Summary
Beskrevet her er en forenklet standard betjeningsprocedure for mikrobiome profilering ved hjælp af 16S rRNA metagenomanalyse sekvensering og analyse ved hjælp af frit tilgængelige værktøjer. Denne protokol vil hjælpe forskere, som er nye inden for mikrobiom-området, samt dem, der kræver opdateringer om metoder til at opnå bakteriel profilering ved en højere opløsning.
Abstract
Den menneskelige tarm er koloniseret af billioner af bakterier, der understøtter fysiologiske funktioner såsom fødevare metabolisme, energi høst, og regulering af immunsystemet. Perturbation af den sunde tarm mikrobiom er blevet foreslået at spille en rolle i udviklingen af inflammatoriske sygdomme, herunder multipel sklerose (MS). Miljømæssige og genetiske faktorer kan påvirke sammensætningen af mikrobiomet Derfor er identifikation af mikrobielle samfund, der er forbundet med en sygdoms fænotype, blevet det første skridt i retning af at definere mikrobiomes rolle i sundhed og sygdom. Brug af 16S rRNA metagenomanalyse sekventering for profilering bakteriel samfund har bidraget til at fremme mikrobiome forskning. På trods af sin brede anvendelse, er der ingen ensartet protokol for 16S rRNA-baseret taksonomisk profilering analyse. En anden begrænsning er den lave opløsning af taksonomisk tildeling på grund af tekniske vanskeligheder såsom mindre sekvensering læser, samt brug af kun Forward (R1) læser i den endelige analyse på grund af lav kvalitet af reverse (R2) læser. Der er behov for en forenklet metode med høj opløsning til at karakterisere bakteriel mangfoldighed i en given biopræparat. Fremskridt i sekvensering teknologi med evnen til at sekvens længere læser ved høj opløsning har bidraget til at overvinde nogle af disse udfordringer. Den nuværende sekvenserings teknologi kombineret med en offentligt tilgængelig metagenomisk analyse pipeline såsom R-baseret divisive Amplicon denoising algoritme-2 (DADA2) har medvirket til at fremme mikrobiel profilering ved høj opløsning, da DADA2 kan tildele sekvens på slægten og Arts niveauer. Beskrevet her er en guide til at udføre bakteriel profilering ved hjælp af to-trins forstærkning af v3-v4-regionen i 16S rRNA-genet, efterfulgt af analyse ved hjælp af frit tilgængelige analyseværktøjer (dvs. DADA2, Phyloseq og METAGENassist). Det menes, at denne enkle og komplette workflow vil tjene som et glimrende værktøj for forskere interesseret i at udføre mikrobiome profilering undersøgelser.
Introduction
Microbiota refererer til en samling af mikroorganismer (bakterier, vira, archaea, Bakteriofager og svampe), der lever i et bestemt miljø, og mikrobiomet refererer til det kollektive genom af residente mikroorganismer. Da bakterier er en af de mest udbredte mikrober i mennesker og mus, er denne undersøgelse kun fokuseret på bakteriel profilering. Den menneskelige tarm er koloniseret af trillioner af bakterier og hundredvis af bakteriestammer1. Den normale Gut mikrobiota spiller en afgørende rolle i at opretholde en sund tilstand i værten ved at regulere funktioner (dvs. vedligeholdelse af en intakt tarm barriere, føde stof metabolisme, energi homøostase, hæmning af kolonisering af patogene organismer, og regulering af immunrespons)2,3,4,5. Kompositoriske forstyrrelser af tarmen mikrobiota (Gut dysbiosis) har været forbundet med en række sygdomme hos mennesker, herunder gastrointestinale lidelser6, fedme7,8, slagtilfælde9, kræft10, diabetes8,11, reumatoid arthritis12, allergi13, og centrale nervesystem-relaterede sygdomme som multipel sklerose (MS)14,15 og Alzheimers sygdom (ad)8,16. Derfor har der i de senere år været stigende interesse for værktøjer til identificering af bakterie sammensætning på forskellige krops steder. En pålidelig metode bør have egenskaber såsom at være høj gennemløb og nem at bruge, der har evnen til at klassificere bakteriel mikrobiota med høj opløsning, og er lave omkostninger.
Kulturbaserede mikrobiologiske teknikker er ikke følsomme nok til at identificere og karakterisere den komplekse tarm mikrobiom på grund af svigt af flere tarm bakterier til at vokse i kulturen. Fremkomsten af den Sequencing-baserede teknologi, især 16S rRNA-baserede metagenomanalyse Sequencing, har overvundet nogle af disse udfordringer og omdannet mikrobiome forskning17. Advanced 16S rRNA-baseret sekvente Rings teknologi har hjulpet med at etablere en kritisk rolle for tarm mikrobiomet i menneskers sundhed. Det humane Mikrobiome-projekt, et nationalt Institut for sundhedsinitiativ18, og MetaHIT-projektet (et europæisk initiativ)19 har begge medvirket til at etablere en grundlæggende ramme for mikrobiomome analyse. Disse initiativer bidrog til at kickstarte flere undersøgelser for at bestemme den rolle, som tarm mikrobiomet spiller for menneskers sundhed og sygdom.
