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Cancer Research

एंडोथेलियल ट्यूब फॉर्मेशन परख पर लागू फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न 3डी मैट्रिक्स सिस्टम

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60304
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 1
1Medical Oncology Department, Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS), CIBERONC, 2Department of Medical Oncology, Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Universidad Autónoma de Madrid, CIBERONC, 4Department of Oncology & Pathology, Karolinska Institutet

Summary

इस विधि का उद्देश्य बाद में सेलुलर परख के लिए एक प्राकृतिक पाड़ के रूप में फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न 3 डी मैट्रिस प्राप्त करना है। फाइब्रोब्लास्ट एक पूर्व-इलाज संस्कृति प्लेट में वरीयता प्राप्त होते हैं और मैट्रिक्स पीढ़ी के लिए एस्कॉर्बिक एसिड के साथ प्रेरित होते हैं। मैट्रिस को प्रासंगिक कोशिकाओं (जैसे, एंडोथेलियल कोशिकाओं) को संस्कृति के लिए विसेलुलरी और अवरुद्ध किया जाता है।

Abstract

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) एक त्रि-आयामी पाड़ है जो ऊतकों में कोशिकाओं के लिए मुख्य समर्थन के रूप में कार्य करता है। अपने संरचनात्मक कार्य के अलावा, ईसीएम सेल माइग्रेशन, प्रसार और भेदभाव में भी भाग लेता है। फाइब्रोब्लास्ट ईसीएम फाइबर व्यवस्था और उत्पादन को संशोधित करने वाली कोशिकाओं का मुख्य प्रकार है। कैंसर में, सीएएफ (कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट) स्थायी सक्रियण स्थिति में हैं, ईसीएम रीमॉडलिंग में भाग ले रहे हैं, ट्यूमर सेल माइग्रेशन को सुविधाजनक बना रहे हैं, और ट्यूमर से जुड़े एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित कर रहे हैं, अन्य समर्थक ट्यूमरिकेंटिक भूमिकाओं के बीच। इस विधि का उद्देश्य एक फाइबर संरचना के साथ एक त्रि-आयामी मैट्रिक्स बनाना है जो वीवो मैट्रिस में समान है, अमर फाइब्रोब्लास्ट या मानव प्राथमिक सीएएफ का उपयोग करके। फाइब्रोब्लास्ट पूर्व-इलाज सेल संस्कृति प्लेटों में सुसंस्कृत हैं और एस्कोबिक एसिड उत्तेजना के तहत उगाए जाते हैं। फिर, फाइब्रोब्लास्ट हटा दिए जाते हैं और आगे सेल सीडिंग के लिए मैटिस अवरुद्ध हो जाते हैं। इस ईसीएम मॉडल में, फाइब्रोब्लास्ट को विभिन्न प्रकार के मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए सक्रिय या संशोधित किया जा सकता है, जिनके प्रभावों का अध्ययन सेल संस्कृति में किया जा सकता है। 3डी मैट्रिस को सेल सिग्नल्स द्वारा भी आकार दिया जाता है, जैसे क्षरण या क्रॉस-लिंकिंग एंजाइम जो फाइबर वितरण को संशोधित कर सकते हैं। इस संदर्भ में, एंजियोजेनेसिस का अध्ययन किया जा सकता है, साथ ही अन्य सेल प्रकारजैसे एपिथेलियल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ।

