Summary
מטרת שיטה זו היא להשיג פיברוההדף מטריצות 3D נגזר כפיגום טבעי עבור הבאים הסלולר assays. פיברותקיעות מורצת לוחית התרבות שטופלו מראש ומגורה עם חומצה אסקורבית ליצירת מטריקס. מטריצות מdecellularized וחסומות לתאים רלוונטיים לתרבות (למשל, תאי האנדותל).
Abstract
מטריצת החילוץ (ECM) היא פיגום תלת מימדי הפועל כתמיכה העיקרית בתאים ברקמות. מלבד תפקידה הקונסטרוקטיבי, ה-ECM משתתפת גם בהעברת תאים, התפשטות ובידול. פיברותקיעות הם הסוג העיקרי של תאים שינוי הסדר סיבים ECM וייצור. בסרטן, CAFs (סרטן הקשורים בגידולים) הם במצב הפעלה קבע, השתתפות שיפוץ ECM, הקלה על הגירה תא הגידול, ומגרה אנגיוגנזה הקשורות לגידול, בין התפקידים הפרו-tuמגניים אחרים. המטרה של שיטה זו היא ליצור מטריצה תלת ממדית עם הרכב סיבים דומה בתוך מטריצות vivo, באמצעות פיברותקיעות מונצח או כף s הראשי האנושי. פיברופיצוצים הם מתורבתים בלוחות מטופלים מראש של תרבות התא, גדל תחת גירוי חומצה אסקורבית. לאחר מכן, פיברותקיעות מוסרים ומטריצות חסומות עבור זריעת תאים נוסף. במודל ECM זה, ניתן להפעיל או לשנות לייצר סוגים שונים של מטריקס, אשר השפעותיו ניתן ללמוד בתרבות התא. מטריצות תלת-ממדית מעוצבות גם על-ידי אותות תאים, כגון אנזימים השפלות או מקושרים, שעשויים לשנות את התפלגות הסיבים. בהקשר זה, ניתן ללמוד אנגיוגנזה, יחד עם סוגי תאים אחרים כגון תאים סרטניים אפיתל.
Introduction
מטריצת החילוץ (ECM) היא מבנה דינאמי הקיים בכל סוגי הרקמה. הוא מורכב מחלבונים ופוליסכרידים היוצרים רשת של סיבים חיוניים עבור הדבקה, הגירה ותקשורת1. הרכב ECM משתנה בהתאם לרקמה. בעוד סוג-I קולגן הוא חלבון מבניים הנפוצות ביותר, סוגי קולגן II, III, V ו-XI ניתן למצוא גם ברקמות שונות2. Fibronectin שנוצר על ידי פיברותקיעות נדרש עבור הדבקה תא2. יתר על כן, יש מולקולות מבניות אחרות כמו אלסטין, קולטני למינציה ו פני השטח הנקרא אינטגרציה כי בתווך סיבים הרכבה הם ספציפיים רקמות ECM שונים2. ה-ECM ממלאת תפקיד חשוב כפיגום תאים ויכול להיות גם מעורב בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים1. חריגות ב-ECM הם נצפו בפתוגיות כגון סרטן, אשר משנה קומפוזיציה ECM ו/או הארגון שלה. בגידולים, ה-ECM מייצגת את המרכיב הלא-סלולארי של הסביבה המיקרוקומבית (TME), מרכיב סביבתי מורכב של רכיבי תאים כגון פיברותקיעות, תאי החיסון, תאי האנדותל, קרום הלב ומגוון גורמים מסיסים. ידוע כי TME מקדמת התקדמות הסרטן גרורות; סרטן הקשורים פיברותקיעות, כמו סוג תא השולט בסטרומה הגידול, לקחת חלק בתהליך זה3. בניגוד לפיברותקיעות רגילה, cafs נמצאים הפעלה קבועה, מראה הפרשה מוגברת של חלבונים ecm וגורמי גדילה (g., שינוי מקדם הצמיחה-β, tgf-β), כמו גם ביטוי גבוה יותר של כמה סמנים, כגון α-השריר חלקה אקטין (α-SMA)וחלבון ההפעלה פיברוהפיצוץ (fap עם זאת, ה-CAFs הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית, המציגה רמות שונות של הפעלה או סימן ביטוי5. ניתן להניח כי אז הרכב והמבנה של מטריצות הנגזר של פיברוהפיצוץ יהיה תלוי במצב ומאפיינים בפיברוהפיצוץ.
