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Immunology and Infection

दवा से भरे लिपोसोम्स इंजेक्शन द्वारा लार्वा जेब्राफिश मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करना

Published: February 18, 2020 doi: 10.3791/60198
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Molecular Medicine and Pathology, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland, 2School of Pharmacy, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland, 3School of Medicine, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland

Summary

यहां, हम मैक्रोफेज-वंश कोशिकाओं को दवा वितरण को लक्षित करने के उद्देश्य से दवा से भरे लिपोसोम और लार्वा जेब्राफिश में उनके माइक्रोइंजेक्शन के संश्लेषण का वर्णन करते हैं।

Abstract

जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)लार्वा मेजबान-रोगजनक बातचीत की जांच करने और उनके कार्यात्मक रूप से संरक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के कारण भड़काऊ रोग के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के योगदान के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के रूप में विकसित हुआ है। वे भी व्यापक रूप से कैसे सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं विकास प्रक्रियाओं गाइड में मदद की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । लार्वा जेब्राफिश की ऑप्टिकल पारदर्शिता और आनुवंशिक ट्रैकेबिलिटी का लाभ उठाकर, ये अध्ययन अक्सर जीवित इमेजिंग दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित करते हैं ताकि बरकरार जानवरों के भीतर फ्लोरोसेंटी चिह्नित मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल की कार्यात्मक रूप से विशेषता हो सके। रोग रोगजन्य में उनकी विविध कार्यात्मक विषमता और कभी-कभी विस्तार की भूमिकाओं के कारण, मैक्रोफेज को महत्वपूर्ण ध्यान मिला है। आनुवंशिक जोड़तोड़ के अलावा, रासायनिक हस्तक्षेप अब नियमित रूप से हेरफेर और लार्वा जेब्राफिश में मैक्रोफेज व्यवहार की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन दवाओं की डिलीवरी आमतौर पर प्रत्यक्ष विसर्जन या माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से मुफ्त दवा के निष्क्रिय लक्ष्यीकरण तक सीमित है। ये दृष्टिकोण इस धारणा पर भरोसा करते हैं कि मैक्रोफेज व्यवहार में कोई भी परिवर्तन मैक्रोफेज पर दवा के प्रत्यक्ष प्रभाव का परिणाम है, न कि किसी अन्य सेल प्रकार पर सीधे प्रभाव का डाउनस्ट्रीम परिणाम। यहां, हम दवा से भरे फ्लोरोसेंट लिपोसोम्स को माइक्रोइंजेक्ट करके विशेष रूप से लार्वा जेब्राफिश मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करने के लिए अपने प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम बताते हैं कि पोलोक्सामर 188-संशोधित दवा से भरे नीले फ्लोरोसेंट लिपोसोम को मैक्रोफेज द्वारा आसानी से लिया जाता है, न कि न्यूट्रोफिल द्वारा। हम इस बात के सबूत भी प्रदान करते हैं कि इस तरह से वितरित की गई दवाएं दवा की कार्रवाई के तंत्र के अनुरूप मैक्रोफेज गतिविधि को प्रभावित कर सकती हैं । यह तकनीक मैक्रोफेज के लिए दवाओं के लक्ष्यीकरण को सुनिश्चित करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए मूल्य की होगी और जब ड्रग्स विसर्जन जैसे पारंपरिक तरीकों से वितरित करने के लिए बहुत जहरीले हैं ।

Introduction

मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट सिस्टम रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। इस प्रणाली में मोनोसाइट्स, मोनोसाइट-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाएं और मैक्रोफेज होते हैं, जो सक्रिय रूप से विदेशी रोगजनकों को फागोसाइटोज़ करते हैं, जिससे रोगजनक फैलते हैं। इन फागोसाइटिक और माइक्रोबिसिल प्रभावक कार्यों के अलावा, डेंड्रिटिक कोशिकाएं और मैक्रोफेज अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणालीकोसक्रिय करने के लिए साइटोकिन उत्पादन और एंटीजन-प्रस्तुति में भी सक्षम हैं। इन कोशिकाओं में से, मैक्रोफेज को उनकी विविध कार्यात्मक विषमता और कई भड़काऊ रोगों में शामिल होने के कारण विशेष ध्यान मिला है, ऑटोइम्युनिटी और संक्रामक रोगों सेकैंसर2,3,4,5,6,7तक। मैक्रोफेज की प्लास्टिसिटी और उनके ऊतक पर्यावरण की जरूरतों के अनुकूल होने की उनकी क्षमता को वीवो में इन कोशिकाओं का सीधे निरीक्षण और पूछताछ करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

लार्वा जेब्राफिश एक आदर्श आदर्श जीव है जिसके द्वारा वीवो8में मैक्रोफेज के कार्य और प्लास्टिसिटी का अध्ययन करना है । लार्वा जेब्राफिश की ऑप्टिकल पारदर्शिता सीधे मैक्रोफेज के व्यवहार का पालन करने के लिए एक खिड़की प्रदान करती है, खासकर जब मैक्रोफेज-मार्किंग ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के साथ मिलकर। लार्वा जेब्राफिश की लाइव इमेजिंग क्षमता और प्रायोगिक ट्रैकेबिलिटी का दोहन करने से मैक्रोफेज फ़ंक्शन में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त हुई हैं जिनकी मानव रोग9, 10,11,12,13,14,15की सीधी प्रासंगिकता है . इनमें से कई अध्ययनों ने जेब्राफिश में दवा गतिविधि के उच्च संरक्षण का लाभ भी उठाया है (एक विशेषता जो एक पूरे पशु दवा खोज मंच16,17,18के रूप में उनके उपयोग को रेखांकित करती है, औषधीय रूप से मैक्रोफेज फ़ंक्शन में हेरफेर करने के लिए रासायनिक हस्तक्षेपों का उपयोग करके। आज तक, इन औषधीय उपचारों को ज्यादातर विसर्जन के माध्यम से वितरित किया गया है, जिसके लिए दवा को पानी में घुलनशील होने की आवश्यकता होती है, या मुफ्त दवा के प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन(चित्रा 1ए)द्वारा। इन निष्क्रिय वितरण रणनीतियों की सीमाओं में ऑफ-टारगेट प्रभाव और सामान्य विषाक्तता शामिल है जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन पर किसी भी प्रभाव का आकलन करने में बाधा डाल सकती है। इसके अतिरिक्त, मैक्रोफेज पर दवा प्रभावों की जांच करते समय यह अज्ञात है कि क्या दवाएं स्वयं मैक्रोफेज पर या अधिक अप्रत्यक्ष तंत्र ों के माध्यम से कार्य कर रही हैं। मैक्रोफेज फ़ंक्शन की जांच करने के लिए इसी तरह के रासायनिक हस्तक्षेप अध्ययन करते समय, हमने माना कि विशेष रूप से मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करने के लिए एक सस्ती और सीधी डिलीवरी विधि विकसित करने की एक अपूरित आवश्यकता थी।

