Summary
Formålet med denne metode er at opnå fibroblast-afledte 3D matricer som et naturligt stillads for efterfølgende cellulære assays. Fibroblaster siver i en forbehandlet kultur plade og stimuleres med ascorbinsyre til matrix generering. Matricer er decellularized og blokeret for kultur relevante celler (f. eks endotelceller).
Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en tredimensionel stillads, der fungerer som den vigtigste støtte til celler i væv. Ud over sin strukturelle funktion, ECM også deltager i celle migration, spredning, og differentiering. Fibroblaster er den vigtigste type af celler, der modificerer ECM fiber arrangement og produktion. I kræft, CAFs (kræft associerede fibroblaster) er i permanent aktivering status, deltager i ECM Remodeling, lette tumor celle migration, og stimulere tumor-associeret angiogenese, blandt andre Pro-tumorigenic roller. Formålet med denne metode er at skabe en tredimensionel matrix med en fibersammensætning, der svarer til in vivo matricer, ved hjælp af udødeliggjort fibroblaster eller humane primære cafs. Fibroblaster dyrkes i præ-behandlede cellekultur plader og dyrket under ascorbinsyre stimulation. Derefter fjernes fibroblaster, og matricer blokeres for yderligere celle såning. I denne ECM-model, kan fibroblaster aktiveres eller ændres til at generere forskellige slags matrix, hvis virkninger kan undersøgt i cellekultur. 3D matricer er også formet af celle signaler, ligesom nedbrydning eller cross-Linking enzymer, der kan ændre fiber fordeling. I denne sammenhæng kan angiogenese undersøgt, sammen med andre celletyper såsom epiteliale tumorceller.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk struktur til stede i alle typer af væv. Det består af proteiner og polysaccharider, der skaber et net af fibre afgørende for celle vedhæftning, migration, og kommunikation1. ECM sammensætning varierer afhængigt af vævet. Mens type-I kollagen er det mest udbredte strukturelle protein, kan kollagen type II, III, V og XI også findes i forskellige væv2. Fibronectin genereret af fibroblaster er nødvendig for celle vedhæftning2. Desuden er der andre strukturelle molekyler som elastin, Laminin og overflade receptorer kaldet integriner at mægle fiber samling og er specifikke for de forskellige ECM væv2. ECM spiller en vigtig rolle som en celle stilladser og kan også være involveret i både fysiologiske og patologiske processer1. Abnormaliteter i ECM er observeret i patologier såsom kræft, som ændrer ECM sammensætning og/eller dets organisation. I tumorer repræsenterer ECM den ikke-cellulære komponent af tumor mikromiljø (TME), en kompleks Milieu af celle komponenter såsom fibroblaster, immunceller, endotelceller, pericytes og en række opløselige faktorer. Det er kendt, at TME fremmer kræft progression og metastase; Cancer-associerede fibroblaster, som en fremherskende celletype i tumor stroma, deltager i denne proces3. I modsætning til normale fibroblaster, CAFs er i permanent aktivering, viser øget sekretion af ECM proteiner og vækstfaktorer (f. eks, omdanne vækstfaktor-β, TGF-β), samt et højere udtryk for nogle markører, såsom α-glat muskel actin (α-SMA) og fibroblast aktivering protein (FAP)4. Men CAFs er en heterogen cellepopulation, der viser forskellige niveauer af aktivering eller markør udtryk5. Det kan antages derefter, at sammensætningen og strukturen af fibroblast-afledte matricer vil afhænge af fibroblast status og egenskaber.
I denne forbindelse er formålet med denne metode at etablere en passende in vitro-model for ECM-produktion ved fibroblaster svarende til in vivo ECM-indstillingen. Vi foreslår denne fremgangsmåde som en in vitro translationel metode til yderligere undersøgelser af tumor celle funktioner, som chemoresistance eller migration, medieret af ECM. Som vores gruppe har offentliggjort andetsteds, CAFs kan fås fra fersk vævsprøver, men det skal bemærkes, at CAFs overlevelse i kulturen er begrænset, og deres celle passage nummer er reduceret6. Desuden kan CAF-primær kulturer, der er etableret ud fra patientprøver, anvendes til matrix generering. Manipulation af genekspression i fibroblaster er også en interessant måde at producere varierede in vitro-matricer til at vurdere de mulige virkninger på matrix sammensætning, fiberorientering osv. På denne linje har vores gruppe for nylig rapporteret om rollen som snegl-udtrykker fibroblaster i sammensætningen og fiber orienteringen af forskellige afledte matricer7.