Introduction

एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) सभी प्रकार के ऊतकों में मौजूद एक गतिशील संरचना है। इसमें प्रोटीन और पॉलीसैकराइड होते हैं जो सेल आसंजन, प्रवास और संचार1के लिए महत्वपूर्ण फाइबर का जाल बनाते हैं। ईसीएम संरचना ऊतक के आधार पर भिन्न होती है। जबकि टाइप-आई कोलेजन सबसे प्रचलित संरचनात्मक प्रोटीन है, कोलेजन प्रकार द्वितीय, III, वी और ग्यारहवीं भी विभिन्नऊतकों2 में पाया जा सकता है । सेल आसंजन2के लिए फाइब्रोब्लास्ट द्वारा उत्पन्न फाइब्रोनेक्टिन की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, इलास्टिन, लेमिनिन और सतह रिसेप्टर्स जैसे अन्य संरचनात्मक अणु हैं जिन्हें इंटीग्रिन कहा जाता है जो फाइबर असेंबली में मध्यस्थता करते हैं और विभिन्न ईसीएम ऊतकों के लिए विशिष्टहैं। ईसीएम सेल पाड़ के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और इसे शारीरिक और रोग दोनों प्रक्रियाओं में भी शामिल किया जा सकता है1। ईसीएम में असामान्यताएं कैंसर जैसी विकृतियों में देखी जाती हैं, जो ईसीएम संरचना और/या उसके संगठन को बदल देता है । ट्यूमर में, ईसीएम ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (टीएमई) के गैर-सेलुलर घटक का प्रतिनिधित्व करता है, जो सेल घटकों जैसे फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिकेट्स और घुलनशील कारकों की एक किस्म का एक जटिल परिवेश है। यह ज्ञात है कि TME कैंसर प्रगति और मेटास्तासिस को बढ़ावा देता है; कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट, ट्यूमर स्ट्रोमा में एक प्रमुख सेल प्रकार के रूप में, इसप्रक्रिया3 में भाग ले . सामान्य फाइब्रोब्लास्ट के विपरीत, सीएएफ स्थायी सक्रियण में हैं, जिसमें ईसीएम प्रोटीन और विकास कारकों (उदाहरण के लिए, विकास कारक-ट्रांसफॉर्मेशन- टीजीएफ-ए) के साथ-साथ कुछ मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति दिखाई देती है, जैसे कि α-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) और फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन प्रोटीन (एफएपी)4। हालांकि, सीएएफ एक विषम कोशिका आबादी है, जिसमें सक्रियण या मार्कर अभिव्यक्ति5के विभिन्न स्तर दिखाई देते हैं। यह तब माना जा सकता है कि फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न मैट्रिस की संरचना और संरचना फाइब्रोब्लास्ट स्थिति और विशेषताओं पर निर्भर करेगी।

इस संदर्भ में, इस पद्धति का लक्ष्य वीवो ईसीएम सेटिंग में फाइब्रोब्लास्ट द्वारा ईसीएम पीढ़ी के लिए एक उपयुक्त इन विट्रो मॉडल स्थापित करना है। हम ईसीएम द्वारा मध्यस्थता किए गए कीमोरेज या माइग्रेशन जैसे ट्यूमर सेल कार्यों के आगे के अध्ययन के लिए इन विट्रो ट्रांसलेशनल पद्धति के रूप में इस दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। जैसा कि हमारे समूह ने कहीं और प्रकाशित किया है, सीएएफ ताजा ऊतक नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संस्कृति में सीएएफ का अस्तित्व सीमित है और उनके सेल मार्ग संख्या6कम हो जाती है। इसके अलावा, रोगियों के नमूनों से स्थापित सीएएफ प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग मैट्रिक्स पीढ़ी के लिए किया जा सकता है। फाइब्रोब्लास्ट में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर मैट्रिक्स संरचना, फाइबर अभिविन्यास आदि पर संभावित प्रभावों का आकलन करने के लिए विभिन्न इन विट्रो मैट्रिस का उत्पादन करने का एक दिलचस्प तरीका भी है। इन पंक्तियों के साथ, हमारे समूह ने हाल ही में विभिन्न व्युत्पन्न मैट्रिस7की संरचना और फाइबर अभिविन्यास में घोंघा-व्यक्त फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका की सूचना दी है।

