Summary
والهدف من هذا الأسلوب هو الحصول علي الخلايا الليفية المستمدة من المصفوفات 3D كسقالة طبيعيه لاختبارات الخلوية اللاحقة. يتم البذر الخلايا الليفية في لوحه الثقافة قبل المعالجة وحفز مع حمض الاسكوربيك لتوليد مصفوفة. المصفوفات هي المكررة ومسدودة للثقافة الخلايا ذات الصلة (علي سبيل المثال ، الخلايا البطانية).
Abstract
مصفوفة خارج الخلية (ECM) هي سقالة ثلاثية الابعاد التي تعمل بمثابه الدعم الرئيسي للخلايا في الانسجه. الاضافه إلى وظيفتها الهيكلية ، يشارك الECM أيضا في هجره الخلايا ، والانتشار ، والتمايز. الخلايا الليفية هي النوع الرئيسي للخلايا تعديل ترتيب ألياف ECM والإنتاج. في السرطان ، CAFs (الأورام الليفية المرتبطة بالسرطان) هي في حاله التنشيط الدائم ، والمشاركة في أعاده عرض ECM ، وتسهيل هجره الخلايا السرطانية ، وتحفيز تولد الاوعيه المرتبطة بالورم ، من بين الأدوار الأخرى الموالية للتوريجيني. والهدف من هذا الأسلوب هو إنشاء مصفوفة ثلاثية الابعاد مع تكوين ألياف التي تشبه في المصفوفات المجرية ، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الخلد أو CAFs الاساسيه الإنسان. يتم استزراع الخلايا الليفية في لوحات ثقافة الخلية قبل المعالجة وتزرع تحت تحفيز حمض الاسكوربيك. ثم يتم أزاله الخلايا الليفية ويتم حظر المصفوفات لمزيد من البذر الخلية. في هذا النموذج ECM ، يمكن تنشيط الخلايا الليفية أو تعديلها لتوليد أنواع مختلفه من المصفوفة ، التي يمكن دراستها اثار في ثقافة الخلية. كما تتشكل المصفوفات ثلاثية الابعاد بواسطة إشارات الخلايا ، مثل التحلل أو الانزيمات المتداخلة التي قد تعدل توزيع ألياف. وفي هذا السياق ، يمكن دراسة الاوعيه الدموية ، إلى جانب أنواع الخلايا الأخرى مثل خلايا الورم الظهاريه.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي بنيه ديناميكية موجودة في جميع أنواع الانسجه. وهو يتالف من البروتينات والسكريات التي تخلق شبكه من ألياف الحاسمة للتصاق الخلية ، والهجرة ، والاتصالات1. يختلف تكوين ECM حسب الانسجه. في حين ان الكولاجين من النوع الأول هو البروتين الهيكلي الأكثر انتشارا ، يمكن أيضا العثور علي أنواع الكولاجين الثاني والثالث والخامس والحادي عشر في الانسجه المختلفة2. وهناك حاجه fibronectin التي تولدها الخلايا الليفية للتصاق الخلية2. وعلاوة علي ذلك ، هناك جزيئات هيكليه أخرى مثل والايلاستين ، laminin والمستقبلات السطحية تسمي التكاملات التي تتوسط الجمعية ألياف ومحدده لأنسجه ECM مختلفه2. يلعب ECM دورا هاما كسقالة الخلية ويمكن أيضا ان تشارك في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية1. لوحظت تشوات في ECM في امراض مثل السرطان ، الذي يغير تكوين ECM و/أو تنظيمها. في الأورام ، يمثل ECM المكون غير الخلوي للبيئة المجهرية للورم (TME) ، وهو بيئة معقده من مكونات الخلايا مثل الخلايا الليفية ، والخلية المناعية ، والخلايا البطانية ، والعجانات ، ومجموعه متنوعة من العوامل القابلة للذوبان. ومن المعروف ان TME يعزز تقدم السرطان والانبثاث. الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان, كنوع الخلية المهيمنة في سدي الورم, المشاركة في هذه العملية3. علي عكس الخلايا الليفية العادية ، CAFs في التنشيط الدائم ، والتي تظهر زيادة إفراز البروتينات ECM وعوامل النمو (علي سبيل المثال ، تحويل عامل النمو-β ، TGF-β) ، فضلا عن تعبير اعلي من بعض علامات ، مثل العضلات الملساءα (α-SMA) والخلايا الليفية تنشيط البروتين ومع ذلك ، CAFs هي السكان خليه غير متجانسة ، والتي تبين مستويات مختلفه من التنشيط أو علامة التعبير5. ويمكن افتراض ذلك ان تكوين وهيكل المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية سوف تعتمد علي حاله الخلايا الليفية والخصائص.
