Summary
Bu yöntemin amacı sonraki hücresel tahliller için doğal bir iskele olarak fibroblast türetilmiş 3D matris elde etmektir. Fibroblastlar önceden işlenmiş bir kültür plakası içinde tohumlanır ve matris üretimi için askorbik asit ile uyarılır. Matrisler hücreden arındırılır ve kültürle ilgili hücrelere (örn. endotel hücreleri) bloke edilir.
Abstract
Hücre dışı matriks (ECM), dokularda hücreler için ana destek görevi gören üç boyutlu bir iskeledir. ECM, yapısal işlevinin yanı sıra hücre göçü, çoğalma ve farklılaşmaya da katılır. Fibroblastlar ECM lif düzenleme ve üretim değiştiren hücrelerin ana türüdür. Kanserde, CAFs (kanser ilişkili fibroblastlar) kalıcı aktivasyon durumu, ECM remodeling katılan, tümör hücre göçü kolaylaştırmak, ve uyarıcı tümör ilişkili anjiyogenez, diğer pro-tümörijenik roller arasında. Bu yöntemin amacı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya insan birincil CAFs kullanarak, in vivo matrisbenzer bir lif bileşimi ile üç boyutlu bir matris oluşturmaktır. Fibroblastlar önceden tedavi edilen hücre kültürü tabakalarında kültürlenir ve askorbik asit stimülasyonu altında yetiştirilir. Daha sonra fibroblastlar çıkarılır ve daha fazla hücre tohumlama için matrisler bloke edilir. Bu ECM modelinde, fibroblastlar etki hücre kültüründe incelenebilir matris, farklı türde oluşturmak için aktive veya değiştirilebilir. 3D matrisler de hücre sinyalleri tarafından şekillenir, bozulma veya lif dağılımını değiştirebilecek çapraz bağlantı enzimleri gibi. Bu bağlamda, anjiyogenez, epitel tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile birlikte incelenebilir.
Introduction
Hücre dışı matriks (ECM) tüm doku türlerinde bulunan dinamik bir yapıdır. Hücre yapışması, göç ve iletişim için çok önemli olan liflerin bir ağ oluşturmak proteinler ve polisakkaritler oluşur1. ECM bileşimi dokuya bağlı olarak değişir. Tip-I kollajen en yaygın yapısal protein iken, kollajen türleri II, III, V ve XI de çeşitli dokularda bulunabilir2. Fibroblastlar tarafından üretilen fibronektin hücre adezyonu için gereklidir2. Ayrıca, elastin gibi diğer yapısal moleküller vardır, laminin ve yüzey reseptörleri integrinler denilen bu lif montaj aracılık ve farklı ECM dokulara özgü2. ECM bir hücre iskelesi olarak önemli bir rol oynar ve aynı zamanda fizyolojik ve patolojik süreçler de dahil edilebilir1. ECM'de anormallikler Kanser gibi patolojilerde gözlenir, bu da ECM kompozisyonunu ve/veya organizasyonunu değiştirir. Tümörlerde, ECM tümör mikroçevre (TME), fibroblastlar, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, perisitler ve çözünür faktörlerin çeşitli gibi hücre bileşenlerinin karmaşık bir ortam hücresel olmayan bileşeni temsil eder. TME'nin kanser progresyonu ve metastazı teşvik ettiği bilinmektedir; kanserilişkili fibroblastlar, tümör stroma baskın hücre tipi olarak, bu süreçte yer almak3. Normal fibroblastların aksine, CAF'ler kalıcı aktivasyon da, ECM proteinlerinin ve büyüme faktörlerinin (örneğin, Transforming Growth Factor-β, TGF-β) salgılanmasının yanı sıra α-düz kas aktin (α-SMA) ve fibroblast aktivasyon proteini (FAP)4gibi bazı belirteçlerin daha yüksek bir ekspresyonu gösterir. Ancak, CAFs aktivasyon veya marker ifade5farklı düzeylerde gösteren heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Daha sonra fibroblast kaynaklı matrislerin bileşimi ve yapısının fibroblast durumuna ve özelliklerine bağlı olacağı varsayılabilir.
