Summary
Her beskriver vi syntesen af narkotikabelastede liposomer og deres mikroinjektion i larvezebrafisk med det formål at målrette lægemiddellevering til makrofag-afstamning celler.
Abstract
Zebrafisk(Danio rerio)larver har udviklet sig til en populær model til at undersøge host-patogen interaktioner og bidraget fra medfødte immunceller til inflammatorisk sygdom på grund af deres funktionelt bevarede medfødte immunsystem. De er også meget udbredt til at undersøge, hvordan medfødte immunceller hjælpe guide udviklingsmæssige processer. Ved at drage fordel af den optiske gennemsigtighed og genetiske tractability af larve zebrafisk, disse undersøgelser ofte fokusere på levende billeddannelse tilgange til funktionelt karakterisere fluorescerende markerede makrofager og neutrofiler i intakte dyr. På grund af deres forskelligartede funktionelle heterogenitet og stadigt voksende roller i sygdompatogenese, makrofager har fået betydelig opmærksomhed. Ud over genetiske manipulationer, kemiske indgreb er nu rutinemæssigt bruges til at manipulere og undersøge makrofag adfærd i larve zebrafisk. Levering af disse stoffer er typisk begrænset til passiv målretning af gratis stof gennem direkte nedsænkning eller mikroinjektion. Disse tilgange er afhængige af den antagelse, at eventuelle ændringer i makrofag adfærd er resultatet af en direkte effekt af lægemidlet på makrofager selv, og ikke en downstream konsekvens af en direkte effekt på en anden celle type. Her præsenterer vi vores protokoller for målretning af lægemidler specifikt til larve zebrafisk makrofager ved microinjecting stof-loaded fluorescerende liposomer. Vi afslører, at poloxamer 188-modificerede stof-loaded blå fluorescerende liposomer er let taget op af makrofager, og ikke af neutrofiler. Vi fremlægger også bevis for, at lægemidler leveret på denne måde kan påvirke makrofagaktivitet på en måde, der er i overensstemmelse med stoffets virkningsmekanisme. Denne teknik vil være af værdi for forskere, der ønsker at sikre målretning af lægemidler til makrofager, og når narkotika er for giftige til at blive leveret ved traditionelle metoder som nedsænkning.
Introduction
Den mononukleare fagocyt system giver en første linje i forsvaret mod invaderende patogener. Dette system består af monocytter, monocyt-afledte dendritiske celler og makrofager, som aktivt fagocytoze udenlandske patogener, hvilket begrænser patogenspredning. Ud over disse fagocytiske og mikrobiske effektor funktioner, dendritiske celler og makrofager er også i stand til cytokin produktion og antigen-præsentation for at aktivere adaptive immunsystem1. Af disse celler, makrofager har fået særlig opmærksomhed på grund af deres forskelligartede funktionelle heterogenitet og engagement i flere inflammatoriske sygdomme, fra autoimmune og smitsomme sygdomme til kræft2,3,4,5,6,7. Makrofagers plasticitet og deres evne til funktionelt at tilpasse sig behovene i deres vævsmiljø kræver eksperimentelle tilgange til direkte at observere og afhøre disse celler in vivo.
Larve zebrafisk er en ideel model organisme til at studere funktionen og plasticitet makrofager i vivo8. Den optiske gennemsigtighed af larve zebrafisk giver et vindue til direkte at observere adfærd makrofager, især når kombineret med makrofag-mærkning transgene reporter linjer. Udnyttelse af larvezebrafisks live billeddannelsespotentiale og eksperimentelle tractability har ført til mange væsentlige indsigter i makrofagsfunktion , der har direkte relevans for sygdomme hos mennesker9,10,11,12,13,14,15. Mange af disse undersøgelser har også benyttet sig af den høje bevarelse af narkotikaaktivitet i zebrafisk (en egenskab, der understøtter deres anvendelse som en hel dyr drug discovery platform16,17,18), ved at udnytte kemiske indgreb til farmakologisk manipulere makrofag funktion. Til dato, disse farmakologiske behandlinger er for det meste blevet leveret enten gennem nedsænkning, som kræver, at stoffet skal være vandopløseligt, eller ved direkte mikroinjektion af gratis stof(figur 1A). Begrænsninger af disse passive leveringsstrategier omfatter off-target effekter og generel toksicitet, der kan udelukke at vurdere enhver indvirkning på makrofag funktion. Derudover, når man undersøger narkotika effekter på makrofager er det uvist, om narkotika handler på makrofager selv eller gennem mere indirekte mekanismer. Når vi udfører lignende kemiske indgreb undersøgelser for at undersøge makrofag funktion, vi erkendte, at der var et udækket behov for at udvikle en billig og ligetil leveringsmetode til at målrette lægemidler specifikt til makrofager.
