Summary
Målet med denne metoden er å få Fibroblast-avledet 3D-matriser som et naturlig stillas for påfølgende cellulære analyser. Fibroblaster er sådd i en pre-behandlet kultur plate og stimulert med askorbinsyre for matrise generasjon. Matriser er decellularized og blokkert til kultur relevante celler (f. eks, endothelial celler).
Abstract
Ekstracellulære matrise (ECM) er et tredimensjonalt stillas som fungerer som den viktigste støtten for celler i vev. Foruten sin strukturelle funksjon, deltar ECM også i celle migrasjon, spredning og differensiering. Fibroblaster er den viktigste typen celler modifisere ECM-fiber ordning og produksjon. I kreft, CAFs (kreft assosiert fibroblaster) er i permanent aktiveringsstatus, deltar i ECM remodeling, tilrettelegge tumor celle migrasjon, og stimulere tumor-assosiert angiogenese, blant annet Pro-tumorigene roller. Målet med denne metoden er å skape en tredimensjonal matrise med en fiber sammensetning som ligner in vivo matriser, ved hjelp av udødeliggjort fibroblaster eller menneskelig primære CAFs. Fibroblaster er kultivert i pre-behandlet cellekultur plater og vokst under askorbinsyre stimulering. Deretter blir fibroblaster fjernet og matriser er blokkert for videre celle seeding. I denne ECM-modellen kan fibroblaster aktiveres eller endres for å generere ulike typer matrise, hvis effekter kan bli studert i cellekultur. 3D-matriser er også formet av celle signaler, som degradering eller kryss-linking enzymer som kan endre fiber distribusjon. I denne sammenheng kan angiogenese bli studert, sammen med andre celletyper som epitel tumorceller.
Introduction
Ekstracellulære matrise (ECM) er en dynamisk struktur som finnes i alle typer vev. Den består av proteiner og polysakkarider som skaper et garn av fibre som er avgjørende for vedheft, migrasjon og kommunikasjon1. ECM sammensetning varierer avhengig av vevet. Mens type-I kollagen er den mest utbredte strukturelle protein, kan kollagen typer II, III, V og XI også finnes i ulike vev2. Fibronektin generert av fibroblaster er nødvendig for celle vedheft2. Videre er det andre strukturelle molekyler som elastin, laminin og overflate reseptorer kalt integrins som megle fiber montering og er spesifikke for de ulike ECM vev2. ECM spiller en viktig rolle som et celle stillas og kan også være involvert i både fysiologiske og patologiske prosesser1. Unormalt i ECM er observert i patologi som kreft, som endrer ECM sammensetning og/eller dets organisasjon. I svulster representerer ECM den ikke-cellulære komponenten av tumor mikromiljøet (TME), et komplekst miljø av celle komponenter som fibroblaster, immunceller, endothelial celler, pericytes og en rekke løselige faktorer. Det er kjent at TME fremmer kreft progresjon og metastasering; kreft-assosiert fibroblaster, som en dominerende celle type i tumor stroma, ta del i denne prosessen3. I motsetning til normale fibroblaster, CAFs er i permanent aktivering, viser økt sekresjon av ECM proteiner og vekstfaktorer (f. eks, transformere vekstfaktor-β, TGF-β), samt et høyere uttrykk for noen markører, slik som α-glatte muskel utgangen (α-SMA) og Fibroblast aktivisering protein (FAP)4. CAFs er imidlertid en heterogen cellepopulasjon, som viser ulike nivåer av aktivering eller markør uttrykk5. Det kan antas da at sammensetningen og strukturen av Fibroblast-avledet matriser vil avhenge av Fibroblast status og egenskaper.
I denne sammenhengen er målet med denne metodikken å etablere en hensiktsmessig in vitro-modell for ECM-generering med fibroblaster tilsvarende in vivo ECM-innstilling. Vi foreslår denne tilnærmingen som en in vitro translational metodikk for videre studier av tumor celle funksjoner, som chemoresistance eller migrasjon, formidlet av ECM. Som vår gruppe har publisert andre steder, kan CAFs fås fra ferske vevsprøver, men det må bemerkes at CAFs ' overlevelse i kulturen er begrenset og deres celle passasje nummeret er redusert6. I tillegg CAF primære kulturer etablert fra pasientens prøver kan brukes for matrise generasjon. Manipulering av genuttrykk i fibroblaster er også en interessant måte å produsere varierte in vitro matriser for å vurdere mulige effekter på matrisen sammensetning, fiber orientering, etc. Langs disse linjene, har vår gruppe nylig rapportert rolle snail-uttrykker fibroblaster i sammensetningen og fiber orientering av ulike avledet matriser7.
