित रोगों जैसे एकाधिक स्क्लेरोसिस (एमएस)14,15 और अल्जाइमर रोग (एडी)8,16. इसलिए, हाल के वर्षों में, विभिन्न शरीर स्थलों पर जीवाणु संरचना की पहचान करने के लिए उपकरणों में रुचि बढ़ रही है। एक विश्वसनीय विधि में उच्च-थ्रूपुट और उपयोग में आसान होने, उच्च संकल्प के साथ बैक्टीरियल माइक्रोबायोटा को वर्गीकृत करने की क्षमता होने, और कम लागत वाली विशेषताएं होनी चाहिए।

संस्कृति आधारित सूक्ष्मजीवी तकनीक कई आंत बैक्टीरिया की विफलता के कारण संस्कृति में विकसित होने के कारण जटिल आंत माइक्रोबायोम की पहचान करने और उनकी विशेषता के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं हैं। अनुक्रमण आधारित प्रौद्योगिकी के आगमन, विशेष रूप से 16S rRNA आधारित metagenomic अनुक्रमण, इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने और microbiome अनुसंधान17बदल गया है. उन्नत 16S RNA आधारित अनुक्रमण प्रौद्योगिकी मानव स्वास्थ्य में आंत microbiome के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका स्थापित करने में मदद मिली है. मानव Microbiome परियोजना, स्वास्थ्य पहल के एक राष्ट्रीय संस्थान18, और MetaHIT परियोजना (एक यूरोपीय पहल)19 दोनों microbiome विश्लेषण के लिए एक बुनियादी ढांचे की स्थापना में मदद की है. इन पहलों ने मानव स्वास्थ्य और रोग में आंत माइक्रोबायोम की भूमिका निर्धारित करने के लिए कई अध्ययनों को शुरू करने में मदद की।

अनेक समूहों ने सूजन रोगों वाले रोगियों में आंत का अपस्फीति12,14,15,20,21,22दिखाया है . मल्टीप्लेक्स और कम लागत की क्षमता के कारण वर्गीकरण प्रोफाइलिंग के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा होने के बावजूद, 16S RNA-आधारित वर्गीकरण रूपरेखा के लिए कोई समान प्रोटोकॉल नहीं हैं। एक अन्य सीमा छोटे अनुक्रमण पढ़ता है (150 bp या 250 bp) और केवल आगे अनुक्रमण पढ़ने का उपयोग करने के कारण वर्गीकरण कार्य के कम संकल्प है (R1) कम गुणवत्ता रिवर्स अनुक्रमण पढ़ता है (R2) के कारण. हालांकि, अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति के लिए इन चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने में मदद मिली है, इस तरह के अनुक्रम की क्षमता के रूप में अब युग्मित अंत पढ़ता का उपयोग पढ़ता है (जैसे, Illumina MiSeQ 2x300bp).

वर्तमान अनुक्रमण प्रौद्योगिकी अनुक्रम कर सकते हैं 600 बीपी अच्छी गुणवत्ता पढ़ता है, जो R1 और R2 के विलय की अनुमति देता है पढ़ता है. ये मर्ज किए गए अब R1 और R2 पढ़ता बेहतर वर्गीकरण कार्य की अनुमति दें, विशेष रूप से खुले उपयोग आर-आधारित Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) प्लेटफ़ॉर्म के साथ। DADA2 के बजाय परिचालन वर्गीकरण इकाई (OTU) कार्य QIIME23द्वारा उपयोग की समानता के आधार पर amplicon अनुक्रम संस्करण (ASV)-आधारित कार्य का इस्तेमाल करता है। ASV 1-2 न्यूक्लियोटाइड्स, जो जीनस और प्रजातियों के स्तर पर काम करने के लिए सुराग के भीतर डेटाबेस में एक सटीक अनुक्रम मैच में परिणाम से मेल खाता है। इस प्रकार, लंबे समय तक, अच्छी गुणवत्ता युग्मित अंत के संयोजन पढ़ता है और बेहतर वर्गीकरण असाइनमेंट उपकरण (जैसे DADA2) microbiome अध्ययन बदल दिया है.

लेकिन यहाँ 16S RRNA और डेटा विश्लेषण के V3-V4 क्षेत्र के दो कदम प्रवर्धन का उपयोग कर बैक्टीरियल प्रोफाइलिंग प्रदर्शन के लिए एक कदम दर कदम गाइड है DADA2, Phylosek, और METAGENassist पाइपलाइनों का उपयोग कर. इस अध्ययन के लिए मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन (एचएलए) श्रेणी के ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग किया जाता है, क्योंकि कुछ एचएलए श्रेणी के एलेल्स एमएस20,24,25जैसे ऑटोम्यून्यून रोगों के लिए एक पूर्वाग्रह से जुड़े हुए हैं। हालांकि, आंत microbiota की संरचना को विनियमित करने में HLA वर्ग द्वितीय जीन के महत्व अज्ञात है. यह hypothesized है कि HLA वर्ग द्वितीय अणु विशिष्ट बैक्टीरिया के लिए चयन करके आंत माइक्रोबियल समुदाय को प्रभावित करेगा. प्रमुख हिस्टो संगतता परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय नॉकआउट चूहों (AE.KO) या चूहों मानव HLA-DQ8 अणुओं व्यक्त (HLA-DQ8)24,25,26 में HLA वर्ग द्वितीय अणुओं के महत्व को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया आंत माइक्रोबियल समुदाय को आकार देने. ऐसा माना जाता है कि आर-आधारित डेटा विश्लेषण के साथ यह पूर्ण और सरलीकृत कार्यप्रवाह माइक्रोबायोम प्रोफाइलिंग अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम करेगा।

चूहों की पीढ़ी अंतर्जात murine MHC वर्ग द्वितीय जीन की कमी (AE.KO) और एई-/ HLA-DQA1 *0103, DQB1 *0302 (HLA-DQ8) एक C57BL/6J पृष्ठभूमि के साथ ट्रांसजेनिक चूहों पहले26वर्णित किया गया है. मल के नमूने दोनों लिंगों (8-12 सप्ताह की उम्र) के चूहों से एकत्र किए जाते हैं। चूहे पहले पैदा कर रहे थे और NIH और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार आयोवा पशु सुविधा के विश्वविद्यालय में बनाए रखा. संदूषण नियंत्रण रणनीतियों जैसे एक लेमिनर प्रवाह कैबिनेट के अंदर चूहों की weaning, चूहों के विभिन्न उपभेदों के बीच दस्ताने के बदलने, और चूहों के उचित रखरखाव आंत microbiome की रूपरेखा के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं.

उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (PPE) अत्यधिक पूरी प्रक्रिया के दौरान की सिफारिश कर रहे हैं. डीएनए अलगाव प्रदर्शन करते समय उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए, PCR1 और PCR2 प्रवर्धन, और अनुक्रमण कदम. बाँझ का उपयोग, DNase मुक्त, RNase मुक्त, और pyrogen मुक्त आपूर्ति की सिफारिश की है. microbiome काम और फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तियों के लिए नामित पाइप्टर प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। Microbiota विश्लेषण सात कदम के होते हैं: 1) मल नमूना संग्रह और प्रसंस्करण; 2) डीएनए की निकासी; 3) 16S rRNA जीन प्रवर्धन; 4) अनुक्रमित पीसीआर का उपयोग कर डीएनए पुस्तकालय निर्माण; 5) अनुक्रमित पीसीआर (लाइब्रेरी) की सफाई और परिमाणीकरण; 6) मिसेक अनुक्रमण; और 7) डेटा प्रसंस्करण और अनुक्रम विश्लेषण। सभी प्रोटोकॉल चरणों का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दर्शायागया है।

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Protocol

प्रोटोकॉल आयोवा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. मल नमूना संग्रह और हैंडलिंग

  1. डिवाइडर बक्से को स्टरलाइज़ करें (सामग्री की तालिकादेखें, अनुपूरक चित्र 1) 70% इथेनॉल के साथ।
  2. नमूना आईडी और उपचार समूह (यदि लागू हो) के साथ पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूब (एक प्रति माउस)।
  3. चूहों को बाँझ डिवाइडर बक्से में रखें और उन्हें सामान्य रूप से 1 ज तक शौच करने की अनुमति दें।
  4. बाँझ बलप्स का उपयोग कर एक खाली, पूर्व लेबल 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में मल छर्रों लीजिए और सुरक्षित रूप से ट्यूब बंद. प्रत्येक माउस से एकत्र करने के बाद संदंश को स्टरलाइज़ करें।
  5. आगे के प्रसंस्करण तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मल छर्रों युक्त microcentrifuge ट्यूब रखें।
    नोट: डिवाइडर बक्से फायदेमंद हैं क्योंकि वे एक समय में कई चूहों (अप करने के लिए 12) से मल के नमूने के एक साथ संग्रह की अनुमति देते हैं।

2. डीएनए का निष्कर्षण

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर फ्रीजर और thaw से मल के नमूने (माउस या मानव) निकालें।
    नोट: मानव मल के नमूनों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने की सलाह दी जाती है क्योंकि स्टॉक नमूनों से 200 मिलीग्राम या आवश्यक राशि एकत्र करने की आवश्यकता होती है।
  2. 50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा में प्रारंभिक सामग्री और एल्यूट डीएनए के 200 मिलीग्राम का उपयोग करें।
  3. एक डीएनए अलगाव किट रिक्त जिसमें कोई मल नमूना जोड़ा जाता है, लेकिन सभी डीएनए निष्कर्षण चरणों के माध्यम से संसाधित किया जाता है शामिल करें।
    नोट: एक विशिष्ट डीएनए अलगाव किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया गया था, क्योंकि इसमें विशिष्ट अभिकर्मकों को जैव ठोस, अपाच्य पौधों की सामग्री, और मानव और माउस मल में मौजूद lysed लाल रक्त कोशिकाओं से हेम यौगिकों को हटाने के लिए शामिल किया गया था नमूने.
  4. मनका ट्यूब को समरूपक में रखें (सामग्री की सारणीदेखें ) तथा नमूनों को 45 एस के लिए आरटी तथा 4.5 मध की चाल के लिए समरूप बनाइए।
    नोट: किसी भी निर्माता से बीड-बीटिंग homogenizer इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि मानकीकृत करने के लिए सिफारिश की है, विशेष रूप से गति और homogenization की अवधि, जब एक और विक्रेता से मनका की धड़कन homogenizer का उपयोग कर.
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक जीवाणु डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग कर अलग-अलग माउस मल नमूनों से डीएनए अलग करना (सामग्री की तालिकादेखें) मामूली संशोधनों के साथ। एक फ्लोरीमीटर पर या उच्च संवेदनशीलता इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप पर डीएनए के 1 डिग्री एल लोड करके अलग डीएनए मात्रा (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: डीएनए की अपेक्षित उपज 500-2,500 एनजी से लेकर कर सकते हैं जब मल के नमूने के 200 मिलीग्राम के साथ शुरू होता है।
  6. एल्यूशन बफर का उपयोग करके डीएनए की सांद्रता को 4-20 एनजी/जेडएल में समायोजित करें। पीसीआर1 एक ही दिन नहीं किया जाता है, तो 16S rRNA जीन प्रवर्धन (PCR1) के लिए आगे बढ़ने से पहले डीएनए (के रूप में चरण 2.5 में किया) ReQuantify.

3. 16S rRNA जीन प्रवर्धन (पीसीआर1)

  1. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में 16S rRNA जीन प्रवर्धन (PCR1) की स्थापना की एक 25 डिग्री एल प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग कर.
  2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, बफर सहित 2x उच्च निष्ठा polymerase एंजाइम मिश्रण के 12.5 डिग्री एल जोड़ें, dNTPs के अलावा (सामग्री की तालिकादेखें): 10.5 डिग्री एल कुल मात्रा में डीएनए के 40 एनजी (पीसीआर ग्रेड पानी के साथ कुल मात्रा समायोजित): 1 $L (प्रत्येक) आगे की और 1 डिग्री एम एकाग्रता पर रिवर्स प्राइमर।
    नोट: प्राइमर के अनुक्रम इस प्रकार हैं:
    फॉरवर्ड प्राइमर - 5'-टीसीजीटीसीजीजीजीजीटीसीचा गटगटगटाच्या जागा कागदमागच्या GGGGGCWGCAG-3' रिवर्स प्राइमर $ 5'-GTCTCGTCGCGGATGTGTGTA TAGAGACACTAGTATC C-3'. PCR प्लेट में चरण 2.3 (किट अभिकर्मक नियंत्रण) से रिक्त किट शामिल करें.
  3. पीसीआर प्लेट और अपकेंद्रित्र को 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 000 x ग्राम पर एक टेबलटॉप प्लेट अपकेंद्रण में 1 मिनट के लिए सील करें (सामग्री की तालिकादेखें ) और पीसीआर को एक थर्मल साइकिलर में निष्पादित करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 1 के 25 चक्र) 30 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 2) 30 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 3) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 s; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार; और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    नोट: हालांकि इस 16S rRNA जीन प्रवर्धन विधि biospecimens के विभिन्न प्रकार के साथ काम करना चाहिए, यह प्रवर्धन चक्र की संख्या मानकीकरण जब एक नई परियोजना शुरू करने की सलाह दी है.
  4. एक उच्च संवेदनशीलता electrophoresis चिप पर डीएनए के 1 $L लोड करके PCR1 उत्पाद के आकार की पुष्टि करें. वैकल्पिक रूप से, पीसीआर 1 उत्पाद के 550 बीपी की पुष्टि करने के लिए एक 1.5% agarose जेल पर 16S rRNA-एम्फ्लेसिाइड उत्पाद के 5 डिग्री एल चलाते हैं।
    नोट: 16S rRNA प्रवर्धित उत्पाद की सफाई वैकल्पिक है और डीएनए अलगाव किट पर निर्भर करता है / यदि एक घर में डीएनए अलगाव विधि का उपयोग कर, PCR1 उत्पाद निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक microbiome डीएनए शुद्धि किट का उपयोग साफ किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें). डीएनए आइसोलेशन किट का इस्तेमाल यहां एक अल्ट्रापुरे डीएनए देता है और पीसीआर 1 उत्पाद की सफाई की आवश्यकता नहीं है।