En række grupper har vist Gut dysbiosis hos patienter med inflammatoriske sygdomme12,14,15,20,21,22. Selv om det er almindeligt anvendt til taksonomisk profilering på grund af evnen til at multiplex og lave omkostninger, er der ingen ensartede protokoller for 16S rRNA-baseret taksonomisk profilering. En anden begrænsning er den lave opløsning af taksonomisk tildeling på grund af mindre sekvensering af læsninger (150 BP eller 250 BP) og brug af kun fremad sekvensering læst (R1) på grund af lav kvalitet reverse sekventering læser (R2). Men, fremskridt i sekvensering teknologi har bidraget til at overvinde nogle af disse udfordringer, såsom evnen til at sekvens længere læser ved hjælp af parret-end læser (f. eks Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nuværende sekvensering teknologi kan sekvens 600 BP god kvalitet læser, som tillader sammenlægning af R1 og R2 læser. Disse fusionerede længere R1 og R2 læser giver bedre taksonomiske tildelinger, især med åben adgang R-baseret divisive Amplicon denoising algoritme-2 (DADA2) platform. DADA2 bruger amplikonen Sequence variant (ASV)-baserede tildelinger i stedet for operationelle taksonomiske Unit (otu)-tildelinger baseret på 97% lighed udnyttet af qiime23. ASV kampe resulterer i en nøjagtig sekvens match i databasen inden for 1 – 2 nucleotider, hvilket fører til tildeling på slægten og Arts niveauer. Kombinationen af længere, kvalitetsmæssige og bedre taksonomiske tildelings værktøjer (som f. eks. DADA2) har således forvandlet mikrobiome studier.
Forudsat her er en trin-for-trin guide til udførelse af bakteriel profilering ved hjælp af to-trins forstærkning af v3-v4-regionen 16S rRNA og dataanalyse ved hjælp af DADA2, Phyloseq og METAGENassist pipelines. Til denne undersøgelse anvendes humane leukocytantigen (HLA) klasse II-Transgene mus, da visse HLA klasse II-alleler er forbundet med en disposition for autoimmune sygdomme som MS20,24,25. Men, betydningen af HLA klasse II gener i reguleringen af sammensætningen af Gut mikrobiota er ukendt. Det er en hypotese, at HLA klasse II molekyle vil påvirke Gut mikrobielle samfund ved at vælge for specifikke bakterier. Major komplekse Complex (MHC) klasse II Knockout-mus (AE. ko) eller mus, der udtrykker humane HLA-DQ8-molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 blev anvendt for at forstå betydningen af HLA-klasse II-molekyler i forme tarm mikrobielle samfund. Det menes, at denne komplette og forenklede arbejdsgang med R-baseret dataanalyse vil tjene som et glimrende redskab for forskere, der er interesseret i at udføre mikrobiome profilering undersøgelser.
Generation af mus mangler endogene murine MHC klasse II gener (AE. KO) og AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) Transgene mus med en C57BL/6J baggrund er blevet beskrevet tidligere26. Fækale prøver opsamles fra mus af begge køn (8 – 12 ugers alderen). Mus blev tidligere opdrættet og vedligeholdt i University of Iowa Animal facilitet som pr NIH og institutionelle retningslinjer. Forurenings bekæmpelses strategier såsom fravænning af musene inde i et laminar flow kabinet, udskiftning af handsker mellem forskellige stammer af mus og korrekt vedligeholdelse af mus er kritiske trin til profilering af Gut-mikrobiome.
Korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) anbefales stærkt under hele proceduren. Passende negative kontroller bør medtages, når der udføres DNA-isolation, PCR1 og PCR2 forstærkning, og sekvensering trin. Brug af sterile, DNase-fri, RNase-fri og pyrogen-fri forsyninger anbefales. Der skal anvendes en udpeget pipette til mikrobiome arbejde og filtrerede pipettespidser i hele protokollen. Mikrobiota analyse består af syv trin: 1) fækal prøveindsamling og behandling; 2) udvinding af DNA; 3) 16S rRNA-genamplifikation; 4) DNA-Biblioteks konstruktion ved hjælp af indekseret PCR; 5) oprydning og kvantificering af indekseret PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; og 7) databehandling og Sekvensanalyse. Der vises et skematisk diagram over alle protokol trin i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og anvendelse udvalg af University of Iowa.
1. fækal prøveindsamling og håndtering
- Steriliser skille kasserne (Se tabel over materialer, supplerende figur 1) med 70% ethanol.
- Foretikettens mikrocentrifuge glas (én pr. mus) med prøve-ID og behandlingsgruppe (hvis relevant).
- Placer musene i steriliserede skille kasser, og lad dem defecere normalt i op til 1 time.
- Saml fækal pellets i en tom, præ-mærket 1,5 ml mikrocentrifuge rør ved hjælp af sterile pincet og lukke røret forsvarligt. Steriliser pincet efter opsamling fra hver mus.
- Mikrocentrifuge røret, der indeholder fækale pellets, placeres i a-80 °C fryser indtil videre forarbejdning.
Bemærk: Opdeler boksene er fordelagtige, fordi de tillader samtidig indsamling af fækale prøver fra flere mus (op til 12) på én gang.