Liposomer er mikroskopiske, biokompatible, lipid tolagede vesikler, der kan indkapsle proteiner, nukleotider og narkotika last19. Den unilamellar eller multilamellar lipid tolags struktur liposomer danner en vandig indre lumen, hvor vandopløselige lægemidler kan indarbejdes, mens hydrofobe lægemidler kan integreres i lipid membraner. Desuden kan de fysisk-kemiske egenskaber liposomer, herunder størrelse, opladning og overflade ændringer manipuleres til at skræddersy deres målretning til specifikke celler20,21. Disse funktioner i liposomer har gjort dem til et attraktivt middel til at levere narkotika og øge præcisionen af de nuværende behandlingsregimer20. Som liposomer er naturligt fagocytozed af makrofager (en funktion udnyttes ved deres rutinemæssige brug i at levere clodronate specifikt til makrofager til ablation eksperimenter22),de præsenterer som en attraktiv mulighed for makrofag-specifikke stof levering(Figur 1B).
Denne protokol beskriver formuleringen af lægemidler i blå fluorescerende liposomer belagt med hydrofile polymer poloxamer 188, der danner et beskyttende lag på liposom overfladen og har vist sig at forbedre opbevaring af lægemidler og har overlegen biokompatibilitet23. Poloxamer blev valgt til overfladebelægning af liposomer som vores tidligere forskning havde vist, at sammenlignet med polyethylenglycol modificeret liposomer, poloxamer modificerede liposomer viste bedre biokompatibilitet efter subkutan injektion af rotte poter og lignende farmakokinetik hos kaniner efter intravenøs infusion23. Protokoller er også beskrevet for deres mikroinjektion i larve zebrafisk og levende billeddannelse til at vurdere deres makrofag-målretning evne og lokalisering til intracellulære rum er nødvendige for liposom nedbrydning og cytoplasmatisk stof levering. Som et proof-of-concept har vi tidligere brugt denne teknik til at målrette to lægemidler til makrofager at undertrykke deres aktivering i en larve zebrafisk model af akut gigt inflammation24. Dette stof levering teknik udvider den kemiske "værktøjskasse" til rådighed for zebrafisk forskere, der ønsker at sikre makrofag-målretning af deres lægemidler af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af Drug-loaded Marina Blå-mærket Liposomer
BEMÆRK: Liposomer transporterer den blå fluorescerende farvestof, Marina Blue og narkotika er udarbejdet ved hjælp af en tynd film hydrering metode med post indsættelse af poloxamer 188. Alle procedurer udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Kontrol liposomer kun bære Marina blå og PBS. Eksemplet her beskriver lastning liposomer med en mitokondrier-målretning antioxidant stof25, der bruges i de repræsentative resultater som et bevis-of-concept.
- For at forberede liposomer opløses 16,4 mg (22,2 μmol) af fosfolipiderne 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosforcholin (se Tabel over materialer),4.3 mg (11,1 μmol) kolesterol (se materialetabellen)og 2,8 mg (3,7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-fosforcholin (se materialetabel, i 3 ml chloroform:methanol (3:1 v/v) i en 25 ml rundbundskolbe.
- Til ovenstående blanding, tilsæt 31 nmol af Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin (se Tabel over materialer)og 300 nmol af en mROS hæmmende stof (se Tabel over materialer)og sonicat kort at opløse. For kontrol liposomer, kun tilføje Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin.
BEMÆRK: For at undgå fotoblegning af det lysfølsomme Marina Blue fluorescerende farvestof skal du beskytte alle procedurer mod lys, hvor det er muligt. Dette er også vigtigt, hvis det stof, der skal lastes, er lysfølsomt. - Opløsningsmidlet fjernes langsomt på en roterende fordamper (se Materialetabel)over et temperaturstyret vandbad, der er sat til 45 °C, ved at rotere ved 75 omdrejninger under vakuumtryk (200 mbar i 15 min og derefter 0 mbar i 20 min). Dette danner en tør tynd lipid film inden for glasvægge af kolben, der er yderligere tørret i 45 min under N2 for at lette fuldstændig fjernelse af det organiske opløsningsmiddel.
- Efter dannelsen af den tynde film, indstille vakuumtrykket til 40 mbar i 15 min, derefter rense med nitrogengas i 30 min for at sikre fjernelse af rester opløsningsmiddel.
- Fugt den tynde film med 1 ml fosfatbuffere (PBS, pH 7.4) og forsegles med parafilm, før kolben omrører ved hjælp af en roterende fordamper over et vandbad på 60 °C i 20 minutter for at danne vesikler.
- Den hydrerede suspension udsættes for 7 cyklusser af fryse og optøved frysning i flydende N2 i 3 min efterfulgt af nedsænkning i et vandbad på 45 °C i 7 min.