בהקשר זה, המטרה של מתודולוגיה זו היא ליצור מודל מתאים ליצירת מבחנה מתאימה לדור ECM באמצעות המקבילה לקביעת vivo ECM. אנו מציעים גישה זו במסגרת מתודולוגיה להפריה חוץ גופית למחקרים נוספים של הפונקציות של תאי הגידול, כמו הגירה או העברה, מתווכת על ידי ECM. כמו הקבוצה שלנו פרסמה במקום אחר, CAFs ניתן להשיג מדגימות רקמה טרייה, אבל יש לציין כי ה-CAFs ' הישרדות בתרבות מוגבלת מספר המעבר הסלולרי שלהם מופחת6. בנוסף, התרבויות הראשיות של קפה שהוקמו מדגימות המטופלים ניתן להשתמש עבור יצירת מטריקס. מניפולציה של ביטוי גנים בפיברותקיעות היא גם דרך מעניינת לייצר מגוון מטריצות מבחנה כדי להעריך את ההשפעות האפשריות על הרכב מטריקס, כיוון סיבים, וכו '. לאורך הקווים האלה, הקבוצה שלנו דיווחה לאחרונה על התפקיד של חילזון המבטא פיברותקיעות בהרכב וכיוון הסיבים של מטריצות נגזרות שונות7.
יתר על כן, CAFs ו-ECM מעורבים במערכת כלי הדם, הן בדור הספינה והן במסגרת האגרטל החיצוני שכבה8. שיפוץ ECM גורם לאנגיוגנזה; מטריצה מטאלופרוטטיות (mmps) נראה כסוג האנזים החשוב ביותר לתרום לתהליך זה9,10. רקמת הרקמה של התאים הראשוניים היוצרים את ECMs, ECMS קרו, גורמי צמיחה שיורית הכלולים ECMS, אלסטיות מטריקס, ואת עובי מטריצה מתוארים כגורמים מעורבים הפעלת תא אנדותל11. בגידולים, היפוקסיה מגדילה את הנוקשות ECM ואת הדור של נבט האנדותל12. יתר על כן, כף s להפריש כלי דם אנדותל מקדם גידול (בתוספת) וטסיות הנגזר גורם הצמיחה (PDGF) המעוררים אנגיוגנזה בגידול סטרומה13. בתחום זה, ניתן להשתמש ביצירת מטריצות חוץ גופית לחקר תהליכי אנגיוגנזה או פעולת MMP בתנאים ניסיוניים שונים. כך, הרבייה מחוץ לתחום של מטריצה האנלוגית ביותר vivo יכול להיות כלי רב ערך כדי לחקור את תפקידה של ECM באנגיוגנזה או מיקרו-סביבתי אינטראקציות תאים.
גירוי של גידולים מתורבתים עם חומצה אסקורבית כדי לשפר את התצהיר מטריצה וליצור ECM היא דרך מקובלת של הפקת אנלוגית vivo מטריצות. שורות התאים מונצח הפיצוץ בקלות הם מופעלים על ידי גורמי גדילה מגוונים, כמו PDGF-BB, מקדם הגידול נמק-α (TNF-α) או TGF-β14. בתוך TME, כף s סינתזה סוג-I קולגן ו fibronectin כמרכיב העיקרי של ECM4. באופן דומה, מרכיבים אלה מצויים כמרכיבים מרכזיים של מטריצות שנוצרו על-ידי הפריה חוץ גופית (איור 1).