4. डीएनए लाइब्रेरी निर्माण अनुक्रमित पीसीआर (PCR2) का उपयोग

  1. 96 पुस्तकालयों के लिए एक विशेष रैक (सामग्री की तालिका देखें) में सूचकांक 1 और सूचकांक 2 बारकोड प्राइमर रखें।
    1. 1-12 कॉलम में इंडेक्स 1 प्राइमर की व्यवस्था करें और विशेष रैक की पंक्तियों A-H में इंडेक्स 2 प्राइमर की व्यवस्था करें।
    2. कॉलम 1-12 में इंडेक्स 1 का 2.5 $L जोड़ें और मल्टीचैनल पिपेट ्स्ड मल्टीचैनल पिपेट्स का उपयोग करके A-H पंक्तियों में इंडेक्स 2 प्राइमर जोड़ें। सूचकांक 1 और सूचकांक 2 adopter प्राइमर पर नई टोपी (सामग्री की तालिकादेखें) प्लेस और यह एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर.
  2. एक multichannel pipette का उपयोग करना, जोड़ें 12.5 $L 2x उच्च निष्ठा polymerase एंजाइम मिश्रण एक बफर युक्त, dNTPs के अलावा(सामग्री की तालिका देखें); पीसीआर ग्रेड पानी के 5 डिग्री और 16S rRNA-एम्प्लीकृत उत्पाद के 2.5 $L.
    नोट: एक ही रन में 96 से अधिक पुस्तकालयों के बहुसंकेतन के लिए प्रत्येक नमूने के लिए अद्वितीय सूचकांक जोड़ें, जैसा कि किरनन एट अल27में वर्णित है। वर्तमान प्रोटोकॉल 16S मेटेगोनॉमिक्स अनुक्रमण विधि (जैसे, Illumina) में प्रदान किए गए निर्माता के निर्देश के अनुसार एक वाणिज्यिक किट (जैसे, नेक्सेरा एक्सटी इंडेक्स किट) से एडाप्टर का उपयोग करता है।
  3. सील और अपकेंद्रण 1 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर अनुक्रमित पीसीआर प्लेट और के लिए क्रमादेशित एक थर्मल साइकिलर में पीसीआर प्रदर्शन: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 8 चक्र, 2) 30 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 3) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 s; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
  4. एक उच्च संवेदनशीलता इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप पर डीएनए के 1 $L लोड करके अनुक्रमित पीसीआर उत्पाद के 630 आधार आकार की पुष्टि करें। वैकल्पिक रूप से, उत्पाद के आकार और तीव्रता की पुष्टि करने के लिए 1.5% agarose जेल पर अनुक्रमित PCR उत्पाद के 5 $L चलाएँ।

5. अनुक्रमित पीसीआर (पीसीआर2) और क्वांटिफिकेशन की सफाई

  1. पीसीआर 2 amplicon के 5 $L प्रत्येक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल जलाशय ट्रे में एक मल्टीचैनल पाइपेट का उपयोग कर पता लगाने योग्य DNase, RNase, मानव डीएनए, और Pyrogenic बैक्टीरिया से मुक्त (सामग्री की तालिकादेखें).
  2. मल्टीचैनल जलाशय ट्रे से पूल्ड उत्पाद को एक खाली, पूर्व-लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और मिश्रण करने के लिए भंवर में स्थानांतरित करें।
  3. निर्माता के निर्देश के अनुसार मानक चुंबकीय मोती किट(सामग्री की तालिका देखें)का उपयोग कर PCR2 उत्पाद को शुद्ध करें। यदि आवश्यक हो तो पीसीआर 2 के शेष 20 डिग्री सेल्सियस को आगे के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ही प्लेट में रखें।
  4. पीसीआर ग्रेड पानी के 1 एमएल में 100% इथेनॉल के 4 एमएल जोड़कर ताजा 80% इथेनॉल तैयार करें।
  5. समान रूप से मोती फैलाने के लिए 30 s के लिए आरटी और भंवर के लिए चुंबकीय मनका बराबर।
  6. संक्षेप में भंवर और जमा PCR2 amplicon नमूने नीचे स्पिन.
  7. एक पूर्व लेबल में चुंबकीय मोती के 80 डिग्री एल जोड़ें, बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब के साथ 80 $L पूल्ड पीसीआर उत्पादों की, तो भंवर और समान रूप से चुंबकीय मोती को फिर से निलंबित करने के लिए संक्षेप में स्पिन.
  8. 15 मिनट के लिए ट्यूब परेशान बिना आरटी में सामग्री को इनक्यूबेट करें।
  9. ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर डीएनए तथा चुंबकीयमोतियों के साथ 5 मि.
  10. ध्यान से निकालें और supernatant के 150 डिग्री सेल्सियस त्याग दें।
  11. मोती और 30 s के लिए इनक्यूबेट परेशान बिना ताजा तैयार 80% इथेनॉल के 200 डिग्री एल जोड़ें।
  12. ध्यान से निकालें, और सभी supernatant त्याग दें.
  13. 5.11-5.12 चरणों को दोहराएँ. एक P10 पिपेट के साथ शेष मात्रा निकालें. सूचकांक पीसीआर ट्यूब चुंबकीय स्टैंड पर शेष के साथ, 15 मिनट के लिए हवा सूखी करने के लिए मोती की अनुमति दें।
  14. चुंबकीय स्टैंड से निकालें. एल्यूशन बफर के 33 डिग्री एल जोड़ें (डीएनए किट के इल्यूशन बफर स्वीकार्य है)। भंवर अच्छी तरह से, और पक्ष पर किसी भी शेष तरल को दूर करने के लिए एक त्वरित स्पिन प्रदर्शन करते हैं। 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर जगह है।
  15. सुपरनेंट (क्लीन पीसीआर उत्पादों) के 30 डिग्री एल को पूर्व-लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  16. यह अनुक्रमण के दौरान आवश्यक हो जाएगा के रूप में, एक फ्लोरीमीटर या उच्च संवेदनशीलता इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप पर शुद्ध पूल के 1 डिग्री एल लोड करके शुद्ध पूल की मात्रा निर्धारित करें। नीचे विस्तृत के रूप में MiSeQ प्रदर्शन करते हैं।

