Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Målretting narkotika til Larval Zebrafish Macrophages ved å injisere narkotika-lastet liposomer

Published: February 18, 2020 doi: 10.3791/60198
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Molecular Medicine and Pathology, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland, 2School of Pharmacy, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland, 3School of Medicine, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland

Summary

Her beskriver vi syntesen av legemiddelbelastede liposomer og deres mikroinjeksjon i larvesebrafisk med det formål å målrette narkotikalevering til makrofag-avstamningceller.

Abstract

Sebrafisk (Danio rerio) larver har utviklet seg til en populær modell for å undersøke host-patogeninteraksjoner og bidrag et medfødt immunceller til inflammatorisk sykdom på grunn av deres funksjonelt bevarte medfødte immunsystem. De er også mye brukt til å undersøke hvordan medfødte immunceller bidrar til å veilede utviklingsprosesser. Ved å dra nytte av den optiske gjennomsiktigheten og genetiske tractability av larval sebrafisk, fokuserer disse studiene ofte på levende bildetilnærminger for å funksjonelt karakterisere fluorescerende merkede makrofager og nøytrofiler i intakte dyr. På grunn av deres mangfoldige funksjonelle heterogenitet og stadig voksende roller i sykdomspatogenese, har makrofager fått betydelig oppmerksomhet. I tillegg til genetiske manipulasjoner brukes kjemiske intervensjoner nå rutinemessig til å manipulere og undersøke makrofagatferd i larvalsebrafisk. Levering av disse stoffene er vanligvis begrenset til passiv målretting av gratis stoff gjennom direkte nedsenking eller mikroinjeksjon. Disse tilnærmingene er avhengige av antagelsen om at eventuelle endringer i makrofagatferd er et resultat av en direkte effekt av stoffet på makrofagene selv, og ikke en nedstrøms konsekvens av en direkte effekt på en annen celletype. Her presenterer vi våre protokoller for målretting av legemidler spesielt til larvesebrafisk makrofager ved mikrosprøytende legemiddelbelastede fluorescerende liposomer. Vi avslører at poloxamer 188-modifiserte narkotika-lastet blå fluorescerende liposomer er lett tatt opp av makrofager, og ikke av nøytrofiler. Vi gir også bevis for at legemidler levert på denne måten kan påvirke makrofagaktivitet på en måte som er i samsvar med virkningsmekanismen til stoffet. Denne teknikken vil være av verdi for forskere som ønsker å sikre målretting av legemidler til makrofager og når narkotika er for giftige til å bli levert av tradisjonelle metoder som nedsenking.

Introduction

Det enukleære phagocyte-systemet gir en første forsvarslinje mot invaderende patogener. Dette systemet består av monocytter, monocytt-avledede dendrittiske celler og makrofager, som aktivt fagocytoze utenlandske patogener, og dermed begrense patogenspredning. I tillegg til disse fagocytiske og mikrobicidale effektorfunksjonene er dendrittiske celler og makrofager også i stand til cytokinproduksjon og antigenpresentasjon for å aktivere det adaptive immunsystemet1. Av disse cellene har makrofager fått spesiell oppmerksomhet på grunn av deres mangfoldige funksjonelle heterogenitet og involvering i flere inflammatoriske sykdommer, fra autoimmunitet og smittsomme sykdommer til kreft2,3,4,5,6,7. Plastisiteten til makrofager og deres evne til å funksjonelt tilpasse seg behovene til vevsmiljøet, krever eksperimentelle tilnærminger for å direkte observere og avhøre disse cellene i vivo.

Larval sebrafisk er en ideell modell organisme for å studere funksjonen og plastisiteten til makrofager in vivo8. Den optiske gjennomsiktigheten til larvalsebrafisk gir et vindu for å direkte observere oppførselen til makrofager, spesielt når de er kombinert med makrofag-merking transgene reporterlinjer. Utnytte live imaging potensial og eksperimentell elimive tractability av larval sebrafisk har ført til mange betydelig innsikt i makrofag funksjon som har direkte relevans for menneskelig sykdom9,10,11,12,13,14,15. Mange av disse studiene har også benyttet seg av høy bevaring av narkotikaaktivitet i sebrafisk (et attributt som underbygger deres bruk som en hel dyrenarkotikaoppdagelsesplattform16,17,18), ved å utnytte kjemiske intervensjoner til farmakologisk manipulere makrofagfunksjon. Til dags dato har disse farmakologiske behandlingene for det meste blitt levert enten gjennom nedsenking, noe som krever at stoffet er vannløselig, eller ved direkte mikroinjeksjon av fritt legemiddel (figur 1A). Begrensninger i disse passive leveringsstrategiene inkluderer off-target effekter og generell toksisitet som kan utelukke å vurdere eventuelle innvirkning på makrofagfunksjon. I tillegg, når du undersøker narkotikaeffekter på makrofager, er det ukjent om stoffene handler på makrofagene selv eller gjennom mer indirekte mekanismer. Når vi utfører lignende kjemiske intervensjonsstudier for å undersøke makrofagfunksjon, innså vi at det var et udekket behov for å utvikle en billig og grei leveringsmetode for å målrette narkotika spesielt mot makrofager.

