Summary
Le but de cette méthode est d'obtenir des matrices 3D dérivées du fibroblaste comme échafaudage naturel pour les essais cellulaires ultérieurs. Les fibroblastes sont enseventdanss dans une plaque de culture prétraitée et stimulés avec de l'acide ascorbique pour la génération de matrices. Les matrices sont décellularisées et bloquées aux cellules pertinentes à la culture (p. ex., les cellules endothéliales).
Abstract
La matrice extracellulaire (ECM) est un échafaudage tridimensionnel qui agit comme principal support pour les cellules dans les tissus. Outre sa fonction structurelle, l'ECM participe également à la migration cellulaire, à la prolifération et à la différenciation. Les fibroblastes sont le principal type de cellules modifiant l'arrangement et la production de fibres ECM. Dans le cancer, les CAF (fibroblastes associés au cancer) sont dans le statut permanent d'activation, participant au remodelage d'ECM, facilitant la migration de cellules de tumeur, et stimulant l'angiogenèse tumeur-associée, entre autres rôles pro-tumorigenic. L'objectif de cette méthode est de créer une matrice tridimensionnelle avec une composition de fibres qui est similaire aux matrices in vivo, en utilisant des fibroblastes immortalisés ou des CAF primaires humaines. Les fibroblastes sont cultivés dans des plaques de culture cellulaire prétraitées et cultivés sous stimulation acide ascorbique. Ensuite, les fibroblastes sont enlevés et les matrices sont bloquées pour l'ensemencement des cellules. Dans ce modèle ECM, les fibroblastes peuvent être activés ou modifiés pour générer différents types de matrice, dont les effets peuvent être étudiés dans la culture cellulaire. Les matrices 3D sont également façonnées par des signaux cellulaires, comme la dégradation ou les enzymes de liaison croisée qui pourraient modifier la distribution des fibres. Dans ce contexte, l'angiogenèse peut être étudiée, avec d'autres types de cellules telles que les cellules épithéliales.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) est une structure dynamique présente dans tous les types de tissus. Il se compose de protéines et de polysaccharides qui créent un filet de fibres cruciales pour l'adhérence cellulaire, la migration et la communication1. La composition de l'ECM varie selon le tissu. Tandis que le collagène de type I est la protéine structurale la plus répandue, les types de collagène II, III, V et XI peuvent également être trouvés dans divers tissus2. La fibronectine générée par les fibroblastes est nécessaire pour l'adhérence cellulaire2. En outre, il existe d'autres molécules structurelles comme l'élastine, la laminine et les récepteurs de surface appelés integrins qui médiateur assemblage de fibres et sont spécifiques aux différents tissus ECM2. L'ECM joue un rôle important en tant qu'échafaudage cellulaire et peut également être impliqué dans les processus physiologiques et pathologiques1. Des anomalies dans l'ECM sont observées dans des pathologies telles que le cancer, qui modifie la composition de l'ECM et/ou son organisation. Dans les tumeurs, l'ECM représente la composante non cellulaire du microenvironnement tumoral (TME), un milieu complexe de composants cellulaires tels que les fibroblastes, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales, les péricytes et une variété de facteurs solubles. On sait que le TME favorise la progression du cancer et la métastes; les fibroblastes cancéreux-associés, en tant que type de cellule prédominant dans le stroma de tumeur, prennent part à ce processus3. Contrairement aux fibroblastes normaux, les CAC sont en activation permanente, montrant une sécrétion accrue de protéines ECM et de facteurs de croissance (p. ex., Transforming Growth Factor-MD, TGF-MD), ainsi qu'une expression plus élevée de certains marqueurs, tels que l'actine musculaire lisse (-SMA) et la protéine d'activation du fibroblaste (FAP)4. Cependant, les CAT sont une population cellulaire hétérogène, montrant différents niveaux d'activation ou d'expression de marqueur5. On peut alors supposer que la composition et la structure des matrices dérivées du fibroblaste dépendront de l'état et des caractéristiques du fibroblaste.
Dans ce contexte, l'objectif de cette méthodologie est d'établir un modèle in vitro approprié pour la génération d'ECM par des fibroblastes équivalents au réglage In vivo ECM. Nous proposons cette approche comme méthodologie translationnelle in vitro pour d'autres études des fonctions de cellules tumorales, comme la chimiorésistance ou la migration, négociées par ECM. Comme notre groupe l'a publié ailleurs, les FCA peuvent être obtenus à partir d'échantillons de tissus frais, mais il faut noter que la survie des CAF en culture est limitée et leur nombre de passages cellulairesréduit6 . En outre, les cultures primaires des FAC établies à partir d'échantillons de patients peuvent être utilisées pour la génération de matrices. La manipulation de l'expression génique dans les fibroblastes est également une façon intéressante de produire des matrices in vitro variées pour évaluer les effets possibles sur la composition de la matrice, l'orientation des fibres, etc. Dans ce sens, notre groupe a récemment signalé le rôle des fibroblastes exprimant des escargots dans la composition et l'orientation des fibres de diverses matrices dérivées7.