लिपोसोमसूक्ष्म, जैव संगत, लिपिड बाइलेयर्ड वेसिकल्स हैं जो प्रोटीन, न्यूक्लियोटाइड्स और ड्रग कार्गो19को समाहित कर सकते हैं। लिपोसोम्स की अनिलामेलर या मल्टीलामेलर लिपिड बाइलेयर संरचना एक जलीय आंतरिक ल्यूमेन बनाती है जहां पानी में घुलनशील दवाओं को शामिल किया जा सकता है जबकि हाइड्रोफोबिक दवाओं को लिपिड झिल्ली में एकीकृत किया जा सकता है। इसके अलावा, लाइपोसोम के भौतिक रासायनिक गुणों, जिसमें आकार, आवेश और सतह संशोधन शामिल हैं, को विशिष्ट कोशिकाओं20,21के लिए उनके लक्ष्यीकरण को दर्जी करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है। लिपोसोम्स की इन विशेषताओं ने उन्हें दवाएं पहुंचाने और वर्तमान उपचार आहार20की सटीकता बढ़ाने के लिए एक आकर्षक वाहन बनाया है । चूंकि लिपोसोम्स स्वाभाविक रूप से मैक्रोफेज द्वारा phagocytozed होते हैं (विशेष रूप से एब्लेशन प्रयोगों22के लिए मैक्रोफेज के लिए क्लोड्रेनाट वितरित करने में उनके नियमित उपयोग द्वारा शोषित एक विशेषता), वे मैक्रोफेज-विशिष्ट दवा वितरण(चित्र ा 1बी)के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में उपस्थित हैं।

यह प्रोटोकॉल हाइड्रोफिलिक पॉलीमर पोलोक्सामर 188 के साथ लेपित ब्लू फ्लोरोसेंट लिपोसोम्स में दवाओं के निर्माण का वर्णन करता है, जो लिपोसोम सतह पर एक सुरक्षात्मक परत बनाता है और दवा प्रतिधारण को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और बेहतर जैव अनुकूलता23है। पोलोक्समर को लिपोसोम्स की सतह कोटिंग के लिए चुना गया था क्योंकि हमारे पिछले शोध में दिखाया गया था कि, जब पॉलीथीन ग्लाइकोल संशोधित लिपोसोम्स की तुलना में, पोलोक्सामर संशोधित लिपोसोम्स ने23में नसों में नसों में रहने के बाद चूहों के पंजे और इसी तरह के फार्माकोकिनेटिक्स के चमड़े के इंजेक्शन के बाद बेहतर बायोकॉप्पपेंटिबिलिटी दिखाई । प्रोटोकॉल भी लार्वा जेब्राफिश में उनके माइक्रोइंजेक्शन के लिए वर्णित है और लाइव इमेजिंग उनके मैक्रोफेज लक्ष्यीकरण क्षमता और लिपोसोम क्षरण और साइटोप्लाज्मिक दवा वितरण के लिए आवश्यक इंट्रासेलुलर डिब्बों के लिए स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए । एक सबूत के रूप में अवधारणा हम पहले इस तकनीक का इस्तेमाल किया है मैक्रोफेज के लिए दो दवाओं को लक्षित करने के लिए तीव्र गाउटी सूजन24के एक लार्वा जेब्राफिश मॉडल में उनकी सक्रियता को दबाने के लिए । यह दवा वितरण तकनीक जेब्राफिश शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध रासायनिक "टूलकिट" का विस्तार करती है जो अपनी रुचि की दवाओं को मैक्रोफेज-लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करना चाहते हैं।

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Protocol

1. नशीली दवाओं से भरी मरीना ब्लू लेबल Liposomes की तैयारी

नोट: ब्लू फ्लोरोसेंट डाइ, मरीना ब्लू और दवा ले जाने वाले लिपोसोम ्सपोलोक्सामर 188 के पोस्ट सम्मिलन के साथ एक पतली फिल्म हाइड्रेशन विधि का उपयोग करके तैयार किए जाते हैं। सभी प्रक्रियाओं को कमरे के तापमान पर तब तक किया जाता है जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो। नियंत्रण liposomes केवल मरीना नीले और PBS ले । यहां उदाहरण एक माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग एंटीऑक्सीडेंट दवा25 के साथ लोड िंग लिपोसोम ्सका वर्णन करता है जिसका उपयोग प्रतिनिधि परिणामों में प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट के रूप में किया जाता है।

  1. लिपोसोम्स तैयार करने के लिए फॉस्फोलिपिड 1,2-डिपामेलिटोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (सामग्री की तालिकादेखें), 4.4.4 मिलीग्राम (22.2 माइक्रोमोल) भंग करें। 3 मिलीग्राम (11.1 μmol) कोलेस्ट्रॉल (सामग्री की तालिकादेखें) और 2.8 मिलीग्राम (3.7 μmol) 1,2-डिसेटेरॉयल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (सामग्री की तालिका देखें, क्लोरोफॉर्म के 3 मिलील में: मेथनॉल (3:1 v/v) एक 25 mL गोल नीचे फ्लास्क में ।
  2. उपरोक्त मिश्रण के लिए, मरीना ब्लू के 31 nmol जोड़ें 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-फॉस्फोथेनॉलामामाइन (सामग्री की तालिकादेखें) और एक mROS के 300 nmol दवा को बाधित (सामग्री की तालिकादेखें) और संक्षेप में पूरी तरह से भंग करने के लिए सोनीकेट करें। नियंत्रण लिपोसोम्स के लिए, केवल मरीना ब्लू 1,2-डिमेक्सडेकैनोइल-एसएन-ग्लिसेरो-फॉस्फोथेनॉलामामाइन जोड़ें।
    नोट: प्रकाश के प्रति संवेदनशील मरीना ब्लू फ्लोरोसेंट रंग की फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए, जहां संभव हो, प्रकाश से सभी प्रक्रियाओं की रक्षा करें। यह भी महत्वपूर्ण है अगर दवा लोड किया जा करने के लिए प्रकाश के प्रति संवेदनशील है ।
  3. एक रोटरी वाष्पीकरण पर धीरे-धीरे सॉल्वेंट निकालें (सामग्री की तालिकादेखें) एक तापमान नियंत्रित पानी स्नान पर वैक्यूम दबाव के तहत 75 आरपीएम पर घुमाकर 45 डिग्री सेल्सियस सेट (15 मीटर के लिए 200 मीटर तो 20 मीटर के लिए 0 मीटर) । यह फ्लास्क की कांच की दीवारों के भीतर एक सूखी पतली लिपिड फिल्म बनाता है जो कार्बनिक सॉल्वेंट को पूरी तरह से हटाने की सुविधा के लिए एन2 के तहत 45 मिनट के लिए आगे सूख जाता है।
  4. पतली फिल्म के गठन के बाद, वैक्यूम दबाव को 15 मीटर के लिए 40 मीटर तक सेट करें, फिर अवशेष विलायक को हटाने के लिए 30 00 के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ शुद्ध करें।
  5. फॉस्फेट-बफर्ड लवलाइन (पीबीएस, पीएच 7.4) के 1 मिलील का उपयोग करके पतली फिल्म को हाइड्रेट करें और वेसिकल बनाने के लिए 20 न्यूनतम के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान पर रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग करके फ्लास्क का उपयोग करने से पहले पैराफिल्म के साथ सील करें।
  6. 3 मिन के लिए तरल एन2 में ठंड से फ्रीज और गल के 7 चक्रों के लिए हाइड्रेटेड निलंबन विषय और 7 मिन के लिए एक ४५ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में विसर्जन के बाद ।
  7. बड़े यूनिमेलर वेसिकल्स को प्राप्त करने के लिए 2-6 चक्रों के लिए एक मिनी-एक्सट्रूडर (सामग्री की तालिकादेखें) और 1.0 माइक्रोन ट्रैक-नक़्क़ाशीदार पॉलीकार्बोनेट झिल्ली (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके झिल्ली के माध्यम से लिपोसोम निकालें।
    नोट: मैक्रोफेज की ओर अधिक अनुकूल लक्ष्यीकरण प्राप्त करने के लिए, निष्कासन चक्रों में हेरफेर करें जब तक कि लिपोसोम का व्यास लगभग 1 माइक्रोन26,27,28न हो जाए।
  8. 186,000 x ग्राम पर अल्ट्रासेंटरिफुगेशन द्वारा एक गोली में ताजा लिपोसोम्स को गाढ़ा करें और 1% पोलोक्सामर 188 (सामग्री की तालिकादेखें) समाधान (पीबीएस में 10 मिलीग्राम/mL) 45 डिग्री सेल्सियस पर और 750 आरपीएम 30 कमर के लिए 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब अटैचमेंट (सामग्री की सामग्री देखें)के 1 mL के साथ।
  9. अल्ट्रासेन्टिफ्यूज मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 186,000 x ग्राम पर करें और किसी भी अनबाउंड बहुलक या दवा को हटाने के लिए अधिरत्न को हटा दें। प्रकाश से संरक्षित लिपोसोम्स छर्रों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. लिपोसोम आकार और जीटा क्षमता का लक्षण वर्णन