Liposomer er mikroskopiske, biokompatible, lipid tolagsvesikler som kan innkapsle proteiner, nukleotider og legemiddellast19. Unilamellar eller multilamellær lipid bilayer struktur av liposomer danner en vandig indre lumen der vannløselige legemidler kan innlemmes mens hydrofobe legemidler kan integreres i lipidmembraner. I tillegg kan de fysikokjemiske egenskapene til liposomer, inkludert størrelse, ladning og overflatemodifikasjoner manipuleres for å skreddersy målrettingen til bestemte celler20,21. Disse funksjonene av liposomer har gjort dem til et attraktivt kjøretøy for å levere narkotika og forbedre presisjonen av dagens behandlingsregimer20. Som liposomer er naturlig phagocytozed av makrofager (en funksjon utnyttet av deres rutinemessigbruk i å levere clodronate spesielt til makrofager for ablasjon eksperimenter22), de presenterer som et attraktivt alternativ for makrofag-spesifikk narkotikalevering (Figur 1B).

Denne protokollen beskriver formuleringen av legemidler i blå fluorescerende liposomer belagt med hydrofile polymer poloxamer 188, som danner et beskyttende lag på liposom overflaten og har vist seg å forbedre stoffet oppbevaring og har overlegen biokompatibilitet23. Poloxamer ble valgt for overflatebelegg av liposomer som vår tidligere forskning hadde vist at sammenlignet med polyetylenglykol modifisertliposomer, poloxamer modifisertliposomer viste bedre biokompatibilitet etter subkutan injeksjon av rottepoter og lignende farmakokinetikk hos kaniner etter intravenøs infusjon23. Protokoller er også beskrevet for deres mikroinjeksjon i larval sebrafisk og levende bildebehandling for å vurdere deres makrofag-målretting evne og lokalisering til intracellulære rom som er nødvendige for liposom nedbrytning og cytoplasmatisk narkotikalevering. Som et konseptbevis har vi tidligere brukt denne teknikken til å målrette to legemidler til makrofager for å undertrykke aktiveringen i en larvesebrafiskmodell av akutt giktisk betennelse24. Denne legemiddelleveringsteknikken utvider den kjemiske "verktøykassen" som er tilgjengelig for sebrafiskforskere som ønsker å sikre makrofag-målretting av sine legemidler av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av narkotika-lastet Marina Blå-merket Liposomer

MERK: Liposomer som bærer det blå fluorescerende farge, Marina Blue og stoffet er utarbeidet ved hjelp av en tynn film hydreringsmetode med postinnsetting av poloxamer 188. Alle prosedyrer utføres ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert. Kontroller liposomer bare bære Marina blå og PBS. Eksemplet her beskriver lasting liposomer med en mitokondrier-målretting antioksidant narkotika25 som brukes i de representative resultatene som et bevis-of-concept.

  1. For å forberede liposomer, oppløse 16,4 mg (22,2 μmol) av fosfolipider 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (se Tabell av materialer), 4.3 mg kolesterol (se Materialer)og 2,8 mg (3,7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-fosfokolin (se Materialer, i 3 ml kloroform:metanol (3:1 v/v) i en 25 ml rundbunnskolbe.
  2. Til blandingen ovenfor tilsett 31 nmol av Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphosphoethanolamine (se Materialtabell)og 300 nmol av et mROS hemmende stoff (se Materialtabell)og sonikere kort for å oppløse soneksimentet helt. For kontroll liposomer, bare legge Marina Blå 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosfoetanolamin.
    MERK: For å unngå fotobleking av det lysfølsomme Marina Blue fluorescerende farge, beskytt alle prosedyrer mot lys, der det er mulig. Dette er også viktig hvis stoffet som skal lastes er lysfølsomt.
  3. Fjern oppløsningsvæsken langsomt på en roterende fordamper (se Materialtabell) over et temperaturkontrollert vannbad satt til 45 °C ved å rotere ved 75 o/min under vakuumtrykk (200 mbar i 15 min og deretter 0 mbar i 20 min). Dette danner en tørr tynn lipidfilm innenfor glassveggene i kolben som er ytterligere tørket i 45 min under N2 for å lette fullstendig fjerning av organisk løsningsmiddel.
  4. Etter dannelsen av den tynne filmen, sett vakuumtrykket til 40 mbar i 15 min, og tøm deretter med nitrogengass i 30 min for å sikre fjerning av rester løsemiddel.
  5. Hydrer den tynne filmen ved hjelp av 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7.4) og forsegle med parafilm før du agiterer kolben ved hjelp av en roterende fordamper over et 60 °C vannbad i 20 min for å danne vesikler.
  6. Subjekter den hydrerte suspensjonen til 7 sykluser med frysing og tining ved frysing i væske N2 i 3 min etterfulgt av nedsenking i et 45 °C vannbad i 7 min.
  7. Ekstrude liposomer gjennom en membran ved hjelp av en mini-ekstruder (se Tabell av materialer)og 1,0 μm spor-etset polykarbonat membraner (se Tabell av materialer)for 2-6 sykluser for å oppnå store unilamellar vesikler.
    MERK: For å oppnå gunstigere målretting mot makrofager, manipulere ekstrudering sykluser til diameteren av liposomer er ca 1 μm26,27,28.
  8. Kondenser de friske liposomene til en pellet ved ultracentrifugering ved 186 000 x g og inkubator med 1 ml 1% poloxamer 188 (se Materialtabell) oppløsning (10 mg/ml i PBS) ved 45 °C og 750 o/min i 30 min ved bruk av en termomikser med en 2 ml mikrocentrifugerørfeste (se Materialbord).
  9. Ultracentrifuge blandingen ved 186.000 x g i 1 t ved 4 °C og fjern supernatanten for å fjerne ubundet polymer eller legemiddel. Oppbevar liposomene ved 4 °C, beskyttet mot lys.