6. मिसेक अनुक्रमण

  1. एक नमूना शीट बनाएँ जिसमें मेटेजेनोमिक्स कार्यप्रवाह के लिए नमूना-विशिष्ट बारकोड जानकारी और मिसेक उपकरण पर deएकाधिकxing(सामग्री की तालिका देखें)। इस नमूना शीट को सॉफ़्टवेयर पर अपलोड करें (उदा., Illumina Experiment Manager).
  2. चरण 5.15 से 4 एनएम तक पूल किए गए पुस्तकालयों को पतला करें।
  3. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में ताजा तैयार 0.2 एम NaOH के 5 डिग्री एल के साथ 4 एनएम पुस्तकालय पूल के 5 डिग्री एल के संयोजन के द्वारा विकृत पूल्ड पुस्तकालयों। भंवर संक्षेप में मिश्रण करने के लिए, centrifuge संक्षेप में और परिवेश आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
  4. मिश्रण करने के लिए धीरे से बर्फ ठंडा संकरीकरण बफर (एचबी बफर) और पिपेट के 990 डिग्री एल जोड़ें। यह एक 20 pM पुस्तकालय उपज जाएगा.
  5. एक 4 एनएम नियंत्रण पुस्तकालय उपज के लिए 0.1% ट्वीन 20 के साथ 10 एनएम नियंत्रण पुस्तकालय के 3 $L (10 एमएम Tris-HCl, पीएच 8.5, 0.1% ट्वीन 20 के साथ) के साथ 2 $L का मिश्रण। मिश्रण करने के लिए ताजा तैयार 0ण्2 छ नाह तथा भंवर के 5 डिग्री एल को संक्षेप में मिलाएं। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. मिश्रण करने के लिए धीरे से 990 डिग्री एल बर्फ ठंडा संकरीकरण बफर (एचबी बफर) और पिपेट जोड़ें। यह 20 pM नियंत्रण पुस्तकालयों उपज होगी.
    नोट: denatured 20 पी एम नियंत्रण पुस्तकालयों -20 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह के लिए अप करने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। 4 सप्ताह के बाद, क्लस्टर संख्या कम हो जाती है।
    1. 20 पी एम लाइब्रेरी के 210 डिग्री एल को 20 पी एम नियंत्रण पुस्तकालय के 40 डिग्री एल (अंतिम सांद्रता $ 18%) के साथ संयोजित करें, और एचबी बफर के 350 डिग्री एल जोड़ें। 7 pM के एक अंतिम एकाग्रता में पुस्तकालय लोड.
      नोट: इनपुट विवरण रन प्रदर्शन के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
  7. 96 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट के नमूने। 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखो, मिसेक कारतूस के उपयुक्त कुएं में अंतिम पूल के 600 डिग्री सेल्सियस लोड करें।
    नोट: ऊपर धारा 6 एक जीनोमिक/डीएनए कोर सुविधा में किया जा सकता है।