Bu bağlamda, bu metodolojinin amacı in vivo ECM ayarına eşdeğer fibroblastlar ile ECM üretimi için uygun bir in vitro model oluşturmaktır. Bu yaklaşımı, ECM aracılığında kemodirenç veya göç gibi tümör hücre fonksiyonlarının daha ileri çalışmaları için in vitro çeviri metodolojisi olarak öneriyoruz. Grubumuz başka bir yerde yayınlandığı gibi, CAFs taze doku örneklerinden elde edilebilir, ancak bu kültürDE CAFs 'hayatta kalma sınırlı olduğunu ve hücre geçiş sayısıazalır unutulmamalıdır 6. Buna ek olarak, hasta örneklerinden oluşturulan CAF primek kültürleri matris üretimi için kullanılabilir. Fibroblastlarda gen ekspresyonunun manipülasyonu da matris bileşimi, lif oryantasyonu, vb üzerinde olası etkilerini değerlendirmek için çeşitli in vitro matrisler üretmek için ilginç bir yoldur. Bu doğrultuda, grubumuz son zamanlarda çeşitli türemiş matrisler 7 kompozisyon ve lif oryantasyonusal Salyangoz ifadefibroblastlarrolünü bildirdi.
Ayrıca, CAFs ve ECM vasküler sistem, damar üretimi hem de vazo dıştabakasınınbir parçası olarak 8 yer almaktadır. ECM remodeling anjiyogenez indükler; matris metalloproteinazlar (MDP' ler) bu sürece katkıda bulunan en önemli enzim tipi gibi görünüyor9,10. EcM'leri oluşturan primer hücrelerin doku vaskülarizasyonu, ECM makromolekülleri, ECM'de yer alan artık büyüme faktörleri, matris elastikiyeti ve matris kalınlığı endotel hücre aktivasyonunda rol oynayan faktörler olarak tanımlanır11. Tümörlerde hipoksi ECM sertliğini ve endotel filizi oluşumunu arttırır12. Ayrıca, CAFs salgılar vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) tümör stroma anjiyogenez uyarmak13. Bu alanda, in vitro matris üretimi farklı deneysel koşullar altında anjiyogenez süreçleri veya MMP eylem çalışma için kullanılabilir. Böylece, en analog in vivo matris in vitro üreme anjiyogenez veya mikro-çevresel hücre etkileşimleri ECM rolünü araştırmak için değerli bir araç olabilir.
Matris birikimini artırmak ve Bir ECM oluşturmak için askorbik asit ile kültürlü fibroblastların uyarılması in vivo matrisler benzer üreten kabul edilen bir yoludur. Ölümsüzleştirilmiş fibroblast hücre hatları kolayca kültürlenir ve PDGF-BB, Tümör Nekrozu Faktör-α (TNF-α) veya TGF-β14gibi çeşitli büyüme faktörleri ile aktive edilir. TME içinde, CAFs sentez tip-I kollajen ve fibronektin ECM ana bileşenleri olarak4. Benzer şekilde, bu bileşenler in vitro-oluşturulan fibroblast kaynaklı matrislerin ana bileşenleri olarak bulunur(Şekil 1).