Videre er CAFs og ECM involvert i det vaskulære systemet, både i fartøy generasjon og som en del av vasen ytre lag8. ECM remodeling induserer angiogenese; Matrix metalloproteinases (MMPs) synes å være den viktigste enzymet type bidra til denne prosessen9,10. Vevs endometrial blodkar til primær celler som genererer ECMs, ECM-makromolekyler, gjenværende vekstfaktorer som er inkludert i ECM, matrise elastisitet og matrise tykkelse er beskrevet som faktorer involvert i endothelial celle aktivering11. I svulster øker hypoksi ECM-stivhet og endothelial generasjon12. Videre skiller CAFs vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) og blodplate avledet vekstfaktor (PDGF) som stimulerer angiogenese i tumor stroma13. I dette feltet, in vitro Matrix generasjon kan brukes til å studere angiogenese prosesser eller MMP handling under ulike eksperimentelle forhold. Således, in vitro reproduksjon av de mest analoge in vivo matrise kan være et verdifullt verktøy for å undersøke ECM rolle i angiogenese eller mikro-miljømessige celle interaksjoner.
Stimulering av kultivert fibroblaster med askorbinsyre å forbedre matrise avsetning og generere en ECM er en akseptert måte å produsere analoge in vivo matriser. Udødeliggjort Fibroblast cellelinjer er lett kultivert og aktiveres av ulike vekstfaktorer, som PDGF-BB, tumor nekrose faktor-α (TNF-α) eller TGF-β14. Innenfor TME, CAFs syntetisere type-I kollagen og fibronektin som de viktigste komponentene i ECM4. På samme måte er disse komponentene funnet som viktige komponenter av in vitro-generert Fibroblast-avledet matriser (figur 1).
Det finnes forskjellige in vitro-metoder for å simulere in vivo ECM. Bruken av belagte kultur retter med blandinger av ECM-fibre ble utvidet i tidligere år, men denne 2D-tilnærmingen trengte forbedring av 3D-strukturer, slik som tverrbundet gels (f.eks. Matrigel)1. Matrigel-lignende oppsett har blitt standardmetoden for å simulere en 3D-matrise. Fibrin er også et alternativ når du genererer matriser, men mislykkes i form av styrke og holdbarhet av ECM1. Kollagen som brukes i kombinasjon med andre ECM-komponenter, endrer noen av ovennevnte problemer. Men disse kollagen gels danne et sterkt nettverk med fibre som kan være orientert, men er svært heterogen, noe som kan være et problem i eksperimentet repetisjoner1. Likevel må det antas at, avhengig av formålet med eksperimenter, bruk av Matrigel eller andre hydrogeler er mer hensiktsmessig (f. eks i matrisen sammentrekning studier der gel sammentrekning kan lett oppdages).
Den potensielle immunogenisitet av de genererte matriser kan være et problem i eksperimenter med noen celletyper. Derfor, for å redusere muligheten for immunresponser på grunn av ECM-generering celler når du bruker vår metode, matriser er decellularized og vasket, selv om celle fragment fjerning ikke kunne være totalt15. Den ideelle ECM må være kompatibel med cellekultur og i stand til å kommunisere og reagere på celle signaler. Vår prosedyre gjør det mulig å innføre endringer uten problemer under ECM-produksjon (f.eks. ved å legge til Fibroblast vekstfaktorer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human vevsprøver ble innhentet med godkjennelse av forskningsetikk styret til sykehuset Ramón y Cajal, Madrid.
1. utarbeidelse av løsninger
- Forbered 0,2% gelatin løsning: Tilsett 1 g av gelatin til 500 mL av PBS. Autoklav løsningen og hold ved 4 ° c. Filter med et 0,22 μm-filter før bruk.
