Summary
この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。
Abstract
細胞外マトリックス(ECM)は、組織の細胞の主な支持体として機能する3次元足場である。その構造的機能に加えて、ECMはまた、細胞の遊走、増殖、および分化に関与する。線維芽細胞は、ECM繊維の配置と生産を修飾する細胞の主なタイプです。癌において、CAF(癌関連線維芽細胞)は永久的な活性化状態にあり、ECMリモデリングに参加し、腫瘍細胞の移行を促進し、腫瘍関連血管新生を刺激し、他のプロ腫瘍形成の役割の間で。この方法の目的は、不死化線維芽細胞またはヒト一次CAFを使用して、生体内行列に類似した繊維組成を有する3次元マトリックスを作成することです。線維芽細胞は、前処理された細胞培養プレートで培養され、アスコルビン酸刺激下で成長する。次いで、線維芽細胞を除去し、マトリックスをさらに細胞播種のためにブロックする。このECMモデルでは、線維芽細胞を活性化または改変して、細胞培養で効果を研究できる異なる種類のマトリックスを生成することができます。3Dマトリックスは、繊維分布を変更する可能性のある分解酵素や架橋酵素などの細胞シグナルによっても形成されます。この文脈において、血管新生は、上皮腫瘍細胞などの他の細胞型と共に研究することができる。
Introduction
細胞外マトリックス(ECM)は、あらゆる種類の組織に存在する動的構造である。これは、細胞接着、移行、および通信1に不可欠な繊維のネットを作成するタンパク質と多糖で構成されています。ECM組成物は、組織によって異なる。I型コラーゲンは最も一般的な構造タンパク質であるが、コラーゲンタイプII、III、V及びXIは種々の組織2にも見られる。線維芽細胞によって生成されるフィブロネクチンは、細胞接着2に必要である。さらに、エラスチン、ラミニンおよび表面受容体のような他の構造分子は、繊維アセンブリを媒介し、異なるECM組織2に特異的であるインテグリンと呼ばれる。ECMは細胞足場として重要な役割を果たし、生理学的および病理学的プロセス1の両方に関与することもできる。ECMの異常は、ECM組成およびその組織を変化させる癌などの病態で観察される。腫瘍において、ECMは、腫瘍微小環境(TME)の非細胞成分、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、ペリサイトおよび様々な可溶性因子などの細胞成分の複合体ミリューを表す。TMEは癌の進行および転移を促進することが知られている;癌関連線維芽細胞は、腫瘍間質における主要な細胞型として、このプロセス3に参加する。正常な線維芽細胞とは異なり、CAFは永久的な活性化において、ECMタンパク質および成長因子の分泌の増加を示す(例えば、増殖因子β、TGF-βの形質転換)、ならびにα平滑筋アクチン(α-SMA)および線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)4のようないくつかのマーカーのより高い発現を示す。しかし、CFは異種細胞集団であり、異なるレベルの活性化またはマーカー発現5を示す。その後、線維芽細胞由来行列の組成および構造は、線維芽細胞の状態および特性に依存すると仮定することができる。
この文脈において、この方法論の目的は、in vivo ECM設定と同等の線維芽細胞によるECM生成のための適切なインビトロモデルを確立することである。このアプローチは、ECMが媒介する化学抵抗や遊走などの腫瘍細胞機能のさらなる研究のためのインビトロ翻訳方法論として提案する。我々のグループが他の場所で発表したように、CFは新鮮な組織サンプルから得ることができるが、培養中のCAFの生存率は限られており、その細胞通過数は6を減少させられることに留意しなければならない。さらに、患者のサンプルから確立されたCAF一次培養物はマトリックス生成に使用することができる。線維芽細胞における遺伝子発現の操作は、マトリックス組成、繊維配向などに対する可能な影響を評価するために、様々なインビトロ行列を生成する興味深い方法でもあります。これらの線に沿って、我々のグループは最近、様々な導出行列7の組成および繊維配向におけるカタツムリ発現線維芽細胞の役割を報告した。