- Ekstruder liposomer gennem en membran ved hjælp af en mini-ekstruder (se Tabel over materialer)og 1,0 μm track-ætset polycarbonat membraner (se Tabel over materialer)i 2-6 cykler for at opnå store unilamellar vesikler.
BEMÆRK: For at opnå mere gunstig målretning mod makrofager, manipulere ekstrudering cykler indtil diameteren af liposomer er ca 1 μm26,27,28. - Den friske liposomer kondenseres i en pellet ved ultracentrifugation ved 186.000 x g og inkuberes med 1 ml poloxamer 188 (se Materialetabel)opløsning (10 mg/ml i PBS) ved 45 °C og 750 omdr./min. i 30 min ved hjælp af en termomixer med en 2 ml mikrocentrifugerørvedhæftet fil (se materialetabel).
- Ultracentrifuge blandingen ved 186.000 x g for 1 h ved 4 °C og fjern supernatanten for at fjerne enhver ubundet polymer eller et unaturligt lægemiddel. Liposomerne spår ved 4 °C, beskyttet mod lys.
2. Karakterisering af Liposome Størrelse og Zeta Potentiale
- Fortyndet liposom formulering med ultrarent vand (1:100) og måle partikelstørrelse, polydispersity index (PDI) og zeta potentiale liposomer ved hjælp af en dynamisk lys spredning analysator (se Tabel over materialer),i treeksemplarer ved 25 °C.
BEMÆRK: PDI er et mål for størrelsen af nanopartikelpopulationen. PDI-værdier < 0,05 angiver en mere ensartet fordeling, mens værdier tættere på 1 angiver en større størrelsesfordeling. Zeta-potentialet er den samlede overfladeopladning.
3. Beregning af entrapment effektivitet og narkotika lastning i Liposomer
BEMÆRK: At bestemme entrapment effektiviteten af lægemidlet i liposomer, stoffetindhold, der er indeholdt i supernatant og liposome pellet måles.
- Resuspendering liposome pellet i 1 ml PBS.
- Fjern supernatantet, fortyndet 10 x med ultrarent vand og analysér ved højtydende væskekromatografi (HPLC).
- For at bestemme lægemiddelkoncentrationen i liposomerne tilsættes 100 μL liposom suspension til 900 μL 10% triton-X100 opløsning (for at ødelægge lipidmembranen, frigive det fastspændte lægemiddel og forhindre lipidopbygning i HPLC-kolonnen) og vortex i 3 min. før analysen.
- Prøvetilføres 20 μL i et HPLC-system bestående af en kvatoerpumpe, termostat autosampler og en 3 μm 250 x 4,6 mm kolonne. Indstil den mobile fase (10 mM PBS pH 2.5, acetonitril og methanol (30:40:30, v/v/v)) flowhastighed til 0,9 mL/min og få spektrale profiler ved hjælp af en diode array detektor indstillet til 230 mM.
- Beregn entrapmenteffektiviteten (EE) og lægemiddelbelastning (DL) ved hjælp af følgende ligninger:
EE (%) = [Mig / Mt] x 100
DL (%) = [Mig / Mlip] x 100
Hvor mig er massen af narkotika indkapslet, Mt er den samlede masse af stof, der anvendes under formulering og Mlip er den samlede masse af lipider (herunder kolesterol) og indkapslet stof.
4. Forberedelse og injektion af liposomer
- Forbered borosilikat mikroinjektionsnåle ved at indsætte en tynd vægborosilikat glaskapillær (1 mm O.D. x 0,78 mm ID x 10 cm længde) i en mikropipette puller enhed (se Tabel over materialer)med følgende generiske puller indstillinger (varme 680, træk 75, hastighed 40, tid 55 og tryk 530) til at producere en tilspidset mikroinjektion nål.
- Placer nålene i en petriskål på modellering ler og arrangere på en måde, at den trak ende ikke rører bunden af skålen. Hold petriskållåget lukket for at undgå støvforurening, indtil det er klar til brug.
- Fortyndefrisklavet liposome formuleringer 1:1 i sterile PBS (pH 7.4) og kort vortex (2-3 s) til at blande.
BEMÆRK: Beskyt liposomer mod lys, indtil larver er klar til mikroinjektion. - Opsæt voksne zebrafiskavlspar aftenen før og opsaml embryoner som tidligere beskrevet af Rosen et al.29.
- Overfør embryonerne til en petriskål (100 mm x 20 mm stil med ca. 60 embryoner pr. skål), der indeholder E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)suppleret med 0,1% methylenblåt for at hæmme svampevækst. Alle døde eller ubefrugtede embryoner og inkubere natten over ved 28,5 °C.
- For at lette live imaging, tilføje 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) til E3 medierne, når embryonerne nå 24 timer af udvikling for at forhindre pigmentdannelse (melanization).
- Manuelt dechorionate embryoner ved ca 30 h post befrugtning (hpf) ved hjælp af fine tip pincet.