  1. अल्ट्राप्योर पानी (1:100) के साथ लिपोसोम निर्माण को पतला करें और कण आकार, पॉलीडिस्फैलाव इंडेक्स (पीडीआई) और लिपोसोम्स की जीटा क्षमता को मापने के लिए एक गतिशील प्रकाश बिखरने वाले एनालाइजर (सामग्री की तालिकादेखें), 25 डिग्री सेल्सियस पर त्रिपलीमेंट्स में।
    नोट: पीडीआई नैनोपार्टिकल आबादी के आकार वितरण का एक उपाय है। पीडीआई मूल्य और एलटी; 0.05 अधिक समान वितरण को इंगित करता है जबकि 1 के करीब मूल्य एक बड़े आकार के वितरण का संकेत देते हैं। जीटा क्षमता समग्र सतह प्रभारी है।

3. लिपोसोम्स में फंसाने की दक्षता और ड्रग लोडिंग की गणना

नोट: लिपोसोम में दवा की फंसाने की क्षमता निर्धारित करने के लिए, अलौकिक और लिपोसोम गोली में निहित दवा सामग्री को मापा जाता है।

  1. पीबीएस के 1 mL में लिपोसोम गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. अतिशुद्ध पानी के साथ 10 x पतला, पतला और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा विश्लेषण करें।
  3. लिपोसोम्स के भीतर दवा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, 10% ट्राइटन-X100 समाधान के 900 μL के लिए लिपोसोम निलंबन के 100 μL जोड़ें (लिपिड झिल्ली को नष्ट करने के लिए, फंसी हुई दवा जारी करने और लिपिड को एचपीएलसी कॉलम के भीतर निर्माण को रोकने के लिए) और 3 मिनट के लिए भंवर विश्लेषण से पहले।
  4. एक क्वाटरनेरी पंप, थर्मोस्टेट ऑटो-पारखी और 3 माइक्रोन 250 x 4.6 मिमी कॉलम से मिलकर एक एचपीएलसी सिस्टम में नमूना के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें। मोबाइल चरण निर्धारित करें (10 एमएम पीबीएस पीएच 2.5, एसीटोनिट्रिल और मेथनॉल (30:40:30, v/v/v)) प्रवाह दर 0.9 mL/min के लिए प्रवाह दर और एक डायोड सरणी डिटेक्टर सेट का उपयोग कर स्पेक्ट्रल प्रोफाइल प्राप्त 230 मीटर M M पर सेट.
  5. निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके फंसाने की दक्षता (ईई) और ड्रग लोडिंग (डीएल) की गणना करें:
    EE (%) = [मुझे/मीट्रिक टन] x १००
    डीएल (%) = [मुझे/Mlip] x १००
    जहां मुझे समझाया दवा का द्रव्यमान है, माउंट निर्माण के दौरान इस्तेमाल की जाने वाली दवा का कुल द्रव्यमान है और Mlip लिपिड (कोलेस्ट्रॉल सहित) और समझाया दवा का कुल द्रव्यमान है।