2. udvinding af DNA
- Fjern fækale prøver (mus eller menneske) fra fryseren og tø ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Det er tilrådeligt at tø menneskelige afføring prøver natten over ved 4 °C efter behov for at indsamle 200 mg eller den nødvendige mængde fra lagerprøver. - Brug 200 mg af udgangsmaterialer og elueres DNA til et endeligt volumen på 50 μl.
- Inkluder et DNA-isolations sæt blank, hvor der ikke tilsættes fækal prøve, men behandles gennem alle DNA-ekstraktions trin.
Bemærk: Der blev anvendt et specifikt DNA-isolations sæt (Se tabel over materialer), da det indeholder specifikke reagenser til fjernelse af hæmmende materialer såsom biotørstof, ufordøjet plantemateriale og hæm forbindelser fra lyseres røde blodlegemer til stede i menneske-og muse skammel Prøver. - Anbring perle røret i en homogenisator (Se tabel over materialer), og homogeniser prøverne til 45 s ved RT og en hastighed på 4,5 m/s.
Bemærk: Perle-slå homogenisator fra enhver producent kan anvendes. Det anbefales dog at standardisere metoden, især hastigheden og varigheden af homogenisering, når du bruger perle-slå homogenisator fra en anden leverandør. - Isoler DNA fra individuelle mus fækale prøver ved hjælp af en bakteriel DNA isolation kit efter producentens protokol (Se tabel over materialer) med mindre ændringer. Kvantificere det isolerede DNA ved at læsse 1 μL af DNA'ET på et fluorimeter eller på elektroforese-chippen med høj følsomhed (Se tabel over materialer).
Bemærk: Det forventede udbytte af DNA kan variere fra 500 – 2500 ng, når du starter med 200 mg af fækal prøven. - Juster koncentrationen af DNA til 4 – 20 ng/μL ved hjælp af elueringsbuffer. Requantify DNA'ET (som udført i trin 2,5) før du fortsætter til 16S rRNA genforstærkning (PCR1), hvis PCR1 ikke udføres på samme dag.
3.16S rRNA-Genamplifikation (PCR1)
- Opsæt 16S rRNA-genamplifikation (PCR1) i en 96 Well PCR-plade ved hjælp af en reaktions volumen på 25 μL.
- Ved hjælp af en multikanals pipette tilsættes 12,5 μL 2x high-fidelity polymerase enzym blanding, herunder buffer, foruden dNTP'er (Se tabel over materialer): 40 ng af DNA i op til 10,5 μl total volumen (Justér den totale volumen med PCR-kvalitet vand): 1 μl (hver) af forlæns og reverse primere ved 1 μM koncentration.
Bemærk: Sekvenser af primere er som følger:
fremad primer = 5 '-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' reverse primer = 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. Medtag et sæt, der er tomt fra trin 2,3 (kit-reagens kontrol) i PCR-pladen. - PCR-pladen Forsegl og centrifugeres ved 1.000 x g ved 20 °c i 1 min i en bordplade centrifuge (Se tabel over materialer) og udføres PCR i en termisk variator programmeret til: 95 °c i 3 min; 25 cyklusser af 1) 95 °C for 30 s, 2) 55 °C for 30 s, 3) 72 °C for 30 s; Endelig forlængelse ved 72 °C i 5 min; og hold ved 4 °C.
Bemærk: Selv om denne 16S rRNA-genforstærknings metode bør arbejde med forskellige typer af bioprøver, anbefales det at standardisere antallet af forstærknings cyklusser, når der startes et nyt projekt. - Bekræft størrelsen på PCR1 produkt ved at indlæse 1 μL af DNA'ET på en elektroforese-chip med høj følsomhed. Alternativt kan du køre 5 μL 16S rRNA-amplificeret produkt på en 1,5% agopstået gel for at bekræfte 550 BP af PCR1 produktet.
Bemærk: Oprydning af 16S rRNA amplificeret produkt er valgfrit og afhænger af den DNA-isolationssæt/metode, der anvendes. Hvis der anvendes en in-House DNA-isolationsmetode, kan PCR1 produkt rengøres ved hjælp af et mikrobiome DNA-rensningsudstyr i fabrikantens protokol (Se tabel over materialer). Det DNA-isolationssæt, der anvendes her, giver et ultrarent DNA og kræver ikke oprydning af PCR1 produktet.
4. DNA-Biblioteks konstruktion ved hjælp af indekseret PCR (PCR2)
-
Placer indeks 1 og index 2 Barcoded primere i et særligt rack (se tabel over materialer) til 96 biblioteker.
- Arranger indeks 1 primer i kolonne 1 – 12 og indeks 2 primer i række A – H i det særlige rack.
- Tilsæt 2,5 μL af indeks 1 i kolonne 1 – 12 og indeks 2 primer i række A – H ved hjælp af multikanalpipetter. Placer den nye hætte (Se tabel over materialer) på indeks 1 og indeks 2 adoptant primere, og opbevar den i en fryser med 20 °c.
- Ved hjælp af en multikanals pipette tilsættes 12,5 μL 2x high fidelity polymerase enzym blanding, der indeholder en buffer, foruden dNTP'er (Se tabel over materialer); 5 μL PCR-grad vand og 2,5 μL 16S rRNA-amplificeret produkt.
