Summary
O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).
Abstract
A matriz extracelular (ECM) é um andaime tridimensional que atua como o principal suporte para as células nos tecidos. Além de sua função estrutural, o ECM também participa da migração celular, proliferação e diferenciação. Fibroblastos são o principal tipo de células modificando o arranjo de fibra e a produção de ECM. No câncer, os CAFs (fibroblastos associados ao câncer) estão em estado de ativação permanente, participando da remodelação do ECM, facilitando a migração de células tumorais e estimulando a angiogênese associada ao tumor, entre outros papéis pró-tumorigenic. O objetivo deste método é criar uma matriz tridimensional com uma composição de fibra semelhante às matrizes in vivo, utilizando fibroblastos imortalizados ou CAFs primários humanos. Os fibroblastos são cultivados em placas de cultura celular pré-tratadas e cultivados estimulação de ácido ascórbico. Em seguida, os fibroblastos são removidos e matrizes são bloqueadas para semeadura celular. Neste modelo De ECM, os fibroblastos podem ser ativados ou modificados para gerar diferentes tipos de matriz, cujos efeitos podem ser estudados na cultura celular. As matrizes 3D também são moldadas por sinais celulares, como degradação ou enzimas que ligam cruzadas que podem modificar a distribuição de fibras. Neste contexto, a angiogênese pode ser estudada, juntamente com outros tipos de células, como células tumorais epiteliais.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) é uma estrutura dinâmica presente em todos os tipos de tecido. Consiste em proteínas e polissacarídeos que criam uma rede de fibras cruciais para a adesão celular, migração e comunicação1. A composição de ECM varia dependendo do tecido. Enquanto o colágeno tipo-I é a proteína estrutural mais prevalente, os tipos de colágeno II, III, V e XI também podem ser encontrados em vários tecidos2. Fibronectina gerada por fibroblastos é necessária para a adesão celular2. Além disso, existem outras moléculas estruturais como elastina, laminina e receptores de superfície chamados integrinas que mediam a montagem de fibras e são específicas para os diferentes tecidosECM 2. O ECM desempenha um papel importante como andaime celular e também pode estar envolvido em processos fisiológicos e patológicos1. As anormalidades no ECM são observadas em patologias como câncer, que altera a composição do ECM e/ou sua organização. Em tumores, o ECM representa o componente não celular do microambiente tumoral (TME), um ambiente complexo de componentes celulares, como fibroblastos, células imunes, células endotélias, pericitos e uma variedade de fatores solúveis. Sabe-se que a TME promove a progressão do câncer e a metástase; fibroblastos associados ao câncer, como um tipo de célula predominante no estroma tumoral, participam desse processo3. Ao contrário dos fibroblastos normais, os CAFs estão em ativação permanente, mostrando maior secreção de proteínas ecm e fatores de crescimento (por exemplo, Transformando fator de crescimento-β, TGF-β), bem como uma maior expressão de alguns marcadores, como a actina muscular α-smooth (α-SMA) e proteína de ativação de fibroblasto (FAP)4. No entanto, os CAFs são uma população heterogênea de células, mostrando diferentes níveis de ativação ou expressãomarcador5. Pode-se supor então que a composição e a estrutura de matrizes fibroblasto-derivadas dependerão do status e das características do fibroblasto.
Neste contexto, o objetivo desta metodologia é estabelecer um modelo in vitro adequado para a geração de ECM por fibroblastos equivalentes à configuração in vivo de ECM. Propomos essa abordagem como uma metodologia translacional in vitro para estudos posteriores de funções de células tumorais, como quimioresistência ou migração, mediada pela ECM. Como o nosso grupo publicou em outros lugares, CAFs podem ser obtidos a partir de amostras de tecido fresco, mas tem que ser notado que a sobrevivência dos CAFs na cultura é limitada e seu número de passagem celular é reduzido6. Além disso, as culturas primárias da CAF estabelecidas a partir de amostras de pacientes podem ser usadas para geração de matriz. A manipulação da expressão gênica em fibroblastos também é uma maneira interessante de produzir matrizes in vitro variadas para avaliar os possíveis efeitos na composição da matriz, orientação de fibras, etc. Ao longo destas linhas, nosso grupo relatou recentemente o papel de fibroblastos de expressar caracol na composição e orientação de fibras de várias matrizes derivadas7.