2. Karakterisering av liposom størrelse og Zeta potensial

  1. Fortynn liposom formulering med ultrarent vann (1:100) og mål partikkelstørrelsen, polydispersity index (PDI) og zeta potensial av liposomer ved hjelp av en dynamisk lys spredning analysator (se Tabell av materialer),i triplicate ved 25 °C.
    MERK: PDI er et mål på størrelsesfordelingen av nanopartikkelpopulasjonen. PDI-verdier < 0,05 angir en mer ensartet fordeling, mens verdier nærmere 1 angir en større størrelsesfordeling. Zeta potensialet er den totale overflateladningen.

3. Beregning av entrapment effektivitet og narkotika lasting i liposomer

MERK: For å bestemme entrapment effektiviteten av stoffet i liposomer, måles legemiddelinnholdet i supernatant og liposom pellet.

  1. Resuspend er liposompellet i 1 ml PBS.
  2. Fjern supernatanten, fortynn 10 x med ultrarent vann og analyser ved høyytelses flytende kromatografi (HPLC).
  3. For å bestemme legemiddelkonsentrasjonen i liposomene, tilsett 100 μL liposom suspensjon til 900 μL av 10% triton-X100 løsning (for å ødelegge lipidmembranen, slippe det festede stoffet og forhindre lipidoppbygging i HPLC-kolonnen) og vortex i 3 min før analyse.
  4. Injiser 20 μL prøve i et HPLC-system bestående av en kvartær pumpe, termostat auto-sampler og en 3 μm 250 x 4,6 mm kolonne. Sett den mobile fasen (10 mM PBS pH 2,5, acetonitrile og metanol (30:40:30, v/v/v)) strømningshastighet til 0,9 ml/min og få spektrale profiler ved hjelp av en diodearraydetektor satt til 230 mM.
  5. Beregn entrapmenteffektivitet (EE) og legemiddelbelastning (DL) ved hjelp av følgende ligninger:
    EE (%) = [Meg / Mt] x 100
    DL (%) = [Meg / Mlip] x 100
    Hvor jeg er massen av stoffet innkapslet, Mt er den totale massen av stoffet som brukes under formulering og Mlip er den totale massen av lipider (inkludert kolesterol) og innkapslet stoff.