4. लिपोसोम्स की तैयारी और इंजेक्शन

  1. एक पतला लाली माइक्रोइंजेक्शन सेटिंग्स (हीट 680, पुल 75, वेग 40, समय 55 और दबाव 530) के साथ एक पतली दीवार बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (1 मिमी ओडी एक्स 0.78 मिमी आईडी एक्स 10 सेमी लंबाई) डालकर बोरोसिलिकेट माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करें।
  2. मॉडलिंग मिट्टी पर एक पेट्री डिश में सुई प्लेस और एक तरह से व्यवस्था है कि खींचा अंत पकवान के नीचे छू नहीं है । उपयोग के लिए तैयार होने तक धूल संदूषण से बचने के लिए पेट्री डिश ढक्कन बंद रखें।
  3. पतला हौसले से तैयार लिपोसोम फॉर्मूलेशन 1:1 बाँझ PBS (पीएच 7.4) में और संक्षेप में भंवर (2-3 एस) मिश्रण करने के लिए।
    नोट: प्रकाश से लिपोसोम की रक्षा करें जब तक लार्वा माइक्रोइंजेक्शन के लिए तैयार न हो जाए।
  4. वयस्क ज़ेब्राफिश प्रजनन जोड़े रात से पहले की स्थापना करें और पहले रोसेन एट अलद्वारावर्णित भ्रूण एकत्र करें ।
  5. भ्रूण को पेट्री डिश (100 मिमी x 20 मिमी शैली में लगभग 60 भ्रूण प्रति डिश) में स्थानांतरित करें जिसमें ई 3 मध्यम (5 एमएम एनसीएल, 0.17 एमएम केसीएल, 0.33 एम सीएसीएल2,0.33 एमएम एमजीएसओ4)शामिल हैं, जो फंगल विकास को बाधित करने के लिए 0.1% मेथिलीन ब्लू के साथ पूरक हैं। सभी मृत या निषेचित भ्रूण निकालें और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  6. लाइव इमेजिंग की सुविधा के लिए, E3 मीडिया में 0.003% एन-फिनिलथिओरेया (पीटीयू) जोड़ें जब भ्रूण वर्णक गठन (मेलानीकरण) को रोकने के लिए विकास के 24 घंटे तक पहुंचते हैं।
  7. मैन्युअल रूप से ठीक टिप संदंश का उपयोग करके लगभग 30 घंटे पोस्ट निषेचन (एचपीएफ) पर भ्रूण को डिकोरियोनेट करें।
    नोट: भ्रूण को डिकोरियोनेट करने के लिए एंजाइमैटिक उपचार का उपयोग न करें क्योंकि यह एपिथेलियल क्षति और स्थानीय सूजन का कारण बन सकता है जिससे प्रतिरक्षा अध्ययन प्रभावित हो सकता है
  8. भ्रूण को निषेचन (डीपीएफ) के 2 दिन बाद तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर विकसित होने दें।
  9. पूरी सतह को कवर करने वाली एक पतली फिल्म बनाने के लिए एक छोटे से 35 मिमी संस्कृति पकवान के ढक्कन में पर्याप्त 3% मिथाइल सेल्यूलोज (E3 मीडिया में) डालने के द्वारा एक इंजेक्शन प्लेट तैयार करें।
    नोट: E3 मीडिया में 3% मिथाइल सेल्यूलोज तैयार करते समय, मिथाइल सेल्यूलोज को कक्षीय शेखर पर कोमल आंदोलन के साथ भंग करने में कई दिन लगते हैं।
  10. Tricaine के २०० μg/mL के साथ पूरक E3 मीडिया में इनक्यूबेटिंग द्वारा लार्वा का एनेस्थेटाइज करें ।
  11. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके लगभग 20-25 लार्वा का एक पूल एकत्र करें और भ्रूण को गुरुत्वाकर्षण द्वारा पिपेट की नोक पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति दें। लार्वा को न्यूनतम तरल के साथ स्थानांतरित करने का ध्यान रखते हुए, उन्हें 35 मिमी संस्कृति डिश ढक्कन के बीच में रखें।
  12. एक माइक्रोकेपिलर लोडर का उपयोग करके, निम्नलिखित तरीकों से लार्वा की व्यवस्था करें: माइक्रोइंजेक्शन सुई की ओर सामना करने वाली पृष्ठीय सतह के साथ इंजेक्शन प्लेट के शीर्ष की ओर पूर्वकाल, हिंदब्रेन वेंट्रिकल(चित्रा 2ए-डी); या, इंजेक्शन प्लेट के बाईं ओर पूर्वकाल (जब दाईं ओर इंजेक्शन) वेंट्रल सतह के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई की ओर सामना करना पड़ साइनस नसस(चित्र ा 2I)में इंजेक्ट करने के लिए ।
    नोट: जब इस तरह से इंजेक्शन, हिंदब्रेन वेंट्रिकल निवासी(चित्रा 2ई)और कौडल हेमेटोपोइटिक ऊतक (सीएचटी) निवासी(चित्रा 2जे)मैक्रोफेज को क्रमशः लक्षित किया जा सकता है। लार्वा जेब्राफिश का सीएचटी क्षेत्र स्तनधारी भ्रूण जिगर के अनुरूप एक हेमेटोपोइटिक साइट है। इस की व्यवस्था करते समय भ्रूण को नुकसान पहुंचाने के लिए अतिरिक्त ध्यान न दें क्योंकि इससे स्थानीय सूजन पैदा हो सकती है जिससे प्रतिरक्षा अध्ययन प्रभावित हो सकते हैं।
  13. ताजा तैयार लिपोसोम (चरण 4.3 से) लें और माइक्रोकेशिका लोडर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके लगभग 5 माइक्रोन इंजेक्शन मिश्रण के साथ इंजेक्शन सुई भरें।
    नोट: मैक्रोफेज के फागोलाइसोसोमल डिब्बों के लिए लिपोसोम्स के स्थानीयकरण का आकलन करते समय(चित्रा 2एच),इस इंजेक्शन मिश्रण को 200 μg/mL के साथ पूरक करें। (सामग्री की तालिकादेखें) और lysosomes के एक दूर लाल फ्लोरोसेंट मार्कर के १०० एनएम (सामग्री की मेजदेखें) क्रमशः phagosomes30,31 और lysosomes३२,निशान ।
  14. सुई को एक माइक्रोजोड़क (सामग्री की तालिकादेखें) में माउंट करें जो चुंबकीय स्टैंड और एक दबाव इंजेक्टर (सामग्री की तालिकादेखें) से जुड़ा हुआ है। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत स्थिति और लगभग 50 एमएस की एक पल्स अवधि और लगभग 40 साई के एक इंजेक्शन दबाव के लिए इंजेक्टर सेट।
  15. व्यास में लगभग 5 μm के उद्घाटन उत्पन्न करने के लिए साफ ठीक टिप संदंश के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक काटें।
  16. एक हीमोसाइटोमीटर की ग्रिड लाइनों पर तैनात खनिज तेल की एक बूंद में एक बोलस इंजेक्शन द्वारा इंजेक्शन की मात्रा को कैलिब्रेट करें। पल्स अवधि और/या इंजेक्शन दबाव को तब तक समायोजित करें जब तक बोलस का व्यास सबसे छोटी ग्रिड लाइनों के 2.5 को कवर नहीं करता (यह लगभग 1 nL की मात्रा से मेल खाता है)।
  17. प्रत्येक लार्वा के हिंडब्रेन वेंट्रिकल में लिपोसोम इंजेक्शन मिश्रण के 1 nL को सावधानीपूर्वक इंजेक्ट करें।
    नोट: हिंदब्रेन वेंट्रिकल में इंजेक्शन लगाते समय, ध्यान रखें कि बहुत दूर वेंरैली (हिंदब्रेन से परे) प्रवेश न करें क्योंकि यह अंतर्निहित वास्कुलचर को बाधित कर सकता है जिससे नकसीर हो सकती है। पापी नसस में इंजेक्शन लगाते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि सुई की नोक सिर्फ पेरिकार्डियम के भीतर है और जर्दी को भेदने नहीं है।
  18. इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन प्लेट में E3 मीडिया जोड़कर इंजेक्शन लार्वा को तुरंत E3 मीडिया में वापस स्थानांतरित करें और प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके मिथाइल सेल्यूलोज से लार्वा को धीरे से उत्तेजित करें।
  19. लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा विश्लेषण तक लार्वा को 28.5 डिग्री सेल्सियस (प्रकाश से संरक्षित) पर इनक्यूबेट करें।

5. लिपोसोम्स के मैक्रोफेज टारगेटिंग की पुष्टि करने के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग और इमेज एनालिसिस