Além disso, cafs e ECM estão envolvidos no sistema vascular, tanto na geração de navios e como parte do vaso camada externa8. A remodelação do ECM induz a angiogênese; metaloproteinases matriz (MMPs) parecem ser o tipo de enzima mais importante contribuindo para este processo9,10. A vascularização tecidual de células primárias que geram os ECMs, macromoléculas de ECM, fatores de crescimento residuais incluídos no ECM, elasticidade da matriz e espessura da matriz são descritos como fatores envolvidos na ativação de células endotélias11. Em tumores, hipóxia aumenta a rigidez do ECM e a geração de brotos endotelianos12. Além disso, os CAFs secretam o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) que estimulam a angiogênese no estroma13do tumor. Neste campo, a geração de matriz in vitro poderia ser usada para estudar processos de angiogênese ou ação de MMP diferentes condições experimentais. Assim, a reprodução in vitro da matriz in vivo mais análoga pode ser uma ferramenta valiosa para investigar o papel da ECM na angiogênese ou nas interações microambientais celulares.
A estimulação de fibroblastos cultivados com ácido ascórbico para melhorar a deposição da matriz e gerar um ECM é uma maneira aceita de produzir matrizes in vivo análogas. As linhas de células fibroblastas imortalizadas são facilmente cultivadas e ativadas por diversos fatores de crescimento, como PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) ou TGF-β14. Dentro da TME, cafs sintetizar tipo-I colágeno e fibronectina como os principais componentes da ECM4. Da mesma forma, esses componentes são encontrados como componentes principais de matrizes derivadas de fibroblasto in vitro (Figura 1).
Existem diferentes metodologias in vitro para simular in vivo ECM. O uso de pratos de cultura revestido com misturas de fibras ECM foi estendido nos últimos anos, mas essa abordagem 2D precisava de melhorias nas estruturas 3D, como géis interligados (por exemplo, Matrigel)1. A configuração matrigel-like tornou-se o método padrão para simular uma matriz 3D. Fibrin também é uma alternativa ao gerar matrizes, mas falha em termos de força e durabilidade do ECM1. O colágeno usado em combinação com outros componentes da ECM altera alguns dos problemas acima mencionados. No entanto, estes géis de colágeno formam uma forte rede com fibras que podem ser orientadas, mas são altamente heterogêneas, o que pode ser um problema nas repetições de experimentos1. No entanto, deve-se supor que, dependendo do objetivo dos experimentos, o uso de Matrigel ou outros hidrogéis é mais apropriado (por exemplo, em estudos de contração de matriz em que a contração do gel pode ser facilmente detectada).
A imunogenicidade potencial das matrizes geradas pode ser um problema em experimentos com alguns tipos de células. Portanto, para reduzir a possibilidade de respostas imunes devido às células geradoras de ECM ao usar nosso método, as matrizes são descelularizadas e lavadas, embora a remoção de fragmentos celulares não possa ser de15. O ECM ideal precisa ser compatível com a cultura celular e capaz de se comunicar e reagir aos sinais celulares. Nosso procedimento permite a introdução de mudanças sem dificuldade durante a produção de ECM (por exemplo, adicionando fatores de crescimento estimulantes do fibroblasto).
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Protocol
Amostras de tecido humano foram obtidas com a aprovação do Conselho de Ética de Pesquisa do Hospital Ramón y Cajal, Madrid.
1. Preparação de Soluções
- Prepare 0,2% de solução de gelatina: adicione 1 g de gelatina a 500 mL de PBS. Autoclave a solução e manter a 4 °C. Filtro com um filtro de 0,22 μm antes de usar.
- Prepare 1% de glutaraldeído: Adicione 1 mL de 25% de solução de ações glutaraldeído para 24 mL da PBS. Filtro com um filtro de 0,22 μm antes de usar.
- Prepare 1 M de etanolamina: prepare a solução de etanolamina com filtro H2O. estéril com um filtro de 0,22 μm antes do uso.
NOTA:Como a etanolamina é fornecida com um boné de segurança, uma agulha e seringa serão necessárias. - Prepare o ácido ascórbico: adicione 0,1 mL de 50 mg/mL solução de estoque ascórbico ácido (sensível à luz) para 100 mL de meio.
- Prepare o amortecedor da lysis: prepare PBS 0.5% Triton 100X com 20 nM de NH4OH. Adicione NH4OH logo antes de usar.
- Prepare PBS Pen/Strep: solução de ações de Pen/Strep diluída para 100 U/mL Pen e 100 μg/mL Strep.