Bemærk: Tilføj unikke indekser til hver prøve for multiplexing på mere end 96 biblioteker i et enkelt løb, som beskrevet i Kiernan et al.27. Denne protokol bruger adaptere fra et kommercielt Kit (f. eks. nextera XT index Kit) i henhold til producentens instruktion i 16s metagenomik-sekvensningsmetoden (f. eks. Illumina). - Forsegl og centrifuger den indekserede PCR-plade ved 1.000 x g ved 20 °c i 1 min. og Udfør PCR i en termisk variator programmeret til: 95 °c i 3 min; 8 cyklusser af 1) 95 °C for 30 s, 2) 55 °C for 30 s, 3) 72 °C for 30 s; og endelig forlængelse ved 72 °C i 5 min.
- Bekræft 630-basis størrelsen for det indekserede PCR-produkt ved at indlæse 1 μL DNA på en elektroforese-chip med høj følsomhed. Alternativt kan du køre 5 μL indekseret PCR-produkt på en 1,5% agopstået gel for at bekræfte produktets størrelse og intensitet.
5. oprydning af indekseret PCR (PCR2) og kvantificering
- Pulje 5 μl af PCR2 amplikonen ved hjælp af multikanalpipetter fra hver brønd ind i en multikanals reservoir bakke fri for detekterbar DNase, RNase, humant DNA og pyrogene bakterier (Se tabel over materialer).
- Overfør det poolede produkt fra multikanals reservoir bakken til et tomt, formærket 1,5 mL mikrocentrifuge glas og vortex til mix.
- Purify PCR2 produkt ved hjælp af standard magnetiske perler Kit (Se tabel over materialer) som pr fabrikantens instruktion. Forsegl og opbevar de resterende 20 μL PCR2 i samme plade ved-80 °C til yderligere brug, hvis det er nødvendigt.
- Tilbered frisk 80% ethanol ved at tilsætte 4 mL 100% ethanol til 1 mL PCR-kvalitet vand.
- Ækvibrere den magnetiske perle til RT og vortex for 30 s at sprede perlerne jævnt.
- Kort vortex og spin ned de poolede PCR2 amplikonen prøver.
- Tilsæt 80 μL magnetiske perler til et formærket, sterilt 1,5 mL mikrocentrifuge glas med 80 μL af poolede PCR-produkter, derefter vortex og spin ned kort for jævnt at resuspendere de magnetiske perler.
- Inubat indholdet på RT uden at forstyrre rørene i 15 min.
- Anbring røret med DNA og magnetiske perler på en magnetisk stander (Se tabel over materialer) i 5 min.
- Fjern forsigtigt og kassér 150 μL af supernatanten.
- Tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol uden at forstyrre perlerne og inkubere i 30 s.
- Fjern forsigtigt, og Kassér alle supernatanten.
- Gentag trin 5.11 – 5.12. Fjern den resterende lydstyrke med en P10-pipette. Lad perlerne lufttørre i 15 minutter med indeks PCR-røret tilbage på magnet stativet.
- Fjern fra den magnetiske stander. Tilsæt 33 μL elueringsbuffer (elueringsbuffer af DNA-kit er acceptabel). Vortex godt, og udføre en hurtig spin for at fjerne eventuelle resterende væske på siden. Inkuber i 2 min. og anbring den magnetiske stander i 5 min.
- Overfør 30 μL af supernatanten (rene PCR-produkter) til et præ-mærket 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
- Kvantificer den rensede pulje ved at indlæse 1 μL af den rensede pulje på et fluorimeter eller en højfølsom elektroforese-chip, da dette vil være påkrævet under sekvensering. Udfør MiSeq som beskrevet nedenfor.
6. sekventering af MiSeq
- Opret et eksempelark, der indeholder eksempel specifikke stregkode oplysninger til metagenomik workflow og demultiplexede på miseq-instrumentet (Se tabel over materialer). Upload dette eksempelark til softwaren (f. eks. Illumina Experiment Manager).
- Fortynd de poolede biblioteker fra trin 5,15 til 4 nM.
- Denature poolet biblioteker ved at kombinere 5 μL af 4 nM bibliotek pulje med 5 μL frisklavet 0,2 M NaOH i en 1,5 mL mikrocentrifuge tube. Vortex kortvarigt for at blande, centrifugeres kortvarigt og Inkuber i 5 minutter ved Ambient RT.
- Tilsæt 990 μL iskold hybridiserings buffer (HB-buffer), og pipette forsigtigt for at blande. Dette vil give et 20 pM bibliotek.
- 2 μL af 10 nM-kontrol biblioteket kombineres med 3 μL EBT-buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, med 0,1% Tween 20) for at give et 4 nM-kontrol bibliotek. Tilsæt 5 μL frisklavet 0,2 N NaOH og vortex kortvarigt for at blande. Inkuber i 5 minutter ved RT.
-
Tilsæt 990 μL iskold hybridiserings buffer (HB-buffer), og pipette forsigtigt for at blande. Dette vil give 20 pM kontrol biblioteker.