  1. पानी के नहाने को 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. 0.003% पीटीयू और 200 μg/mL Tricaine के साथ पूरक E3 मीडिया युक्त एक नई Perti डिश को स्थानांतरित करके लिपोसोम इंजेक्शन लार्वा का एनेस्थेटाइज़ करें।
  3. E3 मीडिया में 1% कम पिघलने बिंदु agarose भंग करके लाइव इमेजिंग बढ़ते माध्यम तैयार करें, एक माइक्रोवेव में ०.००३% पीटीयू के साथ पूरक । पानी के स्नान में रखें और एक बार समाधान 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है, त्रिकेन के 200 μg/mL जोड़ें।
  4. अगारोज के समय से पहले पॉलीमराइजेशन को रोकने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बढ़ते माध्यम रखें।
  5. पानी विसर्जन लेंस(चित्रा 2ई)से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर हिंदब्रेन की पृष्ठीय सतह को छवि बनाने के लिए, लार्वा को इस प्रकार एम्बेड करें: बढ़ते माध्यम (लगभग 5 मिमी की गहराई तक) के साथ 35 मिमी संस्कृति पकवान भरें और इसे बहुलक होने दें। आगागुलाब में एक छोटी खाई की खुदाई करें जो जर्दी थैली को समायोजित करने के लिए पर्याप्त आकार का है।
  6. पिघलते बढ़ते माध्यम के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट भरें, थोड़ी मात्रा को निष्कासित करें, और एनेस्थेटाइज्ड लार्वा एकत्र करने के लिए इसका उपयोग करें। तुरंत लार्वा को संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें और जर्दी सैक, वेंट्रल साइड को खुदाई किए गए छेदों में केंद्रित करें, एक माइक्रोकेपिलरी लोडर का उपयोग करके। समय-समय पर उन्हें इस स्थिति में तब तक बनाए रखें जब तक कि अगारोज पॉलीमरेज न हो जाए। E3 मीडिया के साथ ओवरले २०० μg/mL Tricaine के साथ पूरक ।
    नोट: लार्वा को स्थानांतरित और स्थिति करते समय, इस बात का ध्यान रखें कि एपिथेलियल क्षति और स्थानीय सूजन का कारण न हो जो प्रतिरक्षा अध्ययन को प्रभावित कर सकता है। लार्वा की स्थिति को जीने के लिए सीएचटी क्षेत्र(चित्रा 2जे),ऊपर वर्णित माउंट, लेकिन खुदाई किए गए छेद के भीतर लार्वा को बाद में स्थिति।
  7. उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग करते समय, लार्वा को एम्बेड करें, बिना अगारोज बिस्तर के, सीधे ग्लास बॉटम डिश के तल पर। उन्हें पृष्ठीय सतह को नीचे (या पार्श्व रूप से) व्यवस्थित करें और बहुलककरण का पालन करें, पूरे पकवान सतह को बढ़ते माध्यम की एक भी परत के साथ कवर करें। एक बार बहुलीकृत, 200 μg/Tricaine के mL के साथ पूरक E3 मीडिया की एक पतली परत जोड़ें।
  8. इमेज जीने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर हिंदब्रेन वेंट्रिकल, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 512 x 512 पिक्सल; 40 x 3 μm Z-ढेर (हिंदब्रेन की पृष्ठीय-सबसे सतह से विस्तार); 20x उद्देश्य; 2.5x ज़ूम।
    नोट: नमूनों के बीच संकेत तीव्रता की तुलना करते समय (उदाहरण के लिए जब मरीना ब्लू लेबल liposomes के तेज इमेजिंग रिपोर्टर लाइनों के भीतर इंजेक्शन या तो मैक्रोफेज[Tg (mpeg1: EGFP)३३]या neutrophils[Tg (lyz: EGFP)३४]),यह आवश्यक है कि लेजर सेटिंग्स एक ही रखा जाता है (जैसे, पिनहोल व्यास, लेजर वोल्टेज, ऑफसेट और लाभ) यह सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए कि कोई भी अंतर बदल छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का एक विरूपण साक्ष्य नहीं है।
  9. मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम्स के मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल तेज की मात्रा निर्धारित करने के लिए 3D इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। एक जेड-स्टैक के भीतर लिपोसोम(चित्रा 2एफ)युक्त कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, व्यक्तिगत जेड वर्गों के माध्यम से स्क्रॉल करें और मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम वाले व्यक्तिगत कोशिकाओं की संख्या गिनें। कोशिकाओं के भीतर लिपोसोम की फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए(चित्रा 2जी),इंट्रासेलर मरीना ब्लू की कुल या मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक कोशिका (एक्स, वाई और जेड आयामों में) के आसपास ब्याज का एक क्षेत्र आकर्षित करें।

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Representative Results

फ्लोरोसेंट लिपोसोम्स संलग्न दवाओं की तैयारी के लिए यहां वर्णित पतली फिल्म हाइड्रेशन दृष्टिकोण एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के साथ, लिपोसोम23,24के अनसिलेलर होने की उम्मीद है। उत्पादित लिपोसोम्स के आकार, जीटा क्षमता, दवा लोडिंग और फंसाने की दक्षता तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत की जाती है। लिपोसोम्स का कण आकार (दवा लोडिंग से पहले और बाद में) समान है(तालिका 1)। नियंत्रण लिपोसोम की तुलना में दवा से भरे लिपोसोम ्स की सतह चार्ज (जीटा क्षमता) थोड़ा अधिक तटस्थ है, हालांकि, वे सभी नकारात्मक रूप से चार्ज किए जाते हैं जिसका अर्थ है कि यह उनके बायोडिस्ट्रीब्यूशन पैटर्न को काफी नहीं बदलेगा।

हिंदब्रेन वेंट्रिकल में मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम्स के माइक्रोइंजेक्शन के परिणामस्वरूप निवासी मैक्रोफेज द्वारा तेजी से तेज हो ता है जिसे 3 घंटे पोस्ट इंजेक्शन द्वारा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से देखा जा सकता है, जब मैक्रोफेज वंश-मार्किंग ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन टीजी (mpeg1:EGFP)33 (चित्रा 2सी, ई-जी)में इंजेक्ट किया जाता है। यह न्यूट्रोफिल (न्यूट्रोफिल-विशिष्ट टीजी (lyz:EGFP)34 रिपोर्टर लाइन) के भीतर चिह्नित है जो शायद ही कभी इंट्रासेलर लिपोसोम(चित्रा 2ई-जी)से युक्त मनाया जाता है। व्यक्तिगत लिपोसोम-लादेन मैक्रोफेज के भीतर, लिपोसोम फागोलाइसोसोमल डिब्बों(चित्रा 2एच)के भीतर जमा होते हैं, जो लिपोसोम क्षरण और बाद में साइटोप्लाज्म35में उनकी दवा सामग्री को छोड़ने के लिए आवश्यक है। लिपोसोम डिलीवरी के लिए विभिन्न माइक्रोइंजेक्शन साइटों का चयन प्रभावित कर सकता है कि ऊतक-निवासी मैक्रोफेज को लक्षित किया जाता है। उदाहरण के रूप में, हिंदब्रेन वेंट्रिकल में डिलीवरी कुशलता पूर्वक हिंदब्रेन-निवासी मैक्रोफेज(चित्रा 2डी, ई)को लक्षित करती है जबकि साइनस वेनससस में माइक्रोइंजेक्शन परिसंचरण(चित्रा 2I,J)के माध्यम से सीएचटी-रेजिडेंट मैक्रोफेज को लिपोसोम्स वितरित कर सकता है।