In vivo ECM simüle etmek için farklı in vitro metodolojileri vardır. ECM liflerinin karışımı ile kaplamalı kültür yemeklerinin kullanımı geçmiş yıllarda genişletilmiş, ancak bu 2D yaklaşım çapraz bağlı jeller (örneğin, Matrigel)1gibi 3D yapılar, iyileştirme gerekiyordu. Matrigel benzeri kurulum, 3B matrisi simüle etmek için standart bir yöntem haline gelmiştir. Fibrin de matris üreten bir alternatif ama ECM1gücü ve dayanıklılığı açısından başarısız olur. Kollajen diğer ECM bileşenleri ile birlikte kullanılan yukarıda belirtilen konuların bazılarını değiştirir. Ancak, bu kollajen jeller yönlendirilebilir lifler ilerlikleri ile güçlü bir ağ oluşturmak, ancak son derece heterojen, deney tekrarları bir sorun olabilir1. Bununla birlikte, deneylerin amacına bağlı olarak, Matrigel veya diğer hidrojellerin kullanımının daha uygun olduğu varsayılmalıdır (örneğin, jel kontraksiyonunun kolayca tespit edilebildiği matris daralma çalışmalarında).
Üretilen matrislerin potansiyel immünojenite bazı hücre tipleri ile deneylerde bir sorun olabilir. Bu nedenle, bizim yöntemi kullanırken ECM üreten hücreler nedeniyle bağışıklık yanıtları olasılığını azaltmak için, matrisler hücreden arındırılmış ve yıkanır, hücre parça kaldırma toplam olamazdı rağmen15. İdeal ECM hücre kültürü ile uyumlu olması ve iletişim kurmak ve hücre sinyallerine tepki gerekir. Prosedürümüz, ECM üretimi sırasında (örn. fibroblast uyarıcı büyüme faktörleri ekleyerek) değişikliklerin zorlanmadan başlatılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Madrid'deki Ramón y Cajal Hastanesi Araştırma Etik Kurulu'nun onayı ile insan doku örnekleri alındı.
1. Çözümlerin Hazırlanması
- %0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın: 500 mL PBS'ye 1 g jelatin ekleyin. Çözeltiyi otomatik olarak tökezle ve 4 °C'de tutun. Kullanmadan önce 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın.
- %1 glutaraldehit hazırlayın: 24 mL PBS'ye %25 glutaraldehit stok çözeltisi 1 mL ekleyin. Kullanmadan önce 0,22 μm filtre ile filtre uygulayın.
- 1 M etanolin hazırlayın: Kullanmadan önce steril H2O. Filtre ile etanolamin çözeltisi hazırlayın.
NOT: Etanolamin bir güvenlik kapağı ile sağlandığı için iğne ve şırınga gerekecektir. - Askorbik asit hazırlayın: 0.1 mL 50 mg/mL stok çözeltisi askorbik asit (ışığa duyarlı) ila 100 mL orta ekleyin.
- Lysis tamponhazırlayın: PBS hazırlamak 0.5% Triton 100X ile 20 nM NH4OH. Kullanmadan hemen önce NH4OH ekleyin.
- PBS Kalem/Strep hazırlayın: 100 U/mL Kalem ve 100 μg/mL Strep'e pen/Strep stok çözeltisini seyreltin.
- %10 FBS ile DMEM hazırlayın: 500 mL DMEM'e %10 FBS ekleyin. Takviyesi ile 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 0.1 mg/mL Normocin ve 0.25 g/mL amphotericin B.
- %2 BSA ısı denatüre hazırlayın: 100 mL steril suya 2 g BSA ekleyin. 7 dakika kaynar suda ılık.
- Antibiyotiklerle FBS hazırlayın: 200 U/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin, 100 μg/mL gentamisin ve 2.5 g/mL amphotericin B ile ek FBS.
2. Hücre Kültürü Hazırlama
- Ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar hücre hattı
- Kültür rekombinant telomeraz transfeced ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastlar (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) DMEM ile 10% FBS ve korumak 37 ° C ve 5% CO2.
- Endotel hücreleri
- Kültür insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs, ATCC PCS-100-013) EBM-2 ortamda 2% FBS içeren ve 37 ° C ve% 5 CO2korumak .
- Fibroblast birincil kültür
NOT: CAF kuruluşu ve kültürü için grubumuz tarafından daha önce yayınlanan protokol6izlenmiştir.- Kısaca, yaklaşık 2-3 mm3 küçük parçalar halinde doku örnekleri kesilmiş ve antibiyotik yüksek konsantrasyonile FBS tohum.