BEMÆRK: Brug ikke enzymatisk behandling til dechorionate embryoner, da dette kan forårsage epitelskader og lokal inflammation, hvorved immunologiske undersøgelser påvirkes - Lad embryonerne udvikle sig ved 28,5 °C indtil 2 dage efter befrugtning (dpf).
- Forbered en injektionplade ved at hælde nok 3% methylcellulose (i E3 medier) i låget af en lille 35 mm kulturskål til at danne en tynd film, der dækker hele overfladen.
BEMÆRK: Når der forberedes 3% methylcellulose i E3 medier, tager det flere dage for methylcellulose at opløsemed blid omrøring på en orbital shaker. - Bedøve larverne ved at inkubere i E3-medier suppleret med 200 μg/ml Tricaine.
- Saml en pulje på ca. 20-25 larver ved hjælp af en plastoverførselspipette, og lad embryonerne koncentrere sig ved pipettespidsen ved tyngdekraften. Sørge for at overføre larver med minimal væske, placere dem i midten af 35 mm kultur parabol låg.
- Ved hjælp af en mikrokapillær læsser arrangeres larverne på følgende måder: anterior mod toppen af injektionspladen med rygoverfladen vendt mod mikroinjektionsnålen, for at injicere i baghjernens ventrikel (figur 2A-D); eller, anterior mod venstre side af injektionspladen (ved injektion fra højre) med ventraloverfladen vendt mod mikroinjektionsnålen for at injicere i sinus venosus (figur 2I).
BEMÆRK: Når baghjernens ventrikelbeboer(figur 2E)og halehæmatopoietisk væv (CHT)-resident (figur 2J)indsættes på denne måde, kan makrofager målrettes. CHT-regionen af larve zebrafisk er et hæmatopoietisk sted svarende til pattedyr føtal leveren. Vær ekstra opmærksom på ikke at beskadige embryonerne, mens du arrangerer, da dette kan forårsage lokal inflammation og dermed påvirke immunologiske undersøgelser. - Tag frisklavede liposomer (fra trin 4.3) og ryg fyld en injektionsnål med ca. 5 μL af liposominjektionsblandingen ved hjælp af en mikrokapillær læsser (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Ved vurderingen af lokaliseringen af liposomer til de phagolysosomale segmenter af makrofager (figur 2H)suppleres denne injektionsblanding med 200 μg/ml af en rød fluorescerende markør for fagosomer (se Materialetabellen) og 100 nM af en langt rød lysstofmarkør af lysosomer (se Materialetabellen)for at markere phagosoms30,31 og lysosomer32. - Monter nålen i en mikromanipulator (se Materialetabel),der er forbundet med et magnetisk stativ og en trykinjektor (se Materialetabel). Placer under et stereomikroskop, og indstil injektoren til en pulsvarighed på ca. 50 ms og et injektionstryk på ca. 40 psi.
- Skær spidsen af mikroinjektionsnålen med rene finspidspincitre for at generere en åbning med en diameter på ca. 5 μm.
- Kalibrer det volumen, der skal injiceres, ved at indsprøjte en bolus i en dråbe mineralsk olie, der er placeret over gitterlinjerne i et hæmitorom. Fastgør pulsens varighed og/eller injektionstrykket, indtil bolusens diameter dækker 2,5 af de mindste gitterlinjer (dette svarer til et volumen på ca. 1 nL).
- Injicer omhyggeligt 1 nL af liposom injektion mix i baghjernen ventrikel af hver larver.
BEMÆRK: Når du injicerer i baghjernen ventrikel, passe på ikke at trænge for langt ventrally (ud over baghjernen), da dette kan forstyrre den underliggende vaskulatur, der fører til blødninger. Ved injektion i sinus venosus, bør der udvises forsigtighed for at sikre spidsen af nålen er lige inden for perikardiet og ikke trænger til æggeblomme. - Efter injektionen overføres de injicerede larver straks tilbage til E3-mediet ved at tilføje E3-medier til injektionspladen og forsigtigt ophidse larverne ud af methylcelluloseved hjælp af en plastoverførselspipette.
- Økue larverne ved 28,5 °C (beskyttet mod lys) indtil analyse ved direkte konfokalbilleddannelse.
5. Confocal Imaging og billedanalyse for at bekræfte Makrofag målretning af Liposomer
- Varm et vandbad op på 50 °C.
- Bedøve liposome-injiceret larver ved at overføre til en ny Perti skål, der indeholder E3 medier suppleret med 0,003% PTU og 200 μg/mL Tricaine.
- Forbered levende billeddannelse montering medium ved at opløse 1% lavt smeltepunkt agarose i E3 medier, suppleret med 0,003% PTU, i en mikrobølgeovn. Anbring i vandbadet, og når opløsningen er afkølet til 50 °C, tilsættes 200 μg/ml Tricaine.