एक इम्यूनोलॉजिकल चुनौती के लिए मैक्रोफेज प्रतिक्रिया से पूछताछ करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय लाइपोसोम डिलीवरी के लिए माइक्रोइंजेक्शन साइट पर विचार महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि जांच के तहत विशेष मैक्रोफेज दवा प्राप्त कर रहे हैं। हमने नियमित रूप से हिंदब्रेन वेंट्रिकल में दवा से भरे लिपोसोम की डिलीवरी के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है ताकि मोनोसोडियम यूरेट (एमएसयू) क्रिस्टल के मैक्रोफेज प्रतिक्रिया पर इन दवाओं के प्रभाव का आकलन किया जा सके, इसी तरह हिंदब्रेन डिब्बे(चित्रा 3ए)में इंजेक्शन लगाया गया है । तीव्र गाउटी सूजन के कारक एजेंट के रूप में, एमएसयू क्रिस्टल टिश्यू-रेजिडेंट मैक्रोफेज को सक्रिय करते हैं ताकि माइटोकॉन्ड्रियल रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (एमआरओ)10,36,37,38पर निर्भर प्रक्रिया के माध्यम से इंटरल्यूकिन-1ए (आईएल-1ए) सहित प्रो-भड़काऊ मध्यस्थों का उत्पादन किया जा सके। ये सक्रिय मैक्रोफेज फिर न्यूट्रोफिल घुसपैठ को ड्राइव करते हैं, जो तीव्र गाउटी सूजन की एक बानगी है। हिंदब्रेन वेंट्रिकल में एक mROS-अवरोधक दवा के साथ भरी हुई लाइपोसोम्स का माइक्रोइंजेक्शन लिपोसोम-लादेन हिंदब्रेन-निवासी मैक्रोफेज(चित्रा 3बी-डी)के भीतर एमएसयू क्रिस्टल-चालित एमएसओ उत्पादन को काफी दबा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने 49.12 ± 0.17% की एक फंसाने की दक्षता हासिल की, जिसके परिणामस्वरूप 103.05 ± 0.36 माइक्रोन की दवा एकाग्रता के साथ एक निर्माण हुआ। ध्यान दें, इस एकाग्रता पर 1 nL मात्रा इंजेक्शन हमारे प्रयोगों के दौरान कोई नमूदार विषाक्तता के परिणामस्वरूप, के रूप में सकल रूपात्मक परिवर्तन या हृदय की गिरफ्तारी का सबूत है । मैक्रोफेज सक्रियण राज्य पर इस दवा के दमनकारी प्रभावों का आगे सत्यापन आईएल1बी अभिव्यक्ति (आईएल-1ए के जेब्राफिश ऑर्थोलॉग) की जांच करके सीटू संकरण(चित्र 4ए, बी)और न्यूट्रोफिल(चित्रा 4सी, डी)की अस्थायी भर्ती द्वारा किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध पारंपरिक मुफ्त दवा वितरण बनाम लिपोसोम-मध्यस्थता दवा वितरण को लार्वा जेब्राफिश को दर्शाती है। (क)लार्वा जेब्राफिश के लिए दवा वितरण के लिए नियमित रूप से उपयोग की जाने वाली रणनीतियां काफी हद तक विसर्जन या मुफ्त दवा के माइक्रोइंजेक्शन तक सीमित हैं। (ख)नशीली दवाओं से भरे लिपोसोम्स का माइक्रोइंजेक्शन मैक्रोफेज को सीधे लक्षित करने की अनुमति देता है, जहां फागोलाइसोसोमल डिब्बों के भीतर लिपोसोम क्षरण के परिणामस्वरूप साइटोप्लाज्मिक दवा वितरण होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट लिपोसोम का उपयोग करके मैक्रोफेज के लिए दवाओं को लक्षित करना। (A)माइक्रोइंजेक्शन सेट-अप जिसमें माइक्रोइंजेक्शन सुई (काला तीर) और लार्वा 3% मिथाइलसेल्यूलोज के भीतर 35 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में सरणी दिखाते हैं। (ख)लार्वा का बढ़ाया हुआ दृश्य ए(सी)लाइव कॉन्फोकल छवि में 2 डीपीएफ टीजी (mpeg1:EGFP) लार्वा, पूर्वकाल से बाएं तक। (डी)सरणी लार्वा का बढ़ाया हुआ दृश्य, जैसा कि ए में, हिंदब्रेन वेंट्रिकल में माइक्रोइंजेक्शन का प्रदर्शन (काला तीर माइक्रोइंजेक्शन सुई के निशान) में माइक्रोइंजेक्शन का प्रदर्शन करता है। (ई)योजनाबद्ध चित्रण हिंदब्रेन-निवासी मैक्रोफेज और लाइव कॉन्फोकल छवियों (पृष्ठीय दृश्यों, बाएं से पूर्वकाल) के टीजी (mpeg1: EGFP) और टीजी (lyz: EGFP) लार्वा के हिंदब्रेन माइक्रोइंजेक्शन के बाद 3 एच, मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम्स (सफेद तीर मार्क लिपोसोम-लादेन मैक्रोजफ) के हिंदब्रेन क्षेत्र के । (एफ और जी)मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल (जैसा कि ई में पता चला) द्वारा लिपोसोम तेज का परिमाणीकरण, मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम्स की कोशिकाओं(एफ)और फ्लोरेसेंस तीव्रता/सेल(जी)युक्त कोशिकाओं की संख्या के रूप में मापा जाता है । (एच)हिन्दोसोम के लाल फ्लोरोसेंट मार्कर और टीजी (mpeg1:EGFP लार्वा) लार्वा के भीतर लाइसोसोम्स के एक सुदूर लाल फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ चिह्नित हिंदब्रेन के भीतर लिपोसोम-लादेन मैक्रोफेज की लाइव कॉन्फोकल छवि, मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम्स के हिंडब्रेन माइक्रोइंजेक्शन के बाद 3 एच। (I)सरणी लार्वा का बढ़ाया हुआ दृश्य, जैसा कि ए में, साइनस नसस (काला तीर माइक्रोइंजेक्शन सुई के निशान) में माइक्रोइंजेक्शन का प्रदर्शन करता है। (जम्मू) टीजी (mpeg1:EGFP) और टीजी (lyz: EGFP) लार्वा, 3 h के सीएचटी क्षेत्र के सीएचटी-रेजिडेंट मैक्रोफेज और लाइव कॉन्फोकल इमेज (पार्श्व दृश्य, बाएं से पूर्वकाल) और टीजीएफपी लार्वा, 3 एच के माइक्रोइंजेक्शन के बाद साइनस वेनसस (सफेद तीर मार्क लिपोसोम-लादेन मैक्रोफेज) के लक्ष्यीकरण को दर्शाता है। त्रुटि बार प्रदर्शन का मतलब ± एसडी *पीएंड एलटी;0.05; पी एंड एलटी; 0.0001, छात्र टी-टेस्ट। स्केल बार = 100 मिमी (ए), 100 माइक्रोन (बी), 250 माइक्रोन (सी, डी, और मैं), 10 माइक्रोन (ई), 5 माइक्रोन (एच), 50 माइक्रोन (जे) । इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एमआरओ-बाधा वाली दवा से भरे लिपोसोम का माइक्रोइंजेक्शन सक्रिय मैक्रोफेज के भीतर एमआरओ उत्पादन को दबा देता है। (A)योजनाबद्ध प्रकार के लोग मैक्रोफेज के लिए एक mROS-बाधा दवा के लक्ष्यीकरण को दर्शाती है और एमएसयू क्रिस्टल उत्तेजना के बाद मैक्रोफेज सक्रियण पर इसके प्रभाव का आकलन करती है। (बी और सी)लिपोसोम-लादेन मैक्रोफेज (नियंत्रण liposomes/L-C(बी)या mROS-अवरोधित liposomes/L-MI(C)की लाइव कॉन्फोकल छवियां टीजी (mpeg1:EGFP) लार्वा के हिंदब्रेन के भीतर, फ्लोरोसेंट mROS-विशिष्ट जांच के साथ भी चिह्नित (सामग्री की तालिकादेखें, जहां फ्लोरोसेंट सिग्नल को गर्म रंगों के साथ एक हीटमैप के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, जो मरीना ब्लू-लेबल वाले लिपोसोम्स और एमएसयू क्रिस्टल के हिंदब्रेन माइक्रोइंजेक्शन के बाद गर्म रंगों के साथ प्रदर्शित होता है। मरीना ब्लू फ्लोरेसेंस ग्रेस्केल में छद्म रंग का है। (घ)मैक्रोफेज के भीतर MROS-विशिष्ट जांच की फ्लोरेसेंस तीव्रता का परिमाणीकरण, जैसा कि बी और सी एरर बार में पता चला है, का मतलब ± एसडी । ****पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०००१, छात्र टी-टेस्ट। स्केल बार = 10 माइक्रोन (बी)। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक mROS अवरोधक के साथ भरी हुई लिपोसोम्स के माइक्रोइंजेक्शन सक्रिय मैक्रोफेज और मैक्रोफेज संचालित न्यूट्रोफिल भर्ती के भीतर il1b अभिव्यक्ति को दबा देता है । (A) आईएल1बी की अभिव्यक्ति (काले तीरों द्वारा चिह्नित), जैसा कि सीटू संकरण में पूरे माउंट द्वारा पता लगाया गया है, हिंदब्रेन क्षेत्र के भीतर 3 एच हिंदब्रेन माइक्रोइंजेक्शन ऑफ कंट्रोल (एल-सी) या एमआरओ-अवरोधित लिपोसोम्स (एल-एमआई) और एमएसयू क्रिस्टल, पूर्वकाल से बाएं। संख्या प्रदर्शित फेनोटाइप के साथ लार्वा के अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ख) आईएल1बी अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण, जैसा कि ए में पाया गया है, जिसमें प्रतिशत लार्वा के रूप में दिखाया गया है जो उच्च, निम्न या कोई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है । (C) टीजी (lyz: EGFP) लार्वा (पृष्ठीय विचारों, बाएं से पूर्वकाल) के हिंदब्रेन क्षेत्र के भीतर न्यूट्रोफिल की कॉन्फोकल छवियां, जैसा कि एल-सी या एल-एमआई और एमएसयू क्रिस्टल के हिंदब्रेन माइक्रोइंजेक्शन के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस 3 (3 एचपीआई) और 6 (6 एचपीआई) एच द्वारा पता लगाया गया है। (घ)एल-सी या एल-एमआई और एमएसयू क्रिस्टल के हिंदब्रेन माइक्रोइंजेक्शन के बाद सी, 1 (1 एचपीआई), 3 (3 एचपीआई), 6 (6 एचपीआई) और 9 (9 एचपीआई) एच में पता चला न्यूट्रोफिल का अस्थायी मात्राकरण । त्रुटि सलाखों के प्रदर्शन का मतलब ± एसडी । ****पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०००१, एन एस महत्वपूर्ण नहीं, एक तरह से ANOVA, डननेट के पोस्ट हॉक टेस्ट । स्केल बार = 100 माइक्रोन (ए), 50 माइक्रोन (सी)। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लिपोसोम्स की फिजिकोकेमिकल संपत्ति (एल) नियंत्रण लिपोसोम mROS-अवरोधित liposomes
आकार (μm) 1.2 ± 0.07 1.1 ± 0.04
जीटा क्षमता (एमवी) -25.9 ± 0.57 -13.0 ± 0.11
फंसाने की दक्षता (ईई, %) N/A 49.12 ± 0.17
ड्रग लोडिंग (डीएल, %) N/A 0.37 ± और एलटी;0.01