En outre, les CAF et eCM sont impliqués dans le système vasculaire, à la fois dans la génération de navires et dans le cadre de la couche externe de vase8. Le remodelage d'ECM induit l'angiogenèse ; metalloproteinases matrice (MMP) semblent être le type d'enzyme le plus important contribuant à ce processus9,10. La vascularisation tissulaire des cellules primaires qui génèrent les ECM, les macromolécules ECM, les facteurs de croissance résiduels inclus dans l'ECM, l'élasticité de matrice, et l'épaisseur de matrice sont décrits comme facteurs impliqués dans l'activation endothéliale de cellules11. Dans les tumeurs, l'hypoxie augmente la rigidité eCM et la génération de germes endothéliales12. En outre, les CAF sécrètent le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance plaquettaire-dérivé (PDGF) qui stimulent l'angiogenèse dans le stroma de tumeur13. Dans ce domaine, la génération de matrice in vitro pourrait être utilisée pour étudier les processus d'angiogenèse ou l'action MMP dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, la reproduction in vitro de la matrice in vivo la plus analogue pourrait être un outil précieux pour étudier le rôle de l'ECM dans l'angiogenèse ou les interactions cellulaires micro-environnementales.
La stimulation des fibroblastes cultivés avec de l'acide ascorbique pour améliorer le dépôt de matrice et générer un ECM est un moyen accepté de produire des matrices in vivo analogues. Les lignées cellulaires de fibroblaste immortalisées sont facilement cultivées et sont activées par divers facteurs de croissance, comme PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-MD (TNF-MD) ouTGF-14. Au sein du TME, les CAF synthétisent le collagène de type I et la fibronectine comme principaux composants de l'ECM4. De même, ces composants sont trouvés comme des composants majeurs des matrices dérivées du fibroblaste générées in vitro (figure 1).
Il existe différentes méthodologies in vitro pour simuler in vivo ECM. L'utilisation de plats de culture enrobés avec des mélanges de fibres ECM a été étendue au cours des dernières années, mais cette approche 2D a nécessité une amélioration des structures 3D, telles que les gels interconnectés (par exemple, Matrigel)1. La configuration matrigel-like est devenu la méthode standard pour simuler une matrice 3D. La fibrine est également une alternative lors de la génération de matrices, mais échoue en termes de force et de durabilité de l'ECM1. Le collagène utilisé en combinaison avec d'autres composants ECM modifie certains des problèmes mentionnés ci-dessus. Cependant, ces gels de collagène forment un réseau fort avec des fibres qui peuvent être orientées, mais sont très hétérogènes, qui peuvent être un problème dans les répétitions d'expérience1. Néanmoins, il faut supposer que, selon l'objectif des expériences, l'utilisation de Matrigel ou d'autres hydrogels est plus appropriée (par exemple, dans les études de contraction matricielle dans lesquelles la contraction du gel peut être facilement détectée).
L'immunogénicité potentielle des matrices générées pourrait être un problème dans les expériences avec certains types de cellules. Par conséquent, pour réduire la possibilité de réponses immunitaires dues aux cellules génératrices d'ECM lors de l'utilisation de notre méthode, les matrices sont décellularisées et lavées, bien que l'ablation des fragments cellulaires ne puisse pas être totale15. L'ECM idéal doit être compatible avec la culture cellulaire et capable de communiquer et de réagir aux signaux cellulaires. Notre procédure permet l'introduction de changements sans difficulté pendant la production d'ECM (par exemple, l'ajout de facteurs de croissance stimulant le fibroblaste).
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Protocol
Des échantillons de tissus humains ont été obtenus avec l'approbation du Comité d'éthique de la recherche de l'hôpital Ramon y Cajal, Madrid.
1. Préparation de solutions
- Préparer une solution de gélatine de 0,2 % : ajouter 1 g de gélatine à 500 ml de PBS. Autoclave la solution et garder à 4 oC. Filtrer à l'utilisation d'un filtre de 0,22 m avant utilisation.