- Forbered 1% glutaraldehyde: Tilsett 1 mL 25% glutaraldehyde lagerløsning til 24 mL PBS. Filter med et 0,22 μm-filter før bruk.
- Forbered 1 M ethanolamine: Forbered ethanolamine løsning med sterilt H2O. filter med et 0,22 μm-filter før bruk.
Merk: som ethanolamine er utstyrt med en sikkerhets lokk, vil en nål og sprøyte være nødvendig. - Forbered askorbinsyre: tilsett 0,1 mL 50 mg/mL lagerløsning askorbinsyre (lysfølsom) til 100 mL medium.
- Klargjør lyseringsbuffer: klargjør PBS 0,5% Triton 100% med 20 nM på NH4Oh. Legg NH4oh rett før bruk.
- Klargjør PBS penn/strep: fortynne penn/strep lagerløsning til 100 U/mL penn og 100 μg/mL strep.
- Forbered DMEM med 10% FBS: tilsett 10% FBS til 500 mL DMEM. Supplere med 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,1 mg/mL Normocin og 0,25 μg/mL amfotericin B.
- Klargjør 2% BSA varme denaturert: Tilsett 2 g BSA til 100 mL sterilt vann. Varm i kokende vann i 7 min.
- Forbered FBS med antibiotika: supplere FBS med 200 U/mL penicillin, 200 μg/mL Streptomycin, 100 μg/mL Gentamicin og 2,5 g/mL amfotericin B.
2. Cell kultur forberedelse
- Udødeliggjort fibroblaster cellelinje
- Kultur rekombinant telomerase transfekterte udødeliggjort menneskelig foreskin fibroblaster (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) i DMEM med 10% FBS og vedlikeholde ved 37 ° c og 5% CO2.
- Endothelial celler
- Kultur menneskelige navle vene endothelial celler (HUVECs, ATCC PCS-100-013) i EBM-2 medium som inneholder 2% FBS og vedlikeholde ved 37 ° c og 5% CO2.
- Fibroblast primær kultur
Merk: for CAF etablering og kultur, protokollen tidligere utgitt av vår gruppe ble fulgt6.- Kort, kutt vevsprøver i små biter på ca 2-3 mm3 og frø i FBS med høy konsentrasjon av antibiotika.
- Når den første fibroblaster dukket opp, erstatte medium med FBM medium for celle vedlikehold.
Merk: avhengig av vev opprinnelse, cellekulturer kan være forurenset lett. Vask prøvene i PBS supplert med antibiotika, med svært forurenset vev (f. eks, kolon6) og rist for 30-45 min.
3. Fibroblast-avledet 3D-matriser (tilpasset fra Castelló-Cros og Cukierman16)
- Tilsett 2 mL 0,2% gelatin løsning på hver brønn av en 6-brønn plate og ruge for 1 time ved 37 ° c eller over natten ved 4 ° c.
- Aspirer gelatin og vask den i 2 mL PBS.
- Tilsett 2 mL 1% glutaraldehyde og ruge i 30 min ved RT. Glutaraldehyde vil kryss-link gelatin.
- Aspirer glutaraldehyde og vask brønner i 2 mL PBS i 5 min. Gjenta 3 ganger.
- Tilsett 2 mL 1 M ethanolamine og ruge i 30 min ved RT. ethanolamine vil handle for å blokkere de resterende glutaraldehyde.
- Aspirer ethanolamine og vask brønner i 2 mL PBS i 5 min. Gjenta 3 ganger.
- Tilsett 1 mL DMEM med 10% FBS. Hvis mediet umiddelbart blir rosa, fjerner du mediet, vasker i 2 mL PBS og legger til 1 mL DMEM med 10% FBS.
- Seed 1 mL Fibroblast fjæring, med 5 x 105 celler i hver brønn. Totalt volum i hver brønn vil være 2 mL.
- Kultur celler til 100% samløpet er nådd. Fjern deretter mediet og Bytt ut med DMEM med 10% FBS med 50 μg/mL askorbinsyre og Tilleggsbehandling hvis det brukes.