तालिका 1: पीबीएस (नियंत्रण) या mROS-अवरोधित लिपोसोम्स की भौतिक रासायनिक विशेषताएं (डेटा का मतलब ± मानक विचलन, एन = 3) है। सभी लिपोसोम मरीना ब्लू के साथ लेबल किए गए थे।

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Discussion

यहां, हमने लार्वा जेब्राफिश में विशेष रूप से मैक्रोफेज को लक्षित करने के लिए दवा से भरे लिपोसोम तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया है। इस विधि का उपयोग विशेष रूप से मैक्रोफेज के लिए दवाओं के प्रत्यक्ष लक्षित वितरण को सुनिश्चित करके कुछ रोग मॉडलों में मैक्रोफेज की भूमिका को विच्छेदन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इसका उपयोग तब किया जा सकता है जब दवाओं की सामान्य विषाक्तता विसर्जन जैसे अधिक पारंपरिक मार्गों द्वारा वितरित होने पर उनके उपयोग को सीमित करती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल अन्य नैनोपार्टिकुलेट सिस्टम का विकल्प प्रदान करता है जिनका उपयोग लार्वा जेब्राफिश में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए किया गया है। इनमें एंटीमलेरिया दवा रिफामपिसिन को माइकोबैक्टीरियम मैरिनम-संक्रमितमैक्रोफेज को लक्षित करना शामिल है ताकि उप-माइक्रोन आकार पॉलीमेरिक नैनोकणों39का उपयोग करके बैक्टीरियल क्लीयरेंस को बढ़ावा दिया जा सके । एक अन्य उदाहरण में, पॉलीमेरोसोम्स के भीतर न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस के प्रेरक (आर- रोस्कोविटिन) का एनकैप्सुलेशन दिखाया गया है, जिससे इस दवा को न्यूट्रोफिल ्स को लक्षित किया गया है, जिससे सूजन संकल्प40को बढ़ावा दिया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने उनके गैर-विषाक्त, जैव संगत और बायोडिग्रेडेबल गुणों के कारण दवा वितरण के लिए एक वाहन के रूप में लिपोसोम का उपयोग किया है। इसके अलावा, वे गैर इम्यूनोजेनिक हैं, जो विशेष महत्व का है जब प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, जैसे उन यहां वर्णित के रूप में । हाइड्रोफिलिक, हाइड्रोफोबिक, एम्फीपैथिक और लिपोफिलिक दवाओं सहित कार्गो की एक श्रृंखला भी ले जा ईजाद की जा सकती है।