- Préparer 1% de glutaraldéhyde: Ajouter 1 ml de 25% de solution de stock de glutaraldéhyde à 24 ml de PBS. Filtrer à l'utilisation d'un filtre de 0,22 m avant utilisation.
- Préparer 1 M d'éthanolamine : préparer la solution d'éthanolamine avec un filtre stérile H2O. avec un filtre de 0,22 m avant utilisation.
REMARQUE: Comme l'éthanolamine est muniamine avec un bouchon de sécurité, une aiguille et une seringue seront nécessaires. - Préparer l'acide ascorbique : ajouter 0,1 ml de 50 mg/mL de récurage d'acide ascorbique (sensible à la lumière) à 100 ml de milieu.
- Préparer le tampon de lyse : préparez PBS 0.5% Triton 100X avec 20 nM de NH4OH. Ajouter NH4OH juste avant l'utilisation.
- Préparer PBS Pen/Strep : solution de stock Pen/Strep diluée à 100 U/mL Pen et 100 'g/mL Strep.
- Préparer DMEM avec 10% FBS: Ajouter 10% FBS à 500 ml de DMEM. Supplément avec 100 u/mL de pénicilline, 100 streptomycines g/mL, 0,1 mg/mL de normocine et 0,25 g/mL d'amphotericine B.
- Préparer 2% BSA de chaleur dénaturée: ajouter 2 g de BSA à 100 ml d'eau stérile. Chauffer à l'eau bouillante pendant 7 min.
- Préparer FBS avec des antibiotiques: supplément FBS avec 200 U/mL pénicilline, 200 g/mL de streptomycine, 100 g/mL de gentamicin et 2,5 g/mL d'amphotericine B.
2. Préparation de la culture cellulaire
- Ligne cellulaire immortalisée de fibroblastes
- Culture recombinante telomerase transfecté fibroblastes humains contrele (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) dans le DMEM avec 10% FBS et maintenir à 37 oC et 5% CO2.
- Cellules endothéliales
- Culture des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs, PCS-100-013 d'ATCC) dans le milieu EBM-2 contenant 2% de FBS et maintiennent à 37 oC et 5% de CO2.
- Culture primaire du fibroblaste
REMARQUE: Pour l'établissement et la culture des FAC, le protocole précédemment publié par notre groupe a été suivi6.- En bref, couper des échantillons de tissus en petits morceaux d'environ 2-3 mm3 et des graines dans FBS avec une forte concentration d'antibiotiques.
- Lorsque les premiers fibroblastes sont apparus, remplacer le milieu par le milieu FBM pour l'entretien cellulaire.
REMARQUE: Selon l'origine des tissus, les cultures cellulaires peuvent être contaminées facilement. Laver les échantillons de PBS complétés avec des antibiotiques, avec des tissus hautement contaminés (p. ex., colon6) et secouer pendant 30-45 min.
3. Matrices 3D dérivées du fibroblaste (Adapté de Castello-Cros et Cukierman16)
- Ajouter 2 ml de solution de gélatine de 0,2 % à chaque puits d'une assiette de 6 puits et incuber pendant 1 h à 37 oC ou toute la nuit à 4 oC.
- Aspirez la gélatine et lavez-la dans 2 ml de PBS.
- Ajouter 2 ml de 1 % de glutaraldéhyde et incuber pendant 30 min à RT. Le glutaraldéhyde reliera la gélatine.
- Aspirez le glutaraldéhyde et lavez les puits dans 2 ml de PBS pendant 5 min. Répétez 3 fois.
- Ajouter 2 ml d'éthanolamine de 1 M et couver pendant 30 min à RT. L'éthanolamine agira pour bloquer le reste du glutaraldéhyde.
- Aspirez l'éthanolamine et lavez les puits dans 2 ml de PBS pendant 5 min. Répétez 3 fois.
- Ajouter 1 ml de DMEM avec 10% FBS. Si le milieu devient immédiatement rose, retirer le milieu, laver dans 2 ml de PBS et ajouter à nouveau 1 ml de DMEM avec 10% FBS.
- Graine 1 ml de suspension de fibroblaste, avec 5 x 105 cellules dans chaque puits. Le volume total dans chaque puits sera de 2 ml.
- Cellules de culture jusqu'à ce que la confluence à 100% soit atteinte. Ensuite, retirez le milieu et remplacez par DMEM avec 10% FBS avec 50 'g/mL acide ascorbique et un traitement supplémentaire si elle est utilisée.
- Remplacer le milieu par du DMEM frais par 10 % de FBS et 50 'g/mL d'acide ascorbique tous les 2 jours pendant 6 jours.
