Summary
Syftet med denna metod är att få fibroblast-härledda 3D-matriser som en naturlig byggnadsställning för efterföljande cellulära analyser. Fibroblaster är seedade i en pre-behandlade odlingsplattan och stimuleras med askorbinsyra för Matrix generation. Matriserna är decellularized och blockeras för att odla relevanta celler (t. ex. endotelceller).
Abstract
Den extracellulära matrix (ECM) är en tredimensionell byggnadsställning som fungerar som det viktigaste stödet för celler i vävnader. Förutom sin strukturella funktion deltar ECM också i cell migration, spridning och differentiering. Fibroblaster är den huvudsakliga typen av celler modifiera ECM fiber arrangemang och produktion. I cancer, CAFs (cancer associerade fibroblaster) är i permanent aktiveringsstatus, deltar i ECM remodeling, underlätta tumör cell migration, och stimulera tumör-associerad angiogenes, bland andra Pro-tumorigenic roller. Syftet med denna metod är att skapa en tredimensionell matris med en fiber komposition som liknar in vivo matriser, med hjälp av förevigade fibroblaster eller mänskliga primära CAFs. Fibroblaster är odlade i förbehandlade cellkulturer plattor och odlas under askorbinsyra stimulering. Sedan, fibroblaster avlägsnas och matriser blockeras för ytterligare cell seedning. I denna ECM-modell kan fibroblaster aktiveras eller modifieras för att generera olika typer av matris, vars effekter kan studeras i cellkulturen. 3D-matriser formas också av cell signaler, som nedbrytning eller tvär bindnings ande enzymer som kan förändra fiber distributionen. I detta sammanhang, angiogenes kan studeras, tillsammans med andra celltyper såsom epitelial tumörceller.
Introduction
Den extracellulära matrix (ECM) är en dynamisk struktur som finns i alla typer av vävnad. Den består av proteiner och polysackarider som skapar ett nät av fibrer avgörande för celladhesion, migration, och kommunikation1. ECM-sammansättningen varierar beroende på vävnaden. Medan typ-I kollagen är det vanligaste strukturella proteinet, kollagentyper II, III, V och XI kan också hittas i olika vävnader2. Fibronectin som genereras av fibroblaster behövs för celladhesion2. Dessutom finns det andra strukturella molekyler som elastin, laminin och ytan receptorer kallas integriner att medla fiber montering och är specifika för de olika ECM vävnader2. ECM spelar en viktig roll som en cell byggnadsställning och kan också vara involverade i både fysiologiska och patologiska processer1. Avvikelser i ECM observeras i patologier som cancer, som förändrar ECM sammansättning och/eller dess organisation. I tumörer, ECM representerar icke-cellulära komponenten i tumören mikromiljö (TME), en komplex miljö av cellkomponenter såsom fibroblaster, immunceller, endotelceller, pericyter och en mängd lösliga faktorer. Det är känt att TME främjar cancer progression och metastaser; cancer-associerade fibroblaster, som en dominerande celltyp i tumören stroma, delta i denna process3. Till skillnad från vanliga fibroblaster, Cafs är i permanent aktivering, visar ökad utsöndring av ECM proteiner och tillväxtfaktorer (t. ex., omvandla tillväxtfaktor-β, TGF-β), samt ett högre uttryck av vissa markörer, såsom α-glatt mus kula ring aktin (α-SMA) och fibroblast aktiverings protein (FAP)4. Emellertid, CAFs är en heterogen cellpopulation, visar olika nivåer av aktivering eller markör uttryck5. Det kan antas då att sammansättningen och strukturen av fibroblast-härledda matriser kommer att bero på fibroblast status och egenskaper.