- Prepare o DMEM com 10% FBS: Adicione 10% FBS a 500 mL de DMEM. Suplemento com penicilina U/mL 100, 100 μg/mL estreptomicina, 0,1 mg/mL Normocin e 0,25 μg/mL amphotericin B.
- Prepare 2% de calor BSA desnaturado: adicione 2 g de BSA a 100 mL de água estéril. Aqueça em água fervente por 7 min.
- Prepare fbs com antibióticos: suplemento FBS com 200 U/mL penicilina, 200 μg/mL estreptomicina, 100 μg/mL gentamicina e 2.5 g/mL amphotericin B.
2. Preparação da cultura celular
- Fibroblastos imortalizados linha celular
- Cultura recombinante telomerase transfected imortalizado fibroblastos do prepúcio humano (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) em DMEM com 10% FBS e manter a 37 °C e 5% CO2.
- Células endotélias
- Células endotelias de veia sumo-umbilical humana sumundo (HUVECs, ATCC PCS-100-013) no ebm-2 médio contendo 2% FBS e manter em 37 °C e 5% CO2.
- Cultura primária do fibroblasto
NOTA:Para o estabelecimento e a cultura da CAF, o protocolo previamente publicado pelo nosso grupo foi seguido6.- Resumidamente, corte amostras de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente 2-3 mm3 e sementes em FBS com alta concentração de antibióticos.
- Quando os primeiros fibroblastos apareceram, substitua o meio com o meio fbm para manutenção celular.
NOTA:Dependendo da origem do tecido, as culturas celulares podem ser contaminadas facilmente. Lave amostras em PBS complementadas com antibióticos, com tecido altamente contaminado (por exemplo, cólon6)e agite por 30-45 min.
3. Matrizes 3D derivadas de fibroblasto (adaptadas de Castelló-Cros e Cukierman16)
- Adicione 2 mL de 0,2% de solução de gelatina para cada poço de uma placa de 6 poços e incubar por 1 h a 37 °C ou durante a noite em 4 °C.
- Aspirate gelatina e lavá-lo em 2 mL de PBS.
- Adicionar 2 mL de 1% glutaraldeído e incubar por 30 min no RT. Glutaraldehyde vai cruzar-link gelatina.
- Aspirate glutaraldeído e lavar poços em 2 mL de PBS para 5 min. Repita 3 vezes.
- Adicione 2 mL de 1 M de etanolamina e incubada por 30 min na RT. Etanolamina atuará para bloquear o glutaraldeído restante.
- Aspirate etanolamina e poços de lavagem em 2 mL de PBS para 5 min. Repita 3 vezes.
- Adicionar 1 mL de DMEM com 10% FBS. Se o meio ficar imediatamente rosa, retire o meio, lave em 2 mL de PBS e adicione novamente 1 mL de DMEM com 10% FBS.
- Semente 1 mL de suspensão do fibroblasto, com 5 x 105 células em cada poço. O volume total em cada poço será de 2 mL.
- Células culturais até 100% de confluência é alcançado. Em seguida, retire o meio e substitua por DMEM por 10% FBS com 50 μg/mL ácido ascórbico e tratamento adicional se usado.
- Substitua o médio por DMEM fresco por 10% FBS e 50 μg/mL ácido ascórbico a cada 2 dias durante 6 dias.
NOTA:Se o tratamento adicional for usado (por exemplo, PDGF-BB, TGF-β e/ou outros fatores de crescimento), adicione-os nos mesmos dias em que o tratamento com ácido ascórbico é adicionado. - Dois dias após o último tratamento de ácido ascórbico, retire o meio e lave em 2 mL de PBS.
- Adicione lentamente 1 mL de tampão de lyse, pré-aquecido a 37 °C, a cada poço. Incubar por 5-10 min em RT até fibroblastos são lysed (observável o microscópio).
- Com cuidado e sem remover o amortecedor da lyse, adicione 2 mL de PBS. Em seguida, aspirar cerca de 2,5 mL de PBS. Repita duas vezes para um total de três lavações.
- Eventualmente, remover 2,5 mL de PBS e adicionar 2 mL de PBS com Pen / Strep (100 U/ mL e 100 μg/mL, respectivamente). Selar com filme e manter a 4 °C por até 3 meses.