इसके अलावा, सीएएफ और ईसीएम वेस्कुलर सिस्टम में शामिल हैं, दोनों पोत उत्पादन में और फूलदान बाहरी परत8के हिस्से के रूप में । ईसीएम रीमॉडलिंग एंजियोजेनेसिस को प्रेरित करती है; मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीन्स (एमएमपी) इस प्रक्रिया9,10में योगदान करने वाले सबसे महत्वपूर्ण एंजाइम प्रकार लगते हैं । प्राथमिक कोशिकाओं का ऊतक संवहनी जो ईसीएम, ईसीएम मैक्रोमॉलिक्यूल्स, ईसीएम में शामिल अवशिष्ट विकास कारक, मैट्रिक्स लोच और मैट्रिक्स मोटाई को एंडोथेलियल सेल एक्टिवेशन11में शामिल कारकों के रूप में वर्णित किया गया है। ट्यूमर में, हाइपोक्सिया ईसीएम कठोरता और एंडोथेलियल स्प्राउट जेनरेशन12को बढ़ाता है। इसके अलावा, सीएएफ वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) और प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक (पीडीजीएफ) को स्रावित करते हैं जो ट्यूमर स्ट्रोमा13में एंजियोजेनेसिस को उत्तेजित करते हैं। इस क्षेत्र में, इन विट्रो मैट्रिक्स पीढ़ी का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में एंजियोजेनेसिस प्रक्रियाओं या एमएमपी कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, वीवो मैट्रिक्स में सबसे अनुरूप का इन विट्रो प्रजनन एंजियोजेनेसिस या माइक्रो-एनवायरमेंटल सेल इंटरैक्शन में ईसीएम की भूमिका की जांच करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है।

मैट्रिक्स जमाव को बढ़ाने और ईसीएम उत्पन्न करने के लिए एस्कोबिक एसिड के साथ सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट की उत्तेजना वीवो मैट्रिस में अनुरूप उत्पादन का एक स्वीकार्य तरीका है। अमर फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनें आसानी से सुसंस्कृत हैं और पीडीजीएफ-बीबी, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफ-α) या टीजीएफ-एग्नेस14जैसे विविध विकास कारकों द्वारा सक्रिय होती हैं। टीएमई के भीतर, सीएएफ ईसीएम4के मुख्य घटकों के रूप में टाइप-आई कोलेजन और फाइब्रोनेक्टिन का संश्लेषण करता है। इसी तरह, ये घटक इन विट्रो-जनित फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न मैट्रिस(चित्रा 1)के प्रमुख घटकों के रूप में पाए जाते हैं।

वीवो ईसीएम में अनुकरण करने के लिए अलग-अलग इन विट्रो पद्धतियों हैं। ईसीएम फाइबर के मिश्रण के साथ लेपित संस्कृति व्यंजनों का उपयोग पिछले वर्षों में बढ़ाया गया था, लेकिन इस 2डी दृष्टिकोण को 3 डी संरचनाओं में सुधार की आवश्यकता थी, जैसे क्रॉस-लिंक्ड जैल (जैसे, मैट्रीगेल)1। मैट्रिक्स की तरह सेटअप 3 डी मैट्रिक्स का अनुकरण करने के लिए मानक विधि बन गया है। मैट्रिस पैदा करते समय फिब्रिन भी एक विकल्प है लेकिन ईसीएम1की ताकत और स्थायित्व के मामले में विफल रहता है । अन्य ईसीएम घटकों के संयोजन में उपयोग किए जाने वाले कोलेजन कुछ उपरोक्त मुद्दों में संशोधन करता है। हालांकि, ये कोलेजन जैल फाइबर के साथ एक मजबूत नेटवर्क बनाते हैं जो उन्मुख हो सकते हैं, लेकिन अत्यधिक विषम होते हैं, जो प्रयोग पुनरावृत्ति1में एक समस्या हो सकती है। फिर भी, यह माना जाना चाहिए कि, प्रयोगों के उद्देश्य के आधार पर, मैट्रिक्स संकुचन अध्ययन में मैट्रिक्स संकुचन अध्ययन में मैट्रिक्स संकुचन का उपयोग अधिक उपयुक्त है(उदाहरण के लिए, जिसमें जेल संकुचन का आसानी से पता लगाया जा सकता है)।