I detta sammanhang är målet med denna metod att etablera en lämplig in vitro-modell för ECM-generering av fibroblaster som motsvarar in vivo ECM-inställningen. Vi föreslår detta tillvägagångssätt som en in vitro-translationell metodik för fortsatta studier av tumör cells funktioner, som kemoresistens eller migration, medierad av ECM. Som vår grupp har publicerat någon annanstans, CAFs kan erhållas från färska vävnadsprover, men det måste noteras att CAFs överlevnad i kulturen är begränsad och deras cell passage nummer reduceras6. Dessutom kan CAF-grundkulturer som etablerats från patienters prover användas för matrisgenerering. Manipulation av genuttryck i fibroblaster är också ett intressant sätt att producera varierade in vitro-matriser för att bedöma de möjliga effekterna på Matrix sammansättning, fiber orientering, etc. Längs dessa linjer, vår grupp har nyligen rapporterat rollen av snigel-uttrycker fibroblaster i sammansättningen och fiber orientering av olika härledda matriser7.
Dessutom är CAFs och ECM involverade i kärlsystemet, både i fartygs generationen och som en del av vasen yttre lagret8. ECM remodeling inducerar angiogenes; Matrix metalloproteinaser (MMPs) verkar vara den viktigaste enzym typ som bidrar till denna process9,10. Vävnaden vaskularisering av primära celler som genererar ECMS, ECM makromolekyler, kvarvarande tillväxtfaktorer som ingår i ECM, Matrix elasticitet, och Matrix tjocklek beskrivs som faktorer inblandade i endotelceller cell aktiveringen11. I tumörer, hypoxi ökar ECM styvhet och endotelial spira generation12. Dessutom, CAFs utsöndrar vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och trombocytderivat tillväxtfaktor (PDGF) som stimulerar angiogenes i tumör stroma13. Inom detta område, in vitro Matrix generation kan användas för att studera angiogenes processer eller MMP åtgärder under olika experimentella förhållanden. Således kan in vitro-reproduktion av den mest analoga in vivo Matrix vara ett värdefullt verktyg för att undersöka ECM: s roll i angiogenes eller mikro-miljö cell interaktioner.
Stimulering av odlade fibroblaster med askorbinsyra för att förbättra Matrix deposition och generera en ECM är ett accepterat sätt att producera analoga in vivo matriser. Förevigat fibroblast cellinjer är lätt odlade och aktiveras av olika tillväxtfaktorer, som PDGF-BB, tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) eller TGF-β14. Inom TME, Cafs syntetisera typ-I kollagen och Fibronektin som de viktigaste komponenterna i ECM4. Likaså, dessa komponenter finns som viktiga komponenter i in vitro-genererade fibroblast-härledda matriser (figur 1).
Det finns olika in vitro-metoder för att simulera in vivo ECM. Användningen av belagda kultur rätter med blandningar av ECM-fibrer förlängdes under de senaste åren, men denna 2D-strategi behövde förbättras för 3D-strukturer, såsom tvärbunden gel (t. ex. Matrigel)1. Den Matrigel-liknande installationen har blivit standardmetod för simulering av en 3D-matris. Fibrin är också ett alternativ när man genererar matriser men misslyckas i termer av styrka och hållbarhet av ECM1. Kollagen som används i kombination med andra ECM komponenter ändrar några av de ovan nämnda frågorna. Men dessa kollagen geler bildar ett starkt nätverk med fibrer som kan orienteras, men är mycket heterogena, vilket kan vara ett problem i experiment repetitioner1. Det måste dock antas att, beroende på syftet med experimenten, användningen av matrigel eller andra hydrogeler är lämpligare (t. ex. i matriskontraktion studier där gelkontraktion lätt kan upptäckas).
Den potentiella immunogeniciteten hos de genererade matriserna kan vara ett problem i experiment med vissa celltyper. Därför, för att minska risken för immunsvar på grund av ECM-producerande celler när du använder vår metod, matriser är decellularized och tvättas, även om cell fragment avlägsnande inte kunde vara totalt15. Den ideala ECM måste vara kompatibel med cellkultur och kunna kommunicera och reagera på cell signaler. Vårt förfarande gör det möjligt att införa förändringar utan svårighet under ECM-produktion (t. ex. lägga fibroblast-stimulerande tillväxtfaktorer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga vävnadsprover erhölls med godkännande av forskningsetiska nämnden för sjukhuset Ramón y Cajal, Madrid.
1. beredning av lösningar
- Förbered 0,2% gelatin lösning: Tillsätt 1 g gelatin till 500 mL PBS. Autoklav lösningen och håll vid 4 ° c. Filter med ett 0,22 μm filter före användning.