Bemærk: denatureret 20 pM kontrol biblioteker kan opbevares ved-20 °C op til 4 uger. Efter 4 uger har klynge numrene en tendens til at falde.- Kombiner 210 μL af 20 pM-biblioteket med 40 μL af 20 pM-kontrol biblioteket (slutkoncentration = ~ 18%), og tilsæt 350 μL HB-buffer. Indlæs biblioteket ved en endelig koncentration på 7 pM.
Bemærk: Input detaljer skal justeres som pr køre præstation.
- Kombiner 210 μL af 20 pM-biblioteket med 40 μL af 20 pM-kontrol biblioteket (slutkoncentration = ~ 18%), og tilsæt 350 μL HB-buffer. Indlæs biblioteket ved en endelig koncentration på 7 pM.
- Inkubatprøver i 2 min ved 96 °C. Sæt på is i 5 min. Læg 600 μL af den endelige pulje i den korrekte brønd af MiSeq-patronerne.
Bemærk: Afsnit 6 ovenfor kan udføres på en genomisk/DNA-kerne facilitet.
7. data behandling og Sekvensanalyse
- Brug R-software (version 3,5) til DADA2 databehandling og analyser. I trin 7.1 – 7.4 skal du bruge den åbne software som beskrevet i den tidligere udviklede DADA2 online-vejledning, som findes på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >.
Bemærk: Et let brugbart R-script er blevet vedhæftet som en supplerende fil 2, og brugerne skal ændre navnet og kilden til sekvensering af filer (f. eks. SAMPLENAME_R1_001. fastq og SAMPLENAME_R2_001. fastq). - Visualiser kvalitets profilerne for de fremad-og omvendte læsninger ved hjælp af kommandoen plot Qualityprofile .
- Trim nukleotider fra fremad og omvendte læsninger baseret på kvalitets plot. Disse parametre er angivet ved Trunčlen parameter i DADA2.
Bemærk: Her anvendes 280 som den længde tærskel, som de fremadrettet læsninger skal kasseres i, og 260 anvendes som den længde tærskel, som de omvendte læsninger skal kasseres for. - Behandl RAW 16s data som fastq filer af DADA2 pipeline som skitseret i online tutorial (fundet på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >) til at fusionere R1 og R2 læser og danne amplikonen sekvens varianter (asvs), som derefter bruges til at tildele taxa med Silva referencedata Base23.
Bemærk: en prøve amplikonen Sequence variant tabel genereret fra DADA2 pipeline er inkluderet som supplerende fil 3. Der kan anvendes enten en Green gene-eller Silva-referencedatabase, da der ikke blev fundet forskelle i bakterie klassificeringen ved hjælp af en af disse databaser. - Generer en brugerdefineret tilknytningsfil, der indeholder metadataene (f. eks. genotype, køn, behandling osv.) for hver prøve. En eksempelmetadata-fil er medtaget som supplerende fil 4.
- Beregn Alpha diversitet (Shannon index) og beta mangfoldighed ved hjælp af Principal koordinater analyse (PCA) baseret på de forfinede otu tæller ved hjælp af phyloseq28 som skitseret i online tutorial, fundet på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >.
- Udfør følgende analyse i METAGENassist29.
Bemærk: Udfør den differentierede overflod analyse ved hjælp af Wilcoxon Rank-sum test på slægten niveau. Varmekort og differentielt rigelige taxa er fremhævet ved hjælp af METAGENassist29, en offentligt tilgængelig og web-baseret analyse pipeline.- Upload tabellen taksonomisk overflod (CSV-format), og vælg eksempler i kolonnen.
- Overfør tilknytningsfilen (CSV-format), og vælg eksempler i en række.
- Vælg Indstillinger for at fjerne variabler med over 50% nuller, og Udelad ikke-tildelte og ikke-tilknyttede læsninger.
- Vælg Indstillinger for at normalisere rækker efter sum og Logfør Normaliser kolonner.
- Lav en vulkan, PCA, eller plsda plot ved at klikke på det samme i venstre kolonne og klik på Fjern prøver navn for at gøre grafen.
- Udfør en t-test (hvis kun to grupper) eller ANOVA (hvis større end to grupper) for at visualisere de funktioner (bakterier), der varierer mellem grupperne. Klik på markerede funktioner for at visualisere bestemte bakterier, der varierer mellem grupperne.
- Klik på Dendrogram eller varmekort for at oprette respektive plots. Yderligere analyse, såsom prøve visualisering af grupper eller t-test/ANOVA-baserede Top 25-funktioner, kan udføres.
- Klik på Randomforest for at oprette grafer, der viser funktioner, som kan bruges til klassifikation. Klik på fanen afvigelse øverst for at oprette grafer for de mest populære funktioner, der er forskellige mellem/mellem grupper. Klik på funktions detaljer for at se en liste over bakterier, der varierer mellem grupperne, og klik på hver bakterie for at oprette en grafisk oversigt over det samme.
- Klik på fanen outlier øverst for at visualisere eksempler, der er outliers.
- Endelig skal du klikke på download og vælge enten 1) en zip-fil, der indeholder alle de udførte analyse eller 2) de ønskede funktioner til at downloade. Denne fil skal gemmes som et entydigt navn og skal pakkes ud før brug.