इस प्रोटोकॉल को अंजाम देते समय कई महत्वपूर्ण कदम उठाए जाते हैं, जिनका विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए । इनमें ऐसे कदम शामिल हैं जहां लार्वा को शारीरिक रूप से संभाला जाता है और लार्वा को किसी भी गैरइरादतन क्षति को कम करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसमें लार्वा को मैन्युअल रूप से डिकोरिओनाटिंग करते समय (विशेष रूप से जर्दी की नाजुक एपिथेलियल लाइनिंग के साथ संपर्क से बचना), इंजेक्शन प्लेट पर लार्वा सरणी, इंजेक्शन के बाद प्लेट से उनके हटाने और लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए उनके बढ़ते हुए शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का एक अपरिहार्य घटक माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से लिपोसोम (और किसी भी प्रतिरक्षा चुनौतियों) को डिलीवरी करने की आवश्यकता है जो स्थानीय सूजन पैदा कर सकता है और इसलिए प्रायोगिक परिणाम को प्रभावित कर सकता है। लार्वा जेब्राफिश में माइक्रोइंजेक्शन ऊतक क्षति को कम करने के लिए प्रशिक्षण की एक निश्चित डिग्री की आवश्यकता होती है। हमारे काम में, लगभग 5 माइक्रोन का माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप व्यास उत्पन्न करना बहुत मामूली सतह एपिथेलियल क्षति उत्पन्न करता है (जैसा कि 2 डीपीएफ लार्वा के हिंदब्रेन वेंट्रिकल में इंजेक्शन देते समय सतह एपिथेलियल कोशिकाओं के भीतर भड़काऊ मार्कर मैट्रिक्स धातुविज्ञान 9 की बहुत कम अभिव्यक्ति का सबूतहै)। यह व्यास टिप भी काफी छोटा है इंजेक्शन सामग्री के रिसाव से बचने के लिए, हिंदब्रेन वेंट्रिकल से बाहर, जब माइक्रोइंजेक्शन सुई हटा दिया जाता है । यहां यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इंजेक्शन की मात्रा 2 nL से अधिक अक्सर इंजेक्शन छेद के माध्यम से बह रही सामग्री में से कुछ में परिणाम होगा वेंट्रिकल की मात्रा से अधिक का एक परिणाम के रूप में इंजेक्शन छेद के माध्यम से बह निकला । एमएसयू क्रिस्टल10जैसी बाद की प्रतिरक्षा चुनौतियों को इंजेक्ट करने के लिए 5 माइक्रोन का एक टिप व्यास भी पर्याप्त आकार का है। माइक्रोग्राइंडर के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप को 45 डिग्री तक बेवेल करना ताकि एक तेज टिप उत्पन्न हो सके, जो हिंदब्रेन वेंट्रिकल41को कवर करने वाले बाहरी पेराइडरम और आंतरिक बेसल एपिथेलियल परतों का बेहतर प्रवेश प्रदान कर सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इंजेक्शन प्रक्रिया के लिए नियंत्रित करने के लिए मैक्रोफेज फ़ंक्शन पर दवा-लोडेड लिपोसोम के प्रभावों का आकलन करते समय यहां उपयोग किए जाने वाले (यानी, नियंत्रण लिपोसोम) जैसे नियंत्रण इंजेक्शन आवश्यक हैं। किसी दी गई दवा के लिए एकाग्रता का चयन करना जब लिपोसोम में तैयार करना भी एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि विसर्जन द्वारा वितरित प्रभावोत्पादक दवा सांद्रता, लिपोसोम-मध्यस्थता वाली दवा वितरण का उपयोग करते समय आवश्यक लोगों से भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, किसी को सावधान रहना चाहिए कि पोलोक्सामर के साथ लिपोसोम पोस्ट संशोधन की भौतिक रासायनिक विशेषताओं को बदल न दिया जाए क्योंकि यह उनके जैव वितरण पैटर्न को प्रभावित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल के संशोधन और भविष्य के विकास के लिए एक क्षेत्र मैक्रोफेज लक्ष्यीकरण और तेज को और बढ़ाने के लिए लिगांड या रिसेप्टर्स जैसे लिपोसोम्स में विभिन्न सतह सुविधाओं को शामिल करने की जांच करना होगा, या न्यूट्रोफिल जैसी विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए होगा। इस उन्नत दृष्टिकोण के लिए सतह सुविधाओं को उजागर करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होगी जो विभिन्न जेब्राफिश प्रतिरक्षा कोशिका डिब्बों के लिए अद्वितीय हैं, जो वर्तमान में खराब समझ रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के संशोधन के लिए आगे के क्षेत्रों में अपनी बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए लिपोसोम ्स में अन्य फ्लोरोसेंट जांच का समावेश शामिल है (उदाहरण के लिए, जब अन्य ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों में इंजेक्ट किया जाता है) और उनके भौतिक गुणों में फेरबदल करना जैसे आकार और चार्ज42,43। यह भी जांच करना महत्वपूर्ण होगा कि क्या विभिन्न लार्वा चरणों में लिपोसोम प्रशासन के विभिन्न मार्ग अतिरिक्त मैक्रोफेज आबादी को लक्षित करने के लिए अपनी बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार कर सकते हैं, उदाहरण के लिए आंतों के एपिथेलियल कोशिकाएं । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल में, सभी इंजेक्शन 2 डीपीएफ लार्वा पर किए गए थे। जेब्राफिश विकास के तीसरे दिन के दौरान मुंह से गुदा रूपों तक एक निरंतर लुमेन, मुंह44के उद्घाटन के बाद। आगे के दिन तक गुदा एक पूरी तरह से खुले समाप्त ट्यूब एक ध्रुवीकृत एपिथेलियम४४के साथ लाइन में खड़ा में जिसके परिणामस्वरूप खुलता है । यह देखना दिलचस्प होगा कि लिपोसोम ्स में पुराने लार्वा का विसर्जन आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं को समझाया दवाओं के लक्ष्यीकरण की सुविधा प्रदान कर सकता है या नहीं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों मौजूद हैं ।

Acknowledgments

इस काम को सीजेएच (न्यूजीलैंड की स्वास्थ्य अनुसंधान परिषद और मार्सडन फंड, रॉयल सोसायटी ऑफ न्यूजीलैंड) और जेडडब्ल्यू (ऑकलैंड विश्वविद्यालय से संकाय अनुसंधान विकास कोष) को दिए गए अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक जेब्राफिश सुविधा के विशेषज्ञ प्रबंधन के लिए अलथा महगांवकर, बायोमेडिकल इमेजिंग रिसर्च यूनिट, स्कूल ऑफ मेडिकल साइंसेज, ऑकलैंड विश्वविद्यालय के साथ सहायता के लिए टीजी (mpeg1:EGFP) रिपोर्टर लाइन उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600

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References

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Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. W., Dalbeth, N., Wu, Z., Hall, C. J. Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes. J. Vis. Exp. (156), e60198, doi:10.3791/60198 (2020).

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