7. डेटा प्रसंस्करण और अनुक्रम विश्लेषण

  1. DADA2 डेटा संसाधन और विश्लेषण के लिए आर सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.5) का उपयोग करें। चरण 7.1-7.4 के लिए, पहले से विकसित DADA2 ऑनलाइन ट्यूटोरियल में उल्लिखित के रूप में खुला उपयोग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें पर पाया [lt;https://benzneb.github.io/dada2/tutorial.html.gt;.
    नोट: एक आसानी से प्रयोग करने योग्य आर स्क्रिप्ट एक पूरक फ़ाइल 2के रूप में संलग्न किया गया है, और उपयोगकर्ताओं का नाम और अनुक्रमण फ़ाइलों का स्रोत बदलना होगा (उदा., SAMPLENAME]R1]001.fastQ और SAMPLENAME]R2 ]001.fastQ)।
  2. आगे की गुणवत्ता प्रोफ़ाइल विज़ुअलाइज़ करें और प्लॉटगुणवत्ता प्रोफ़ाइल आदेश का उपयोग कर के रिवर्स पढ़ता है।
  3. आगे से न्यूक्लिओटाइड ट्रिम और रिवर्स गुणवत्ता साजिश के आधार पर पढ़ता है। ये पैरामीटर DADA2 में truncLen पैरामीटर द्वारा निर्दिष्ट किए जाते हैं।
    नोट: यहाँ, 280 लंबाई थ्रेशोल्ड जिसके लिए आगे पढ़ता छोड़ दिया जाएगा के रूप में उपयोग किया जाता है, और 260 लंबाई थ्रेशोल्ड जिसके लिए रिवर्स पढ़ता छोड़ दिया जाएगा के रूप में उपयोग किया जाता है।
  4. ऑनलाइन ट्यूटोरियल में उल्लिखित के रूप में DADA2 पाइप लाइन द्वारा fastQ फ़ाइलों के रूप में कच्चे 16S डेटा प्रक्रिया (https://benzneb.github.io/dada2/tutorial.html और gt;) R1 और R2 मर्ज करने के लिए उपयोग किया जाता है और फार्म एम्प्लिचन अनुक्रम वेरिएंट (ASVs), जो तो आवंटित करने के लिए उपयोग किया जाता है सिल्वा संदर्भ डेटाबेस23के साथ taxa |
    नोट: DADA2 पाइपलाइन से उत्पन्न एक नमूना amplicon अनुक्रम भिन्न तालिका पूरक फ़ाइल 3के रूप में शामिल किया गया है। या तो एक Greengene या सिल्वा संदर्भ डेटाबेस इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में जीवाणु वर्गीकरण में कोई अंतर इन डेटाबेस के या तो का उपयोग कर पाया गया.
  5. एक उपयोगकर्ता-निर्धारित मैपिंग फ़ाइल जनरेट करें जिसमें प्रत्येक नमूने के लिए मेटाडेटा (यानी, जीनोटाइप, लिंग, उपचार, आदि) शामिल हैं. एक नमूना मेटाडेटा फ़ाइल पूरक फ़ाइल 4के रूप में शामिल किया गया है।
  6. अल्फा विविधता (Shannon सूचकांक) और बीटा विविधता का उपयोग कर प्रमुख निर्देशांक विश्लेषण (पीसीए) के आधार पर दुर्लभ OTU मायने रखता है के आधार पर PhyloseK28 ऑनलाइन ट्यूटोरियल में उल्लिखित के रूप में, पर पाया गया का उपयोग कर [lt;https://benzneb.github.io/dada2/tutorial.html.html.gt;.
  7. METAGENassist29में निम्नलिखित विश्लेषण करें .
    नोट:     जीनस स्तर पर Wilcoxon रैंक-सम परीक्षण का उपयोग कर अंतर बहुतायत विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं। गर्मी नक्शे और अंतर प्रचुर मात्रा में टैक्सा METAGENassist29,एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है और वेब आधारित विश्लेषण पाइप लाइन का उपयोग कर प्रकाश डाला जाता है.
    1. वर्गीकरण बाहुल्य तालिका (CSV स्वरूप) अपलोड करें और स्तंभ में नमूनेका चयन करें।
    2. मैपिंग फ़ाइल (CSV स्वरूप) अपलोड करें और एक पंक्ति में नमूनेका चयन करें।
    3. 50% से अधिक शून्य वाले चरों को निकालने के लिए विकल्प का चयन करें, और अनअसाइन नहीं किया गया और मैप न किया गया पढ़ता न छोड़ें.
    4. पंक्तियों को योग के अनुसार सामान्य बनाने और स्तंभों को सामान्य बनाने के लिए विकल्पों का चयन करें.
    5. बाएं हाथ के कॉलम में एक ही क्लिक करके एक ज्वालामुखी, पीसीए, या PLSDA साजिश बनाओ और ग्राफ बनाने के लिए नमूने नाम निकालें क्लिक करें।
    6. समूहों के बीच भिन्न सुविधाओं (बैक्टीरिया) की कल्पना करने के लिए एक t-परीक्षण(यदि केवल दो समूह) या ANOVA (यदि दो समूहों से अधिक हो) निष्पादित करें. समूहों के बीच भिन्न विशिष्ट बैक्टीरिया को विज़ुअलाइज़ करने के लिए चयनित सुविधाएँ क्लिक करें.
    7. संबंधित प्लॉट बनाने के लिए Dendrogram या हीट मानचित्र पर क्लिक करें. अतिरिक्त विश्लेषण, जैसे समूहों द्वारा नमूना दृश्यावलोकन या t-परीक्षण/ANOVA-आधारित शीर्ष 25 सुविधाएँ, किया जा सकता है।
    8. RandomForest क्लिक करें चरस है कि वर्गीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखा रेखांकन बनाने के लिए. शीर्ष सुविधाओं के लिए ग्राफ़ बनाने के लिए शीर्ष पर भिन्नता टैब क्लिक करें जो समूहों के बीच/ समूहों के बीच भिन्न बैक्टीरिया की सूची देखने के लिए सुविधा विवरण क्लिक करें और प्रत्येक जीवाणु को उसी का ग्राफ़िकल सारांश बनाने के लिए क्लिक करें.
    9. बाहरी नमूने हैं कि कल्पना करने के लिए शीर्ष पर Outlier टैब पर क्लिक करें।
    10. अंत में, डाउनलोड क्लिक करें और या तो का चयन करें 1) सभी विश्लेषण प्रदर्शन या 2) वांछित सुविधाओं को डाउनलोड करने के लिए युक्त एक ज़िप फ़ाइल. यह फ़ाइल एक अद्वितीय नाम के रूप में सहेजी जानी चाहिए और उपयोग करने से पहले उसे अनज़िप करने की आवश्यकता होगी.

नोट: माइक्रोबायोम विश्लेषण के दौरान किए गए विस्तृत सांख्यिकीय परीक्षणों के लिए चेन एट अल और ह्यूजार्थ एट अल14,30के कार्यों का उल्लेख करें।

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Representative Results

के रूप में MHC वर्ग द्वितीय अणुओं (मानवों में HLA) अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में केंद्रीय खिलाड़ी हैं और एमएस24,25,26के लिए एक गड़बड़ी के साथ मजबूत संघों दिखाने के लिए , यह hypothesized था कि HLA वर्ग द्वितीय अणु आंत माइक्रोबियल संरचना को प्रभावित करेगा. इसलिए, चूहों MHC वर्ग द्वितीय जीन की कमी (AE.KO) या मानव HLA-DQ8 जीन व्यक्त (HLA-DQ8) आंत माइक्रोबियल समुदाय को आकार देने में HLA वर्ग द्वितीय अणुओं के महत्व को समझने के लिए उपयोग किया गया.

मल के नमूने AE.KO (n ] 16) और HLA-DQ8 (n ] 12) ट्रांसजेनिक चूहों से एकत्र किए गए थे, जीवाणु डीएनए निकाला गया था, और 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्र को बढ़ाया गया था। amplicon आकार (550 बीपी) एक 1.5% agarose जेल पर नमूने चलाने के द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्र 2A, गलियों 1-6) . इसके अलावा 16S rRNA amplicon आकार (550 बीपी) की पुष्टि एक उच्च संवेदनशीलता इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप पर पीसीआर 1 उत्पाद के 1 डिग्री सेल्सियस लोड करके किया गया था (चित्र 2बी, गलियों 1-7) .

एक इलेक्ट्रोफेरोग्राम 16S rRNA पीसीआर उत्पाद से उत्पन्न किया गया था, जो टुकड़े आकार के साथ चोटी क्षेत्रों दिखाया गया था $550 bp (चित्र 2C)। दोहरा अनुक्रमण और अनुक्रमण एडाप्टर अनुक्रमित PCR (PCR2) है कि प्रत्येक नमूने के लिए एक अद्वितीय पहचान असाइन की है और एक एकल MiSeQ अनुक्रमण रन में कई नमूनों के मल्टीप्लेक्स की अनुमति का उपयोग कर संलग्न थे. अनुक्रमित पीसीआर की पुष्टि agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा किया गया था (चित्र 2A, गलियों 7-12) और एक उच्च संवेदनशीलता इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप (चित्र 2B, गलियों 8-12), चित्र 2D]. पीसीआर 2 से सभी नमूने जमा, शुद्ध, और एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमक है कि आगे R1 और रिवर्स R2 अच्छी गुणवत्ता के पढ़ता पर भरी हुई थी (चित्र 3)। औसत प्राप्त गुणवत्ता फ़िल्टरिंग और trimming के बाद पढ़ता है 88,125 थे (की दूरी 9,597-111,848).