4. Forberedelse og injeksjon av liposomer

  1. Forbered borosilikat mikroinjeksjonnåler ved å sette inn en tynn vegg borosilikat glasskapillær (1 mm OD x 0,78 mm ID x 10 cm lengde) i en mikropipette avtrekker (se Materialtabell) med følgende generiske avtrekksinnstillinger (varme 680, trekk 75, hastighet 40, tid 55 og trykk 530) for å produsere en konisk mikroinjeksjonsnål.
  2. Plasser nålene i en Petri-tallerken på modelleringsleire og ordne på en måte at den trukket enden ikke berører bunnen av parabolen. Hold petriskållokket lukket for å unngå støvkontaminering til det er klart til bruk.
  3. Fortynn nylagde liposomformuleringer 1:1 i sterile PBS (pH 7.4) og kort vortex (2-3 s) for å blande.
    MERK: Beskytt liposomer mot lys til larver er klare for mikroinjeksjon.
  4. Sett opp voksen sebrafisk avl par natten før og samle embryoer som tidligere beskrevet av Rosen et al.29.
  5. Overfør embryoene til en Petri-tallerken (100 mm x 20 mm stil med ca. 60 embryoer per tallerken) som inneholder E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)supplert med 0,1% metylenblå for å hemme soppvekst. Fjern alle døde eller ubefruktede embryoer og inkuber over natten ved 28,5 °C.
  6. For å lette levende bildebehandling, legg til 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) til E3-mediet når embryoene når 24 timer med utvikling for å forhindre pigmentdannelse (melanisering).
  7. Dechorionate embryoene manuelt ved ca. 30 timer etter befruktning (hpf) ved hjelp av fine spisstang.
    MERK: Ikke bruk enzymatisk behandling for å dechorionate embryoer, da dette kan forårsake epitelskade og lokal betennelse og dermed påvirke immunologiske studier
  8. La embryoene utvikle seg ved 28,5 °C til 2 dager etter befruktning (dpf).
  9. Forbered en injeksjonsplate ved å helle nok 3% metylcellulose (i E3-medier) inn i lokket på en liten 35 mm kulturrett for å danne en tynn film som dekker hele overflaten.
    MERK: Når du forbereder 3% metylcellulose i E3-medier, tar det flere dager før metylcelluloseet oppløses med mild agitasjon på en orbital shaker.
  10. Bedøve larver ved å inkubere i E3 media supplert med 200 μg/ml Tricaine.
  11. Samle et basseng på ca 20-25 larver ved hjelp av en plastoverføringspipette og la embryoene konsentrere seg på spissen av pipetten ved tyngdekraften. Ta vare på å overføre larver med minimal væske, plasser dem midt i 35 mm kulturfatlokket.
  12. Bruk en mikrokapillærlaster til å ordne larver på følgende måter: fremre mot toppen av injeksjonsplaten med dorsaloverflaten vendt mot mikroinjeksjonsnålen, for å injisere i bakhjernenventrikkel (Figur 2A-D); eller, fremre mot venstre for injeksjonsplaten (ved injeksjon fra høyre) med ventraloverflaten vendt mot mikroinjeksjonsnålen for å injisere i sinusvenosus (figur 2I).
    MERK: Når injisert på denne måten, hindbrain ventrikkel-resident (Figur 2E) og caudal hematopoietisk vev (CHT)-resident (Figur 2J) makrofager kan målrettes, henholdsvis. CHT-regionen av larval sebrafisk er et hematopoetisk sted som er analogt med pattedyrleveren. Vær ekstra oppmerksom på ikke å skade embryoene mens du arrangerer, da dette kan forårsake lokal betennelse og dermed påvirke immunologiske studier.
  13. Ta nylagde liposomer (fra trinn 4.3) og fyll en injeksjonsnål med ca. 5 μL av den liposominjeksjonsblandingen ved hjelp av en mikrokapillær laster (se Materialtabell).
    MERK: Når du vurderer lokalisering av liposomer til de fagolysosomale rommene i makrofager (Figur 2H),supplere denne injeksjonsblandingen med 200 μg/ml av en rød fluorescerende markør for fagosom (se Materialtabell) og 100 nM av en langt rød fluorescerende markør av lysosomer (se Materialtabell)for å markere flagosomer30,31 og lysosomer32,henholdsvis.
  14. Monter nålen i en mikromanipulator (se Materialtabell) koblet til et magnetisk stativ og en trykkinjektor (se Materialtabell). Posisjon under et stereomikroskop og sett injektoren til en pulsvarighet på ca. 50 ms og et injeksjonstrykk på ca. 40 psi.
  15. Skjær spissen av mikroinjeksjonsnålen med rene fine spisstang for å generere en åpning på ca. 5 μm i diameter.
  16. Kalibrer volumet som skal injiseres ved å injisere en bolus i en dråpe mineralolje plassert over rutenettlinjene til et hemocytometer. Juster pulsvarigheten og/eller injeksjonstrykket til bolusdiameteren dekker 2,5 av de minste rutenettlinjene (dette tilsvarer et volum på ca. 1 nL).
  17. Injiser forsiktig 1 nL av den liposominjeksjonsblandingen i bakhjernens ventrikkel av hver larver.
    MERK: Når du injiserer i bakhjernen ventrikkel, ta vare på ikke å trenge inn for langt ventrally (utover bakhjernen) som dette kan forstyrre den underliggende vaskulaturen fører til blødninger. Ved injeksjon i sinus venosus, bør det utvises forsiktighet for å sikre at nålens spiss er like innenfor perikardiet og ikke trenger inn i eggeplommen.
  18. Etter injeksjon, overfør umiddelbart de injiserte larver tilbake til E3-medier ved å legge E3-medier til injeksjonsplaten og forsiktig agitating larvene ut av metylcellulose ved hjelp av en plastoverføringspipette.
  19. Inkuber larver ved 28,5 °C (beskyttet mot lys) til analyse ved levende konfokal avbildning.