REMARQUE: Si un traitement supplémentaire est utilisé (p. ex., PDGF-BB, TGF-MD et/ou d'autres facteurs de croissance), ajoutez-les les mêmes jours que le traitement à l'acide ascorbique. - Deux jours après le dernier traitement à l'acide ascorbique, retirer le milieu et laver dans 2 ml de PBS.
- Ajouter lentement 1 ml de tampon de lyse, préchauffé à 37 oC, à chaque puits. Incuber de 5 à 10 min à RT jusqu'à ce que les fibroblastes soient lysés (observables sous le microscope).
- Soigneusement et sans enlever le tampon de lyse, ajouter 2 mL de PBS. Puis aspirer environ 2,5 ml de PBS. Répéter deux fois pour un total de trois lavages.
- Finalement, retirer 2,5 mL de PBS et ajouter 2 ml de PBS avec Pen/Strep (100 U/mL et 100 'g/mL, respectivement). Sceller avec le film et conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.
REMARQUE: Selon l'expérience, le stockage à long terme des matrices générées peut affecter les résultats. Nous recommandons d'utiliser des matrices dès que possible, et encore plus si l'expérience implique l'ensemencement cellulaire, en raison de la dégradation possible des protéines. Si des matrices sont utilisées pour des analyses structurelles, comme l'observation du collagène, les matrices peuvent être fixées et stockées pendant de plus longues périodes. Ce protocole est indiqué pour une plaque de culture de 6 puits. D'autres plaques peuvent être utilisées, mais les volumes réactifs et la concentration de suspension cellulaire doivent être recalculés en fonction de la zone de puits.
4. Essai de formation de tube
- Cultivez des cellules HUVEC dans EBM-2 2% FBS jusqu'à la confluence maximale.
- Remplacer le milieu par EBM-2 sans FBS pendant 8 h.
- Préparer les matrices avant l'ensemencement des cellules.
- Retirer les matrices du réfrigérateur et les placer pendant 1 h à RT.
- Bloquer les matrices en ajoutant 2 ml de BSA dénaturé par la chaleur. Incuber 1 h à 37 oC.
- Aspirez BSA et lavez-vous 2 ml de PBS.
- Seed 2 x 105 HUVEC cellules dans le milieu FBS-appauvri sur chaque puits d'une plaque de 6 puits précédemment enduit avec des matrices 3D dérivées du fibroblaste.
- Incuber les cellules endothéliales à 37 oC pendant 16 h.
- Examiner la formation de la structure en tube sous un microscope de champ lumineux standard au grossissement 20-40x.
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Representative Results
Les fibroblastes stimulés PAR LE PDGF-BB créent un ECM plus épais. Herrera et coll. ont montré comment les fibroblastes stimulés par le PDGF ont généré une matrice plus épaisse ainsi qu'une orientation plus élevée en fibres7. Les fibroblastes BJ-hTERT ont été incubés avec ou sans PDGF et les zones représentatives observées ont montré une distribution cellulaire plus alignée dans des matrices produites par le fibroblaste stimulé par le PDGF(figure 1a). L'expression des protéines de collagène I et de fibronectin a été augmentée dans les matrices dérivées de fibroblastes stimulés par le PDGF (Figure 1b) et, par conséquent, l'épaisseur de la matrice a été augmentée (Figure 1c). De plus, le collagène I et la fibronectine présentent des motifs parallèles, comme le montrent les histogrammes de directionnalité (Figure 1d).
Les matrices 3D dérivées des fibroblastes PDGF-BB-stimulés induisent la tubulogénèse dans les cellules endothéliales. Les cellules DE HUVEC ont été ensemiées sur des matrices décellularisées dérivées des fibroblastes DE BJ-hTERT STIMULÉs par LE PDGF ou non stimulés. Les cellules endothéliales ensemiées sur des matrices générées par les fibroblastes stimulés par le PDGF présentaient plus de structures capillaires que dans des conditions non stimulées(figure 2).