उत्पन्न मैट्रिस की संभावित इम्यूनोजेनिकिटी कुछ सेल प्रकारों के साथ प्रयोगों में एक मुद्दा हो सकता है। इसलिए, हमारी विधि का उपयोग करते समय ईसीएम पैदा करने वाली कोशिकाओं के कारण प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की संभावना को कम करने के लिए, मैट्रिस को विसेल्यूशिना और धोया जाता है, हालांकि सेल टुकड़ा हटाने कुल15नहीं हो सकता है। आदर्श ईसीएम को सेल संस्कृति के साथ संगत होने और सेल संकेतों के संवाद और प्रतिक्रिया करने में सक्षम होने की आवश्यकता है। हमारी प्रक्रिया ईसीएम उत्पादन के दौरान बिना किसी कठिनाई के परिवर्तनों की शुरूआत की अनुमति देती है (उदाहरण के लिए, फाइब्रोब्लास्ट-उत्तेजक विकास कारकों को जोड़ना)।

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Protocol

मानव ऊतक के नमूने अस्पताल रामोन वाई काजल, मैड्रिड के अनुसंधान नैतिकता बोर्ड के अनुमोदन से प्राप्त किए गए थे।

1. समाधान की तैयारी

  1. 0.2% जिलेटिन समाधान तैयार करें: पीबीएस के 500 मीटर में जिलेटिन का 1 ग्राम जोड़ें। घोल को ऑटोक्लेव करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। उपयोग से पहले 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
  2. 1% ग्लूटाराल्डिहाइड तैयार करें: पीबीएस के 24 मिलील में 25% ग्लूटाराल्डिहाइड स्टॉक समाधान का 1 एल जोड़ें। उपयोग से पहले 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
  3. 1 एम इथेनॉलमाइन तैयार करें: उपयोग से पहले 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ एच2ओ फ़िल्टर के साथ इथेनॉलमाइन समाधान तैयार करें।
    नोट:जैसे ही इथेनॉलमाइन को सुरक्षा टोपी प्रदान की जाती है, सुई और सिरिंज की आवश्यकता होगी।
  4. एस्कोम्बिक एसिड तैयार करें: मीडियम के 100 मिलील में 50 एमजी/एमएल स्टॉक सॉल्यूशन एस्कोम्बिक एसिड (लाइट सेंसिटिव) का 0.1 मिलील डालें।
  5. लिसिस बफर तैयार करें: एनएच4ओह के 20 एनएम के साथ पीबीएस 0.5% ट्राइटन 100X तैयार करें। उपयोग से ठीक पहले एनएच4ओह जोड़ें।
  6. पीबीएस पेन/स्ट्रीप तैयार करें: तनु पेन/स्ट्रीप स्टॉक सॉल्यूशन टू १०० यू/एमएल पेन और १०० μg/mL स्ट्रीप ।
  7. 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम तैयार करें: डीएमईएम के 500 एमएल में 10% एफबीएस जोड़ें। १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, ०.१ मिलीग्राम/mL नॉर्मोसिन और ०.२५ μg/mL एम्फोटेरिसिन बी के साथ पूरक ।
  8. 2% बीएसए हीट डिनेनेल्ड तैयार करें: बाँझ पानी के 100 मीटर में बीएसए के 2 ग्राम जोड़ें। 7 मिन के लिए उबलते पानी में गर्म।
  9. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एफबीएस तैयार करें: २०० यू/एमएल पेनिसिलिन, २०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, १०० μg/mL gentamicin और २.५ जी/mL एम्फोटेरिसिन बी के साथ एफबीएस की खुराक ।