יש שונות במתודולוגיות מבחנה כדי לדמות בvivo ECM. השימוש של מנות תרבות מצופה עם תערובות של סיבים ECM הוארך בשנים האחרונות, אבל זה 2D הגישה הדרושים לשיפור מבנים תלת-ממד, כגון ג'לים מקושרות (g., מטריצות)1. תוכנית ההתקנה מסוג מטריקס הפכה לשיטה הסטנדרטית להדמיית מטריצה תלת-ממדית. פיאין הוא גם חלופה בעת יצירת מטריצות אך נכשלת במונחים של חוזק ועמידות של ECM1. קולגן משמש בשילוב עם רכיבי ECM אחרים לכפר על כמה בעיות הנ ל. עם זאת, אלה ג'ל קולגן טופס רשת חזקה עם סיבים שיכולים להיות מכוונים, אבל הם הטרוגנית מאוד, אשר יכול להיות בעיה בחזרות ניסוי1. עם זאת, יש להניח כי, בהתאם למטרת הניסויים, השימוש במטריצה או בהידרוג אחרים מתאים יותר (למשל, במחקרים של התכווצות מטריקס שבהם ניתן לזהות בקלות את התכווצות ג'ל).
החיסוני הפוטנציאלי של מטריצות שנוצר יכול להיות בעיה בניסויים עם סוגי תאים מסוימים. לכן, כדי להפחית את האפשרות של תגובות החיסון בשל התאים ECM לייצר בעת שימוש בשיטה שלנו, מטריצות הם decellularized ושטף, למרות הסרת קטע התא לא יכול להיות סך15. ECM האידיאלית צריכה להיות תואמת לתרבות התאים ומסוגלת לתקשר ולהגיב לאותות תאים. ההליך שלנו מאפשר הקדמה של שינויים ללא קושי במהלך ייצור ECM (למשל, הוספת פיברוהפיצוץ גורמי צמיחה מעוררים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות הרקמה האנושית הושגו באישור מועצת האתיקה של בית החולים רמון י קאחאל, מדריד.
1. הכנת פתרונות
- להכין 0.2% הפתרון ג'לטין: להוסיף g 1 של ג'לטין כדי 500 mL של PBS. הקלזו את הפתרון ושמרו ב -4 ° c. סנן עם מסנן יקרומטר 0.22 לפני השימוש.
- הכינו 1% גלוטאלדהיד: להוסיף 1 מ ל של 25% הפתרון מניות glutarאלדהיד כדי 24 מ ל של PBS. סנן עם מסנן יקרומטר 0.22 לפני השימוש.
- להכין 1 M אתנואנדואמין: להכין פתרון ethanolamine עם מסנן H2O סטרילי עם מסנן 0.22 יקרומטר לפני השימוש.
הערה: כאשר ethanolamine מסופק עם כובע אבטחה, המחט מזרק יהיה צורך. - להכין חומצה אסקורבית: להוסיף 0.1 mL של 50 mg/mL מניות פתרון חומצה אסקורבית (רגיש לאור) כדי 100 mL של בינוני.
- להכין מאגר לפירוק: להכין PBS 0.5% טריטון 100X עם 20 ננומטר של NH4הו. הוספת NH4או ימינה לפני השימוש.
- הכנת הערוץ הPBS/דלקת: לדלל את העט/דלקת המניה כדי 100 U/mL עט ו 100 μg/mL דלקת.
- הכן את DMEM עם 10% FBS: הוסף 10% FBS ל 500 mL של DMEM. תוספת עם 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, 0.1 mg/mL Normocin ו0.25 μg/mL אמפוריטיצין B.
- הכינו 2% החום BSA הלחץ: להוסיף 2 גרם של BSA כדי 100 mL של מים סטריליים. חם במים רותחים במשך 7 דקות.
- הכן FBS עם אנטיביוטיקה: תוספת FBS עם 200 U/mL פניצילין, 200 μg/mL סטרפטומיצין, 100 μg/mL gentamicin ו 2.5 g/mL אמפוריטיצין B.
2. הכנה לתרבות התאים
- קו בתאי פיברופיצוצים
- תרבות רקומביננטי טלומראז וחק הגידול המנוכר העורלה האדם (BJ-htert, ביטול האישורים atcc-4001) ב dmem עם 10% fbs ולשמור ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- תאים אנדותל
- התרבות האנושית וריד הטבור תאים (HUVECs, ATCC PCS-100-013) ב EBM-2 בינוני המכיל 2% FBS ולשמור ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- התרבות הראשית פיברובלסט
הערה: להקמת קפה ותרבות, הפרוטוקול שפורסם בעבר על ידי הקבוצה שלנו הופיע לאחר6.- בקצרה, לחתוך דגימות רקמות לחתיכות קטנות של כ 2-3 מ"מ3 ו זרע ב fbs עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה.