Desuden er CAFs og ECM involveret i det vaskulære system, både i fartøjets generation og som en del af vasens ydre lag8. ECM remodeling inducerer angiogenese; matrix metalloproteinaser (MMPs) synes at være den vigtigste enzym type, der bidrager til denne proces9,10. Væv vaskularisering af primære celler, der genererer ECMs, ECM makromolekyler, resterende vækstfaktorer inkluderet i ECM, matrix elasticitet, og matrix tykkelse er beskrevet som faktorer involveret i endotel celle aktivering11. I tumorer, hypoksi øger ECM stivhed og endotel spire generation12. Desuden, CAFs udskiller vaskulære endotelial vækstfaktor (VEGF) og trombocytafledt vækstfaktor (PDGF), der stimulerer angiogenese i tumor stroma13. På dette område kan in vitro-matrix generering anvendes til at studere angiogenese-processer eller MMP-handling under forskellige eksperimentelle forhold. Således, in vitro-reproduktion af den mest analoge in vivo matrix kunne være et værdifuldt redskab til at undersøge ECM rolle i angiogenese eller mikro-miljø celle interaktioner.
Stimulering af dyrkede fibroblaster med ascorbinsyre for at forbedre matricen deposition og generere en ECM er en accepteret måde at producere analoge in vivo matricer. Immortalized fibroblast cellelinjer er let kulturperler og aktiveres af forskellige vækstfaktorer, ligesom PDGF-BB, tumor nekrose faktor-α (TNF-α) eller TGF-β14. Inden for TME, cafs syntetisere type-I kollagen og fibronektin som de vigtigste komponenter i ECM4. Tilsvarende findes disse komponenter som større komponenter af in vitro-genererede fibroblast-afledte matricer (figur 1).
Der er forskellige in vitro-metoder til at simulere in vivo ECM. Brugen af coated kultur retter med blandinger af ECM fibre blev forlænget i de seneste år, men denne 2D tilgang nødvendig forbedring til 3D-strukturer, såsom cross-linked gels (f. eks Matrigel)1. Den Matrigel-lignende setup er blevet standardmetode til simulering af en 3D-matrix. Fibrin er også et alternativ, når der genereres matricer, men fejler med hensyn til styrke og holdbarhed af ECM1. Kollagen anvendes i kombination med andre ECM komponenter ændrer nogle af de ovennævnte spørgsmål. Men disse kollagen gels danner et stærkt netværk med fibre, der kan være orienteret, men er meget heterogene, hvilket kan være et problem i eksperiment gentagelser1. Det må dog antages, at anvendelsen af matrigel eller andre silicagelrogeler, afhængigt af formålet med forsøgene, er mere hensigtsmæssig (f. eks. i matrix-sammentrækning undersøgelser, hvor gelsammentrækning let kan påvises).
Den potentielle immunogenicitet af de genererede matricer kan være et problem i eksperimenter med nogle celletyper. Derfor, at reducere muligheden for immunrespons på grund af ECM-genererer celler, når du bruger vores metode, matricer er decellularized og vasket, selv om celle fragment fjernelse ikke kunne være total15. Den ideelle ECM skal være kompatibel med cellekultur og i stand til at kommunikere og reagere på celle signaler. Vores procedure giver mulighed for indførelse af ændringer uden problemer under ECM-produktion (f. eks tilføje fibroblast-stimulerende vækstfaktorer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane vævsprøver blev indhentet med godkendelse fra Forskningsudvalget på hospitalet Ramón y cajal, Madrid.
1. forberedelse af løsninger
- Forbered 0,2% gelatineopløsning: Tilsæt 1 g gelatine til 500 mL PBS. Autoclave opløsningen og opbevares ved 4 °C. Filter med et 0,22 μm filter før brug.