2. सेल संस्कृति तैयारी

  1. अमर फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन
    1. संस्कृति पुनः संयोजन टेलोमेराज ट्रांससंक्रमित मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (बीजे-hTERT, ATCC CRL-4001) DMEM में 10% एफबीएस के साथ और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर बनाए रखें ।
  2. एंडोथेलियल कोशिकाएं
    1. ईबीएम-2 माध्यम में संस्कृति मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी, एटीसीसी पीसीएस-100-013) जिसमें 2% एफबीएस युक्त हैं और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर बनाए रखें।
  3. फाइब्रोब्लास्ट प्राथमिक संस्कृति
    नोट:सीएएफ स्थापना और संस्कृति के लिए, हमारे समूह द्वारा पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल6का पालन किया गया था ।
    1. संक्षेप में, लगभग 2-3 मिमी3 के छोटे टुकड़ों में ऊतक के नमूनों में कटौती और एंटीबायोटिक दवाओं की उच्च एकाग्रता के साथ एफबीएस में बीज।
    2. जब पहला फाइब्रोब्लास्ट दिखाई दिया, तो सेल रखरखाव के लिए एफबीएम माध्यम के साथ मध्यम को बदलें।
      नोट:ऊतक मूल के आधार पर, सेल संस्कृतियों को आसानी से दूषित किया जा सकता है। अत्यधिक दूषित ऊतक (जैसे, कोलन6)के साथ एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पीबीएस में नमूने धोएं और 30-45 मिन के लिए हिलाएं।

3. फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न 3डी मैट्रिस (कास्टेलो-क्रोस और क्यूकिरमैन16से अनुकूलित)

  1. 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.2% जिलेटिन समाधान का 2 एल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. एस्पिरेट जिलेटिन और पीबीएस के 2 mL में धो लें।
  3. आरटी में 30 मिन के लिए 1% ग्लूटाराल्डिहाइड और इनक्यूबेट के 2 mL जोड़ें ग्लूटाराल्डिहाइड क्रॉस-लिंक जिलेटिन होगा।
  4. एस्पिरेट ग्लूटाराल्डिहाइड और 5 मिन के लिए पीबीएस के 2 mL में कुओं को धोएं। 3 बार दोहराएं।
  5. आरटी में 30 मिन के लिए 1 एम इथेनामाइन और इनक्यूबेट के 2 एम एल जोड़ें। इथेनमाइन शेष ग्लूटाराल्डिहाइड को ब्लॉक करने के लिए कार्य करेगा।
  6. एस्पिरेट इथेनॉलमाइन और 5 मिन के लिए पीबीएस के 2 mL में कुओं को धोएं। 3 बार दोहराएं।
  7. 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम का 1 एमएल जोड़ें। यदि माध्यम तुरंत गुलाबी हो जाता है, तो माध्यम को हटा दें, पीबीएस के 2 एमएल में धोएं और 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 1 mL को फिर से जोड़ें।
  8. फाइब्रोब्लास्ट निलंबन का बीज 1 एमएल, प्रत्येक कुएं में 5 x 105 कोशिकाओं के साथ। प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा 2 मीटर होगी।
  9. संस्कृति कोशिकाओं को जब तक 100% संगम तक पहुंच जाता है। फिर माध्यम को हटा दें और डीएमईएम के साथ 10% एफबीएस के साथ 50 μg/mL ascorbic एसिड और अतिरिक्त उपचार के साथ यदि इस्तेमाल किया जाता है।
  10. 6 दिनों के लिए हर 2 दिन में 10% एफबीएस और 50 μg/mL एस्कोम्बिक एसिड के साथ ताजा डीएमईएम के साथ मध्यम को बदलें।
    नोट:यदि अतिरिक्त उपचार का उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, पीडीजीएफ-बीबी, टीजीएफ-एऔर/या अन्य बढ़ने वाले कारक), उन्हें उतने ही दिन जोड़ें जैसे एकोबिक एसिड उपचार जोड़ा जाता है।
  11. पिछले एस्कोकएसिड उपचार के दो दिन बाद, माध्यम को हटा दें और पीबीएस के 2 एमएल में धो लें।
  12. धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में लिसिस बफर का 1 एल, 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म जोड़ें। आरटी में 5-10 मिन के लिए इनक्यूबेट जब तक फाइब्रोब्लास्ट (माइक्रोस्कोप के तहत नमूदार) हैं।
  13. ध्यान से और lysis बफर को हटाने के बिना, PBS के 2 mL जोड़ें । फिर पीबीएस के लगभग 2.5 mL aspirate. कुल तीन वॉश के लिए दो बार दोहराएं।
  14. अंततः, पीबीएस के २.५ mL को हटा दें और पेन/स्ट्रीप (१०० यू/एमएल और १०० μg/mL, क्रमशः) के साथ पीबीएस के 2 mL जोड़ें । फिल्म के साथ सील करें और 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट:प्रयोग के आधार पर, उत्पन्न मैट्रिस के दीर्घकालिक भंडारण परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। हम जितनी जल्दी हो सके मैट्रिस का उपयोग करने की सलाह देते हैं, और इससे भी अधिक यदि प्रयोग में संभावित प्रोटीन क्षरण के कारण सेल सीडिंग शामिल है। यदि मैट्रिस का उपयोग संरचनात्मक परखों के लिए किया जाता है, जैसे कोलेजन अवलोकन, मैट्रिस को लंबी अवधि के लिए तय किया जा सकता है और संग्रहीत किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल 6-वेल कल्चर प्लेट के लिए इंगित किया गया है। अन्य प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रतिक्रियाशील खंडों और सेल निलंबन एकाग्रता को अच्छी तरह से क्षेत्र के अनुसार पुनर्गणना करने की आवश्यकता है।