- כאשר הפיברוהפיצוצים הראשונים הופיעו, להחליף בינוני עם מדיום FBM עבור תחזוקת תאים.
הערה: בהתאם מקור הרקמה, תרביות תאים יכול להיות מזוהם בקלות. שטוף דגימות ב-PBS בתוספת אנטיביוטיקה, עם רקמה מזוהמת מאוד (למשל, נקודתיים6) ולנער עבור 30-45 דקות.
3. פיברובלסט-מטריצות תלת-ממד נגזרות (מותאם מ-Castelló-Cros וקוקירמן16)
- הוסף 2 מ ל של 0.2% הפתרון ג'לטין לכל טוב של 6-היטב צלחת הדגירה עבור 1 h ב 37 ° צ' או לילה ב 4 ° c.
- ולשטוף את זה ב 2 מ ל של PBS.
- הוסף 2 מ ל של 1% גלוטרלדהיד ו הדגירה עבור 30 דקות ב RT. גלוטרלדהיד תהיה הג חוצה קישור.
- ולשטוף את הבארות ב 2 מ ל של PBS עבור 5 דקות. חזור 3 פעמים
- הוסף 2 מ ל 1 מתוך ethanolamine ו דגירה עבור 30 דקות ב RT. Ethanolamine יפעל כדי לחסום את הגלוטרלדהיד הנותרת.
- מטפי את ethanolamine ולשטוף בארות 2 מ ל של PBS עבור 5 דקות.. חזור 3 פעמים
- הוסף 1 מ ל של DMEM עם 10% FBS. אם המדיום באופן מיידי הופך ורוד, להסיר את המדיום, לשטוף 2 mL של PBS ולהוסיף שוב 1 mL של DMEM זיכרון עם 10% FBS.
- זרע 1 מ ל של הבולם פיברוהפיצוץ, עם 5 x 105 תאים בכל טוב. נפח כולל בכל באר יהיה 2 מ ל.
- הגישה לתאי תרבות עד 100% מגיעה למפגש. לאחר מכן להסיר את המדיום ולהחליף עם DMEM עם 10% FBS עם 50 μg/mL חומצה אסקורבית טיפול נוסף אם נעשה שימוש.
- החלף בינוני עם DMEM טרי עם 10% FBS ו 50 μg/mL חומצה אסקורבית כל יומיים עבור 6 ימים.
הערה: אם נעשה שימוש בטיפול נוסף (לדוגמה, PDGF-BB, tgf-β ו/או גורמים לגידול אחרים), הוסף אותם באותו היום כמו טיפול בחומצה אסקורבית נוסף. - יומיים לאחר טיפול החומצה האסקורבית האחרון, להסיר את המדיום ולשטוף 2 מ ל PBS.
- הוסיפו באיטיות 1 מ ל של מאגר הליזה, שחומם מראש ב-37 ° c, לכל היותר. מודטה עבור 5-10 דקות בשעה RT עד הפיברוהכדורים הם למטה (הנצפה מתחת למיקרוסקופ).
- בזהירות ומבלי להסיר את מאגר הליזה, להוסיף 2 מ ל של PBS. ואז לאכול כ 2.5 מ ל של PBS. חזור פעמיים על סך של שלוש שטיפות.
- בסופו של דבר, להסיר 2.5 mL של PBS ולהוסיף 2 מ ל של PBS עם עט/דלקת (100 U/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). החותם בסרט והמשך ב -4 ° c עד 3 חודשים.