- İlk fibroblastlar ortaya çıktığında, hücre bakımı için orta ortamı FBM ortamı ile değiştirin.
NOT: Doku kökenine bağlı olarak hücre kültürleri kolayca kontamine olabilir. PBS'de antibiyotiklerle desteklenen, yüksek derecede kontamine olmuş doku (örneğin, kolon6)ile yıkama ve 30-45 dakika sallayın.
3. Fibroblast türetilmiş 3D Matrisler (Castelló-Cros ve Cukierman16'danuyarlanmıştır)
- 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 2 mL%0,2 jelatin çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Jelatini aspire edin ve 2 mL PBS'de yıkayın.
- 2 mL ekleyin 1% glutaraldehit ve inkübat 30 dk RT. Glutaraldehit çapraz bağlantı jelatin olacaktır.
- Glutaraldehit aspire ve 5 dk. 2 mL PBS kuyuları yıkayın.
- RT. Etanolamine de 30 dakika boyunca 1 M etanolin 2 mL ekleyin ve kuluçka kalan glutaraldehit engellemek için hareket edecektir.
- Etanolamin aspire edin ve kuyuları 2 mL PBS'de 5 dk.
- %10 FBS ile 1 mL DMEM ekleyin. Ortam hemen pembeye dönerse, ortayı çıkarın, 2 mL PBS'de yıkayın ve %10 FBS ile tekrar 1 mL DMEM ekleyin.
- Her kuyuda 5 x 105 hücreli 1 mL fibroblast süspansiyon tohumu. Her kuyunun toplam hacmi 2 mL olacaktır.
- %100 biraraya ulaşana kadar kültür hücrelerine ulaşılır. Daha sonra ortamı çıkarın ve kullanılırsa 50 μg/mL askorbik asit ve ek tedavi ile %10 FBS ile DMEM ile değiştirin.
- Orta ortamı 6 gün boyunca her 2 günde bir %10 FBS ve 50 g/mL askorbik asit ile değiştirin.
NOT: Ek tedavi kullanılıyorsa (örneğin, PDGF-BB, TGF-β ve/veya diğer büyüme faktörleri), askorbik asit tedavisinin eklenmegünlerine ilave edilir. - Son askorbik asit tedavisinden iki gün sonra ortayı çıkarın ve 2 mL PBS'de yıkayın.
- Her kuyuya 37 °C'de önceden ısıtılmış 1 mL lysis tamponu ekleyin. Fibroblastlar (mikroskop altında gözlemlenebilir) lysed kadar RT 5-10 dakika kuluçka.
- Dikkatle ve lysis tampon kaldırmadan, 2 mL PBS ekleyin. Daha sonra yaklaşık 2,5 mL PBS aspire edin. Toplam üç yıkıntı için iki kez tekrarlayın.
- Sonunda, 2,5 mL PBS çıkarın ve Pen/Strep ile 2 mL PBS ekleyin (sırasıyla 100 U/mL ve 100 μg/mL). Film ile mühürleyin ve 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
NOT: Deneye bağlı olarak, üretilen matrislerin uzun süreli depolanması sonuçları etkileyebilir. Mümkün olan en kısa sürede matris kullanmanızı öneririz, ve daha da çok eğer deney hücre tohumlama içeriyorsa, olası protein bozulması nedeniyle. Eğer matrisler kollajen gözlemi gibi yapısal tahliller için kullanılırsa, matrisler daha uzun süre sabitlenebilir ve saklanabilir. Bu protokol 6 kuyulu bir kültür plakası için endikedir. Diğer plakalar kullanılabilir, ancak reaktif hacimleri ve hücre süspansiyon konsantrasyonu iyi alana göre yeniden hesaplanması gerekir.