وفي هذا السياق ، فان الهدف من هذه المنهجية هو إنشاء نموذج مناسب في المختبر لتوليد المحتوي بالخلايا الليفية مكافئه لوضع ECM في الجسم. نقترح هذا النهج كمنهجيه انتقاليه في المختبر لمزيد من الدراسات لوظائف الخلايا السرطانية ، مثل المقاومة الكيميائية أو الهجرة ، بوساطة ECM. كما نشرت مجموعتنا في مكان آخر ، ويمكن الحصول علي CAFs من عينات الانسجه الطازجة ، ولكن لا بد من الاشاره إلى ان البقاء علي الحياة CAFs في الثقافة محدوده ويتم تخفيض عدد الخلايا الخاصة بهم6. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الثقافات الاساسيه CAF المنشاة من عينات المرضي لتوليد مصفوفة. التلاعب في التعبير الجيني في الخلايا الليفية هو أيضا وسيله مثيره للاهتمام لإنتاج مصفوفات متنوعة في المختبر لتقييم الآثار المحتملة علي تكوين مصفوفة, الاتجاه ألياف, الخ. وعلي هذا المنوال ، قامت مجموعتنا مؤخرا بالإبلاغ عن دور الخلايا الليفية التي تعبر عن الحلزون في تكوين واتجاه ألياف لمختلف المصفوفات المشتقة7.
وعلاوة علي ذلك ، فان CAFs ونظام ECM يشاركان في الجهاز الوعائي ، سواء في توليد السفن أو كجزء من الطبقة الخارجية لإناء الزهر8. أعاده عرض ECM يحفز تولد الاوعيه. مصفوفة المعادن الفلزية (mmps) ويبدو ان نوع الانزيم الأكثر اهميه المساهمة في هذه العملية9,10. الاوعيه الدموية الانسجه من الخلايا الاوليه التي تولد ECMs ، الجزيئات ECM ، وعوامل النمو المتبقية المدرجة في ECM ، ومرونة مصفوفة ، وسمك مصفوفة توصف بأنها العوامل التي تنطوي علي تنشيط الخلايا البطانية11. في الأورام ، ونقص الأكسجين يزيد من صلابة ECM والبطانية برعم الجيل12. وعلاوة علي ذلك, CAFs تفرز عامل نمو بطانة الاوعيه الدموية (VEGF) وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) التي تحفز تولد الاوعيه في الورم سدي13. في هذا المجال ، يمكن استخدام توليد مصفوفة في المختبر لدراسة عمليات تولد الاوعيه أو العمل التناسبي المختلط في ظل ظروف تجريبية مختلفه. التالي ، يمكن ان يكون الاستنساخ في المختبر من المصفوفة الأكثر تشابها في الجسم المجري أداه قيمه للتحقيق في دور ECM في الاوعيه الدموية أو التفاعلات الخلية البيئية الصغرى.