הערה: בהתאם לניסוי, אחסון לטווח ארוך של מטריצות שנוצרו עשוי להשפיע על התוצאות. אנו ממליצים להשתמש באמצעות מטריצות בהקדם האפשרי, ואפילו יותר כך שאם הניסוי כרוך בזריעת תאים, בשל השפלה אפשרית בחלבון. אם מטריצות משמשות עבור assays מבניים, כגון תצפית קולגן, מטריצות ניתן לתקן ומאוחסן לתקופות ארוכות. פרוטוקול זה מצוין לצלחת התרבות 6-היטב. לוחות אחרים ניתן להשתמש, אבל כרכים מגיבים וריכוז ההשעיה התא צריך להיות מחושבים מחדש על פי אזור טוב.
4. שיטת היווצרות הצינור
- הגדל את תאי HUVEC ב-EBM-2 2% FBS עד למפגש מרבי.
- החלף בינוני באמצעות EBM-2 ללא FBS עבור 8 h.
- הכן מטריצות לפני זריעת תאים.
- הסרת מטריצות מהמקרר והמקום עבור 1 h ב RT.
- מטריצות בלוק על-ידי הוספת 2 מ ל של חום-2% BSA. מודטה 1 h ב 37 ° c.
- ולשטוף ב 2 מ ל של PBS.
- זרעי 2 x 105 תאים huvec ב-fbs-דלה בינונית על כל באר של 6-היטב צלחת מצופה בעבר עם 3d פיברובלסט מטריצות נגזר.
- מודטה תאים אנדותל ב 37 ° c עבור 16 h.
- בדוק את מבנה המבנה כמו שפופרת תחת מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי בהגדלה של 20-40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGF-BB גירוי פיברופיצוצים ליצור ECM עבה יותר. הררה ו-al. הראה כיצד ממריצים את הטריתקיעות של PDGF שיצרו מטריצה עבה יותר וכיוון סיבים גבוהים יותר7. BJ-hTERT פיברותקיעות היו מודחים עם או בלי PDGF ואזורים הנציג נצפתה הראה התפלגות התא מיושר יותר בתוך מטריצות המיוצר על-ידי PDGF-מגורה הפיצוץ (איור 1א). קולגן I ו-fibronectin חלבון הביטוי הוגדלה בתוך מטריצות נגזר של PDGF-מגורה פיברומופיצוצים (איור 1b) וכתוצאה מכך, עובי מטריצה הוגדלה (איור 1ג). יתר על כן, קולגן אני ו fibronectin להראות דפוסים מקבילים, כפי שמוצג היסטגרמות הכיווניות (איור 1ד).
מטריצות תלת-ממדית הנגזרות מ-PDGF-BB-מוסטימולציה בתאי האנדותל. תאים HUVEC שופרה על מטריצות decellularized נגזר PDGF-מגורה או לא מגורה-hTERT פיברוט. תאי האנדותל שנזרע באמצעות מטריצות שנוצרו על ידי מבנים של PDGF-ממריצים הראו יותר נימי-כמו במבנים מאשר תחת תנאים שאינם ממריצים (איור 2).
איור 1: ממריצים PDGF-גירוי לשפר ואנאיזוטרופי ECM. (א) תמונות בינאריות נציג כיוון הסלולר של BJ-hTERT פיברותקיעות מטופלים או לא עם PDGF-BB (לעיל) וכיוון היסטגרמות (למטה), אשר מייצגים את תדירות התפלגות של זוויות תא (מרכוז על זווית 0 °). (ב) להגדיל את ביטוי החלבון של חלבונים מווניים fibronectin ו קולגן אני ב-pdgf-מגורה פיברומועיים שמקורם ecm. (ג) להגדיל את עובי ecm ב-ecm אלה שמקורם בפיברוהעיים של pdgf-מגורה. (ד) להגדיל חלבון וארגון של חלבונים מסחטות כגון fibronectin ו קולגן אני ב-pdgf-גירוי ממריצים שמקורם ecm. . למטה, כיוון היסטגרמות * p < 0.05; p < 0.001. הותאם מהררה ואח '7אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הריפלנים של PDGF ממריצים לקדם הפעלת תא אנדותל, אשר נצפתה על ידי היווצרות של מבנים כמו קפילר על מטריצות הנגזרות PDGF-מגורה. הכלי "ניתוח חלקיקים" מ-ImageJ הראה את קצב הגידול של 1.81 ב-HUVECs הנזרע על מטריצות מ-PDGF-גירוי ממריצים לגבי אלה הנזרע על מטריצות מתוך פיברופיצוצים שאינם ממריצים. הותאם מהררה ואח '7אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטריצות ניתן לייצר עם פיברופיצוצים מונצח או תרבויות העיקרי פיברוהפיצוץ. פיברותקיעות קל לשמור בתרבות מתורבת עם שיעור צמיחה גבוהה התנגדות מתח. הם יכולים אפילו להיות מבודדים מרקמות שלאחר המוות3, למרות זיהום יכול להיות מגבלה, בהתאם למקור הרקמה.