सामुदायिक पारिस्थितिकी विश्लेषण DADA2 विश्लेषण पाइप लाइन का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था और Phylosek और METAGENassist के साथ कल्पना अल्फा विविधता में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए (चित्र 4) और बीटा विविधता ( चित्र5) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मतभेद में समूहों के बीच जीनस और प्रजातियों के स्तर। DADA2 विश्लेषण एक वेब आधारित मंच का उपयोग कर आगे बहाव विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था जो csv प्रारूप में अल्पविराम अलग मूल्यों के साथ एक बहुतायत तालिका उत्पन्न (यानी, Phylosek और / अल्फ़ा और बीटा विविधता विश्लेषण मैपिंग फ़ाइल में सूचीबद्ध यूज़र-डिफ़ाइंड श्रेणियों के आधार पर किए गए थे.

शान्नोन विविधता विश्लेषण HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों की तुलना में AE.KO चूहों के लिए एक समग्र कम अल्फा विविधता से पता चला (चित्र 3). प्रमुख निर्देशांक विश्लेषण के साथ Ordination AE.KO चूहों और HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों के बीच एक अलग स्थानिक क्लस्टरिंग दिखाया (चित्र 5). DADA2 से एक बहुतायत तालिका भी खुला उपयोग सॉफ्टवेयर METAGENassist29का उपयोग कर एक व्यापक मेटेजेनोमिक विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। जीवाणु बहुतायत (जीनस स्तर) के हीट मानचित्र आधारित गुच्छन (चित्र 6क) और विशिष्ट बैक्टीरिया के लिए एक बॉक्स प्लॉट जो दो समूहों के बीच अंतरदर्शाताहै ( चित्र 6 ख ) एक मेटेजनासिस्ट पाइपलाइन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था।

हीट मानचित्र विश्लेषण से पता चला है कि इस तरह के Allobacullum, Desufovibrio, और Rikenella के रूप में कुछ बैक्टीरिया HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे. इसके विपरीत, Biolophila AE.KO चूहों में अधिक प्रचुर मात्रा में था (चित्र 6B) . व्यक्तिगत बैक्टीरिया के सापेक्ष बहुतायत (बिलिफिला और राइकेला) एक प्रतिनिधि बॉक्स प्लॉट में दिखाए जाते हैं (चित्र 6ख) . कुल मिलाकर, डेटा प्रदर्शित करता है कि AE.KO चूहों HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों की तुलना में एक अलग माइक्रोबियल समुदाय के अधिकारी, AE.KO चूहों में विशिष्ट बैक्टीरिया की अनुपस्थिति के साथ. डेटा यह भी सुझाव है कि MHC वर्ग द्वितीय अणुओं कुछ बैक्टीरिया की बहुतायत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. सारांश में, इस सरल और विस्तृत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो microbiome क्षेत्र के लिए नए हैं और साथ ही जो उच्च वर्गीकरण संकल्प प्राप्त करने के लिए तरीकों पर अद्यतन की जरूरत में मदद मिलेगी.

Figure 1
चित्र 1: आंत microbiome अनुक्रमण का प्रवाह आरेख. microbiome अनुक्रमण के सभी चरणों (माइक्रोबायोम डेटा विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह) प्रदर्शित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: 16S rRNA जीन प्रवर्धन और V3-V4 क्षेत्र की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण. (ए) प्रतिनिधि agarose जेल electrophoresis छवि 16S amplicon (PCR1, आकार 550 bp) और अनुक्रमित पीसीआर (PCR2, आकार $ 630 बीपी) AE.KO चूहों से (लेन 1-3 और 7-9) और HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों (लेन 4-6 और 10-12). (बी) 16S amplicon के प्रतिनिधि जेल छवि (PCR1, आकार $ 550 bp) और अनुक्रमित पीसीआर (PCR2, आकार $ 630 bp) AE.KO चूहों के (लेन 1-3 और 8-10) और HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों (लेन 4-7 और 11-12) इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा हल. (ग) 16S एम्प्लिकॉन (पीसीआर1) के प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम ने एक शिखर क्षेत्र दिखाया जिसमें टुकड़े थे जो आकार के थे $ 550 बीपी (डी) अनुक्रमित पीसीआर (पीसीआर 2) के प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम ने एक शिखर क्षेत्र दिखाया जिसमें आकार के टुकड़े शामिल थे । 630 bp. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: आगे की गुणवत्ता प्रोफ़ाइल पढ़ता है (R1, शीर्ष) दो प्रतिनिधि नमूने के लिए और इसी रिवर्स पढ़ता है (R2, नीचे) एक ही नमूने के लिए. विश्लेषण एक DADA2 पाइप लाइन का उपयोग कर किया गया था, जिसमें x-अक्ष पढ़ने की लंबाई से पता चलता है (0-300 कुर्सियां) और y-अक्ष पढ़ता की गुणवत्ता से पता चलता है. नारंगी रेखा प्रत्येक आधार स्थिति पर गुणवत्ता स्कोर वितरण के चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ग्रीन लाइन, औसत गुणवत्ता स्कोर का प्रतिनिधित्व करता है। आगे पढ़ता है (R1) हमेशा रिवर्स पढ़ता (R2) से बेहतर गुणवत्ता दिखाया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: AE.KO चूहों और HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों के अल्फा विविधता उपायों (शैनन विविधता)। प्रत्येक बिंदु एकल माउस के नमूने में $-विविधता (शैनन विविधता) का प्रतिनिधित्व करता है. शान्नोन विविधता HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों की तुलना में AE.KO चूहों के लिए समग्र कम था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: आंशिक कम से कम वर्गों-आधारित आयाम विश्लेषण साजिश के साथ Ordination. साजिश AE.KO चूहों और HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों के बीच एक स्पष्ट जुदाई से पता चलता है. प्रत्येक डॉट एक नमूने के भीतर जीवाणु संरचना का प्रतिनिधित्व करता है, और डॉटेड ग्रहण 80% आत्मविश्वास अंतराल का संकेत देते हैं। पीएलएस-डीए के भूखंडों का उत्पादन मेटेजनेसिस्ट का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: AE.KO चूहों HLA-DQ8 ट्रांसजेनिक चूहों की तुलना में अलग माइक्रोबियल समुदाय दिखा, AE.KO चूहों में विशिष्ट बैक्टीरिया की अनुपस्थिति के साथ. (ए) ऊष्मा मानचित्र में समूहात्मक पदानुक्रमिक गुच्छन के साथ संयुक्त रूप से बैक्टीरिया की सापेक्ष बहुतायत (जीनस स्तर) को दर्शाता है। (बी) बॉक्स प्लॉट में एई.ओ.ओ और एचएलए-डीक्यू8 ट्रांसजेनिक चूहों में दो प्रतिनिधि बैक्टीरिया(बिलोफिला और राइकेला) की सामान्य सापेक्ष बहुतायत दर्शाती है। दोनों भूखंडों METAGENassist का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र 1: एक समय में कई चूहों से मल के नमूनों के संग्रह के लिए डिवाइडर बॉक्स की प्रतिनिधि तस्वीर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary File 2
अनुपूरक फ़ाइल 2: कच्चे दृश्यों से बहुतायत तालिका पैदा करने के लिए DADA2 आर स्क्रिप्ट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 3
अनुपूरक फ़ाइल 3: प्रतिनिधि जीनस बहुतायत तालिका (CSV प्रारूप). इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 4
अनुपूरक फ़ाइल 4: प्रतिनिधि मैपिंग फ़ाइल (CSV स्वरूप). इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल सरल है, आसान करने के लिए पालन कदम के साथ microbiome रूपरेखा प्रदर्शन करने के लिए 16S rRNA metagenomic अनुक्रमण ब्याज की एक बड़ी संख्या से biospecimens. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने माइक्रोबियल पारिस्थितिकी अध्ययनों को बदल दिया है, विशेष रूप से मानव और पूर्व-नैदानिक रोग मॉडल31,32में। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि वह उच्च थ्रूपुट स्तर पर और कमलागतपर दिए गए बायोमेस्नेस में जटिल माइक्रोबियल रचनाओं (कृषि योग्य और गैर-कृषि योग्य सूक्ष्मजीवों) का सफलतापूर्वक विश्लेषण करने की क्षमता रखते हैं। हालांकि, कई कारकों (यानी, बैच प्रभाव, 16S rRNA जीन के लिए प्राइमर का चयन, और अनुक्रम डेटा विश्लेषण) इस तकनीक के व्यापक उपयोग में एक प्रमुख बाधा बनी हुई है.