4. ट्यूब गठन परख

  1. अधिकतम संगम तक ईबीएम-2 2% एफबीएस में HUVEC कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  2. 8 घंटे के लिए FBS के बिना ईबीएम-2 के साथ मध्यम की जगह ।
  3. सीडिंग कोशिकाओं से पहले मैट्रिस तैयार करें।
    1. रेफ्रिजरेटर से मैट्रिस निकालें और आरटी में 1 घंटे के लिए जगह है ।
    2. हीट-डिनेडेव 2% बीएसए के 2 मिलील जोड़कर मैट्रिस ब्लॉक करें। इनक्यूबेट 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. एस्पिरेट बीएसए और पीबीएस के 2 एमएल में धोलें।
  4. बीज 2 x 105 HUVEC कोशिकाओं FBS में समाप्त माध्यम एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं पर पहले 3 डी फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न मैट्रिस के साथ लेपित ।
  5. 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एंडोथेलियल कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. 20-40x आवर्धन पर एक मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत ट्यूब की तरह संरचना गठन की जांच करें।

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Representative Results

पीडीजीएफ-बीबी उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट एक मोटा ईसीएम बनाते हैं। हेरेरा एट अल ने दिखाया कि कैसे पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट ने मोटा मैट्रिक्स के साथ-साथ उच्च फाइबर ओरिएंटेशन7उत्पन्न किया। बीजे-एचसीआरटी फाइब्रोब्लास्ट को पीडीजीएफ के साथ या उसके बिना इनक्यूबेटेड किया गया था और प्रतिनिधि क्षेत्रों में पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट(चित्रा 1ए)द्वारा उत्पादित मैट्रिस में अधिक गठबंधन सेल वितरण दिखाया गया था। कोलेजन I और फाइब्रोनेक्टिन प्रोटीन अभिव्यक्ति PDGF-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट(चित्र 1बी)से प्राप्त मैट्रिस में वृद्धि हुई थी और इसके परिणामस्वरूप मैट्रिक्स की मोटाई बढ़ गई थी(चित्रा 1सी)। इसके अलावा, कोलेजन मैं और फाइब्रोनेक्टिन समानांतर पैटर्न दिखाते हैं, जैसा कि दिशात्मकता हिस्टोग्राम(चित्रा 1डी)में दिखाया गया है।

पीडीजीएफ-बीबी-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त 3डी मैट्रिस एंडोथेलियल कोशिकाओं में ट्यूबलोजेनेसिस को प्रेरित करते हैं। HUVEC कोशिकाओं को पीडीजीएफ-उत्तेजित या गैर-उत्तेजित बीजे-एचसीआरटी फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त विसेलुलर मैट्रिस पर वरीयता प्राप्त की गई थी। पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट द्वारा उत्पन्न मैट्रिस पर वरीयता प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं ने गैर-उत्तेजित परिस्थितियों(चित्रा 2)की तुलना में अधिक केशिका जैसी संरचनाएं दिखाईं।