5. Confocal Imaging og bildeanalyse for å bekrefte makrofagmålretting av liposomer

  1. Varm opp et vannbad til 50 °C.
  2. Bedøve liposom-injisert larver ved å overføre til en ny Perti parabolsom inneholder E3 media supplert med 0,003% PTU og 200 μg / ml Tricaine.
  3. Forbered live imaging montering medium ved å oppløse 1% lavt smeltepunkt oppsto i E3 media, supplert med 0,003% PTU, i en mikrobølgeovn. Plasser i vannbadet og når løsningen er avkjølt til 50 °C, tilsett 200 μg/ml Tricaine.
  4. Hold monteringsmediet i 50 °C vannbadet for å forhindre for tidlig polymerisering av agarose.
  5. For å bilde bakhjernens dorsaloverflate på et konfokalmikroskop utstyrt med en vannnedsenkinglinse (Figur 2E),bygg inn larver som følger: Fyll en 35 mm kulturfat med monteringsmediet (til en dybde på ca. 5 mm) og la det polymerisere. Grave en liten grøft i agarose som er av tilstrekkelig størrelse for å imøtekomme eggeplomme sekk.
  6. Fyll en plastoverføringspipett med smeltet monteringsmedium, utvise en liten mengde, og bruk den til å samle de bedøvede larver. Overfør umiddelbart larver til kulturretten og orientere eggeplommer, ventralside ned, til de utgravde hullene, ved hjelp av en mikrokapillær laster. Periodisk opprettholde dem i denne posisjonen til agarose polymeriserer. Overlegg med E3-medier supplert med 200 μg/ml Tricaine.
    MERK: Ved overføring og posisjonering av larver må du passe på å ikke forårsake epitelskade og lokal betennelse som kan påvirke immunologiske studier. For plassering av larver for å leve bilde CHT-regionen (Figur 2J),monteres som beskrevet ovenfor, men plasser larver i det utgravde hullet lateralt.
  7. Når du forestiller deg et omvendt konfokalmikroskop, kan du bygge inn larver, uten agarosesengen, rett på bunnen av en bunnrett i glass. Ordne dem dorsal overflate ned (eller lateralt) og etter polymerisering, dekke hele parabolen overflaten med et jevnt lag av monteringsmedium. Når polymerisert, legg til et tynt lag med E3-medier supplert med 200 μg/ml Tricaine.
  8. Hvis du vil leve bildet, bruker du følgende innstillinger: 512 x 512 piksler. 40 x 3 μm Z-stabler (som strekker seg fra dorsal-de fleste overflaten av bakhjernen); 20x mål; 2.5x zoom.
    MERK: Når du sammenligner signalintensiteter mellom prøver (for eksempel når du forestiller opptaket av Marina Blue-merkede liposomer injisert i reporterlinjer som markerer enten makrofager [Tg (mpeg1:EGFP)33] eller nøytrofiler [Tg(lyz:EGFP)34]), er det viktig at laserinnstillingene holdes de samme (f.eks. pinhole diameter, laser spenning, offset og gevinst) for å sikre eventuelle forskjeller er ikke en artefakt av endrede bilde oppkjøpinnstillinger.
  9. Bruk 3D-bildeanalyseprogramvare for å kvantifisere makrofag eller nøytrofilopptak av Marina Blue-merkede liposomer. For å kvantifisere antall celler som inneholder liposomer (Figur 2F) i en Z-stabel, bla gjennom de enkelte Z-delene og telle antall individuelle celler som inneholder Marina Blue-merkede liposomer. For å kvantifisere fluorescensintensiteten til liposomer i celler (Figur 2G),tegner du en interesseregion rundt hver celle (i X-, Y- og Z-dimensjonene) for å kvantifisere den totale eller gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til intracellulær Marina Blue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den tynne filmen hydrering tilnærming beskrevet her for fremstilling av fluorescerende liposomer omslutter narkotika er en enkel og kostnadseffektiv metode. Med protokollen som brukes i denne studien, liposomer forventes å være unilamellar23,24. Størrelsen, zeta potensial, narkotika lasting og entrapment effektivitet av liposomer produsert er oppsummert i tabell 1. Partikkelstørrelsen på liposomene (før og etter lasting av legemidler) er like (Tabell 1). Overflateladningen (zeta potensial) av stoff-lastet liposomer er litt mer nøytral sammenlignet med kontroll liposomer, men de er alle negativt ladet betyr at dette ikke vil vesentlig endre deres biodistribusjonsmønster.

Mikroinjeksjon av Marina Blå-merket liposomer i bakhjernen ventrikkel resulterer i rask opptak av bosattmakrofager som lett kan observeres ved konfokal mikroskopi av 3 h etter injeksjon, når injisert i makrofag avstamning-merking transgenic reporter linje Tg (mpeg1:EGFP)33 (Figur 2C, E-G). Dette er i motsetning til nøytrofiler (som merket innenfor nøytrofilspesifikke Tg(lyz:EGFP)34 reporterlinje) som sjelden observeres inneholder intracellulære liposomer (figur 2E-G). Innenfor individuelle liposom-laden makrofager akkumuleres liposomene i phagolysosomale rom (figur 2H), som er nødvendig for liposom nedbrytning og påfølgende frigjøring av innholdet i legemidlet i cytoplasma35. Velge ulike mikroinjeksjon nettsteder for liposom levering kan påvirke hvilke vev-bosattmakrofager er målrettet. Som eksempler, levering i hindbrain ventrikkel effektivt rettet mot hindbrain-resident makrofager (Figur 2D,E) mens mikroinjeksjon i sinus venosus kan levere liposomer til CHT-resident makrofager via sirkulasjonen (Figur 2I,J).