- Förbered 1% glutaraldehyd: Tillsätt 1 mL 25% glutaraldehyd stamlösning till 24 mL PBS. Filter med ett 0,22 μm filter före användning.
- Förbered 1 M etanolamin: Bered etanolaminlösning med sterilt H2O. filter med ett 0,22 μm-filter före användning.
Anmärkning: eftersom etanolamin är försedd med ett säkerhetslock kommer en nål och spruta att behövas. - Förbered askorbinsyra: Tillsätt 0,1 mL 50 mg/mL stamlösning askorbinsyra (ljuskänsliga) till 100 mL medium.
- Förbered lysis buffert: Förbered PBS 0,5% Triton 100X med 20 nM i NH4oh. Lägg till NH4Oh rätt före användning.
- Förbered PBS Pen/STREP: Späd injektionspenna/STREP stamlösning till 100 U/mL penna och 100 μg/mL STREP.
- Förbered DMEM med 10% FBS: tillsätt 10% FBS till 500 mL DMEM. Komplettera med 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 0,1 mg/mL Normocin och 0,25 μg/mL amfotericin B.
- Förbered 2% BSA värme denaturerat: Tillsätt 2 g BSA till 100 mL sterilt vatten. Värm i kokande vatten i 7 min.
- Förbered FBS med antibiotika: komplettera FBS med 200 U/mL penicillin, 200 μg/mL streptomycin, 100 μg/mL gentamicin och 2,5 g/mL amfotericin B.
2. förberedelse av cell odling
- Förevigat fibroblaster cellinjer
- Kultur rekombinant telomeras transfekterade förevigade Human förhuden fibroblaster (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) i DMEM med 10% FBS och underhålla vid 37 ° c och 5% Co2.
- Endotelceller
- Kultur mänsklig navel ven endotelceller (HUVECs, ATCC PCS-100-013) i EBM-2 medium innehållande 2% FBS och underhålla vid 37 ° c och 5% CO2.
- Fibroblast primär kultur
Anmärkning: för CAF etablering och kultur, det protokoll som tidigare publicerats av vår grupp följdes6.- Kort, skära vävnadsprover i små bitar av cirka 2-3 mm3 och utsäde i FBS med hög koncentration av antibiotika.
- När de första fibroblaster dök, ersätta medium med FBM medium för cell underhåll.
Anmärkning: beroende på vävnadens ursprung, cellkulturer kan förorenas lätt. Tvätta prover i PBS kompletteras med antibiotika, med mycket förorenad vävnad (t. ex., kolon6) och skaka för 30-45 min.
3. fibroblast-härledda 3D-matriser (anpassade från Castelló-Cros och Cukierman16)
- Tillsätt 2 mL 0,2% gelatin lösning till varje brunn av en 6-brunn tallrik och inkubera i 1 h vid 37 ° c eller över natten vid 4 ° c.
- Aspirera gelatin och tvätta det i 2 mL PBS.
- Tillsätt 2 mL 1% glutaraldehyd och inkubera i 30 minuter vid RT. glutaraldehyd kommer Cross-Link gelatin.
- Aspirera glutaraldehyd och tvätta brunnar i 2 mL PBS i 5 min. Upprepa 3 gånger.
- Tillsätt 2 mL 1 M etanolamin och inkubera i 30 minuter vid RT. etanolamin kommer att agera för att blockera kvarvarande glutaraldehyd.
- Aspirera etanolamin och tvätta brunnar i 2 mL PBS i 5 min. Upprepa 3 gånger.
- Tillsätt 1 mL DMEM med 10% FBS. Om mediet omedelbart blir rosa, ta bort mediet, tvätta i 2 mL PBS och tillsätt igen 1 mL DMEM med 10% FBS.
- Utsäde 1 mL fibroblast suspension, med 5 x 105 celler i varje brunn. Totala volymen i varje brunn kommer att vara 2 mL.
- Kultur celler tills 100% sammanflödet uppnås. Ta sedan bort mediet och Ersätt med DMEM med 10% FBS med 50 μg/mL askorbinsyra och ytterligare behandling om den används.