さらに、CFおよびECMは血管系に関与しており、血管生成および花瓶外層8の一部としてである。ECMリモデリングは血管新生を誘発する;マトリックスメタロプロテイナーゼ(MmP)は、このプロセス9、10に寄与する最も重要な酵素タイプであると思われる。ECMを生成する一次細胞の組織血管形成には、ECM高分子、ECMに含まれる残留成長因子、マトリックス弾性、およびマトリックス厚さが内皮細胞活性化に関与する因子として記載されている。腫瘍において、低酸素症はECM剛性および内皮芽世代12を増加させる。また、CAFは、腫瘍間質13における血管新生を刺激する血管内皮増殖因子(VEGF)および血小板由来増殖因子(PDGF)を分泌する。この分野では、in vitroマトリックス生成を使用して、異なる実験条件下で血管新生プロセスまたはMMP作用を研究することができる。したがって、生体内マトリックスの最も類似したインビトロ再生は、血管新生またはマイクロ環境細胞相互作用におけるECMの役割を調査するための貴重なツールであり得る。
アスコルビン酸を用いた培養線維芽細胞の刺激は、マトリックス沈着を増強し、ECMを生成し、生体内行列で類似の生成方法として受け入れられている。不死化線維芽細胞株は容易に培養され、PDGF-BB、腫瘍壊死因子α(TNF-α)またはTGF-β14のような多様な増殖因子によって活性化される。TME内では、CAFはECM4の主要成分としてタイプIコラーゲンとフィブロネクチンを合成する。同様に、これらの成分は、インビトロ生成線維芽細胞由来行列の主要成分として見られる(図1)。
生体内ECMをシミュレートするインビトロ方法論は異なります。ECM繊維の混合物を用いたコーティング培養皿の使用は過去数年間に拡張されたが、この2Dアプローチは架橋ゲル(例えば、マトリゲル)1のような3D構造の改善を必要とする。Matrigel のようなセットアップは、3D マトリックスをシミュレートするための標準的な方法となっています。フィブリンはまた、行列を生成する際の代替手段であるが、ECM1の強度と耐久性の点で失敗します.他のECM成分と組み合わせて使用されるコラーゲンは、上記の問題のいくつかを修正します。しかしながら、これらのコラーゲンゲルは、配向できる繊維を有する強いネットワークを形成するが、非常に異種であり、実験の繰り返し1において問題となり得る。それにもかかわらず、実験の目的に応じて、マトリゲルまたは他のヒドロゲルの使用がより適切であると仮定しなければならない(例えば、ゲル収縮を容易に検出できるマトリックス収縮研究において)。
生成されたマトリックスの潜在的な免疫原性は、いくつかの細胞タイプの実験における問題である可能性があります。従って、我々の方法を用いた場合にECM発生細胞による免疫応答の可能性を低減するために、マトリックスは脱細胞化され洗浄されるが、細胞断片除去は合計15でなかった。理想的なECMは、細胞培養と互換性があり、細胞信号と通信して反応できる必要があります。私たちの手順は、ECM生産中に難なく変化の導入を可能にします(例えば、線維芽細胞刺激成長因子を追加)。
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Protocol
ヒト組織サンプルは、マドリードのラモン・イ・カハル病院の研究倫理委員会の承認を得て得られた。
1. ソリューションの準備
- 0.2%ゼラチン溶液を調製する:PBSの500 mLにゼラチン1gを加える。溶液をオートクレーブし、4°Cに保ちます。使用前に0.22μmフィルタでフィルターを適用してください。
- 1%グルタルアルデヒドを調製する:25%グルタルアルデヒド原液1mLを24mLのPBSに加える。使用前に0.22μmフィルタでフィルターを適用してください。
- 1 Mエタノールアミンを調製する:使用前に0.22μmフィルターで滅菌H2Oフィルターでエタノールアミン溶液を調製します。
メモ:エタノールアミンにはセキュリティキャップが付いていますので、針と注射器が必要です。 - アスコルビン酸を調製する:50mg/mLの原液アスコルビン酸(光感受性)の0.1 mLを100mLの培地に加える。
- リシスバッファーを準備する:NH4OHの20 nMでPBS 0.5%トリトン100Xを準備します。使用直前にNH4OHを追加してください。
- PBSペン/ストレップを準備する:100 U/mLペンと100 μg/mLストレップにペン/ストレップのストックソリューションを希釈します。
- 10% FBS で DMEM を準備する: DMEM の 500 mL に 10% FBS を追加します。100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.1 mg/mL ノルモシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B を補足してください。
- 2%BSA熱変性を調製する:無菌水の100 mLにBSAの2gを追加します。沸騰したお湯を7分間温めます。
- 抗生物質でFBSを準備する:200 U/mLペニシリン、200 μg/mLストレプトマイシン、100 μg/mLゲンタマイシン、2.5 g/mLアンホテリシンBを含むFBSを補う。
2. 細胞培養製剤
- 不死化線維芽細胞株
- 培養組換えテロメラーゼトランスフェクト不死ヒト包皮線維芽細胞(BJ-hTERT、ATCC CRL-4001)をDMEMで10%FBSで、37°Cおよび5%CO2で維持する。
- 内皮細胞
- ヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs、ATCC PCS-100-013)を2%FBSを含有するEBM-2培地中で培養し、37°および5%CO2で維持する。
- 線維芽細胞原発培養
メモ:CAFの設立と文化のために、私たちのグループが以前に公開したプロトコルは6に従いました。- 簡単に言えば、組織サンプルを約2〜3mm3の小片に切断し、高濃度の抗生物質を有するFBSで種子を切断する。
- 最初の線維芽細胞が現れたら、細胞維持のために培地をFBM培地に交換してください。
メモ:組織の起源に応じて、細胞培養物は容易に汚染され得る。抗生物質を補充したPBSでサンプルを洗浄し、汚染度の高い組織(例えば、結腸6)を用いて、30〜45分間振る。
3. 線維芽細胞由来の3Dマトリックス(カステロ・クロスおよびクキエルマン16から適応)
- 6ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチン溶液を2mL加え、37°Cで1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
- ゼラチンを吸引し、PBSの2 mLで洗浄する。
- 1%グルタルアルデヒドの2 mLを追加し、RTで30分間インキュベートし、グルタルアルデヒドはゼラチンを架橋します。
- グルタルアルデヒドを吸引し、2mLのPBSで井戸を5分間洗浄します。
- 1 M エタノールアミンを 2 mL 加え、RT で 30 分間インキュベートすると、残りのグルタルアルデヒドをブロックするように作用します。
- エタノールアミンを吸引し、2mLのPBSで井戸を5分間洗浄します。
- 10% FBS で DMEM を 1 mL 追加します。培地がすぐにピンク色になったら、培地を取り出し、2mLのPBSで洗浄し、10%FBSでDMEMを再度1mL加えます。
- 線維芽細胞懸濁液の種子1mLは、各ウェルに5 x 105細胞を有する。各井戸の総容積は2 mLになります。
- 培養細胞は合流100%に達するまでに達する。次に、培地を取り出し、DMEMを10%FBSに50μg/mLアスコルビン酸で交換し、使用する場合は追加の処理を行います。
- 新鮮なDMEMと10%FBS、50 μg/mLアスコルビン酸を2日ごとに6日間交換してください。
注:追加の治療が使用される場合(例えば、PDGF-BB、TGF-βおよび/または他の成長因子)、アスコルビン酸処理が追加されるのと同じ日にそれらを追加する。 - 最後のアスコルビン酸処理の2日後に培地を取り出し、2mLのPBSで洗浄する。
- ゆっくりと1mLのリシス緩衝液を加え、37°で予熱し、各井戸に加える。線維芽細胞がリンパが出るまでRTで5〜10分間インキュベートする(顕微鏡下で観察可能)。
- 慎重に、lysisバッファーを除去することなく、PBSの2 mLを追加します。次いで、PBSの約2.5mLを吸引する。合計 3 回のワッシュに対して 2 回繰り返します。
- 最終的に、2.5 mL の PBS を取り出し、ペン/ストレップ(それぞれ 100 U/mL および 100 μg/mL)で PBS を 2 mL 追加します。フィルムでシールし、最大3ヶ月間4 °Cに保ちます。
メモ:実験によっては、生成された行列の長期保存が結果に影響を与える場合があります。できるだけ早く行列を使用することをお勧めします。コラーゲン観察などの構造アッセイにマトリックスを使用する場合、マトリックスを固定し、より長い期間保存することができます。このプロトコルは、6ウェル培養プレート用に示されています。他のプレートを使用することができますが、反応量と細胞懸濁液濃度は、井戸面積に応じて再計算する必要があります。
4. チューブ形成アッセイ
- 最大合流になるまで EBM-2 2% FBS で HUVEC 細胞を成長させます。
- 8時間FBSなしで媒体をEBM-2に置き換えます。
- 細胞を播種する前に行列を準備します。
- 冷蔵庫からマトリックスを取り出し、RTで1時間置きます。
- 熱変性2%BSAの2 mLを加算して行列をブロックします。37 °Cで1時間インキュベートする。
- BSAを吸引し、2mLのPBSで洗浄する。
- 以前に3D線維芽細胞由来マトリックスでコーティングされた6ウェルプレートの各ウェル上のFBS枯渇培地中の種子2 x 105 HUVEC細胞。
- 内皮細胞を37°Cで16時間インキュベートする。
- 標準的な明視野顕微鏡でチューブ状の構造形成を20-40倍の倍率で調べます。
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Representative Results
PDGF-BB刺激線維芽細胞は、より厚いECMを作成します。エレーラらは、PDGF刺激線維芽細胞が、より厚いマトリックスおよびより高い繊維配向7を生成する方法を示した。BJ-hTERT線維芽細胞をPDGFの有無にかかわらずインキュベートし、観察された代表的な領域は、PDGF刺激線維芽細胞によって産生されるマトリックス中のより整列した細胞分布を示した(図1a)。コラーゲンIおよびフィブロネクチンタンパク質発現は、PDGF刺激線維芽細胞に由来するマトリックスにおいて増加し(図1b)、その結果、マトリックス厚さが増加した(図1c)。また、コラーゲンIおよびフィブロネクチンは、方向性ヒストグラムに示すように平行パターンを示す(図1d)。
PDGF-BB刺激線維芽細胞に由来する3Dマトリックスは、内皮細胞における尿細管形成を誘導する。HUVEC細胞をPDGF刺激または非刺激BJ-hTERT線維芽細胞に由来する脱細胞化マトリックス上に播種した。PDGF刺激線維芽細胞によって生成されたマトリックスに播種された内皮細胞は、非刺激条件下よりも多くの毛細血管様構造を示した(図2)。
図1:PDGF刺激線維芽細胞は、より厚く、異方性ECMを増強する。(A)PDGF-BB(上記)および方向ヒストグラム(下)で治療された、または治療しないBJ-hTERT線維芽細胞の細胞配向を表すバイナリ画像は、細胞角の分布の頻度(0°角度を中心に)を表す。(B)ECM由来のPDGF刺激線維芽細胞におけるフィブロネクチンおよびコラーゲンIの細胞外タンパク質発現の増加。(C)PDGF刺激線維芽細胞由来のECMにおけるECM厚さの増加(D)ECM由来のPDGF刺激線維芽細胞におけるフィブロネクチンおよびコラーゲンIなどの細胞外タンパク質のタンパク質および組織の増加以下、方向性ヒストグラム。*p < 0.05;p < 0.001.エレーラら7から適応し、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PDGF刺激線維芽細胞は内皮細胞活性化を促進し、PDGF刺激線維芽細胞に由来するマトリックス上の毛細血管様構造の形成によって観察された。ImageJの「粒子分析」ツールは、PDGF刺激線維芽細胞からのマトリックスに播種されたHUVECにおいて、非刺激線維芽細胞からのマトリックスに播種されたものに対して1.81の増加率を示した。エレーラら7から適応し、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マトリックスは、不死化線維芽細胞または原発性線維芽細胞培養物で生成することができる。線維芽細胞は、高い成長速度とストレス耐性を有するインビトロ培養で維持することが容易です。それらは死後の組織3から単離することもできるが、汚染は組織の起源に応じて制限される可能性がある。
ここでの3Dマトリックスモデルは、ECM組成と繊維配向を正常に研究するための新しい効果的なシステムを提供しています。また、線維芽細胞活性化状態、遺伝子/タンパク質発現、他の細胞型との相互作用などの分析にも適しています。患者から線維芽細胞で生成されたマトリックスは、腫瘍における間質関連メカニズムのパーソナライズされた研究を可能にすることを強調することが重要です。例えば、このアプローチは、ECMが重要な役割を果たす化学抵抗性の研究に適用することができる。このタイプの研究の翻訳は、臨床現場での患者の治療のための意思決定に役立ち、パーソナライズされた医療を実施する可能性があります。
3D マトリックス プロトコルは面倒ですが、次の手順に従うことで興味深い結果を得ることができます。複数の洗浄工程が必要なため、マトリックスの損傷を避けることは不可欠です。さらに、このプロトコルで異なる細胞培養条件をテストする場合、実験中に発生する可能性のある最小限の違い(例えば、播種時に同じ線維芽細胞懸濁液を使用)のために、マトリックスを同時に生成することをお勧めします。前処理プレート)。
他の組織工学的方法も開発されているが、人間用に互換性のあるECMや組織を作るためには、殺菌のような追加のステップが必要である。新しい技術が生まれていますが、コストがかかり、標準的な実験室施設に適応するのが難しい場合があります。患者から得られた一次CAFを使用することで、異なる治療法をテストする「パーソナライズされた行列」を生成することが可能になります。この行に沿って、私たちのグループは、CFによって生成された行列がNFによって生成された行列と異なることを実証するために、この方法論を使用して、より厚く、より組織化された行列7を示しています。内皮細胞由来の毛細血管様構造は線維芽細胞Snail1発現に依存することが報告されており、今後、CAF由来マトリックスへの影響を観察する研究が行われている。
ECMは、化学療法耐性または腫瘍再発の原因となるメカニズムを理解する前に、さらなる研究を必要とします。そこで、がん細胞や他の間質細胞とのがんやECMコミュニケーションにおける微小環境挙動を調べる手順として、がん患者組織由来のCAF由来マトリックスを用いることを提案する。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
このプロトコルの開発は、PI12/02037、PI15/02101、PI17/01847、PI18/01034 および RD12/0036/0041 Instituto de Salud Carlos III からサポートされました。フォンド・ヨーロッパ・デ・デサロロ地域(FEDER) によって;「CIBER de Cancer」によって, CB16/12/00273 と CB16/12/00446, サルド・カルロス3世-フェーダーのインスティトゥートから;そして、フンダシオン・シエンティフィカAECC(膵臓癌を標的とする多面的なアプローチ)によって。クリスティーナ・ペーニャは、サルド・カルロス3世のミゲル・サーブト契約を受領しています。M.オードは英語のテキストを手伝いました。この研究を通じて、ラボメンバーの皆様の助けとアドバイスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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