Vurdering av mikroinjeksjonsstedet for liposom levering er viktig når du bruker denne teknikken til å avhøre makrofagresponsen på en immunologisk utfordring, da det bidrar til å sikre at de spesielle makrofagene som undersøkes, mottar stoffet. Vi har rutinemessig brukt denne protokollen for levering av legemiddelbelastede liposomer i hindbrain ventrikkel for å vurdere virkningen av disse stoffene på makrofagresponsen på mononatriumurate (MSU) krystaller, tilsvarende injisert i bakhjernerommet (Figur 3A). Som årsaksmiddel for akutt giktbetennelse aktiverer MSU-krystaller vev-resident makrofager for å produsere proinflammatoriske mediatorer, inkludert Interleukin-1β (IL-1β) gjennom en prosess avhengig av mitokondriereaktive oksygenarter (mROS)10,36,37,38. Disse aktiverte makrofagene driver deretter nøytrofilinfiltrasjon, et kjennetegn på akutt gikten betennelse. Mikroinjeksjon av liposomer lastet med et mROS-hemmende stoff i hindbrain ventrikkel kan betydelig undertrykke MSU krystalldrevet mROS produksjon i liposom-laden hindbrain-resident makrofager (Figur 3B-D). Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, oppnådde vi en entrapmenteffektivitet på 49,12 ± 0,17 %, noe som resulterte i en formulering med en legemiddelkonsentrasjon på 103,05 ± 0,36 μM. Merk at injeksjon av et 1 nL-volum ved denne konsentrasjonen ikke resulterte i observerbar toksisitet under våre eksperimenter, noe som gjenspeiles av brutto morfologiske endringer eller hjertestans. Ytterligere validering av de undertrykkende effektene av dette stoffet på makrofagaktiveringstilstand kan utføres ved å undersøke il1b-uttrykk (sebrafisken ortholog av IL-1β) ved hele fjellet in situ hybridisering (Figur 4A,B) og temporal rekruttering av nøytrofiler (Figur 4C,D).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrerer konvensjonell gratis levering av legemidler versus liposom-mediert legemiddellevering til larvalsebrafisk. (A) Strategier rutinemessig brukt for narkotikalevering til larval sebrafisk er i stor grad begrenset til nedsenking i, eller mikroinjeksjon av, gratis stoff. (B) Mikroinjeksjon av legemiddelbelastede liposomer gjør det mulig for direkte målretting mot makrofager, hvor liposom nedbrytning i phagolysosomale rom resulterer i cytoplasmatisk legemiddellevering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Målretting av legemidler mot makrofager ved hjelp av fluorescerende liposomer. (A) Microinjection oppsett som viser mikroinjeksjon nål (svart pil) og larver kledd i en 35 mm vev kultur parabolen innenfor 3% metylcellulose. (B) Forstørret visning av larver kledd som i A. (C) Live confocal bilde av 2 dpf Tg (mpeg1: EGFP) larver, mot venstre. (D) Forstørret visning av arrayed larver, som i A, demonstrere mikroinjeksjon i bakhjernen ventrikkel (svart pil markerer mikroinjeksjon nål). (E) Skjematisk illustrerer målretting av hindbrain-resident makrofager og levende confocal bilder (dorsal visninger, anterior til venstre) av bakhjernen regionen Tg (mpeg1:EGFP) og Tg (lyz:EGFP) larver, 3 t etter hindbrain mikroinjeksjon av Marina Blå-merket liposomer (hvite piler liposome-laden makrofager). (F og G) Kvantifisering av liposomopptak av makrofager og nøytrofiler (som det oppdages i E), målt som antall celler som inneholder (F) og fluorescensintensiteten /cellen (G) av Marina Blå-merkede liposomer. (H) Levende konfokal bilde av liposom-laden makrofag i bakhjernen merket med en rød fluorescerende markør av fagosomer og en langt rød fluorescerende markør av lysosomer i Tg (mpeg1:EGFP) larver, 3 t etter hindbrain mikroinjeksjon av Marina Blå-merket liposomer. (I) Forstørret visning av arrayed larver, som i A, demonstrere mikroinjeksjon i sinus venosus (svart pil markerer mikroinjeksjon nål). (J) Skjematisk illustrerer målretting av CHT-resident makrofager og levende confocal bilder (lateralvisninger, anterior til venstre) av CHT-regionen tg (mpeg1:EGFP) og Tg (lyz:EGFP) larver, 3 t etter mikroinjeksjon av Marina Blå-merkede liposomer inn i sinus venosus (piler liposome-laden makrofager). Feillinjer viser gjennomsnitt ± SD. *p<0,05; p < 0.0001, Studentens t-test. Skalastenger = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D og I), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J). Dette tallet er endret fra forrige publikasjon24. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Mikroinjeksjon av liposomer lastet med et mROS-hemmende legemiddel undertrykker mROS-produksjonen i aktiverte makrofager. (A) Skjematisk illustrerer målrettingen av et mROS-hemmende stoff til makrofager og vurderer det er innvirkning på makrofagaktivering etter MSU krystallstimulering. (B og C) Levende konfokale bilder av liposom-laden makrofager (kontroll liposomer / L-C (B) eller mROS-hemmende liposomer / L-MI (C)) innenfor bakhjernen til Tg (mpeg1: EGFP) larver, også merket med en fluorescerende mROS-spesifikk sonde (se Materialtabell, hvor fluorescerende signal vises som et varmekart med varme farger som representerer høyere nivåer av mROS), 3 t etter hindbrain mikroinjeksjon av Marina Blå-merkede liposomer og MSU krystaller. Marina Blue fluorescens er pseudofarget i gråtoner. (D) Kvantifisering av fluorescensintensitet av mROS-spesifikk sonde i makrofager, som det oppdages i B og C. Feillinjer viser bety ± SD. ****p < 0,0001, Studentens t-test. Skalabar = 10 μm (B). Dette tallet er endret fra forrige publikasjon24. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Mikroinjeksjon av liposomer lastet med en mROS-hemmer undertrykker il1b-uttrykk i aktiverte makrofager og makrofagdrevet nøytrofilrekruttering. (A) Uttrykk for il1b (merket med svarte piler), som det oppdages av hele mount in situ hybridisering, innenfor bakhjernen regionen 3 h etter hindbrain mikroinjeksjon av kontroll (L-C) eller mROS-hemmende liposomer (L-MI) og MSU krystaller, strammere til venstre. Tall representerer andel larver med viste fenotyper. (B) Kvantifisering av il1b uttrykk, som det oppdages i A, vist som prosent larver som viser høy, lav eller ingen uttrykk. (C)Konfokale bilder av nøytrofiler innenfor bakhjerneområdet tg(lyz:EGFP) larver (dorsal visninger, anterior til venstre), som det oppdages av immunofluorescence 3 (3 hpi) og 6 (6 hpi) h etter hindbrain mikroinjeksjon av L-C eller L-MI og MSU krystaller. (D) Temporal kvantifisering av nøytrofiler, som det oppdages i C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) og 9 (9 hki) h etter hindbrain mikroinjeksjon av L-C eller L-MI og MSU krystaller. Feillinjer viser bety ± SD. ****p < 0.0001, n.s. ikke signifikant, enveis ANOVA, Dunnetts post hoc-test. Skalerstenger = 100 μm (A), 50 μm (C). Dette tallet er endret fra forrige publikasjon24. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Fysikokjemisk egenskap av liposomer (L) Kontrollere liposomer mROS-hemmende liposomer
Størrelse (μm) 1,2 ± 0,07 1,1 ± 0,04
Zeta potensial (mV) -25,9 ± 0,57 -13,0 ± 0,11
Entrapment effektivitet (EE, %) N/a 49,12 ± 0,17
Lasting av legemidler (DL, %) N/a 0,37 ± <0,01