تحفيز الخلايا الليفية مثقف مع حمض الاسكوربيك لتعزيز ترسب مصفوفة وتوليد ECM هو وسيله مقبوله لإنتاج مماثله في المصفوفات المجرية. يتم استزراع خطوط الخلايا الليفية الخلد بسهوله ويتم تنشيطها من قبل عوامل النمو المتنوعة ، مثل PDGF-BB ، عامل نخر الورم-α (TNF-α) أو TGF-β14. داخل tme, cafs توليف الكولاجين من النوع الأول و الفيبرونكتين جنيني كمكونات رئيسيه من ECM4. المثل ، تم العثور علي هذه المكونات كمكونات رئيسيه لمصفوفات مشتقه من الخلايا الليفية المتولدة في المختبر (الشكل 1).
وهناك منهجيات مختلفه في المختبر لمحاكاة في الجسم العام ECM. تم تمديد استخدام الاطباق الثقافة المغلفة مع خليط من ألياف ECM في السنوات الماضية ، ولكن هذا النهج 2D بحاجه إلى تحسين الهياكل 3D ، مثل الهلام المرتبطة (علي سبيل المثال ، الحاكم)1. أصبح الاعداد الشبيه بالقاعدة الطريقة القياسية لمحاكاة مصفوفة ثلاثية الابعاد. ويعد الليفيبين أيضا بديلا عند توليد المصفوفات ولكنه يفشل من حيث قوه ومتانة المحتوي1. الكولاجين المستخدم بالاشتراك مع مكونات ECM الأخرى يعدل بعض القضايا المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فان هذه الهلام الكولاجين تشكل شبكه قويه مع ألياف التي يمكن ان تكون موجهه ، ولكنها غير متجانسة للغاية ، والتي يمكن ان تكون مشكله في التكرار التجربة1. ومع ذلك ، يجب ان نفترض انه ، اعتمادا علي الهدف من التجارب ، واستخدام المصفوفات أو غيرها من الهلام المائي هو أكثر ملاءمة (علي سبيل المثال ، في دراسات انكماش مصفوفة التي يمكن الكشف عن تقلص هلام بسهوله).
يمكن ان تكون الوالاستمناع المحتملة للمصفوفات التي تم إنشاؤها مشكله في التجارب مع بعض أنواع الخلايا. ولذلك ، للحد من امكانيه الاستجابات المناعية بسبب خلايا توليد ECM عند استخدام طريقتنا ، والمصفوفات وغسلها ، وعلي الرغم من ان أزاله جزء الخلية لا يمكن ان يكون المجموع15. يحتاج ECM المثالي إلى ان يكون متوافقا مع ثقافة الخلايا وقادرا علي التواصل والتفاعل مع إشارات الخلايا. إجراءاتنا تسمح بإدخال التغييرات دون صعوبة اثناء إنتاج ECM (علي سبيل المثال ، أضافه عوامل النمو تحفيز الخلايا الليفية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول علي عينات من الانسجه البشرية بموافقه مجلس أخلاقيات البحوث الخاص بمستشفي رامون اي كجال ، بمدريد.
1. اعداد الحلول
- اعداد 0.2 ٪ محلول الجيلاتين: أضافه 1 غرام من الجيلاتين إلى 500 مل من تلفزيوني. الاوتوكلاف الحل والحفاظ علي 4 درجه مئوية. تصفيه مع فلتر 0.22 μm قبل الاستخدام.
- اعداد 1 ٪ غلوتارالديهيد: أضافه 1 مل من الحل الأسهم غلوتارالدهيد 25 ٪ إلى 24 مل من تلفزيوني. تصفيه مع فلتر 0.22 μm قبل الاستخدام.
- اعداد 1 M ايثانولامين: اعداد محلول ايثانولامين مع معقم H2O. فلتر مع فلتر 0.22 μm قبل الاستخدام.
ملاحظه: كما يتم توفير ايثانولامين مع غطاء الأمن ، وسوف تكون هناك حاجه ابره وحقنه. - اعداد حمض الاسكوربيك: أضافه 0.1 mL من 50 ملغ/مل الحل الأسهم حمض الاسكوربيك (خفيفه الحساسية) إلى 100 مل من المتوسطة.