- Forbered 1% glutaraldehyd: Tilsæt 1 mL 25% glutaraldehyd stamopløsning til 24 mL PBS. Filter med et 0,22 μm filter før brug.
- Forbered 1 M ethanolamin: Forbered ethanolamin opløsning med sterilt H2O. filter med et 0,22 μm filter før brug.
Bemærk: da ethanolamin er forsynet med en sikkerhedshætte, vil der være brug for en nål og sprøjte. - Forbered ascorbinsyre: tilsæt 0,1 mL 50 mg/mL stamopløsning ascorbinsyre (lysfølsom) til 100 mL medium.
- Forbered lysis buffer: Forbered PBS 0,5% Triton 100X med 20 nM af NH4Oh. Tilføj NH4Oh lige før brug.
- Til klargøring af PBS pen/STREP: fortyndet pen/STREP stamopløsning til 100 U/mL pen og 100 μg/mL STREP.
- Forbered DMEM med 10% FBS: Tilsæt 10% FBS til 500 mL DMEM. Supplement med 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 0,1 mg/mL Normocin og 0,25 μg/mL amphotericin B.
- Forbered 2% BSA varme denatureret: Tilsæt 2 g BSA til 100 mL sterilt vand. Varm i kogende vand i 7 min.
- Forbered FBS med antibiotika: supplement FBS med 200 U/mL penicillin, 200 μg/mL streptomycin, 100 μg/mL gentamicin og 2,5 g/mL amphotericin B.
2. klargøring af cellekultur
- Immortalized fibroblaster cellelinje
- Kultur rekombinant telomerase transficeret udødeliggjort humane forhuden fibroblaster (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) i DMEM med 10% FBS og vedligeholde ved 37 °c og 5% Co2.
- Endotelceller
- Kultur humane navle vene endotelceller (huvecs, ATCC PCs-100-013) i EBM-2 medium indeholdende 2% FBS og vedligeholde ved 37 °c og 5% Co2.
- Primær kultur for fibroblast
Note: for CAF etablering og kultur, den protokol, som tidligere blev offentliggjort af vores gruppe blev fulgt6.- Kortvarigt skæres vævsprøver i små stykker på ca. 2-3 mm3 og frø i FBS med høj koncentration af antibiotika.
- Når de første fibroblaster dukkede, Udskift medium med FBM medium for celle vedligeholdelse.
Bemærk: afhængigt af vævs oprindelse kan cellekulturer let forurenes. Vask prøverne i PBS suppleret med antibiotika, med stærkt forurenet væv (f. eks kolon6) og ryste i 30-45 min.
3. fibroblast-afledte 3D matricer (tilpasset fra Castelló-Cros og Cukierman16)
- Der tilsættes 2 mL 0,2% gelatineopløsning til hver brønd af en 6-brønd plade og Inkuber i 1 time ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.
- Aspirer gelatine og vaskes i 2 mL PBS.
- Tilsæt 2 mL 1% glutaraldehyd og Inkuber i 30 min ved RT. glutaraldehyd vil krydse-link gelatine.
- Sug glutaraldehyd og vask brønde i 2 mL PBS i 5 min. Gentag 3 gange.
- Tilsæt 2 mL 1 M ethanolamin og Inkuber i 30 min ved RT. ethanolamin vil virke for at blokere den resterende glutaraldehyd.
- Sug ethanolamin og vask brønde i 2 mL PBS i 5 min. Gentag 3 gange.
- Tilsæt 1 mL DMEM med 10% FB'ER. Hvis mediet straks bliver lyserød, fjernes mediet, vaskes i 2 mL PBS og tilsættes igen 1 mL DMEM med 10% FBS.
- Frø 1 mL fibroblast suspension, med 5 x 105 celler i hver brønd. Samlet volumen i hver brønd vil være 2 mL.
- Kultur celler indtil 100% sammenløbet er nået. Fjern derefter mediet og Udskift med DMEM med 10% FBS med 50 μg/mL ascorbinsyre og yderligere behandling, hvis det anvendes.
- Udskift medium med frisk DMEM med 10% FBS og 50 μg/mL ascorbinsyre hver 2 dage i 6 dage.