Tabell 1: Fysikokjemiske egenskaper ved PBS (kontroll) eller mROS-hemmende liposomer (data er midler ± standardavvik, n = 3). Alle liposomer ble merket med Marina Blue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi gitt en detaljert protokoll for å formulere legemiddelbelastede liposomer for å spesifikt målrette makrofager i larvalsebrafisk. Denne metoden kan brukes til å dissekere makrofagenes rolle i visse sykdomsmodeller ved å sikre direkte målrettet levering av legemidler spesielt til makrofager. Videre kan det brukes når generell toksisitet av narkotika begrenser bruken når de leveres av mer konvensjonelle ruter, som nedsenking. Protokollen som er beskrevet her, gir et alternativ til andre nanopartikler som har blitt brukt til å målrette medfødte immunceller i larvalsebrafisk. Disse inkluderer målretting antimalarial stoffet rifampicin til Mycobacterium marinum-infiserte makrofager for å fremme bakteriell clearance ved hjelp av sub-mikron størrelse polymernanopartikler39. I et annet eksempel har innkapsling av (R)-roskovitiner, en induktor av nøytrofil apoptose, innenfor polymerosomer vist seg å målrette dette stoffet mot nøytrofiler, og dermed fremme betennelsesoppløsning40. I denne protokollen har vi brukt liposomer som et kjøretøy for narkotikalevering på grunn av deres ikke-giftige, biokompatible og biologisk nedbrytbare egenskaper. I tillegg er de ikke-immunogene, noe som er av særlig betydning når de brukes til å undersøke immunologiske reaksjoner, for eksempel de som er beskrevet her. En rekke laster kan også bæres, inkludert hydrofile, hydrofobe, ampeofiske og lipofile legemidler.