- اعداد تحلل العازلة: اعداد تلفزيوني 0.5 ٪ تريتون 100X مع 20 نيوتن متر من NH4آوه. أضافه NH4OH الحق قبل الاستخدام.
- اعداد تلفزيوني القلم/بكتيريا: تمييع القلم/بكتيريا الحل الأسهم إلى 100 U/mL القلم و 100 ميكروغرام/مل بكتيريا.
- اعداد DMEM مع 10 ٪ من العدد: أضافه 10 ٪ إلى 500 مل من DMEM. الملحق مع 100 U/ml البنسلين, 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين, 0.1 ملغ/مل normocin و 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتيريسن B.
- اعداد 2 ٪ من التشويه الحراري للجيش الصربي البوسني: أضافه 2 غرام من الجيش الصربي البوسني إلى 100 مل من الماء المعقم. دافئ في الماء المغلي لمده 7 دقائق.
- اعداد العنصر المضاد للمضادات الحيوية: الملحقة مع ال200 U/ml البنسلين ، 200 ميكروغرام/مل ستربتومايسين ، 100 ميكروغرام/مل جنتاميسين و 2.5 g/ml الامفوتيريسن B.
2. اعداد الثقافة الخلوية
- الخلايا الليفية الخلد خط الخلية
- الثقافة التيلوميراز المؤتلف المتحولة خلدا القلفة البشرية الخلايا الليفية (BJ-hTERT ، ATCC CRL-4001) في DMEM مع 10 ٪ والمحافظة علي 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- الخلايا البطانية
- الثقافة البشرية الوريد الحبل السري الخلايا (HUVECs ، ATCC جهاز كمبيوتر شخصي-100-013) في EBM-2 المتوسطة التي تحتوي علي 2 ٪ والمحافظة علي 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- الخلايا الليفية الثقافة الاساسيه
ملاحظه: بالنسبة لمؤسسه CAF والثقافة ، تمت متابعه البروتوكول الذي سبق ان نشرته مجموعتنا6.- لفتره وجيزة ، وقطع عينات الانسجه إلى قطع صغيره من حوالي 2-3 مم3 والبذور في المقطع مع تركيز عال من المضادات الحيوية.
- عندما ظهرت الخلايا الليفية الاولي ، استبدال المتوسطة مع FBM المتوسطة لصيانة الخلايا.
ملاحظه: اعتمادا علي أصل الانسجه ، يمكن تلويث ثقافات الخلايا بسهوله. غسل عينات في تلفزيوني تستكمل مع المضادات الحيوية ، مع الانسجه الملوثة للغاية (علي سبيل المثال ، القولون6) ويهز لمده 30-45 دقيقه.
3. الخلايا الليفية المشتقة المصفوفات 3D (مقتبسه من Castelló-Cros وكوكيرمان16)
- أضافه 2 مل من محلول الجيلاتين 0.2 ٪ لكل بئر من 6-بئر لوحه واحتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- يستنشق الجيلاتين ويغسل في 2 مل من تلفزيوني.
- أضافه 2 مل من غلوتارالديهيد 1 ٪ واحتضان لمده 30 دقيقه في RT. غلوتارالديهيد سيربط بين الجيلاتين.
- يستنشق غلوتارالديهيد ويغسل الآبار في 2 مل من تلفزيوني لمده 5 دقائق. كرر 3 مرات.
- أضافه 2 مل من 1 م ايثانولامين واحتضان لمده 30 دقيقه في RT. ستعمل ايثانولامين لمنع غلوتارالدهيد المتبقية.
- يستنشق ايثانولامين ويغسل الآبار في 2 مل من تلفزيوني لمده 5 دقائق. كرر 3 مرات.
- أضف 1 مل من DMEM بنسبه 10%. إذا كانت المتوسطة يتحول علي الفور الوردي ، وأزاله المتوسطة ، وغسل في 2 مل من تلفزيوني وأضافه مره أخرى 1 مل من DMEM مع 10 ٪.