Figure 1
चित्रा 1: पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट मोटा और एनिसोट्रोपिक ईसीएम बढ़ाते हैं। (A)बीजेड-एचसीआरटी फाइब्रोब्लास्ट के सेलुलर ओरिएंटेशन के बाइनरी इमेज प्रतिनिधि का इलाज किया गया है या पीडीजीएफ-बीबी (ऊपर) और दिशात्मक हिस्टोग्राम (नीचे) के साथ नहीं किया गया है, जो सेल कोणों के वितरण की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है (0 डिग्री कोण पर केंद्रित)। (ख)ईसीएम से प्राप्त पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट में एक्स्सेल्युलर प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन I की प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि । (ग)पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त ईसीएम में ईसीएम मोटाई में वृद्धि । (घ)प्रोटीन में वृद्धि और एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन जैसे फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन I के संगठन में पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट में ईसीएम से प्राप्त होता है । नीचे, दिशात्मकता हिस्टोग्राम। * पी एंड एलटी; 0.05; पी एंड एलटी; 0.001। हेरेरा एट अल.7से अनुकूलितइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट एंडोथेलियल सेल सक्रियण को बढ़ावा देता है, जिसे पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त मैट्रिस पर केशिका जैसी संरचनाओं के गठन द्वारा मनाया गया था। इमेजजे के "कण विश्लेषण" उपकरण ने गैर-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट से मैट्रिस पर वरीयता प्राप्त लोगों के बारे में पीडीजीएफ-उत्तेजित फाइब्रोब्लास्ट से मैट्रिस पर वरीयता प्राप्त HUVECs में 1.81 की वृद्धि दर दिखाई। हेरेरा एट अल.7से अनुकूलितइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मैट्रिस को अमर फाइब्रोब्लास्ट या प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों के साथ उत्पन्न किया जा सकता है। फाइब्रोब्लास्ट उच्च विकास दर और तनाव प्रतिरोध के साथ इन विट्रो संस्कृति में बनाए रखना आसान है। वे भी पोस्टमार्टम ऊतक3से अलग किया जा सकता है, हालांकि संदूषण एक प्रतिबंध हो सकता है, ऊतक मूल के आधार पर ।

यहां 3डी मैट्रिक्स मॉडल ईसीएम संरचना और फाइबर अभिविन्यास का सफलतापूर्वक अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास और प्रभावी प्रणाली प्रदान करता है। यह फाइब्रोब्लास्ट एक्टिवेशन स्टेटस, जीन/प्रोटीन एक्सप्रेशन, अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत आदि के विश्लेषणों के लिए भी उपयुक्त है । यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि रोगियों से फाइब्रोब्लास्ट के साथ उत्पन्न मैट्रिस ट्यूमर में स्ट्रोमा से संबंधित तंत्र का व्यक्तिगत अध्ययन संभव बनाते हैं। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण को कीमो-प्रतिरोध के अध्ययन ों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें ईसीएम की महत्वपूर्ण भूमिका है। अध्ययन के इस प्रकार के अनुवाद नैदानिक अभ्यास में रोगियों के इलाज के लिए निर्णय लेने में सहायता कर सकता है, व्यक्तिगत चिकित्सा को लागू करने ।

भले ही 3डी-मैट्रिक्स प्रोटोकॉल थकाऊ हो सकता है, लेकिन निर्देशों का पालन करके दिलचस्प परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई धोने के चरणों की आवश्यकता होती है, इसलिए मैट्रिक्स क्षति से बचना आवश्यक है। इसके अलावा, हम अनुशंसा करते हैं कि जब इस प्रोटोकॉल के साथ विभिन्न सेल संस्कृति शर्तों का परीक्षण किया जाता है, तो प्रयोगों के दौरान होने वाले न्यूनतम मतभेदों के कारण एक ही समय में मैटिस उत्पन्न किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, सीडिंग करते समय एक ही फाइब्रोब्लास्ट निलंबन का उपयोग करना पूर्व इलाज प्लेटें) ।