4. Tüp Oluşumu Tsası
- Maksimum bir araya kadar EBM-2 2% FBS HUVEC hücreleri büyümek.
- Orta ortamı 8 saat boyunca FBS olmadan EBM-2 ile değiştirin.
- Hücreleri tohumlamadan önce matrisleri hazırlayın.
- Matrice'leri buzdolabından çıkarın ve RT'de 1 saat bekletin.
- Isı denatüre 2% BSA 2 mL ekleyerek matrisblok. 37 °C'de kuluçka 1 saat.
- Aspirasyon BSA ve 2 mL PBS yıkayın.
- Tohum 2 x 105 FBS tükenmiş ortamda HUVEC hücreleri daha önce 3D fibroblast türetilmiş matrisler ile kaplanmış 6-iyi plaka her kuyuda.
- 37 °C'de 16 saat boyunca inkübatendial hücreler.
- 20-40x büyütmede standart parlak alan mikroskobu altında tüp benzeri yapı oluşumunu inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGF-BB uyarılmış fibroblastlar daha kalın bir ECM oluşturur. Herrera ve ark. nasıl PDGF uyarılmış fibroblastlar daha kalın bir matris yanı sıra daha yüksek lif oryantasyonu7üretti gösterdi . BJ-hTERT fibroblastları PDGF ile veya PDGF'siz kuluçkaya yatırıldı ve gözlenen temsili alanlar PDGF uyarılmış fibroblast tarafından üretilen matrislerde daha uyumlu hücre dağılımı gösterdi(Şekil 1a). PDGF uyarılmış fibroblastlardan elde edilen matrislerde kollajen I ve fibronektin protein ekspresyonu artmış ve sonuç olarak matris kalınlığı artmıştır (Şekil 1c). Ayrıca kollajen I ve fibronektin yön histogramlarında gösterildiği gibi paralel desenler gösterirler (Şekil 1d).
PDGF-BB-uyarılmış fibroblastlardan elde edilen 3D matrisler endotel hücrelerinde tübulogenezi indükler. HUVEC hücreleri PDGF uyarılmış veya uyarılmayan BJ-hTERT fibroblastlarından elde edilen hücreleşmiş matrislere tohumlandı. PDGF tarafından uyarılmış fibroblastlar tarafından üretilen matrisler üzerinde tohumlanan endotel hücreleri, uyarılmayan koşullara göre daha fazla kılcal damar benzeri yapılar göstermiştir(Şekil 2).
Şekil 1: PDGF uyarılmış fibroblastlar kalın ve anizotropik ECM geliştirmek. (A) PDGF-BB (üstte) ve yön lütfat histogramları (aşağıda) ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen BJ-hTERT fibroblastlarının hücresel yönünü temsil eden ikili görüntüler (0° açı üzerinde merkezleme). (B) ECM'den elde edilen PDGF uyarılmış fibroblastlarda ekstrasellüler proteinlerin fibronektin ve kollajen I protein ekspresyonunda artış. (C) PDGF uyarılmış fibroblastlardan elde edilen ECM kalınlığında artış. (D) ECM'den elde edilen PDGF uyarılmış fibroblastlarda fibronektin ve kollajen I gibi ekstrasellüler proteinlerin protein ve organizasyonunda artış. Aşağıda, yön histogramları. *p < 0.05; p < 0.001. Herrera ve ark.7uyarlanmışbu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PDGF uyarılmış fibroblastlar endotel hücre aktivasyonunu teşvik eder, pdgf uyarılmış fibroblastlardan elde edilen matrislerde kılcal damar benzeri yapıların oluşumu ile gözlenmiştir. ImageJ'in "Parçacık analizi" aracı, pdgf tarafından uyarılmış fibroblastlardan matrisler üzerine tohumlanan HUVEC'lerde, uyarılmayan fibroblastlardan gelen matrislere göre 1.81'lik bir artış oranı gösterdi. Herrera ve ark.7uyarlanmışbu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrisler ölümsüzleştirilmiş fibroblastlar veya primer fibroblast kültürleri ile oluşturulabilir. Fibroblastlar yüksek büyüme hızı ve stres direnci ile in vitro kültürde korumak kolaydır. Hatta post-mortem doku izole edilebilir3, kontaminasyon bir kısıtlama olabilir rağmen, doku kökenine bağlı olarak.