- Opbevar monteringsmediet i vandbadet på 50 °C for at forhindre for tidlig polymerisering af agarose.
- For at afbilde baghjernens ryghjernes rygben på et konfokalmikroskop udstyret med en vandnedmmersionslinse (figur 2E), skal larverne integreres således: Fyld en 35 mm kulturskål med monteringsmediet (til en dybde på ca. 5 mm) og lad den polymerisere. Udgrave en lille grøft i agarose, der er af tilstrækkelig størrelse til at rumme æggeblomme sæk.
- Fyld en plastoverførsel pipette med smeltet montering medium, udvise en lille mængde, og bruge den til at indsamle de bedøvede larver. Straks overføre larver i kulturskålen og orientere æggeblomme sække, ventrale side ned, i de udgravede huller, ved hjælp af en mikrokapillær læsser. Med jævne mellemrum opretholde dem i denne position, indtil agarose polymerizes. Overlay med E3 medier suppleret med 200 μg/mL Tricaine.
BEMÆRK: Når du overfører og positionerer larver, skal du passe på ikke at forårsage epitelskader og lokal inflammation, som kan påvirke immunologiske undersøgelser. Til positionering af larver til levende billede CHT-regionen(figur 2J),monteres som beskrevet ovenfor, men placer larverne inden for det udgravede hul sideværts. - Når billeddannelse på en omvendt konfokal mikroskop, integrere larver, uden agarose seng, direkte på bunden af en glas bund fad. Arranger dem rygoverfladen ned (eller sideværts) og efter polymerisering, dække hele parabol overflade med et jævnt lag af montering medium. Når polymeriseret, tilføje et tyndt lag af E3 medier suppleret med 200 μg/ml Tricaine.
- Hvis du vil live billede hindbrain hjertekammer på en konfokal mikroskop, skal du bruge følgende indstillinger: 512 x 512 pixels; 40 x 3 μm Z-stakke (strækker sig fra dorsal-mest overflade af baghjernen); 20x mål; 2,5 x zoom.
BEMÆRK: Når signalintensiteterne mellem prøverne sammenlignes (f.eks. ved billeddannelse af optagelse af Marina Blue-mærkede liposomer, der injiceres i reporterlinjer, der markerer enten makrofager [Tg(mpeg1:EGFP)33] eller neutrofiler [Tg(lyz:EGFP)34]), er det vigtigt, at laserindstillingerne holdes de samme (f.eks. pinhole diameter, laserspænding, offset og gevinst) for at hjælpe med at sikre eventuelle forskelle er ikke en artefakt af ændrede billede erhvervelse indstillinger. - Brug 3D-billedanalyse software til at kvantificere makrofag eller neutrofile optagelse af Marina Blå-mærkede liposomer. For at kvantificere antallet af celler, der indeholder liposomer (figur 2F) i en Z-stack, skal du rulle gennem de enkelte Z-sektioner og tælle antallet af individuelle celler, der indeholder Marina Blue-mærkede liposomer. For at kvantificere fluorescensintensiteten af liposomer i celler (figur 2G) tegner en interesseregion omkring hver celle (i X-, Y- og Z-dimensionerne) for at kvantificere den intracellulære Marina Blues samlede eller gennemsnitlige fluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tynde film hydrering tilgang beskrevet her til fremstilling af fluorescerende liposomer omslutter narkotika er en enkel og omkostningseffektiv metode. Med den protokol, der anvendes i denne undersøgelse, liposomer forventes at være unilamellar23,24. Størrelsen, zeta potentiale, narkotika lastning og fastklemning effektivitet af liposomer produceret er sammenfattet i tabel 1. Partikelstørrelsen af liposomerne (før og efter indlæsning af lægemidlet) er ens (tabel 1). Overfladeladningen (zetapotentiale) af narkotikabelastede liposomer er lidt mere neutral sammenlignet med kontrolliposomer, men de er alle negativt ladet betyder, at dette ikke vil ændre deres biodistributionsmønster væsentligt.
Microinjection af Marina Blå-mærket liposomer i baghjernen ventrikel resulterer i hurtig optagelse af hjemmehørende makrofager, der let kan observeres ved konfokal mikroskopi ved 3 h efter injektion, når injiceres i makrofag en afstamning-mærkning transgene reporter linje Tg (mpeg1: EGFP)33 (Figur 2C, E-G). Dette er i modsætning til neutrofiler (som markeret inden for neutrofil-specifikke Tg (lyz: EGFP)34 reporter linje), der sjældent observeres indeholder intracellulære liposomer (Figur 2E-G). Inden for individuelle liposom-laden makrofager, liposomerne ophobes inden for phagolysosomal rum (Figur 2H),som er nødvendig for liposom nedbrydning og efterfølgende frigivelse af deres stof indhold i cytoplasma35. Valg af forskellige mikroinjektionssteder til liposom levering kan påvirke, hvilke væv-hjemmehørende makrofager er målrettet. Som eksempler, levering i baghjernen ventrikel effektivt mål hindbrain-hjemmehørende makrofager (Figur 2D,E),mens mikroinjektion i sinus venosus kan levere liposomer til CHT-hjemmehørende makrofager via omløb ( Figur2I,J).