Bemærk: Hvis der anvendes yderligere behandling (f. eks. PDGF-BB, TGF-β og/eller andre vækstfaktorer), tilsættes de samme dage som ascorbinsyre behandling tilsættes. - To dage efter den sidste ascorbinsyre behandling fjernes mediet og vaskes i 2 mL PBS.
- Tilsæt langsomt 1 mL lysisbuffer, forvarmet ved 37 °C, til hver brønd. Inkubér i 5-10 min ved rt, indtil fibroblaster er lyseres (kan observeres under mikroskopet).
- Forsigtigt og uden at fjerne lysis buffer tilsættes 2 mL PBS. Derefter aspirerer ca. 2,5 mL PBS. Gentag to gange for i alt tre skyller.
- Til sidst fjernes 2,5 mL PBS og tilsættes 2 mL PBS med pen/STREP (henholdsvis 100 U/mL og 100 μg/mL). Forsegl med film og opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
Bemærk: afhængigt af eksperimentet kan langtidslagring af de genererede matricer påvirke resultaterne. Vi anbefaler at bruge matricer så hurtigt som muligt, og endnu mere, hvis eksperimentet involverer celle såning, på grund af eventuel protein nedbrydning. Hvis matricer anvendes til strukturelle assays, såsom kollagen observation, matricer kan fastsættes og opbevares i længere perioder. Denne protokol er angivet for en 6-brønd kultur plade. Andre plader kan anvendes, men reaktive volumener og cellesuspension koncentration skal genberegnes efter godt område.
4. analyse af rørdannelse
- Vokse HUVEC celler i EBM-2 2% FBS indtil maksimal sammenløbet.
- Udskift mediet med EBM-2 uden FBS i 8 timer.
- Forbered matricer før såning celler.
- Fjern matricer fra køleskabet og Placer den i 1 time ved RT.
- Blok matricer ved tilsætning af 2 mL varme denatureret 2% BSA. Inkuber 1 t ved 37 °C.
- Udsug BSA og vask i 2 mL PBS.
- Seed 2 x 105 HUVEC celler i FBS-depleteret medium på hver brønd af en 6-brønd plade tidligere belagt med 3D fibroblast-afledte matricer.
- Incubate endotelceller ved 37 °C i 16 timer.
- Undersøg rørlignende struktur dannelse under et standard lys felt mikroskop ved 20-40x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGF-BB stimuleret fibroblaster skabe en tykkere ECM. Herrera et al. viste, hvordan PDGF-stimuleret fibroblaster genereret en tykkere matrix samt højere fiberorientering7. BJ-hTERT-fibroblaster blev inkuberet med eller uden PDGF, og de observerede repræsentative områder viste en mere justeret celle fordeling i matricer produceret af PDGF-stimuleret fibroblast (figur 1a). Kollagen i og fibronektin protein ekspression blev forøget i matricer afledt af PDGF-stimuleret fibroblaster (figur 1b), og derfor blev matrix tykkelsen forhøjet (figur 1c). Desuden viser kollagen i og fibronektin parallelle mønstre, som vist i directionalitetshistogrammer (figur 1d).
3D matricer afledt af PDGF-BB-stimuleret fibroblaster inducere tubulogenesis i endotelceller. HUVEC-celler blev seedet på decellulariserede matricer afledt af PDGF-stimulerede eller ikke-stimulerede BJ-hTERT-fibroblaster. Endotelceller, der sås på matricer genereret af PDGF-stimulerede fibroblaster, viste flere kapillar lignende strukturer end under ikke-stimulerede forhold (figur 2).