מודל 3D-מטריקס כאן מציע מערכת חדשנית ויעילה למחקר בהצלחה הרכב ECM וכיוון הסיבים. הוא מתאים גם לניתוחים של מצב הפעלה פיברוהפיצוץ, ביטוי גנטי/חלבון, אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים, וכו '. חשוב להדגיש כי מטריצות שנוצרו עם פיברופיצוצים מחולים לעשות מחקר אישי של מנגנונים הקשורים משתית בגידולים אפשריים. למשל, גישה זו יכולה להיות מוחלת על מחקרים של התנגדות כימותרפיה, שבו ה-ECM יש תפקיד חשוב. התרגום של סוג זה של מחקר יכול לסייע בקבלת החלטות לטיפול בחולים בפרקטיקה הקלינית, יישום רפואה אישית.
למרות הפרוטוקול 3D-מטריקס יכול להיות מייגע, תוצאות מעניינות ניתן להשיג על ידי ביצוע ההוראות. יש לציין כי יש צורך במספר מדרגות הכביסה, כך שהימנעות מנזק מטריצות היא חיונית. בנוסף, אנו ממליצים כי כאשר מצבים שונים של תרבות התא נבדקים עם פרוטוקול זה, מטריצות צריך להיווצר באותו זמן בשל הבדלים מינימליים שעלולים להתרחש במהלך ניסויים (למשל, באמצעות אותו הבולם פיברומה בעת זריעת צלחות שטופלו מראש).
שיטות אחרות להנדסה ברקמות מפותחות, אך שלבים נוספים כמו עיקור נחוצים ליצירת ECM ורקמות תואמות לשימוש אנושי. למרות שטכנולוגיות חדשות עולות, הן יכולות להיות יקרות ועשויות להיות קשות להסתגלות למתקני מעבדה סטנדרטיים. השימוש ב-CAFs העיקרי שהתקבל מחולים מאפשר ליצור "מטריצות אישית" כדי לבדוק טיפולים שונים. לאורך הקו הזה, הקבוצה שלנו כבר משתמש במתודולוגיה זו כדי להדגים כי מטריצות שנוצרו על ידי CAFs שונים אלה שנוצרו על ידי NFs, מראה מטריצות עבה יותר מאורגן יותר7. אנו דיווחו כי מבנים כמו נימי שמקורם בתאי האנדותל תלויים בביטוי Snail1 הפיצוץ, ויש מחקרים עתידיים להתבונן כי השפעה על מטריצות של הנגזרים כף.
ECM דורש מחקר נוסף לפני שנוכל להבין את המנגנונים הבסיסיים האחראים עמידות כימותרפיה או התדרדרות הגידול. לכן, אנו מציעים את השימוש של מטריצות בבית קפה מרקמות החולה סרטן כהליך לחקור התנהגות מיקרוסביבתית בסרטן ותקשורת ECM עם תאים סרטניים או תאים סטרומה אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 ו-RD12/0036/0041 מהמכון דה סלרוד קרלוס השלישי; על ידי Fondo אירופo דה Desarrollo אזורית (פדר); על ידי "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 ו CB16/12/00446, מן המכון דה סלרוד קרלוס השלישי-פדר; ועל ידי הדרך הטובה AECC (גישה רבת-פנים כדי למקד את סרטן הלבלב). כריסטינה פוניה היא מקבל חוזה של מיגל סרוט, ממכון דה סלרוד קרלוס השלישי. מ. Eaude עזר עם הטקסט באנגלית. אנו מודים לחברי המעבדה על עזרה וייעוץ במהלך המחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