उन्नत 16S RRNA आधारित MiSeQ अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों (2x300bp)33 बैक्टीरिया के 1,500 न्यूक्लिओटाइड लंबी 16S RRNA जीन है, जो कम अनुक्रमण पढ़ता के पहले बाधा overcame में से $ 600 न्यूक्लिओटाइड के अनुक्रमण की अनुमति देते हैं। RRNA के एक अलग क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमर जैसे V3-V5, या V6-V9 प्रत्येक क्षेत्र के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है-विशिष्ट प्राइमर के लिए कुछ पूर्वाग्रह दिखा रहा है पर या के तहत विशेष taxa34का पता लगाने34 ,35. कुछ समूह V1-V2 क्षेत्र21को प्राथमिकता देते हैं, जो क्लोस्ट्रिडियम के लिए वृद्धि पूर्वाग्रह को दर्शाता है लेकिन कुछ जीवाणु प्रजातियों के लिए अंडरडिटेक्शन दर्शाता है। इसके विपरीत, अन्य समूह V4, V3-V4, और V3-V5 क्षेत्रों को पसंद करते हैं, जो जीवाणु कर15,20,36,37के कम से कम पक्षपाती वर्गीकरण को प्रदर्शित करते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल 16S rRNA जीन के V3-V4 क्षेत्रों के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करता है, के रूप में यह दो अतिचरीय क्षेत्रों के साथ 16S rRNA के लंबे क्षेत्र को शामिल किया गया (V3 और V4) अकेले V4 की तुलना में. इसके अतिरिक्त, V3-V4 विशिष्ट amplicon दोनों आगे के विलय की अनुमति देता है (R1) और रिवर्स (R2) पढ़ता है, जीवाणु वर्गीकरण के बेहतर समाधान के लिए अग्रणी. यद्यपि V3-V5 क्षेत्र अब पढ़ता है और अधिक hypervariable क्षेत्रों को शामिल किया गया (V3, V4, और V5), यह R1 और R2 के बीच कोई / अतः अनेक अध्ययनों में केवल R1 से डेटा का उपयोग किया गया है, जब V3-V5 क्षेत्र14का उपयोग करके 16S rRNA मेटेनोमिक अनुक्रमण निष्पादित करते समय जीवाणु वर्गीकरण के लिए पढ़ता है।

जीवाणु डीएनए या पर्यावरण संदूषण38की गिरावट को रोकने के लिए माइक्रोबायोम विश्लेषण के लिए उचित बायो-स्केमिक भंडारण और हैंडलिंग महत्वपूर्ण है . आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर बायो-सीमेंस का दीर्घकालिक भंडारण कुछ बैक्टीरिया या कवक के अतिवृद्धि का कारण बन सकता है। नमूने या तो तुरंत जमे हुए किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाया (1-3 दिनों के लिए), तो जमे हुए. Biospecimen भी इस तरह के न्यूक्लिक एसिड स्थिरीकरण समाधान (जैसे, आरएनए बाद में), 95% इथेनॉल, या एक वाणिज्यिक भंडारण किट के रूप में परिरक्षकों में सीधे संग्रहीत किया जा सकता है। आम सहमति यह है कि इनमें से किसी भी प्रकार के भंडारण विधियों में जीवाणु समुदाय प्रोफाइल39,40में महत्वपूर्ण अंतर नहीं होता . हालांकि परिरक्षकों के साथ एक समाधान आरटी में भंडारण और परिवहन के लिए अनुमति देता है, इन नमूनों आरएनए आधारित परख, चयापचय विश्लेषण, या मल प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है. इन मुद्दों पर अन्य स्थानों पर विस्तार से चर्चाकीगई है39 ,40.

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया और आर्किया के यांत्रिक विघटन के लिए एक मनका-बीटिंग-आधारित विधि का उपयोग है। एक पूर्व अध्ययन से पता चला है कि सेल lysis41के अन्य तरीकों की तुलना में मनका-बीटिंग आधारित विधि का उपयोग करके सबसे अधिक जीवाणु विविधता। डीएनए निष्कर्षण के दौरान एक अधूरा जीवाणु lysis या संदूषण आंत microbiome डेटा42में पूर्वाग्रह परिचय कर सकते हैं. इस बात पर विचार करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रयोगशाला अभिकर्मकों के संदूषण के कारण किटोम43,44,45नामक किटों में शामिल किया गया है . बड़े बायोमास और मिट्टी या मल जैसे अमीर जीवाणु विविधता के साथ नमूने त्वचा जैसे कम बायोमास के साथ नमूनों की तुलना में इन समस्याओं के कम दिखाते हैं। इसलिए, डीएनए निष्कर्षण43,44,45के कारण संभावित संदूषण की शुरूआत की पहचान करने के लिए प्रत्येक निष्कर्षण के साथ एक जल निष्कर्षण नियंत्रण को शामिल किया जाना चाहिए और अन्य नमूनों के साथ संसाधित किया जाना चाहिए।