Bemærk: For detaljerede statistiske tests udført under mikrobiome analyse henvises til værker af Chen et al. og hugerth et al.14,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da MHC klasse II molekyler (HLA hos mennesker) er centrale aktører i den adaptive immunrespons og vise stærke foreninger med en disposition til MS24,25,26, det var en hypotese, at HLA klasse II molekyle påvirke tarm mikrobiel sammensætning. Derfor blev mus, der manglede MHC klasse II-genet (AE. KO) eller udtrykker humant HLA-DQ8-gen (HLA-DQ8) udnyttet til at forstå betydningen af HLA-klasse II-molekyler i udformningen af Gut mikrobielle samfund.
Fækale prøver blev indsamlet fra AE. KO (n = 16) og HLA-DQ8 (n = 12) Transgene mus, bakteriel DNA blev ekstraheret, og v3-v4-regionen af 16S rRNA-genet blev forstærket. Amplikonen-størrelsen (550 BP) blev bekræftet ved at køreprøverne på en 1,5% agopstået gel (figur 2a, Lanes 1–6). Yderligere bekræftelse af 16S rRNA amplikonen størrelse (550 BP) blev udført ved at indlæse 1 μl af PCR1 produktet på en høj følsomhed elektroforese chip (figur 2b, Lanes 1–7).
Et elektro pherogram blev genereret fra 16S rRNA PCR produkt, som viste peak regioner med fragmenter størrelse ~ 550 BP (figur 2c). Dual indekser og sekvente Rings adaptere blev fastgjort ved hjælp af indekseret PCR (PCR2), der tildelte en entydig identitet til hver prøve og tillod multiplexing af mange prøver i en enkelt MiSeq sekvensering Run. Bekræftelse af indekseret PCR blev udført af agrose gel elektroforese (figur 2a, Lanes 7–12) og en højfølsom elektroforese chip (figur 2b, Lanes 8–12), figur 2D]. Alle prøverne fra PCR2 blev samlet, renset og lastet på en næste generations sequencer, der gav frem til R1 og omvendte R2-læsninger af god kvalitet (figur 3). Median opnået læser efter kvalitet filtrering og trimning var 88.125 (interval af 9597 – 111848).
Fællesskabets økologi analyse blev udført ved hjælp af DADA2 analyse pipeline og visualiseret med Phyloseq og METAGENassist for at demonstrere forskelle i Alpha diversitet (figur 4) og beta mangfoldighed (figur 5), samt forskelle på slægten og Arts niveauerne mellem grupperne. DADA2 analyse genereret en overflod tabel med komma-separerede værdier i CSV-format, som blev brugt til yderligere downstream analyse ved hjælp af en webbaseret platform (dvs., Phyloseq og/eller METAGENassist). Alfa-og beta-mangfoldigheds analyserne blev udført på basis af brugerdefinerede kategorier, der er angivet i en tilknytningsfil.
Shannon diversitet analyse afslørede en samlet lavere Alpha mangfoldighed for AE. KO mus sammenlignet med HLA-DQ8 Transgene mus (figur 3). Koordination med hovedkoordinat analyse viste en distinkt rumlig klyngedannelse mellem AE. KO-mus og HLA-DQ8-Transgene mus (figur 5). En overflod tabel fra DADA2 blev også brugt til at udføre en omfattende metagenomanalyse analyse ved hjælp af åben adgang software metagenassist29. Varmekort-baseret klyngedannelse af bakteriel overflod (slægts niveau) (figur 6a) og et felt plot for specifikke bakterier, der viser forskellene mellem to grupper (figur 6b) blev genereret ved hjælp af en metagenassist rørledning.
Heat map analyse viste, at visse bakterier såsom Allobacullum, Desufovibrio, og rikenella var mere RIGELIGE i HLA-DQ8 Transgene mus. I modsætning hertil var Biolophila mere RIGELIG i AE. ko-mus (figur 6b). Relative mængder af individuelle bakterier (bilophila og rikenella) er vist i et repræsentativt felt plot (figur 6b). Tilsammen viser dataene, at AE. KO-mus besidder et særskilt mikrobielt fællesskab sammenlignet med HLA-DQ8-Transgene mus, med fravær af specifikke bakterier i AE. KO-mus. Data tyder også på, at MHC klasse II molekyler spiller en vigtig rolle i overflod af visse bakterier. Kort sagt, denne enkle og detaljerede protokol vil hjælpe forskere, der er nye til mikrobiome felt samt dem, der har brug for opdateringer om metoderne til at opnå højere taksonomisk opløsning.