- بذور 1 مل من تعليق الليفية ، مع 5 × 105 خلايا في كل بئر. الحجم الإجمالي في كل بئر سيكون 2 مل.
- الخلايا الثقافية حتى يتم التوصل إلى التقاء 100 ٪. ثم قم بازاله الوسيطة واستبدلها ب DMEM بنسبه 10% مع 50 ميكروغرام/مل من حمض الاسكوربيك والمعالجة الاضافيه إذا ما استخدمت.
- استبدلي المتوسطة مع DMEM الطازجة مع 10 ٪ و50 ميكروغرام/مل حمض الاسكوربيك كل 2 أيام لمده 6 أيام.
ملاحظه: إذا تم استخدام العلاج الإضافي (علي سبيل المثال ، PDGF-BB ، tgf-β و/أو عوامل النمو الأخرى) ، اضافتها في نفس الأيام كما يتم أضافه علاج حمض الاسكوربيك. - بعد يومين من آخر علاج حمض الاسكوربيك ، وأزاله المتوسطة ويغسل في 2 مل من تلفزيوني.
- أضافه ببطء 1 مل من تحلل العازلة ، قبل تسخينها في 37 درجه مئوية ، لكل بئر. احتضان ل 5-10 دقيقه في RT حتى يتم تفكيك الخلايا الليفية (يمكن ملاحظتها تحت المجهر).
- بعناية ودون أزاله تحلل العازلة ، أضافه 2 مل من تلفزيوني. ثم يستنشق حوالي 2.5 مل من تلفزيوني. كرر مرتين لما مجموعه ثلاثه يغسل.
- في نهاية المطاف ، أزاله 2.5 mL من تلفزيوني وأضافه 2 مل من تلفزيوني مع القلم/بكتيريا (100 U/mL و 100 ميكروغرام/مل ، علي التوالي). ختم مع الفيلم والحفاظ علي 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
ملاحظه: استنادا إلى التجربة ، قد يؤثر التخزين طويل الأجل للمصفوفات التي تم إنشاؤها علي النتائج. نوصي باستخدام المصفوفات في أقرب وقت ممكن ، وحتى أكثر من ذلك إذا كانت التجربة تنطوي علي بذر الخلايا ، وذلك بسبب احتمال تدهور البروتين. إذا تم استخدام المصفوفات لاختبارات هيكليه ، مثل مراقبه الكولاجين ، يمكن إصلاح المصفوفات وتخزينها لفترات أطول. ويشار إلى هذا البروتوكول للوحه ثقافة 6-حسنا. ويمكن استخدام لوحات أخرى ، ولكن الاحجام التفاعلية وتركيز تعليق الخلية تحتاج إلى أعاده حساب وفقا لمنطقه البئر.
4. أنبوب تشكيل الفحص
- تنمو الخلايا HUVEC في EBM-2 2 ٪ المنفذ حتى الحد الأقصى للتقاء.
- استبدال المتوسطة مع EBM-2 دون المنفذة لمده 8 ساعات.
- اعداد المصفوفات قبل الخلايا البذر.
- أزاله المصفوفات من الثلاجة ووضع لمده 1 ساعة في RT.
- كتله المصفوفات عن طريق أضافه 2 مل من الحرارة-التشويه 2 ٪ جيش الصرب البوسني. احتضان 1 ح في 37 درجه مئوية.
- يستنشق الجيش الصربي البوسني ويغسل في 2 مل من تلفزيوني.
- البذور 2 × 105 huvec الخلايا في المتوسطة المنضب علي كل بئر من لوحه 6 جيدا المغلفة سابقا مع المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية 3d.
- احتضان الخلايا البطانية عند 37 درجه مئوية لمده 16 ساعة.