Overvejelse af mikroinjektionsitet for liposom levering er vigtigt, når du bruger denne teknik til at afhøre makrofagssvaret på en immunologisk udfordring, da det hjælper med at sikre, at de særlige makrofager, der undersøges, modtager stoffet. Vi har rutinemæssigt brugt denne protokol til levering af narkotika-loaded liposomer i baghjernen ventrikel til at vurdere virkningen af disse lægemidler på makrofag svar på mononatriumurate (MSU) krystaller, ligeledes injiceres i baghjernen rum(Figur 3A). Som det forårsagende middel til akut gigtbetændelse aktiverer MSU-krystaller vævshjemmehørende makrofager til at producere proinflammatoriske mediatorer, herunder Interleukin-1β (IL-1β) gennem en proces, der er afhængig af mitokondrielre iltarter (mROS)10,36,37,38. Disse aktiverede makrofager derefter køre neutrofil infiltration, et kendetegn for akut gigt betændelse. Microinjection af liposomer fyldt med en mROS-hæmmende stof i baghjernen ventrikel kan i væsentlig grad undertrykke MSU krystal-drevet mROS produktion inden liposome-laden hindbrain-hjemmehørende makrofager (Figur 3B-D). Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, opnåede vi en fastklemningseffektivitet på 49,12 ± 0,17 %, hvilket resulterede i en formulering med en lægemiddelkoncentration på 103,05 ± 0,36 μM. Bemærk, at injicere en 1 nL volumen ved denne koncentration resulterede i nogen observerbar toksicitet under vores forsøg, som det fremgår af grove morfologiske ændringer eller hjertestop. Yderligere validering af de undertrykkende virkninger af dette stof på makrofag aktivering tilstand kan udføres ved at undersøge il1b udtryk (zebrafisk ortholog af IL-1β) ved hele mount in situ hybridization(Figur 4A,B)og tidsmæssige rekruttering af neutrofiler (Figur 4C, D).
Figur 1: Schematic illustrerer konventionel gratis stof levering versus liposome-medieret stof levering til larve zebrafisk. (A) Strategier rutinemæssigt anvendes til narkotika levering til larve zebrafisk er stort set begrænset til nedsænkning i, eller mikroinjektion af, gratis stof. (B) Microinjection af narkotika-loaded liposomer giver mulighed for direkte målretning til makrofager, hvor liposom nedbrydning i fagolysosomal rum resulterer i cytoplasmatisk stof levering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Målretning af lægemidler til makrofager ved hjælp af fluorescerende liposomer. (A) Microinjection set-up viser mikroinjektion nål (sort pil) og larver arrayed i en 35 mm væv kultur parabol inden for 3% methylcellulose. B) Forstørret syn på larver, der er opstillet som i A. (C) Levende konfokalbillede af 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP) larver, der er terior til venstre. (D) Forstørret syn på arrayed larver, som i A, der viser mikroinjektion i baghjernen ventrikel (sort pil markerer mikroinjektion nål). (E) Skematisk illustrerer målretning af hindbrain-hjemmehørende makrofager og levende konfokale billeder (dorsal synspunkter, anterior til venstre) i baghjernen regionen Tg (mpeg1:EGFP) og Tg (lyz: EGFP) larver, 3 h efter baghjernen mikroinjektion af Marina Blå-mærket liposomer (hvide pile mærke liposome-laden makrofager). (F og G) Kvantificering af liposomoptagelse ved makrofager og neutrofiler (som detpåvist i E), målt som antallet af celler, der indeholder (F), og fluorescensintensiteten/cellen (G) i Marina Blue-mærkede liposomer. (H) Live confocal billede af liposome-laden makrofag i baghjernen markeret med en rød fluorescerende markør af phagosomer og en langt rød fluorescerende markør for lysosomer inden tg (mpeg1:EGFP) larver, 3 h efter hindbrain mikroinjektion af Marina Blå-mærket liposomer. (I) Forstørret syn på arrayed larver, som i A, der viser mikroinjektion i sinus venosus (sort pil markerer mikroinjektion nål). (J) Skematisk illustrerer målretning af CHT-hjemmehørende makrofager og levende konfokale billeder (laterale synspunkter, anterior til venstre) i CHT-regionen Tg (mpeg1:EGFP) og Tg (lyz:EGFP) larver, 3 h efter mikroinjektion af Marina Blå-mærket liposomer i sinus venosus (hvide pile mærke liposome-laden makrofager). Visning af fejllinjer værdiværdi ± SD. *p<0,05; p < 0,0001, Student's t-test. Skalastænger = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D og I), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J). Dette tal er blevet ændret fra den tidligere