Figur 1: flow diagram af Gut mikrobiome Sequencing. Alle trin i mikrobiomome sekvensering (prøveindsamling til mikrobiome dataanalyse) vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:16S rRNA-genforstærkning og kvalitetskontrol analyse af v3-v4-regionen. A) repræsentativt agrose gel elektroforese billede af 16s amplikonen (PCR1, str. 550 BP) og indekseret PCR (PCR2, size = 630 BP) fra AE. ko-mus (vogn 1 – 3 og 7 – 9) og HLA-DQ8-Transgene mus (Lanes 4 – 6 og 10 – 12). (B) repræsentativt gel billede af 16s amplikonen (PCR1, size = 550 BP) og indekseret PCR (PCR2, size = 630 BP) af AE. ko mus (Lanes 1 – 3 og 8 – 10) og HLA-DQ8 Transgene mus (Lanes 4 – 7 og 11 – 12) løst ved elektroforese. (C) repræsentativt elektroferogram af 16s amplikonen (PCR1) viste en peak region, der indeholder fragmenter, der var dimensioneret ~ 550 BP.D) repræsentativt elektro pherogram af indekseret PCR (PCR2) viste en spids region bestående af fragmenter i størrelse ~ 630 BP. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvalitets profil for fremad læsninger (R1, top) for to repræsentative prøver og tilsvarende omvendte læsninger (R2, bottom) for de samme prøver. Analysen blev udført ved hjælp af en DADA2 pipeline, hvor x-aksen viser læse længde (0 – 300 baser) og y-aksen viser kvaliteten af aflæsninger. Den grønne linje repræsenterer median kvalitets scoren, hvorimod den orange linje repræsenterer kvartiler af kvalitetsresultat fordelingen ved hver basisposition. Forward læsninger (R1) viste altid bedre kvalitet end omvendte læsninger (R2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Alpha diversitet foranstaltninger (Shannon mangfoldighed) af AE. ko mus og HLA-DQ8 Transgene mus. Hver prik repræsenterer α-diversitet (Shannon Diversity) i en prøve fra en enkelt mus. Shannon-mangfoldigheden var generelt lavere for AE. KO-mus sammenlignet med HLA-DQ8-Transgene mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: koordination med delvis mindste firkanter baseret Dimensionsanalyse plot. Plottet viser en klar adskillelse mellem AE. KO-mus og HLA-DQ8-Transgene mus. Hver prik repræsenterer bakteriel sammensætning i en prøve, og punkterede formørkelser indikerer 80% konfidensintervaller. PLS-DA-plottet blev genereret ved hjælp af METAGENassist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: AE. ko-mus, der viser et særskilt mikrobielt fællesskab sammenlignet med HLA-DQ8-Transgene mus, med fravær af specifikke bakterier i AE. ko-mus. A) varmekort kombineret med agglomerativ hierarkisk klyngedannelse, der viser den relative forekomst af bakterier (slægts niveau). B) felt plot, der viser en normaliseret relativ overflod af to repræsentative bakterier (Bilophila og RIKENELLA) i AE. ko og HLA-DQ8 Transgene mus. Begge parceller blev genereret ved hjælp af METAGENassist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: repræsentativt billede af skille boksen til indsamling af fækale prøver fra flere mus ad gangen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 2: DADA2 R-script til generering af overflod tabel fra RAW-sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Repræsentativ slægt overflod bord (CSV-format). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Repræsentativ tilknytningsfil (CSV-format). Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol er enkel, med nemme at følge trin til at udføre mikrobiome profilering ved hjælp af 16S rRNA metagenomanalyse sekvensering fra et stort antal bioeksemplarer af interesse. Næste generations sekvensering har forvandlet mikrobielle økologi studier, især i humane og prækliniske sygdomsmodeller31,32. Den største fordel ved denne teknik er dens evne til med succes at analysere komplekse mikrobielle kompositioner (culturable og ikke-culturable mikrober) i en given biopræparat på et højt gennemløb niveau og til en lav pris32. Men flere faktorer (dvs. batch effekter, udvælgelse af primere for 16S rRNA-gen, og sekvensdata analyse) fortsat en stor hindring i den udbredte brug af denne teknologi.
Advanced 16S rRNA-baserede miseq sekventering Technologies (2x300bp)33 tillader sekvensering af ~ 600 nukleotider ud af 1.500 nucleotid-Long 16S rRNA-genet af bakterier, som overvandt den tidligere flaskehals af korte sekvensering læser. Primere specifikke for en anden region af rRNA såsom v1-v2, v3-V5, eller V6-v9 kan bruges med hver region-specifikke primere viser nogle bias for over-eller under-detektion af bestemte taxa34,35. Nogle grupper foretrækker v1-v2 region21, som viser en øget bias for Clostridium men under detektion for visse bacteroidetes arter. I modsætning hertil foretrækker andre grupper v4-, v3-v4-og v3-V5-regionerne, som viser den mindst forudindtagede klassifikation af bakteriel taxa15,20,36,37.
Denne protokol bruger primere specifikt for v3-v4-regioner i 16S rRNA-genet, da det dækker den længere region 16S rRNA med to hypervariable regioner (v3 og v4) sammenlignet med v4 alene. Derudover, v3-v4 specifikke amplikonen tillader sammenlægning af både Forward (R1) og reverse (R2) læser, fører til bedre opløsning af bakteriel klassificering. Selvom v3-V5-regionen giver længere læsninger og dækker mere hypervariable regioner (v3, v4 og V5), er det udfordrende at fusionere R1 og R2-læsninger på grund af ingen/små overlappende områder mellem R1 og R2-læsninger. Derfor har en række undersøgelser kun brugt data fra R1 læser for bakteriel klassifikation, når der udføres 16S rRNA metagenomanalyse sekventering ved hjælp af v3-V5 region14.
Korrekt biopræparat opbevaring og håndtering er afgørende for mikrobiome analyse for at forhindre nedbrydning af bakteriel DNA eller miljøforurening38. Langtidsopbevaring af biopræparat ved RT eller 4 °C kan føre til overvækst af visse bakterier eller svampe. Prøverne kan enten fryses straks eller transporteres ved 4 °C (i 1 – 3 dage) og derefter fryses. Biopræparat kan også opbevares direkte i konserveringsmidler såsom nukleinsyre stabiliserings opløsning (f. eks. RNA-senere), 95% ethanol eller et kommercielt opbevaringsudstyr. Den generelle konsensus er, at en af disse lagringsmetoder ikke forårsager betydelige forskelle i bakterie samfund profiler39,40. Selv om en opløsning med konserveringsmidler giver mulighed for opbevaring og transport ved RT, kan disse prøver ikke anvendes til RNA-baserede assays, metabolit analyser eller fækale transplantations eksperimenter. Disse spørgsmål er blevet drøftet i detaljer andetsteds39,40.
Et af de afgørende skridt i denne protokol er brugen af en perle-slå-baseret metode til mekanisk afbrydelse af gram-positive bakterier og archaea. En tidligere undersøgelse viste den højeste bakterie mangfoldighed ved hjælp af perle-slå-baserede metode sammenlignet med andre metoder til celle lysis41. En ufuldstændig bakteriel lysis eller kontaminering under DNA-ekstraktion kan indføre bias i tarm mikrobiome data42. Et andet vigtigt punkt at overveje, er kontaminering på grund af laboratoriereagenser indgår i kits kaldet job43,44,45. Prøver med stor biomasse og rig bakteriel diversitet såsom jord eller afføring viser mindre af disse problemer sammenlignet med prøver med lavere biomasse såsom hud. Derfor bør en vand ekstraktions kontrol inkluderes med hver ekstraktion og forarbejdes med andre prøver for at identificere indslæbning af potentiel kontaminering på grund af DNA-ekstraktion43,44,45.
I mikrobiome analyse kan mangfoldigheden i en prøve måles ved Alpha diversitet, en måling af arternes rigdom eller beta diversiteten, som estimerer forskelle mellem prøver/grupper. Populære metoder til måling af α-diversitet omfatter unifrac (vægtet og uvægtet) kombineret med multivariat statistiske teknikker såsom Principal koordinat analyse (pcoa) eller BREY-Curtis dissimilaritet. Mens UniFrac er baseret på fylogenetiske afstande, udnytter BREY-Curtis dissimilaritet Analysis bakteriel overflod til generering af parceller. Uddybende beskrivelser om α-og β-diversitet drøftes andetsteds30,46,47. En række statistiske metoder kan udnyttes til at sammenligne forskelle i mikrobielle samfund mellem grupperne14,48. Det tilrådes at anvende justerede p-værdier i stedet for rå p-værdier for at korrigere for flere test14.
Der er en bred vifte af Bioinformatik software til at analysere målrettede sekvensering data selvstændigt49. Den foreslåede protokol anvender R-baserede open source-softwarepakker, som giver mulighed for brugervenlig og hurtig profilering af bakterielle taxa gennem R-baserede DADA2 rørledninger. Den overflod tabel genereret fra DADA2 kan anvendes til downstream-analyse ved hjælp af phyloseq og METAGENassist. DADA2 pipeline er fordelagtig over QIIME, fordi det ikke kræver særlige funktioner (dvs. installation af virtuelle maskiner eller docker containere), som har brug for relativt store beregningsmæssige ressourcer og særlig teknisk ekspertise. Især for begyndere til 16S analyse, R er tiltalende, da det er gratis og giver brugerne mulighed for at drage fordel af tilgængelige online tutorials og analyse scripts, der er nemme at udføre. Det er vigtigt, at disse analyseværktøjer kræver relativt små beregningsmæssige ressourcer og kan køres på en PC, Macintosh eller Linux-baseret platform. Derudover kan METAGENassist bruge overflod tabeller genereret fra DADA2 pipelines samt biologisk observation matrix (BIOM) filer genereret fra QIIME/MG-RAST til at udføre analyse såsom PCA, delvis mindste kvadrater diskriminant analyse (PLS-DA), vulkan plots, t-tests (sammenligne to grupper), ANOVA (sammenligne tre eller flere grupper), varmekort plots, tilfældig skov analyse, etc. METAGENassist blev fundet meget brugervenligt.
Sammenfattende beskriver denne protokol en simpel 16S rRNA metagenomanalyse-profilerings rørledning med en detaljeret vejledning om prøveindsamling, DNA-ekstraktion, metagenomanalyse Library-forberedelse, sekvensering af Illumina-miseq og brugervenlig dataanalyse med frit tilgængelige platforme (f. eks. DADA2, phyloseq og METAGENassist). Selv om 16S rRNA metagenomanalyse-baseret taksonomisk profilering er pålidelig til karakterisering af bakterier, der er til stede i særlige bioprøver, kan haglgevær metagenomanalyse sekventering være en bedre tilgang til detaljeret metaboliseringspathway analyse og stamme specifikke bakteriel identifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A. M. modtaget royalties fra Mayo Clinic (betalt af Evelo Biosciences) som en af de opfindere af en teknologi, der hævder brugen af Prevotella histicola til behandling af autoimmune sygdomme.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiering fra NIAID/NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust medicinsk forskningsinitiativ Grant, og University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al.
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