Når du utfører denne protokollen, er det en rekke kritiske trinn der spesiell forsiktighet må tas. Disse inkluderer trinn der larver håndteres fysisk og må tas vare på for å minimere utilsiktet skade på larver. Dette inkluderer når dechorionating larver (spesielt unngå kontakt med delikat epitelforing av eggeplommen), arraying larver på injeksjonsplaten, fjerning fra platen etter injeksjoner og deres montering for levende confocal imaging. En uunngåelig del av denne protokollen er behovet for å levere liposomene (og eventuelle immunutfordringer) gjennom mikroinjeksjon som kan forårsake lokal betennelse og derfor kan påvirke det eksperimentelle utfallet. Mikroinjeksjon i larval sebrafisk krever en viss grad av trening for å minimere vevsskader. I vårt arbeid genererer en mikroinjeksjon nål spiss diameter på ca 5 μm genererer svært mindre overflate epitelskade (som det fremgår av svært lavt uttrykk for inflammatorisk markør matrise metallopeptidase 9 innenfor overflaten epitelceller i umiddelbar nærhet av mikroinjeksjonsåret10)når du injiserer i bakhjernen ventrikkel av 2 dpf larver. Denne diameterspissen er også liten nok til å unngå lekkasje av injisert innhold, ut av bakhjernenventrikkel, når mikroinjeksjonsnålen fjernes. Det er viktig å merke seg her at injeksjonsvolumer større enn 2 nL ofte vil resultere i at noe av det injiserte innholdet flyter over gjennom injeksjonshullet som følge av å overskride volumet av ventrikkelen. En spissdiameter på 5 μm er også av tilstrekkelig størrelse til å injisere påfølgende immunutfordringer, for eksempel MSU-krystaller10. Skråtning av mikroinjeksjonsnålespissen til 45° med en mikrokvern for å generere en skarp spiss kan gi bedre penetrasjon av ytre periderm og indre basal epitellag som dekker bakhjernenventrikkel41. Det er viktig å merke seg at kontroll injeksjoner som de som brukes her (dvs. kontroll liposomer) er avgjørende når du vurderer effekten av narkotika-lastet liposomer på makrofag funksjon for å kontrollere for injeksjonsprosessen selv. Velge en konsentrasjon for et gitt stoff når formulere til liposomer er også et viktig skritt som etablerte effektive legemiddelkonsentrasjoner, når levert av nedsenking, kan avvike fra de som er nødvendige når du bruker liposom-mediert narkotikalevering. I tillegg, når du bruker denne protokollen, bør man være forsiktig med å endre de fysikokjemiske egenskapene til liposomene etter modifikasjon med poloxamer, da dette kan påvirke deres biodistribusjonsmønster.

Et område for modifisering og fremtidig utvikling av denne protokollen vil være å undersøke innlemme ulike overflatefunksjoner til liposomer som ligander eller reseptorer for å ytterligere forbedre makrofag målretting og opptak, eller å målrette ulike immunceller, for eksempel nøytrofiler. Denne avanserte tilnærmingen vil kreve ytterligere studier for å avdekke overflatefunksjoner som er unike for de forskjellige sebrafisk immuncellerommene, som for tiden er dårlig forstått. Ytterligere områder for endring av denne protokollen inkluderer inkorporering av andre fluorescerende sonder i liposomene for å utvide sin allsidighet (f.eks. når de injiseres i andre transgene reporterlinjer) og endre deres fysiske egenskaper slik størrelse og lade42,43. Det vil også være viktig å undersøke om ulike ruter for liposom administrasjon på ulike larvestadier kan utvide sin allsidighet til å målrette mot ytterligere makrofagpopulasjoner, for eksempel intestinale epitelceller. I protokollen som er beskrevet her, ble alle injeksjoner utført på 2 dpf larver. I løpet av den tredje dagen av sebrafisk utvikling en enkelt kontinuerlig lumen fra munnen til anus former, etter åpningen av munnen44. Ved den fremre dagen åpner anusen som resulterer i et helt åpent rør foret med et polarisert epitel44. Det vil være interessant å se om nedsenking av eldre larver i liposomer kan lette målrettingen av innkapslede legemidler til intestinale epitelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke finnes konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd tildelt C.J.H. (Health research Council of New Zealand og Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) og Z.W. (Faculty Research Development Fund fra University of Auckland). Forfatterne takker Alhad Mahagaonkar for ekspertstyring av sebrafiskanlegget, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland for hjelp med confocal imaging og Graham Lieschke for å gi tg (mpeg1:EGFP) reporterlinje.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  2. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  3. Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
  4. Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
  5. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
  6. Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  9. Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
  10. Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
  11. Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
  14. Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  15. Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
  16. Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
  17. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  18. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  19. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
  20. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
  21. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  22. Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
  23. Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
  24. Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
  25. Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
  26. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
  27. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
  28. Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
  29. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  30. Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
  31. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  32. Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
  33. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  34. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  35. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
  36. Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
  37. Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
  38. Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
  39. Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
  40. Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
  41. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
  42. Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
  43. Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
  44. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 156 sebrafisk makrofager liposomer legemiddellevering medfødt immunitet levende bildebehandling
Målretting narkotika til Larval Zebrafish Macrophages ved å injisere narkotika-lastet liposomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. … More

Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. W., Dalbeth, N., Wu, Z., Hall, C. J. Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes. J. Vis. Exp. (156), e60198, doi:10.3791/60198 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter