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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Sistema de matriz 3D derivado de fibroblastos aplicable al ensayo de formación de tubos endoteliales

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60304
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 1
1Medical Oncology Department, Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS), CIBERONC, 2Department of Medical Oncology, Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Universidad Autónoma de Madrid, CIBERONC, 4Department of Oncology & Pathology, Karolinska Institutet

Summary

El objetivo de este método es obtener matrices 3D derivadas de fibroblastos como un andamio natural para ensayos celulares posteriores. Los fibroblastos se sembran en una placa de cultivo pretratada y se estimulan con ácido ascórbico para la generación de matrices. Las matrices se descelularizan y se bloquean para cultivar células relevantes (por ejemplo, células endoteliales).

Abstract

La matriz extracelular (ECM) es un andamio tridimensional que actúa como el principal soporte para las células en los tejidos. Además de su función estructural, el ECM también participa en la migración celular, la proliferación y la diferenciación. Los fibroblastos son el principal tipo de células que modifican la disposición y producción de fibra ECM. En el cáncer, los CAC (fibroblastos asociados al cáncer) están en estado de activación permanente, participando en la remodelación de ECM, facilitando la migración de células tumorales y estimulando la angiogénesis asociada a tumores, entre otros roles protumoraligénicos. El objetivo de este método es crear una matriz tridimensional con una composición de fibra similar a las matrices in vivo, utilizando fibroblastos inmortalizados o CAC primarios humanos. Los fibroblastos se cultivan en placas de cultivo celular pretratadas y se cultivan bajo estimulación de ácido ascórbico. Luego, se eliminan los fibroblastos y las matrices se bloquean para una mayor sembración celular. En este modelo ECM, los fibroblastos se pueden activar o modificar para generar diferentes tipos de matriz, cuyos efectos se pueden estudiar en el cultivo celular. Las matrices 3D también están formadas por señales celulares, como la degradación o enzimas reticuladas que podrían modificar la distribución de fibra. En este contexto, se puede estudiar la angiogénesis, junto con otros tipos de células como las células tumorales epiteliales.

Introduction

La matriz extracelular (ECM) es una estructura dinámica presente en todos los tipos de tejido. Consiste en proteínas y polisacáridos que crean una red de fibras cruciales para la adhesión celular, migración y comunicación1. La composición de ECM varía dependiendo del tejido. Mientras que el colágeno tipo I es la proteína estructural más prevalente, los tipos de colágeno II, III, V y XI también se pueden encontrar en varios tejidos2. La fibronectina generada por los fibroblastos es necesaria para la adhesión celular2. Además, hay otras moléculas estructurales como los receptores de elastina, laminina y superficie llamados integrinas que median el ensamblaje de fibra y son específicas de los diferentes tejidos ECM2. El ECM desempeña un papel importante como andamio celular y también puede participar en procesos fisiológicos y patológicos1. Las anomalías en el ECM se observan en patologías como el cáncer, que altera la composición del ECM y/o su organización. En los tumores, el ECM representa el componente no celular del microambiente tumoral (TME), un entorno complejo de componentes celulares como fibroblastos, células inmunitarias, células endoteliales, pericitas y una variedad de factores solubles. Se sabe que el TME promueve la progresión del cáncer y la metástasis; los fibroblastos asociados al cáncer, como tipo de célula predominante en el estroma tumoral, participan en este proceso3. A diferencia de los fibroblastos normales, los HCA están en activación permanente, mostrando una mayor secreción de proteínas ECM y factores de crecimiento (por ejemplo, Transformación del Factor de Crecimiento, TGF-, o), así como una expresión más alta de algunos marcadores, como la actina muscular lisa (-SMA) y la proteína de activación de fibroblastos (FAP)4. Sin embargo, los CAC son una población de células heterogéneas, que muestra diferentes niveles de activación o expresión de marcador5. Se puede suponer entonces que la composición y la estructura de las matrices derivadas de fibroblastos dependerádel del estado y las características de los fibroblastos.

En este contexto, el objetivo de esta metodología es establecer un modelo in vitro adecuado para la generación de ECM por fibroblastos equivalentes al entorno in vivo de ECM. Proponemos este enfoque como una metodología traslacional in vitro para estudios posteriores de las funciones de las células tumorales, como la quimiorresistencia o la migración, mediada por ECM. Como nuestro grupo ha publicado en otros lugares, los CAC se pueden obtener a partir de muestras de tejido fresco, pero hay que tener en cuenta que la supervivencia de los CAC en el cultivo es limitada y su número de paso celular se reduce6. Además, los cultivos primarios caf a partir de las muestras de los pacientes se pueden utilizar para la generación de matrices. La manipulación de la expresión génica en fibroblastos es también una forma interesante de producir matrices in vitro variadas para evaluar los posibles efectos en la composición de la matriz, la orientación de la fibra, etc. En esta línea, nuestro grupo ha informado recientemente del papel de los fibroblastos que expresan caracoles en la composición y orientación de fibra de varias matrices derivadas7.

Además, los COF y los ECM participan en el sistema vascular, tanto en la generación de vasos como como parte de la capa exterior del jarrón8. La remodelación de ECM induce angiogénesis; matriz metaloproteinasas (MMP) parecen ser el tipo de enzima más importante que contribuye a este proceso9,10. La vascularización tisular de las células primarias que generan los ECM, las macromoléculas ECM, los factores de crecimiento residuales incluidos en el ECM, la elasticidad de la matriz y el grosor de la matriz se describen como factores implicados en la activación de células endoteliales11. En los tumores, la hipoxia aumenta la rigidez de la ECM y la generación de brotes endoteliales12. Por otra parte, los CAF secretan factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que estimulan la angiogénesis en la estromacomercial tumoral13. En este campo, la generación de matriz in vitro podría utilizarse para estudiar los procesos de angiogénesis o la acción de MMP en diferentes condiciones experimentales. Por lo tanto, la reproducción in vitro de la matriz in vivo más análoga podría ser una herramienta valiosa para investigar el papel de la ECM en la angiogénesis o las interacciones celulares microambientales.

La estimulación de fibroblastos cultivados con ácido ascórbico para mejorar la deposición de la matriz y generar un ECM es una forma aceptada de producir matrices in vivo análogas. Las líneas celulares de fibroblastos inmortalizadas se cultivan fácilmente y se activan por diversos factores de crecimiento, como PDGF-BB, Factor de necrosis tumoral (TNF-- ) oTGF-14. Dentro del TME, los CAC sintetizan colágeno tipo I y fibronectina como los principales componentes de ECM4. Del mismo modo, estos componentes se encuentran como componentes principales de matrices derivadas de fibroblastos generadas in vitro(Figura 1).

Existen diferentes metodologías in vitro para simular ECM in vivo. El uso de platos de cultivo recubiertos con mezclas de fibras ECM se amplió en los últimos años, pero este enfoque 2D necesitaba mejorar las estructuras 3D, como los geles reticulados (por ejemplo, Matrigel)1. La configuración similar a Matrigel se ha convertido en el método estándar para simular una matriz 3D. La fibrina también es una alternativa a la hora de generar matrices, pero falla en términos de resistencia y durabilidad del ECM1. El colágeno utilizado en combinación con otros componentes de ECM modifica algunos de los problemas antes mencionados. Sin embargo, estos geles de colágeno forman una red fuerte con fibras que pueden ser orientadas, pero son altamente heterogéneas, lo que puede ser un problema en las repeticiones de experimentos1. No obstante, debe presumirse que, dependiendo del objetivo de los experimentos, el uso de Matrigel u otros hidrogeles es más adecuado (por ejemplo, en estudios de contracción de matrices en los que se puede detectar fácilmente la contracción del gel).

La inmunogenicidad potencial de las matrices generadas podría ser un problema en experimentos con algunos tipos de células. Por lo tanto, para reducir la posibilidad de respuestas inmunitarias debido a las células generadoras de ECM al utilizar nuestro método, las matrices se descelularizan y se lavan, aunque la eliminación de fragmentos de células no podría ser total15. El ECM ideal debe ser compatible con el cultivo celular y ser capaz de comunicarse y reaccionar a las señales celulares. Nuestro procedimiento permite la introducción de cambios sin dificultad durante la producción de ECM (por ejemplo, la adición de factores de crecimiento estimulantes de fibroblastos).

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Protocol

Las muestras de tejido humano se obtuvieron con la aprobación del Consejo de Ética de Investigación del Hospital Ramón y Cajal de Madrid.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparar 0,2% de solución de gelatina: añadir 1 g de gelatina a 500 ml de PBS. Autoclave la solución y mantener a 4 oC. Filtrar con un filtro de 0,22 m antes de su uso.
  2. Preparar 1% glutaraldehyde: Añadir 1 ml de 25% de solución de stock de glutaraldehyde a 24 ml de PBS. Filtrar con un filtro de 0,22 m antes de su uso.
  3. Preparar 1 M de etanolamina: preparar la solución de etanolamina con un filtro estéril H2O. con un filtro de 0,22 m antes de su uso.
    NOTA: Como la etanolamina se proporciona con una tapa de seguridad, se necesitará una aguja y una jeringa.
  4. Preparar ácido ascórbico: añadir 0,1 ml de 50 mg/ml de solución de ascórbico (sensible a la luz) a 100 ml de medio.
  5. Prepare el tampón de lisis: prepare PBS 0.5% Triton 100X con 20 nM de NH4OH. Añadir NH4OH justo antes de su uso.
  6. Preparar PBS Pen/Strep: diluir la solución de culata/estreplozante en 100 U/ml Pen y 100 g/mL Strep.
  7. Preparar DMEM con 10% FBS: Añadir 10% FBS a 500 mL de DMEM. Suplemento con 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 0,1 mg/ml de normocina y 0,25 g/ml de anfotericina B.
  8. Preparar 2% BSA calor desnaturalizado: añadir 2 g de BSA a 100 mL de agua estéril. Caliente en agua hirviendo durante 7 min.
  9. Preparar FBS con antibióticos: suplemento FBS con 200 U/ml de penicilina, 200 g/ml de estreptomicina, gentamicina de 100 g/ml y anfotericina B de 2,5 g/ml.

2. Preparación del cultivo celular

  1. Línea celular de fibroblastos inmortalizados
    1. Cultivo de telomerasa transcombinante transpulsada inmortalizada fibroblastos de prepucio (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) en DMEM con 10% FBS y mantener a 37 oC y 5% CO2.
  2. Células endoteliales
    1. Cultivo de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs, ATCC PCS-100-013) en un medio EBM-2 que contiene 2% de FBS y mantener a 37oC y 5% deCO2.
  3. Cultivo primario de fibroblastos
    NOTA: Para el establecimiento y la cultura de CAF, el protocolo publicado anteriormente por nuestro grupo fue seguido6.
    1. Brevemente, cortar muestras de tejido en pequeños trozos de aproximadamente 2-3 mm3 y semilla en FBS con alta concentración de antibióticos.
    2. Cuando aparecieron los primeros fibroblastos, sustituya el medio por el medio FBM para el mantenimiento celular.
      NOTA: Dependiendo del origen del tejido, los cultivos celulares pueden contaminarse fácilmente. Lavar las muestras en PBS suplementada con antibióticos, con tejido altamente contaminado (por ejemplo, colon6) y agitar durante 30-45 min.

3. Matrices 3D derivadas de fibroblastos (Adaptadas de Castelló-Cros y Cukierman16)

  1. Añadir 2 ml de solución de gelatina al 0,2% a cada pocal de una placa de 6 pocillos e incubar durante 1 h a 37oC o durante la noche a 4oC.
  2. Aspirar gelatina y lavarla en 2 ml de PBS.
  3. Añadir 2 mL de 1% glutaraldehído e incubar durante 30 min en RT. Glutaraldehyde cruzará la gelatina.
  4. Aspirar glutaraldehyde y lavar pozos en 2 mL de PBS durante 5 min. Repetir 3 veces.
  5. Añadir 2 mL de 1 M de etanolamina e incubar durante 30 min en RT. La etanolamina actuará para bloquear el glutaraldehído restante.
  6. Aspirar etanolamina y lavar pozos en 2 ml de PBS durante 5 min. Repetir 3 veces.
  7. Añadir 1 mL de DMEM con 10% FBS. Si el medio se vuelve inmediatamente rosado, retire el medio, lave en 2 ml de PBS y agregue de nuevo 1 ml de DMEM con 10% FBS.
  8. Semilla 1 mL de suspensión de fibroblastos, con 5 x 105 células en cada poca. El volumen total en cada pozo será de 2 ml.
  9. Células de cultivo hasta alcanzar el 100% de confluencia. A continuación, retire el medio y reemplácelo con DMEM con 10% de FBS con ácido ascórbico de 50 g/ml y tratamiento adicional si se utiliza.
  10. Sustituya el medio por DMEM fresco con un 10% de FBS y un ácido ascórbico de 50 g/ml cada 2 días durante 6 días.
    NOTA: Si se utiliza un tratamiento adicional (p. ej., PDGF-BB, TGF-o y/u otros factores de crecimiento), agréguelos los mismos días que se añade el tratamiento con ácido ascórbico.
  11. Dos días después del último tratamiento con ácido ascórbico, retire el medio y lave en 2 ml de PBS.
  12. Añadir lentamente 1 ml de tampón de lisis, precalentado a 37 oC, a cada poca. Incubar durante 5-10 minutos a RT hasta que los fibroblastos estén lysed (observable bajo el microscopio).
  13. Con cuidado y sin quitar el búfer de lisis, agregue 2 ml de PBS. A continuación, aspirar aproximadamente 2,5 ml de PBS. Repita dos veces durante un total de tres lavados.
  14. Finalmente, quite 2.5 mL de PBS y agregue 2 mL de PBS con Pen/Strep (100 U/mL y 100 g/mL, respectivamente). Sellar con película y mantener a 4 oC durante un máximo de 3 meses.
    NOTA: Dependiendo del experimento, el almacenamiento a largo plazo de las matrices generadas puede afectar a los resultados. Recomendamos el uso de matrices tan pronto como sea posible, y más aún si el experimento implica la sembración celular, debido a la posible degradación de las proteínas. Si las matrices se utilizan para ensayos estructurales, como la observación del colágeno, las matrices se pueden fijar y almacenar durante períodos más largos. Este protocolo está indicado para una placa de cultivo de 6 pocillos. Se pueden utilizar otras placas, pero los volúmenes reactivos y la concentración de la suspensión celular deben ser recalculados de acuerdo con el área del pozo.

4. Ensayo de formación de tubos

  1. Cultivar células HUVEC en EBM-2 2% FBS hasta la máxima confluencia.
  2. Reemplace el medio por EBM-2 sin FBS durante 8 h.
  3. Prepare matrices antes de sembrar las células.
    1. Retire las matrices del refrigerador y colóquelas durante 1 h en RT.
    2. Bloquee las matrices añadiendo 2 ml de 2% de BSA desnaturalizado por calor. Incubar 1 h a 37oC.
    3. Aspirar BSA y lavar en 2 mL de PBS.
  4. Semilla2 x 105 células HUVEC en medio agotado por FBS en cada pocal de una placa de 6 pocillos previamente recubierta con matrices derivadas de fibroblastos 3D.
  5. Incubar células endoteliales a 37oC durante 16 h.
  6. Examine la formación de estructuras similares a tubos bajo un microscopio de campo brillante estándar con un aumento de 20-40x.

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Representative Results

Los fibroblastos estimulados PDGF-BB crean un ECM más grueso. Herrera y otros. mostraron cómo los fibroblastos estimulados por PDGF generaron una matriz más gruesa, así como una mayor orientación de fibra7. Los fibroblastos de BJ-hTERT fueron incubados con o sin PDGF y las áreas representativas observadas mostraron una distribución celular más alineada en matrices producidas por fibroblastos estimulados por PDGF(Figura 1a). La expresión de colágeno I y de la proteína fibronectina se incrementó en matrices derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF(Figura 1b)y, en consecuencia, se aumentó el espesor de la matriz(Figura 1c). Además, el colágeno I y la fibronectina muestran patrones paralelos, como se muestra en histogramas de direccionalidad(Figura 1d).

Las matrices 3D derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF-BB inducen la tubulogénesis en las células endoteliales. Las células HUVEC se sembraron en matrices descelularizadas derivadas de fibroblastos BJ-hTERT estimulados por PDGF o no estimulados. Las células endoteliales sembradas en matrices generadas por fibroblastos estimulados por PDGF mostraron estructuras más capilares similares a las de las no estimuladas(Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Los fibroblastos estimulados por PDGF mejoran el ECM más grueso y anisotrópico. (A) Imágenes binarias representativas de la orientación celular de los fibroblastos BJ-hTERT tratados o no con histogramas PDGF-BB (arriba) y direccionalidad (abajo), que representan la frecuencia de distribución de los ángulos de celda (centrado en el ángulo de 0o). (B) Aumento de la expresión proteica de las proteínas extracelulares fibronectina y colágeno I en fibroblastos estimulados por PDGF derivados de ECM. (C) Aumento del espesor de la ECM en las ECM derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF. (D) Aumento de proteínas y organización de proteínas extracelulares como la fibronectina y el colágeno I en fibroblastos estimulados por PDGF derivados de ECM. A continuación, histogramas de direccionalidad. *p < 0.05; p < 0.001. Adaptado de Herrera et al.7Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los fibroblastos estimulados por PDGF promueven la activación de células endoteliales, que se observó mediante la formación de estructuras capilares en matrices derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF. La herramienta "Análisis de partículas" de ImageJ mostró una tasa de aumento de 1,81 en HUVECs sembradas en matrices de fibroblastos estimulados por PDGF con respecto a los sembrados en matrices de fibroblastos no estimulados. Adaptado de Herrera et al.7Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las matrices se pueden generar con fibroblastos inmortalizados o cultivos primarios de fibroblastos. Los fibroblastos son fáciles de mantener en cultivo in vitro con una alta tasa de crecimiento y resistencia al estrés. Incluso se pueden aislar del tejido post mortem3,aunque la contaminación podría ser una restricción, dependiendo del origen del tejido.

El modelo de matriz 3D aquí ofrece un sistema novedoso y eficaz para estudiar con éxito la composición de ECM y la orientación de la fibra. También es adecuado para los análisis del estado de activación de fibroblastos, expresión de genes/proteínas, interacciones con otros tipos de células, etc. Es importante destacar que las matrices generadas con fibroblastos de los pacientes hacen posible el estudio personalizado de los mecanismos relacionados con el estroma en los tumores. Por ejemplo, este enfoque se puede aplicar a estudios de quimio-resistencia, en los que el ECM tiene un papel importante. La traducción de este tipo de estudio podría ayudar en la toma de decisiones para el tratamiento de pacientes en la práctica clínica, implementando la medicina personalizada.

A pesar de que el protocolo de matriz 3D puede ser tedioso, se pueden lograr resultados interesantes siguiendo las instrucciones. Debe tenerse en cuenta que se necesitan varios pasos de lavado, por lo que evitar daños en la matriz es esencial. Además, recomendamos que cuando se prueben diferentes condiciones de cultivo celular con este protocolo, se generen matrices al mismo tiempo debido a las diferencias mínimas que pueden ocurrir durante los experimentos (por ejemplo, utilizando la misma suspensión de fibroblastos al sembrar placas pretratadas).

Se están desarrollando otros métodos de ingeniería de tejidos, pero se necesitan pasos adicionales como la esterilización para crear ECM y tejidos compatibles para uso humano. Aunque surgen nuevas tecnologías, pueden ser costosas y difíciles de adaptar a las instalaciones de laboratorio estándar. El uso de CAF primarios obtenidos de pacientes permite generar "matrices personalizadas" para probar diferentes tratamientos. En esta línea, nuestro grupo ha estado utilizando esta metodología para demostrar que las matrices generadas por los CIF son diferentes a las generadas por los NF, mostrando matrices más gruesas y organizadas7. Hemos informado de que las estructuras capilares derivadas de células endoteliales dependen de la expresión de fibroblastos Snail1, y hay estudios futuros para observar ese efecto en matrices derivadas de LOS CAF.

ECM requiere más estudio antes de que podamos entender los mecanismos subyacentes responsables de la resistencia a la quimioterapia o la recaída tumoral. Por lo tanto, sugerimos el uso de matrices derivadas de CAF de los tejidos del paciente oncológico como un procedimiento para investigar el comportamiento microambiental en el cáncer y la comunicación ECM con células cancerosas u otras células estromales.

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Disclosures

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Acknowledgments

El desarrollo de este protocolo fue apoyado por PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 y RD12/0036/0041 del Instituto de Salud Carlos III; por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); por "CIBER Cáncer de Cáncer", CB16/12/00273 y CB16/12/00446, del Instituto de Salud Carlos III-FEDER; y por la Fundación Científica AECC (un enfoque multifacético para el cáncer de páncreas dirigido). Cristina Peña es beneficiaria de un Contrato Miguel Servet del Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ayudó con el texto en inglés. Agradecemos a los miembros del laboratorio por su ayuda y asesoramiento a lo largo de esta investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium hydroxide (NH4OH) Roth A990.1
Amphotericin-B Corning 30-003-CF
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7906-50G
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-014-CVR
Endothelial Basal Medium (EBM) Lonza CC-3121 add supplements before use
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) Lonza CC-4176
Ethanolamine Sigma 411000-100ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest S181B-500 heat-inactivated before use
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) Lonza CC-3131 add supplements before use
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) Lonza CC-4126
Gelatin from bovine skin Sigma G9391-100G
Glutaraldehyde Sigma g5882
L-Ascorbic Acid Sigma A92902-100G light sensitive
L-Glutamine Lonza BE17-605E
Normocin Invivogen 3ANT-NR-2
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CVR
Triton X100 Roth 3051
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) ATCC ATCC CRL-4001
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) ATCC PCS-100-013

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References

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Investigación del Cáncer Número 154 Microambiente Tumoral Cultivo tridimensional (3D) Matriz Extracelular Fibroblastos Colágeno Neoangiogénesis
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