- دراسة تشكيل هيكل مثل أنبوب تحت مجهر حقل مشرق القياسية في 20-40x التكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGF-BB حفز الخلايا الليفية خلق أكثر سمكا ECM. وأظهرت هيريرا وآخرون كيف الخلايا الليفية المحفزة PDGF ولدت مصفوفة أكثر سمكا ، فضلا عن ارتفاع ألياف التوجه7. وقد حضنت BJ-hTERT الخلايا الليفية مع أو بدون PDGF والمناطق التمثيلية لاحظت وأظهرت توزيع خليه أكثر انحياز في المصفوفات التي تنتجها PDGF-حفز الخلايا الليفية (الشكل 1ا). تم زيادة الكولاجين I و الفيبرونكتين جنيني البروتين التعبير في المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية حفز pdgf (الشكل 1ب) ، التالي ، تم زيادة سماكه مصفوفة (الشكل 1ج). وعلاوة علي ذلك ، الكولاجين I و الفيبرونكتين جنيني تظهر أنماط موازيه ، كما هو مبين في الرسوم البيانية الاتجاهية (الشكل 1د).
المصفوفات الثلاثية الابعاد المشتقة من الخلايا الليفية المحفزة PDGF-BB تحفز الأنابيب في الخلية البطانية. تم المصنفة الخلايا HUVEC علي المصفوفات المكررة المشتقة من PDGF-حفز أو غير محفزه BJ-hTERT الليفية. وأظهرت الخلايا البطانية المصنفة علي المصفوفات المتولدة عن الورم الليفي المحفز PDGF هياكل أكثر تشبه الشعرية منها تحت ظروف غير محفزه (الشكل 2).
الشكل 1: الخلايا الليفية المحفزة PDGF تعزز المحتوي الأكثر سمكا والمتباين الخواص. (ا) الصور الثنائية ممثل التوجه الخلوي من الخلايا الليفية BJ-htert تعامل أو لا مع PDGF-BB (أعلاه) والرسوم البيانية الاتجاهية (أدناه) ، والتي تمثل تواتر توزيع زوايا الخلايا (توسيط علي زاوية 0 °). (ب) زيادة في التعبير عن البروتين من الفيبرونكتين البروتينات خارج الخلية والكولاجين انا في الخلايا الليفية المحفزة PDGF المستمدة من ECM. (ج) زيادة سمك المحتوي في المؤسسة في تلك الخلايا الليفية المستخرجة من الورم الاروفي المحفز لل PDGF. (د) زيادة في البروتين وتنظيم البروتينات خارج الخلية مثل الفيبروكتين والكولاجين الأول في الخلايا الليفية المحفزة لل PDGF المشتقة من ECM. أدناه ، الرسوم البيانية الاتجاهية. * ف < 0.05 ؛ p < 0.001. مقتبسه من هيريرا وآخرون7الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخلايا الليفية المحفزة pdgf تعزز تنشيط الخلية البطانية ، والذي لوحظ من قبل تشكيل الهياكل الشعرية مثل علي المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية المحفزة pdgf. وأظهرت أداه "تحليل الجسيمات" من ImageJ معدل زيادة 1.81 في HUVECs المصنفة علي المصفوفات من الخلايا الليفية المحفزة PDGF بشان تلك المصنفة علي المصفوفات من الخلايا الليفية غير المحفزة. مقتبسه من هيريرا وآخرون7الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن ان تتولد المصفوفات مع الخلايا الليفية الخلد أو ثقافات الخلايا الليفية الاوليه. الخلايا الليفية من السهل الحفاظ عليها في الزراعة في المختبر مع معدل نمو عال ومقاومه الإجهاد. حتى انها يمكن ان تكون معزولة عن الانسجه بعد الوفاة3، علي الرغم من ان التلوث يمكن ان يكون قيدا ، اعتمادا علي أصل الانسجه.