- Ersätt medium med färsk DMEM med 10% FBS och 50 μg/mL askorbinsyra var 2 dagar för 6 dagar.
Anmärkning: om ytterligare behandling används (t. ex., PDGF-BB, TGF-β och/eller andra odlings faktorer), tillsätt dem samma dagar som askor bin Acid behandling tillsätts. - Två dagar efter den sista askorbinsyra behandlingen, ta bort mediet och tvätta i 2 mL PBS.
- Tillsätt långsamt 1 mL lyseringsbuffert, förvärmd vid 37 ° c, till varje brunn. Inkubera i 5-10 min vid RT tills fibroblaster lyseras (observerbara under mikroskopet).
- Försiktigt och utan att ta bort lyseringsbufferten, tillsätt 2 mL PBS. Aspirera sedan ungefär 2,5 mL PBS. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
- Så småningom, ta bort 2,5 mL PBS och tillsätt 2 mL PBS med penna/STREP (100 U/mL respektive 100 μg/mL). Försegla med film och håll vid 4 ° c i upp till 3 månader.
Beroende på experimentet kan långsiktig lagring av de genererade matriserna påverka resultatet. Vi rekommenderar att du använder matriser så snart som möjligt, och ännu mer så om experimentet innebär cell sådd, på grund av möjlig proteinnedbrytning. Om matriser används för strukturella analyser, såsom kollagen observation, kan matriserna fixas och lagras under längre perioder. Detta protokoll är indicerat för en 6-brunn kultur tallrik. Andra plattor kan användas, men reaktiva volymer och koncentration av cellsuspensionen måste räknas om enligt väl område.
4. test av rör bildning
- Odla HUVEC celler i EBM-2 2% FBS tills maximal sammanflödet.
- Byt ut mediet mot EBM-2 utan FBS för 8 h.
- Förbered matriser innan seedning celler.
- Ta bort matriser från kylskåpet och plats för 1 h vid RT.
- Block matriser genom att tillsätta 2 mL värme-denaturerad 2% BSA. Inkubera 1 h vid 37 ° c.
- Aspirera BSA och tvätta i 2 mL PBS.
- Utsäde 2 x 105 huvec celler i FBS-utarmat medium på varje brunn av en 6-brunn plattan tidigare belagd med 3D fibroblast-härledda matriser.
- Inkubera endotelceller vid 37 ° c i 16 timmar.
- Undersök rör-liknande struktur formation under ett vanligt ljust fält Mikroskop vid 20-40x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGF-BB stimulerade fibroblaster skapa en tjockare ECM. Herrera et al. visade hur PDGF-stimulerade fibroblaster genererade en tjockare matris samt högre fiber orientering7. BJ-hTERT fibroblaster var inkuberas med eller utan PDGF och representativa områden observerade visade en mer justerad cell fördelning i matriser som produceras av PDGF-stimulerad fibroblast (figur 1a). Kollagen i och Fibronektin proteinuttryck ökades i matriser som härrör från PDGF-stimulerade fibroblaster (figur 1b) och, följaktligen, matrixjockleken ökades (figur 1c). Dessutom visar kollagen i och Fibronektin parallella mönster, som visas i riktningen histogram (figur 1d).
3D matriser som härrör från PDGF-BB-stimulerade fibroblaster inducera tubulogenes i endotelceller. HUVEC celler var seedade på decellularized matriser som härrör från PDGF-stimulerade eller icke-stimulerad BJ-hTERT fibroblaster. Endotelceller seedade på matriser som genereras av PDGF-stimulerade fibroblaster visade mer kapillärliknande strukturer än under icke-stimulerade förhållanden (figur 2).