3D-matris modeli burada başarıyla ECM kompozisyon ve lif oryantasyonu çalışma için yeni ve etkili bir sistem sunuyor. Fibroblast aktivasyon durumu, gen/protein ekspresyonu, diğer hücre tipleri ile etkileşimvb. Hastalardan gelen fibroblastlarla oluşan matrislerin tümörlerde stroma ile ilgili mekanizmaların kişiselleştirilmiş bir şekilde incelenmesini mümkün kılmış hale getirmek önemlidir. Örneğin, bu yaklaşım kemo-direnç çalışmaları için uygulanabilir, hangi ECM önemli bir role sahiptir. Bu tür bir çalışmanın çevirisi, klinik uygulamada hastaların tedavisi için karar verme de yardımcı olabilir, kişiselleştirilmiş tıp uygulayarak.
3D matris protokolü sıkıcı olsa da, talimatları izleyerek ilginç sonuçlar elde edilebilir. Birden fazla yıkama adımı gerekli olduğu unutulmamalıdır, bu nedenle matris hasarı kaçınarak esastır. Buna ek olarak, farklı hücre kültürü koşulları bu protokol le test edildiğinde, deneyler sırasında oluşabilecek en az farklılıklar nedeniyle aynı anda matrislerin üretilmesi ni öneririz (örn. tohumlama sırasında aynı fibroblast süspansiyonunu kullanmak önceden işlenmiş plakalar).
Diğer doku mühendisliği yöntemleri geliştirilmektedir, ancak insan kullanımı için uyumlu ECM ve dokular oluşturmak için sterilizasyon gibi ek adımlar gereklidir. Yeni teknolojiler ortaya çıksa da, bunlar pahalıya mal olabilir ve standart laboratuvar tesislerine adapte olmak zor olabilir. Hastalardan elde edilen primer CAF'lerin kullanımı, farklı tedavileri test etmek için "kişiselleştirilmiş matrisler" oluşturmayı mümkün kılar. Bu doğrultuda grubumuz, CAF'ler tarafından üretilen matrislerin NF'ler tarafından üretilen matrislerden farklı olduğunu ve daha kalın ve daha düzenli matrisler7'yigösterdiğini göstermek için bu metodolojiyi kullanmaktadır. Endotel hücrelerinden elde edilen kılcal damar benzeri yapıların fibroblast Salyangoz1 ekspresyonuna bağlı olduğunu ve CAFs kaynaklı matrisler üzerindeki bu etkiyi gözlemlemek için ileride yapılacak çalışmalar olduğunu bildirdik.
Kemoterapi direnci veya tümör nüksünden sorumlu alt mekanizmaları anlayamadan önce ECM daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, kanser hücreleri veya diğer stromal hücreler le kanser ve ECM iletişimmikroçevresel davranışı araştırmak için bir prosedür olarak kanser hasta dokularından CAF türetilmiş matrislerin kullanılmasını öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu protokolün geliştirilmesi PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 ve RD12/0036/0041 tarafından Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklenmiştir; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) tarafından; tarafından "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 ve CB16/12/00446, Instituto de Salud Carlos III-FEDER tarafından; ve Fundación Científica AECC (pankreas kanseri hedef için çok yönlü bir yaklaşım) tarafından. Cristina Peña, Instituto de Salud Carlos III'ten Miguel Servet Sözleşmesi'ne sahibidir. M. Eaude İngilizce metin ile yardımcı oldu. Biz bu araştırma boyunca yardım ve tavsiye için laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