Figure 1 : Les fibroblastes stimulés par le PDGF améliorent l'ECM plus épais et anisotropique. (A) Images binaires représentatives de l'orientation cellulaire des fibroblastes BJ-hTERT traités ou non par des histogrammes PDGF-BB (ci-dessus) et directionnalité (ci-dessous), qui représentent la fréquence de distribution des angles cellulaires (centrés sur l'angle de 0 degrés). (B) Augmentation de l'expression protéique des protéines extracellulaires fibronectin et collagène I dans les fibroblastes stimulés par LE PDGF dérivés de l'ECM. (C) Augmentation de l'épaisseur de l'ECM dans les ECM dérivés de fibroblastes stimulés par le PDGF. (D) Augmentation des protéines et de l'organisation des protéines extracellulaires telles que la fibronectine et le collagène I dans les fibroblastes stimulés par le PDGF dérivés de l'ECM. Ci-dessous, histogrammes directionnalité. lt; 0,05; p lt; 0,001. Adapté de Herrera et coll.7Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les fibroblastes stimulés par le PDGF favorisent l'activation des cellules endothéliales, qui a été observée par la formation de structures capillaires sur des matrices dérivées de fibroblastes stimulés par le PDGF. L'outil « Analyse des particules » d'ImageJ a montré un taux d'augmentation de 1,81 dans les HUVEC enseissés sur des matrices de fibroblastes stimulés par le PDGF concernant ceux ensemant sur des matrices de fibroblastes non stimulés. Adapté de Herrera et coll.7Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les matrices peuvent être générées avec des fibroblastes immortalisés ou des cultures primaires de fibroblastes. Les fibroblastes sont faciles à maintenir dans la culture in vitro avec un taux de croissance élevé et une résistance au stress. Ils peuvent même être isolés du tissu post-mortem3, bien que la contamination pourrait être une restriction, selon l'origine du tissu.
Le modèle de matrice 3D offre ici un système nouveau et efficace pour étudier avec succès la composition de l'ECM et l'orientation des fibres. Il convient également aux analyses du statut d'activation du fibroblaste, de l'expression des gènes et des protéines, des interactions avec d'autres types de cellules, etc. Il est important de souligner que les matrices générées par les fibroblastes des patients rendent possible l'étude personnalisée des mécanismes liés au stroma dans les tumeurs. Par exemple, cette approche peut être appliquée aux études de chimio-résistance, dans lesquelles l'ECM a un rôle important. La traduction de ce type d'étude pourrait aider à la prise de décision pour le traitement des patients en pratique clinique, la mise en œuvre de la médecine personnalisée.
Même si le protocole de matrice 3D peut être fastidieux, des résultats intéressants peuvent être obtenus en suivant les instructions. Il convient de noter que plusieurs étapes de lavage sont nécessaires, afin d'éviter les dommages de matrice est essentiel. En outre, nous recommandons que lorsque différentes conditions de culture cellulaire sont testées avec ce protocole, les matrices doivent être générées en même temps en raison de différences minimales qui peuvent se produire au cours des expériences (par exemple, en utilisant la même suspension de fibroblaste lors de l'ensemencement plaques prétraitées).
D'autres méthodes d'ingénierie tissulaire sont en cours de développement, mais des mesures supplémentaires comme la stérilisation sont nécessaires pour créer des ECM et des tissus compatibles pour l'usage humain. Bien que de nouvelles technologies voient le jour, elles peuvent être coûteuses et difficiles à adapter aux installations de laboratoire standard. L'utilisation de CAF primaires obtenus auprès de patients permet de générer des « matrices personnalisées » pour tester différents traitements. Dans ce domaine, notre groupe a utilisé cette méthodologie pour démontrer que les matrices générées par les FA sont différentes de ceux générés par les FN, montrant des matrices plus épaisses et plus organisées7. Nous avons rapporté que les structures capillaires-comme dérivées des cellules endothéliales dépendent de l'expression d'escargot de fibroblaste1, et il y a des études futures pour observer cet effet sur des matrices CAF-dérivées.
ECM nécessite une étude plus approfondie avant que nous puissions comprendre les mécanismes sous-jacents responsables de la résistance à la chimiothérapie ou la rechute tumorale. Par conséquent, nous suggérons l'utilisation des matrices CAF-dérivées des tissus patients de cancer comme procédure pour étudier le comportement microenvironnemental dans le cancer et la communication d'ECM avec des cellules cancéreuses ou d'autres cellules stromales.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
L'élaboration de ce protocole a été soutenue par PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 et RD12/0036/0041 de l'Instituto de Salud Carlos III; par le Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); par "CIBER de Câncer", CB16/12/00273 et CB16/12/00446, de l'Instituto de Salud Carlos III-FEDER; et par la Fondation Cient-fica AECC (une approche multiforme pour cibler le cancer du pancréas). Cristina Pesa est récipiendaire d'un contrat Miguel Servet de l'Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude a aidé avec le texte anglais. Nous remercions les membres du laboratoire pour leur aide et leurs conseils tout au long de cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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