Figur 1: PDGF-stimuleret fibroblaster forbedre tykkere og Anisotropisk ECM. (A) binære billeder repræsentative for cellulær orientering af BJ-hTERT fibroblaster behandlet eller ikke med PDGF-BB (ovenfor) og directionalitet histogrammer (nedenfor), som repræsenterer hyppigheden af fordelingen af celle vinkler (centrering på 0 ° vinkel). (B) stigning i protein ekspression af de ekstracellulære proteiner fibronektin og kollagen i i PDGF-stimuleret fibroblaster afledt af ECM. C) forøgelse af ECM-tykkelsen i de ecm'er, der er afledt af PDGF-stimulerede fibroblaster. (D) stigning i protein og organisering af ekstracellulære proteiner såsom fibronektin og kollagen i i PDGF-stimuleret fibroblaster afledt af ECM. Nedenfor, directionalitet histogrammer. * p < 0,05; p < 0,001. Tilpasset fra Herrera et al.7venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PDGF-stimuleret fibroblaster fremmer endotel celle aktivering, som blev observeret ved dannelsen af kapillar lignende strukturer på matricer afledt af PDGF-stimuleret fibroblaster. Værktøjet "partikel analyse" fra ImageJ viste en stigning på 1,81 i HUVECs seedede på matricer fra PDGF-stimuleret fibroblaster vedrørende dem, der sås på matricer fra ikke-stimulerede fibroblaster. Tilpasset fra Herrera et al.7venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matricer kan genereres med udødeliggjort fibroblaster eller primære fibroblast kulturer. Fibroblaster er nemme at vedligeholde i in vitro-kultur med en høj vækstrate og stress modstand. De kan endda isoleres fra post mortem-vævet3, selv om kontaminering kan være en begrænsning afhængigt af vævs oprindelsen.
3D-matrixmodel her tilbyder et nyt og effektivt system til succes undersøgelse ECM sammensætning og fiberorientering. Det er også velegnet til analyser af fibroblast aktiveringsstatus, gen/protein ekspression, interaktioner med andre celletyper osv. Det er vigtigt at fremhæve, at matricer genereret med fibroblaster fra patienter gør personlig undersøgelse af stroma-relaterede mekanismer i tumorer muligt. For eksempel kan denne fremgangsmåde anvendes til undersøgelser af kemo resistens, hvor ECM har en vigtig rolle. Oversættelsen af denne type undersøgelse kunne støtte i beslutningsprocessen til behandling af patienter i klinisk praksis, gennemføre personlig medicin.
Selvom 3D-Matrix protokollen kan være kedelig, kan der opnås interessante resultater ved at følge instruktionerne. Det skal bemærkes, at flere vaske trin er nødvendige, så undgå matrix skader er afgørende. Derudover anbefaler vi, at når forskellige celle dyrkningsbetingelser testes med denne protokol, skal matricer genereres på samme tid på grund af minimale forskelle, der kan opstå under forsøg (f. eks. ved hjælp af den samme fibroblast suspension, når såning forbehandlede plader).
Andre vævs-Engineering metoder er under udvikling, men yderligere trin som sterilisering er nødvendige for at skabe kompatible ECM og væv til human brug. Selv om der opstår nye teknologier, kan de være dyre og kan være svære at tilpasse sig til standard laboratoriefaciliteter. Brugen af primære CAFs opnået fra patienter gør det muligt at generere "personlige matricer" til at teste forskellige behandlinger. Langs denne linje har vores gruppe brugt denne metode til at påvise, at matricer genereret af CAFs er forskellige fra dem, der genereres af NFs, der viser tykkere og mere organiserede matricer7. Vi har rapporteret, at kapillar lignende strukturer afledt af endotelceller er afhængige af fibroblast Snail1 ekspression, og der er fremtidige undersøgelser for at observere denne effekt på CAFs-afledte matricer.
ECM kræver yderligere undersøgelse, før vi kan forstå de underliggende mekanismer, der er ansvarlige for kemoterapi resistens eller tumor tilbagefald. Derfor foreslår vi brugen af CAF-afledte matricer fra Cancer patientvæv som en procedure til at undersøge mikromiljømæssig adfærd i kræft og ECM-kommunikation med kræftceller eller andre stromale celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Udviklingen af denne protokol blev støttet af PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 og RD12/0036/0041 fra Instituto de Salud Carlos III; af Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); af "CIBER de cáncer", CB16/12/00273 og CB16/12/00446, fra Instituto de Salud Carlos III-FEDER; og af Fundación Científica AECC (en mangesidet tilgang til at målrette kræft i bugspytkirtlen). Cristina Peña er modtager af en Miguel Servet-kontrakt fra Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude hjalp med den engelske tekst. Vi takker Lab medlemmer for hjælp og rådgivning i hele denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