microbiome विश्लेषण में, एक नमूने के भीतर विविधता अल्फा विविधता, प्रजातियों की समृद्धि का एक उपाय है, या बीटा विविधता है, जो नमूनों के बीच असमानता का अनुमान द्वारा मापा जा सकता है / $ विविधता को मापने के लिए लोकप्रिय तरीकों UniFrac (भारित और unweighted) इस तरह के प्रमुख समन्वय विश्लेषण (PCoA) या Brey-Curtis असमानता के रूप में बहुचर सांख्यिकीय तकनीकों के साथ युग्मित शामिल हैं। जबकि UniFrac जातिवृत् तीय दूरी पर आधारित है, Brey-Curtis असमानता विश्लेषण भूखंडों पैदा करने के लिए जीवाणु बहुतायत का इस्तेमाल करता है. के बारे में गहराई से विवरण में - - - और $ - विविधता iare कहीं और चर्चाकी 30,46,47. 14,48समूहों के बीच माइक्रोबियल समुदायों में अंतर की तुलना करने के लिए अनेक सांख्यिकीय विधियों का उपयोग किया जा सकता है . यह एक से अधिक परीक्षण14के लिए सही करने के लिए कच्चे p-मान के बजाय समायोजित p-मान का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है।

लक्षित अनुक्रमण डेटा का स्वतंत्र रूप से49का विश्लेषण करने के लिए जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर की एक किस्म है. प्रस्तावित प्रोटोकॉल आर-आधारित ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करता है, जो आर-आधारित डीएडीए2 पाइपलाइनों के माध्यम से बैक्टीरियल टैक्सा के उपयोगकर्ता के अनुकूल और तेजी से प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है। DADA2 से उत्पन्न बहुतायत तालिका phylosek और METAGENassist का उपयोग कर बहाव विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. DADA2 पाइपलाइन QIIME पर फायदेमंद है क्योंकि यह विशेष सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है (यानी, आभासी मशीनों या डॉकर कंटेनर की स्थापना), जो अपेक्षाकृत बड़े कम्प्यूटेशनल संसाधनों और विशेष तकनीकी विशेषज्ञता की जरूरत है. विशेष रूप से 16S विश्लेषण करने के लिए शुरुआती के लिए, आर अपील कर रहा है, के रूप में यह मुफ़्त है और उपयोगकर्ताओं को सुलभ ऑनलाइन ट्यूटोरियल और विश्लेषण लिपियों कि निष्पादित करने के लिए आसान कर रहे हैं का लाभ लेने के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात, इन विश्लेषण उपकरण अपेक्षाकृत छोटे अभिकलन संसाधनों की आवश्यकता होती है और एक पीसी पर चलाया जा सकता है, Macintosh, या लिनक्स आधारित मंच. इसके अतिरिक्त, METAGENassist DADA2 पाइपलाइनों के साथ ही जैविक अवलोकन मैट्रिक्स (BIOM) QIIME/MG-RAST से उत्पन्न फ़ाइलों से उत्पन्न बहुतायत तालिकाओं का उपयोग कर सकते हैं ऐसे पीसीए, आंशिक कम से कम वर्गों भेदभाव विश्लेषण (PLS-डीए) के रूप में विश्लेषण करने के लिए, ज्वालामुखी भूखंडों, टी-परीक्षण (दो समूहों की तुलना), ANOVA (तीन या अधिक समूहों की तुलना), गर्मी नक्शा भूखंडों, यादृच्छिक वन विश्लेषण, आदि METAGENassist बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल पाया गया.

सारांश में, इस प्रोटोकॉल नमूना संग्रह, डीएनए निष्कर्षण, metagenomic पुस्तकालय की तैयारी पर एक विस्तृत गाइड के साथ, एक सरल 16S rRNA metagenomic रूपरेखा पाइप लाइन का वर्णन करता है, Illumina MiSeQ पर अनुक्रमण, और उपयोगकर्ता के अनुकूल डेटा विश्लेषण स्वतंत्र रूप से उपयोग उपलब्ध प्लेटफार्मों (यानी, DADA2, phylosek, और METAGENassist). हालांकि 16S rRNA metagenomic आधारित वर्गीकरण रूपरेखा विशेष biospecimens में मौजूद बैक्टीरिया की विशेषता के लिए विश्वसनीय है, बन्दूक metagenomic अनुक्रमण विस्तृत चयापचय मार्ग विश्लेषण और तनाव विशेष के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण हो सकता है जीवाणु पहचान.

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Disclosures

ए एम मेयो क्लिनिक से रॉयल्टी प्राप्त (एवोलो बायोसाइंसेज द्वारा भुगतान) एक प्रौद्योगिकी के अन्वेषकों में से एक के रूप में autoimmune रोगों के उपचार के लिए Prevotella histicola के उपयोग का दावा.

Acknowledgments

लेखक NIAID/NIH (1R01AI137075-01), कार्वर ट्रस्ट मेडिकल रिसर्च इनिशिएटिव ग्रांट, और आयोवा पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान अनुसंधान केंद्र, NIEHS/NIH (P30 ES005605) से धन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Natural Microcentriguge Tube USA, Scientific 1615-5500 Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G 3M, MN, US 7100038651 Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter, IN, USA A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip Agilent Technologies, CA, USA 5067-1504 DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps Illumina, Inc., CA, USA 15026762 New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA 12855-100 DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) Kapa Biosystem, MA, USA KK2602 PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes Lewis Bins, WI, US ND03080 Fecal collection
Magnetic stand New England BioLabs, MA, USA S1509S For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4346906 PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA 4311971 PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge Beckman Coulter, IN, USA B30154 Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 Illumina, Inc., CA, USA MS-102-3003 For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina, Inc., CA, USA FC-131-1001 16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays ASI, FL,USA RS71-1 For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge Thermo Fisher Scientific, CA, USA 75004393 For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control Illumina, Inc., CA, USA FC-110-3001 For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA A29789 For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer Omni International, GA, USA 19-001 Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit Thermo Fisher Scientific, CA, USA Q32854 DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture Illumina, Inc., CA, USA FC-130-1005 For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large) Lewis Bins, WI, US DV-2280 Fecal collection
Vertical Dividers (small) Lewis Bins, WI, US DV-1780 Fecal collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Microbiota विश्लेषण दो कदम पीसीआर और अगली पीढ़ी के 16S rRNA जीन अनुक्रमण का उपयोग
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Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N.… More

Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing. J. Vis. Exp. (152), e59980, doi:10.3791/59980 (2019).

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