अन्य टिश्यू-इंजीनियरिंग विधियां विकसित की जा रही हैं, लेकिन मानव उपयोग के लिए संगत ईसीएम और ऊतक ों को बनाने के लिए नसबंदी जैसे अतिरिक्त कदमों की जरूरत है । हालांकि नई प्रौद्योगिकियां उत्पन्न हो रही हैं, वे महंगी हो सकती हैं और मानक प्रयोगशाला सुविधाओं के अनुकूल होना मुश्किल हो सकता है । रोगियों से प्राप्त प्राथमिक सीएएफ का उपयोग विभिन्न उपचारों का परीक्षण करने के लिए "व्यक्तिगत मैट्रिस" उत्पन्न करना संभव बनाता है। इस लाइन के साथ, हमारा समूह इस पद्धति का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए कर रहा है कि सीएएफ द्वारा उत्पन्न मैट्रिस एनएफ द्वारा उत्पन्न लोगों के लिए अलग हैं, जो मोटा और अधिक संगठित मैट्रिस7दिखाते हैं। हमने बताया है कि एंडोथेलियल कोशिकाओं से प्राप्त केशिका जैसी संरचनाएं फाइब्रोब्लास्ट घोंघा 1 अभिव्यक्ति पर निर्भर हैं, और सीएएफ-व्युत्पन्न मैट्रिस पर उस प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए भविष्य के अध्ययन हैं।

ईसीएम आगे के अध्ययन की आवश्यकता है इससे पहले कि हम अंतर्निहित कीमोथेरेपी प्रतिरोध या ट्यूमर पतन के लिए जिंमेदार तंत्र समझ सकते हैं । इसलिए, हम कैंसर रोगी ऊतकों से सीएएफ-व्युत्पन्न मैट्रिस के उपयोग को कैंसर कोशिकाओं या अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ कैंसर और ईसीएम संचार में माइक्रोएनवायरमेंटल व्यवहार की जांच करने की प्रक्रिया के रूप में सुझाते हैं।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल के विकास को PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 और RD12/0036/0041 द्वारा इंस्टीटो डी Salud कार्लोस III से समर्थित किया गया था; फोडो यूरोपो डी डेसररोलो क्षेत्रीय (फेडर) द्वारा; "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 और CB16/12/00446 द्वारा, इंस्टीटो डी Salud कार्लोस III-FEDER से; और Fundación Científica AECC (अग्नाशय के कैंसर को लक्षित करने के लिए एक बहुआयामी दृष्टिकोण) द्वारा। क्रिस्टीना पेना इंस्टीटो डी सलूद कार्लोस III से मिगुएल सर्व्ट अनुबंध की प्राप्तकर्ता हैं। एम Eaude अंग्रेजी पाठ के साथ मदद की । हम इस शोध के दौरान मदद और सलाह के लिए प्रयोगशाला सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium hydroxide (NH4OH) Roth A990.1
Amphotericin-B Corning 30-003-CF
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7906-50G
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-014-CVR
Endothelial Basal Medium (EBM) Lonza CC-3121 add supplements before use
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) Lonza CC-4176
Ethanolamine Sigma 411000-100ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest S181B-500 heat-inactivated before use
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) Lonza CC-3131 add supplements before use
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) Lonza CC-4126
Gelatin from bovine skin Sigma G9391-100G
Glutaraldehyde Sigma g5882
L-Ascorbic Acid Sigma A92902-100G light sensitive
L-Glutamine Lonza BE17-605E
Normocin Invivogen 3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CVR
Triton X100 Roth 3051
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) ATCC ATCC CRL-4001
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) ATCC PCS-100-013

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 154 ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स फाइब्रोब्लास्ट कोलेजन नियोएंजियोजेनेसिस
एंडोथेलियल ट्यूब फॉर्मेशन परख पर लागू फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न 3डी मैट्रिक्स सिस्टम
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Galindo-Pumariño, C., Herrera, A., Muñoz, A., Carrato, A., Herrera, M., Peña, C. Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay. J. Vis. Exp. (154), e60304, doi:10.3791/60304 (2019).

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