publikation24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Microinjection af liposomer fyldt med en mROS-hæmmende stof undertrykker mROS produktion inden for aktiverede makrofager. (A) Schematic illustrerer målretning af en mROS-hæmmende stof til makrofager og vurdere det indvirkning på makrofag aktivering efter MSU krystal stimulation. B og C) Levende konfokale billeder af liposom-laden makrofager (kontrol liposomer/L-C (B) eller mROS-hæmmende liposomer/L-MI (C)) i hindbrain af Tg (mpeg1:EGFP) larver, også markeret med en fluorescerende mROS-specifik sonde (se Tabel over materialer, hvor fluorescerende signal vises som et hæmatmer med varme farver, der repræsenterer højere niveauer af mROS), 3 h efter hindbrain mikroinjektion af Marina Blå-mærket liposomer og MSU krystaller. Marina Blue fluorescens er pseudo-farvet i gråtoneskala. (D) Kvantificering af lysstofescensintensiteten af mROS-specifik sonde i makrofager, som det ekteret i B og C. Fejlstænger viser gennemsnitlige ± SD. ****p < 0,0001, Student's t-test. Skalastang = 10 μm (B). Dette tal er blevet ændret fra den tidligere publikation24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Microinjection af liposomer fyldt med en mROS-hæmmer undertrykker il1b udtryk inden for aktiverede makrofager og makrofag-drevet neutrofil rekruttering. (A) Udtryk for il1b (markeret med sorte pile), som detpåvises ved hele mount in situ hybridization, inden for baghjernen region 3 h efter baghjernen mikroinjektion af kontrol (L-C) eller mROS-hæmmende liposomer (L-MI) og MSU krystaller, anterior til venstre. Tal repræsenterer andelen af larver med viste fænotyper. (B) Kvantificering af il1b udtryk, som det påvises i A, vist som procent larver viser høj, lav eller ingen udtryk. C) Konfokale billeder af neutrofiler i baghjernen slaf tg(lyz:EGFP) larver (dorsal synspunkter, anterior til venstre), som detpåvises ved immunfluorescens 3 (3 hki) og 6 (6 hki) h efter hindbrain mikroinjektion af L-C eller L-MI og MSU krystaller. (D) Tidsmæssig kvantificering af neutrofiler, som det påvises i C, 1 (1 hki), 3 (3 hki), 6 (6 hki) og 9 (9 hki) h efter hindbrain mikroinjektion af L-C eller L-MI og MSU krystaller. Fejllinjer viser gennemsnitlige ± SD. ****p < 0,0001, n.s. ikke signifikant, envejs ANOVA, Dunnetts post hoc-test. Skalastænger = 100 μm (A), 50 μm (C). Dette tal er blevet ændret fra den tidligere publikation24. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Physicochemical egenskab af liposomer (L) | Kontrol liposomer | mROS-hæmmende liposomer |
| Størrelse (μm) | 1,2 ± 0,07 | 1,1 ± 0,04 |
| Zeta potentiale (mV) | -25,9 ± 0,57 | -13,0 ± 0,11 |
| Entrapment effektivitet (EE, %) | Nielsen | 49,12 ± 0,17 |
| Narkotikalastning (DL, %) | Nielsen | 0.37 ± <0.01 |
Tabel 1: PBS's (kontrol) eller mROS-hæmmende liposomers fysisk kemiske egenskaber (data er middel ± standardafvigelse, n = 3). Alle liposomer var mærket med Marina Blue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi givet en detaljeret protokol til at formulere narkotika-loaded liposomer til specifikt at målrette makrofager i larve zebrafisk. Denne metode kan bruges til at dissekere makrofagers rolle i visse sygdomsmodeller ved at sikre direkte målrettet levering af lægemidler specifikt til makrofager. Desuden kan det bruges, når generel toksicitet af narkotika begrænser deres anvendelse, når de leveres af mere konventionelle ruter, som nedsænkning. Den protokol, der er beskrevet her, er et alternativ til andre nanopartikelsystemer, der er blevet brugt til at målrette medfødte immunceller i larvezebrafisk. Disse omfatter rettet mod malaria lægemidlet rifampicin til Mycobacterium marinum-inficeredemakrofager til at fremme bakteriel clearance ved hjælp af sub-mikron størrelse polymere nanopartikler39. I et andet eksempel, indkapsling af (R)-roscovitine, en inducer af neutrofil apoptose, inden for polymerosomer har vist sig at målrette dette stof til neutrofiler, og dermed fremme inflammation opløsning40. I denne protokol har vi brugt liposomer som et middel til levering af lægemidler på grund af deres ikke-giftige, biokompatible og biologisk nedbrydelige egenskaber. Desuden er de ikke-immunogene, hvilket er af særlig betydning, når de anvendes til at undersøge immunologiske reaktioner, som dem, der er beskrevet her. En række laster kan også transporteres, herunder hydrofile, hydrofobe, amphipathic og lipofile lægemidler.