- Bytt medium med friskt DMEM med 10% FBS og 50 μg/mL askorbinsyre hver 2 dager i 6 dager.
Merk: Hvis ytterligere behandling brukes (f. eks PDGF-bb, TGF-β og/eller andre vokse faktorer), legge dem de samme dagene som askorbinsyre behandling er lagt til. - To dager etter den siste askorbinsyre behandling, fjerne medium og vask i 2 mL PBS.
- Sakte Tilsett 1 mL lyseringsbuffer, forvarmet ved 37 ° c, til hver brønn. Ruge for 5-10 min ved RT inntil fibroblaster er lysert (Observer under mikroskopet).
- Forsiktig og uten å fjerne lyseringsbuffer, tilsett 2 mL PBS. Deretter aspirer ca 2,5 mL av PBS. Gjenta to ganger for totalt tre vasker.
- Til slutt, Fjern 2,5 mL av PBS og tilsett 2 mL PBS med pen/strep (100 U/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). Forsegle med film og holde ved 4 ° c i opptil 3 måneder.
Merk: avhengig av eksperimentet kan langvarig lagring av de genererte matriser påvirke resultatene. Vi anbefaler å bruke matriser så snart som mulig, og enda mer hvis eksperimentet omfatter celle seeding, på grunn av mulig protein degradering. Hvis matriser brukes for strukturelle analyser, for eksempel kollagen observasjon, kan matriser festes og lagres i lengre perioder. Denne protokollen er indisert for en 6-brønn kultur plate. Andre plater kan brukes, men reaktive volumer og celle suspensjon konsentrasjon må beregnes på nytt i henhold til godt område.
4. Tube formasjon analysen
- Grow HUVEC celler i EBM-2 2% FBS til maksimal samløpet.
- Erstatt medium med EBM-2 uten FBS for 8 t.
- Forbered matriser før seeding celler.
- Fjern matriser fra kjøleskapet og plasser for 1 time på RT.
- Blokker matriser ved å legge til 2 mL varme denaturert 2% BSA. Ruge 1 h ved 37 ° c.
- Aspirer BSA og vask i 2 mL PBS.
- Seed 2 x 105 HUVEC celler i FBS medium på hver brønn av en 6-brønn plate tidligere belagt med 3D Fibroblast-avledet matriser.
- Ruge endothelial celler ved 37 ° c i 16 timer.
- Undersøk rør-lignende struktur formasjon under en standard lyse feltet mikroskop ved 20-40x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGF-BB stimulert fibroblaster skape en tykkere ECM. Herrera et al. viste hvordan PDGF-stimulert fibroblaster genererte en tykkere matrise i tillegg til høyere fiber orientering7. BJ-hTERT fibroblaster ble inkubert med eller uten PDGF og representative områder observert viste en mer justert celle distribusjon i matriser produsert av PDGF-stimulert Fibroblast (figur 1a). Kollagen I og fibronektin protein uttrykk ble økt i matriser avledet fra PDGF-stimulert fibroblaster (figur 1b) og følgelig ble matrise tykkelse økt (figur 1c). Videre kollagen I og fibronektin viser parallelle mønstre, som vist i retning histogrammer (figur 1d).
3D-matriser avledet fra PDGF-BB-stimulert fibroblaster indusere tubulogenesis i endothelial celler. HUVEC celler ble sådd på decellularized matriser avledet fra PDGF-stimulert eller ikke-stimulert BJ-hTERT fibroblaster. Endothelial celler seeded på matriser generert av PDGF-stimulert fibroblaster viste mer kapillær-lignende strukturer enn under ikke-stimulert forhold (figur 2).