نموذج 3D-مصفوفة هنا يقدم نظاما جديدا وفعالا لدراسة بنجاح تكوين ECM والتوجه ألياف. كما انها مناسبه للتحليلات من حاله تفعيل الخلايا الليفية ، والجينات/البروتين التعبير ، والتفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى ، الخ. من المهم تسليط الضوء علي ان المصفوفات المتولدة مع الخلايا الليفية من المرضي جعل دراسة مخصصه للأليات المتعلقة سدي في الأورام ممكن. علي سبيل المثال ، يمكن تطبيق هذا النهج علي دراسات المقاومة الكيماوية ، التي يكون فيها ECM دورا هاما. ترجمه هذا النوع من الدراسة يمكن ان تساعد في اتخاذ القرارات لعلاج المرضي في الممارسة السريرية ، وتنفيذ الطب شخصيه.
علي الرغم من ان بروتوكول 3D-مصفوفة يمكن ان تكون مملة ، ويمكن تحقيق نتائج مثيره للاهتمام عن طريق اتباع التعليمات. وتجدر الاشاره إلى ان هناك حاجه إلى عده خطوات الغسيل ، لذلك تجنب الضرر مصفوفة أمر ضروري. الاضافه إلى ذلك ، نوصي بأنه عندما يتم اختبار الظروف المختلفة للثقافة الخلوية مع هذا البروتوكول ، يجب إنشاء المصفوفات في نفس الوقت بسبب الحد الأدنى من الاختلافات التي قد تحدث اثناء التجارب (علي سبيل المثال ، باستخدام نفس تعليق الخلايا الليفية عند البذر لوحات المعالجة المسبقة).
ويجري تطوير أساليب أخرى لهندسه الانسجه ، ولكن هناك حاجه إلى خطوات اضافيه مثل التعقيم لإنشاء ECM والانسجه المتوافقة للاستخدام البشري. وعلي الرغم من ان التكنولوجيات الجديدة تنشا ، فانها قد تكون مكلفه وقد يصعب التكيف مع مرافق المختبرات القياسية. استخدام CAFs الاوليه التي تم الحصول عليها من المرضي يجعل من الممكن لتوليد "مصفوفات شخصيه" لاختبار العلاجات المختلفة. علي طول هذا الخط ، وقد تم استخدام مجموعتنا هذه المنهجية لإثبات ان المصفوفات التي تنتجها CAFs تختلف عن تلك التي تم إنشاؤها بواسطة NFs ، والتي تظهر أكثر سمكا وأكثر تنظيما المصفوفات7. وقد ذكرنا ان البني الشعرية الشبيهة المستمدة من الخلايا البطانية تعتمد علي الورم الليفي Snail1 التعبير ، وهناك دراسات مستقبليه لمراقبه هذا التاثير علي المصفوفات المستمدة من CAFs.
يتطلب ECM المزيد من الدراسة قبل ان نتمكن من فهم أليات الاساسيه المسؤولة عن مقاومه العلاج الكيميائي أو انتكاس الورم. ولذلك ، نقترح استخدام المصفوفات المستمدة من الكاف من انسجه المريض السرطان كاجراء للتحقيق في السلوك البيئي المجهري في السرطان والاتصال ECM مع الخلايا السرطانية أو غيرها من الخلايا اللحمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد تطوير هذا البروتوكول PI12/02037 و PI15/02101 و PI17/01847 و PI18/01034 و RD12/0036/0041 من معهد الصليب كارلوس الثالث ؛ الاتحاد الأوروبي للتنمية الاقليميه (FEDER) ؛ بواسطة "CIBER de Cáncer" ، CB16/12/00273 و CB16/12/00446 ، من معهد الصليب كارلوس الثالث-FEDER ؛ ومن قبل مؤسسه Científica AECC (نهج متعدد الأوجه لاستهداف سرطان البنكرياس). وقد تلقت كريستينا بينيا عقد ميغيل سيرفيت من معهد الصليب كارلوس الثالث. ساعد m. Eaude مع النص الإنكليزي. نشكر أعضاء المختبر للحصول علي المساعدة والمشورة في جميع انحاء هذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