Når denne protokol udføres, er der en række kritiske trin, hvor der skal udvises særlig omhu. Disse omfatter trin, hvor larver håndteres fysisk, og der skal udvises forsigtighed for at minimere utilsigtede skader på larverne. Dette omfatter, når manuelt dechorionating larver (især undgå kontakt med den delikate epitel foring af æggeblomme), arraying larver på injektionspladen, deres fjernelse fra pladen efter injektioner og deres montering for levende konfokale billeddannelse. En uundgåelig del af denne protokol er behovet for at levere liposomer (og eventuelle immunudfordringer) gennem mikroinjektion, som kan forårsage lokal inflammation og derfor kan påvirke det eksperimentelle resultat. Microinjection i larve zebrafisk kræver en vis grad af uddannelse for at minimere vævsskader. I vores arbejde genererer genererer genererer genererer en mikroinjektionsnålsdiameter på ca. 5 μm meget mindre overfladeepitelseriskader (som det fremgår af det meget lave udtryk for den inflammatoriske markørmatrix metallopeptidase 9 i overfladeepitelceller i umiddelbar nærhed af mikroinjektionsåret10),når de injiceres i baghjernens hjertekammer på 2 dpf larver. Denne diameter spids er også lille nok til at undgå lækage af injiceret indhold, ud af baghjernen ventrikel, når mikroinjektion nålen er fjernet. Det er vigtigt at bemærke her, at injektionsmængder større end 2 nL ofte vil resultere i nogle af de injicerede indhold flyder gennem injektionhul som følge af overskridelse af mængden af hjertekammer. En spidsdiameter på 5 μm er også af tilstrækkelig størrelse til at tilføre efterfølgende immunudfordringer, såsom MSU-krystaller10. Facetning af mikroinjektionsnålsspidsen til 45° med en mikrogriner, så der kan genereres en skarp spids, kan give bedre gennemtrængning af den ydre periderm og indre basale epitellag, der dækker baghjernens ventrikel41. Det er vigtigt at bemærke, at kontrol injektioner som dem, der anvendes her (dvs. kontrol liposomer) er afgørende ved vurderingen af virkningerne af narkotika-loaded liposomer på makrofag funktion til at kontrollere for injektionsprocessen selv. Valg af en koncentration for et givet lægemiddel, når de formulerer i liposomer er også et vigtigt skridt som etablerede effektiv stof koncentrationer, når de leveres af nedsænkning, kan afvige fra dem, der er nødvendige, når du bruger liposom-medieret narkotika levering. Hertil kommer, når du bruger denne protokol, bør man være forsigtig med ikke at ændre de fysisk-kemiske egenskaber liposomer efter ændring med poloxamer, da dette kan påvirke deres biodistribution mønster.
Et område for ændring og fremtidig udvikling af denne protokol vil være at undersøge indarbejde forskellige overflade funktioner til liposomer såsom ligander eller receptorer til yderligere at forbedre makrofag målretning og optagelse, eller at målrette forskellige immunceller, såsom neutrofiler. Denne avancerede tilgang vil kræve yderligere undersøgelser for at afdække overfladefunktioner, der er unikke for de forskellige zebrafisk immuncellerum, som i øjeblikket er dårligt forstået. Yderligere områder for ændring af denne protokol omfatter indarbejdelse af andre fluorescerende sonder i liposomer til at udvide deres alsidighed (f.eks, når de injiceres i andre transgene reporter linjer) og ændre deres fysiske egenskaber sådan størrelse og afgift42,43. Det vil også være vigtigt at undersøge, om forskellige ruter af liposome administration på forskellige larve stadier kan udvide deres alsidighed til at målrette yderligere makrofag populationer, for eksempel intestinal epitelceller. I den protokol, der er beskrevet her, blev alle injektioner udført på 2 dpf larver. I løbet af den tredje dag af zebrafisk udvikling en enkelt kontinuerlig lumen fra munden til anus former, efter åbningen af munden44. Ved den frem dag anus åbner resulterer i en helt åben rør foret med en polariseret epitel44. Det bliver interessant at se, om nedsænkning af ældre larver i liposomer kan lette målretning af indkapslet medicin til tarm epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke findes konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) og Z.W. (Faculty Research Development Fund from the University of Auckland). Forfatterne takker Alhad Mahagaonkar for ekspertledelse af zebrafisk facilitet, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland for bistand med konfokale billeddannelse og Graham Lieschke for gaver Tg (mpeg1: EGFP) reporter linje.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