Figur 1: PDGF-stimulert fibroblaster forbedre tykkere og ANISOTROP ECM. (A) binære bilder representant for mobilnettet orientering av BJ-hTERT fibroblaster behandlet eller ikke med PDGF-bb (over) og retning histogrammer (nedenfor), som representerer hyppigheten av fordelingen av celle vinkler (sentrering på 0 ° vinkel). (B) økning i protein uttrykk for ekstracellulære proteiner fibronektin og kollagen i i PDGF-stimulert fibroblaster AVLEDET fra ECM. (C) økning i ECM-tykkelse i disse ECMs AVLEDET fra PDGF-stimulert fibroblaster. (D) økning i protein og organisering av ekstracellulære proteiner som fibronektin og KOLLAGEN i PDGF-stimulert fibroblaster AVLEDET fra ECM. Nedenfor, retning histogrammer. * p < 0,05; p < 0,001. Tilpasset fra Herrera et al.7Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: PDGF-stimulert fibroblaster fremme endothelial celle aktivering, som ble observert ved dannelsen av kapillær-lignende strukturer på matriser avledet fra PDGF-stimulert fibroblaster. Den "partikkel analyse" verktøyet fra ImageJ viste en økning på 1,81 i HUVECs seeded på matriser fra PDGF-stimulert fibroblaster om de seeded på matriser fra ikke-stimulert fibroblaster. Tilpasset fra Herrera et al.7Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matriser kan genereres med udødeliggjort fibroblaster eller primære Fibroblast kulturer. Fibroblaster er enkle å vedlikeholde i in vitro kultur med høy vekst og stress motstand. De kan også være isolert fra etter obduksjon vev3, selv om forurensning kan være en restriksjon, avhengig av vevet opprinnelse.
3D-Matrix modellen her tilbyr en roman og effektivt system for å kunne studere ECM komposisjon og fiber orientering. Det er også egnet for analyser av Fibroblast aktiveringsstatus, gen/protein uttrykk, interaksjoner med andre celletyper, etc. Det er viktig å fremheve at matriser generert med fibroblaster fra pasienter gjør personlig studie av stroma-relaterte mekanismer i svulster mulig. For eksempel kan denne tilnærmingen brukes til studier av kjemoterapi-motstand, der ECM har en viktig rolle. Oversettelsen av denne typen studier kan hjelpe i beslutningstaking for behandling av pasienter i klinisk praksis, implementere personlig medisin.
Selv om 3D-Matrix-protokollen kan være kjedelig, kan interessante resultater oppnås ved å følge instruksjonene. Det må bemerkes at flere vasketrinn er nødvendig, så unngå Matrix skade er viktig. I tillegg anbefaler vi at når ulike cellekultur betingelser er testet med denne protokollen, bør matriser genereres samtidig på grunn av minimale forskjeller som kan oppstå under eksperimenter (for eksempel ved bruk av samme Fibroblast suspensjon når seeding pre-behandlet plater).
Andre vev-engineering metoder utvikles, men flere trinn som sterilisering er nødvendig for å skape kompatible ECM og vev for menneskelig bruk. Selv om det oppstår nye teknologier, kan de være kostbare og kan være vanskelige å tilpasse til standard laboratorie fasiliteter. Bruk av primære CAFs innhentet fra pasienter gjør det mulig å generere "personlig matriser" for å teste ulike behandlinger. Langs denne linjen, har vår gruppe brukt denne metodikken for å demonstrere at matriser generert av CAFs er forskjellige fra de som genereres av NFs, viser tykkere og mer organisert matriser7. Vi har rapportert at kapillær-lignende strukturer avledet fra endothelial celler er avhengig av Fibroblast Snail1 uttrykk, og det er fremtidige studier for å observere at effekten på CAFs-avledet matriser.
ECM krever videre studier før vi kan forstå de underliggende mekanismene som er ansvarlige for kjemoterapi motstand eller tumor tilbakefall. Derfor foreslår vi bruk av CAF-avledet matriser fra kreft pasient vev som en prosedyre for å undersøke microenvironmental atferd i kreft og ECM kommunikasjon med kreftceller eller andre stromal celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Utviklingen av denne protokollen ble støttet av PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 og RD12/0036/0041 fra Instituto de salud Carlos III; av Fondo Europeo de desarrollo Regional (FEDER); av "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 og CB16/12/00446, fra Instituto de salud Carlos III-FEDER; og av Fundación Científica AECC (en mangesidig tilnærming for å målrette kreft i bukspyttkjertelen). Cristina Peña er mottaker av en Miguel Servet kontrakt fra Instituto de salud Carlos III. M. Eaude hjalp til med den engelske teksten. Vi takker Lab medlemmer for hjelp og råd gjennom denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