Figur 1: PDGF-stimulerade fibroblaster förbättra tjockare och anisotropisk ECM. (A) binära bilder representativa för cellulär orientering av BJ-hTERT fibroblaster behandlas eller inte med PDGF-BB (ovan) och riktningen histogram (nedan), som representerar frekvensen av fördelningen av cell vinklar (centrering på 0 ° vinkel). (B) ökning av proteinuttryck av de extracellulära proteinerna Fibronektin och kollagen i i PDGF-stimulerade fibroblaster härledda från ECM. C) ökning av ECM-tjocklek i de ECMS som härrör från PDGF-stimulerade fibroblaster. Dökning av protein och organisering av extracellulära proteiner som Fibronektin och kollagen i i PDGF-stimulerade fibroblaster härledda från ECM. Nedan, riktningen histogram. * p < 0,05; p < 0,001. Anpassad från Herrera et al.7vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PDGF-stimulerade fibroblaster främja endotelceller aktivering, som observerades genom bildandet av kapillärliknande strukturer på matriser som härrör från PDGF-stimulerade fibroblaster. Den "Partikelanalys" verktyg från ImageJ visade en ökning på 1,81 i HUVECs seedade på matriser från PDGF-stimulerade fibroblaster om de seedade på matriser från icke-stimulerade fibroblaster. Anpassad från Herrera et al.7vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matriser kan genereras med förevigade fibroblaster eller primära fibroblast kulturer. Fibroblaster är lätta att underhålla i in vitro-kultur med en hög tillväxttakt och stresstålighet. De kan även isoleras från obduktion vävnad3, även om kontaminering kan vara en begränsning, beroende på vävnadens ursprung.
3D-Matrix-modellen här erbjuder ett nytt och effektivt system för att framgångsrikt studera ECM sammansättning och fiber orientering. Det är också lämpligt för analyser av fibroblast aktiveringsstatus, gen/proteinuttryck, interaktioner med andra celltyper, etc. Det är viktigt att lyfta fram att matriser som genereras med fibroblaster från patienter göra personlig studie av stroma-relaterade mekanismer i tumörer möjligt. Till exempel kan denna metod tillämpas på studier av kemo-resistens, där ECM har en viktig roll. Översättningen av denna typ av studie skulle kunna stöd i beslutsfattande för behandling av patienter i klinisk praxis, genomföra personlig medicin.
Även om 3D-Matrix-protokollet kan vara tråkigt, kan intressanta resultat uppnås genom att följa instruktionerna. Det måste noteras att flera tvättsteg behövs, så att undvika mat ris skador är viktigt. Dessutom rekommenderar vi att när olika cell odlingsförhållanden testas med detta protokoll, bör matriserna genereras samtidigt på grund av minimala skillnader som kan förekomma under experiment (t. ex. med samma fibroblast suspension vid sådd förbehandlade plattor).
Andra vävnads-Engineering metoder utvecklas, men ytterligare åtgärder som sterilisering behövs för att skapa kompatibla ECM och vävnader för humant bruk. Även om ny teknik uppstår, kan de vara kostsamma och kan vara svåra att anpassa sig till standard laboratorieanläggningar. Användningen av primära CAFs erhållits från patienter gör det möjligt att generera "personliga matriser" för att testa olika behandlingar. Längs denna linje har vår grupp använt denna metod för att visa att matriser som genereras av CAFs skiljer sig från de som genereras av NFs, visar tjockare och mer organiserade matriser7. Vi har rapporterat att kapillärliknande strukturer som härrör från endotelceller är beroende av fibroblast Snail1 Expression, och det finns framtida studier för att Observera att effekten på CAFs-härledda matriser.
ECM kräver ytterligare studier innan vi kan förstå de bakomliggande mekanismer som ansvarar för kemoterapi motstånd eller tumör återfall. Därför föreslår vi användning av CAF-härledda matriser från cancerpatient vävnader som ett förfarande för att undersöka kontrollerade beteende i cancer och ECM kommunikation med cancerceller eller andra stromaceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Utvecklingen av detta protokoll stöddes av PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 och RD12/0036/0041 från Instituto de Salud Carlos III; av Fondo Europeo de Desarrollo regional (FEDER); genom "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 och CB16/12/00446, från Instituto de Salud Carlos III-FEDER; och av Fundación Científica AECC (en mångfacetterad strategi för att rikta pankreascancer). Cristina Peña är mottagare av ett Miguel Servet kontrakt från Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude hjälpte till med den engelska texten. Vi tackar Lab-medlemmar för hjälp och råd genom denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