NOTA:Dependendo do experimento, o armazenamento a longo prazo das matrizes geradas pode afetar os resultados. Recomendamos o uso de matrizes o mais rápido possível, e ainda mais se o experimento envolve a semeadura celular, devido à possível degradação da proteína. Se as matrizes são usadas para ensaios estruturais, tais como a observação do colagénio, as matrizes podem ser reparadas e armazenadas por uns períodos mais longos. Este protocolo é indicado para uma placa de cultura de 6 poços. Outras placas podem ser usadas, mas os volumes reativos e a concentração da suspensão da pilha precisam de ser recalculados de acordo com a área do poço.
4. Ensaio de Formação do Tubo
- Crescer células HUVEC em EBM-2 2% FBS até a confluência máxima.
- Substitua o meio por EBM-2 sem FBS por 8 h.
- Prepare matrizes antes de semeadura de células.
- Retire as matrizes da geladeira e coloque por 1 h no RT.
- Bloqueie matrizes adicionando 2 mL de calor desnaturado 2% BSA. Incubar 1 h a 37 °C.
- Aspirate BSA e lavar em 2 mL de PBS.
- Sementes 2 x 105 células HUVEC em meio esgotado FBS em cada poço de uma placa de 6 poços previamente revestido com matrizes derivadas de fibroblasto 3D.
- Incubar células endotelias a 37 °C por 16 h.
- Examine a formação de estrutura semelhante a um tubo um microscópio de campo brilhante padrão na ampliação de 20-40x.
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Representative Results
Os fibroblastos estimulados pdgf-bb criam um ECM mais espesso. Herrera et al. mostraram como os fibroblastos estimulados pelo PDGF geraram uma matriz mais espessa, bem como maior orientação defibras 7. Os fibroblastos BJ-hTERT foram incubados com ou sem PDGF e áreas representativas observadas mostraram uma distribuição celular mais alinhada em matrizes produzidas pelo fibroblasto estimulado pelo PDGF (Figura 1a). A expressão de proteína de colágeno I e fibronectina foi aumentada em matrizes derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF (Figura 1b)e, consequentemente, a espessura da matriz foi aumentada(Figura 1c). Além disso, o colágeno I e a fibronectina mostram padrões paralelos, como mostrado em histogramas de direcionalidade (Figura 1d).
Matrizes 3D derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF-BB induzem tubulogênese em células endotélias. As células HUVEC foram semeadas em matrizes descelularizadas derivadas de fibroblastos BJ-hTERT estimulados ou não estimulados de PDGF. As células endotélias semeadas em matrizes geradas por fibroblastos estimulados por PDGF apresentaram estruturas mais capilares do que em condições não estimuladas(Figura 2).
Figura 1: Os fibroblastos estimulados pelo PDGF aumentam o ECM mais espesso e anisotrópico. (A) Imagens binárias representativas da orientação celular dos fibroblastos BJ-hTERT tratados ou não com HDGF-BB (acima) e histogramas de direcionalidade (abaixo), que representam a frequência de distribuição de ângulos celulares (centrando-se no ângulo de 0°). (B) Aumento na expressão proteica das proteínas extracelulares fibronectina e colágeno I em fibroblastos estimulados pdgf derivados de ECM. (C)Aumento da espessura de ECM nesses ECMs derivados de fibroblastos estimulados por PDGF. (D)Aumento de proteínas e organização de proteínas extracelulares, como fibronectina e colágeno I em fibroblastos estimulados pdgf derivados de ECM. Abaixo, histogramas de direcionalidade. *p< 0,05; p < 0,001. Adaptado de Herrera et al.7Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os fibroblastos estimulados pelo PDGF promovem a ativação de células endotélias, observada pela formação de estruturas capilares em matrizes derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF. A ferramenta de "análise de partículas" do ImageJ mostrou uma taxa de aumento de 1,81 em HUVECs semeadas em matrizes de fibroblastos estimulados por PDGF em relação aos semeados em matrizes de fibroblastos não estimulados. Adaptado de Herrera et al.7Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Matrizes podem ser geradas com fibroblastos imortalizados ou culturas fibroblastprimárias. Fibroblastos são fáceis de manter na cultura in vitro com uma alta taxa de crescimento e resistência ao estresse. Podem mesmo ser isolados do tecido post-mortem3,embora a contaminação poderia ser uma limitação, dependendo da origem do tecido.
O modelo 3D-matrix aqui oferece um sistema novo e eficaz para estudar com sucesso a composição e a orientação da fibra de ECM. Também é adequado para as análises do estado de ativação do fibroblasto, expressão gênica/proteína, interações com outros tipos de células, etc. É importante destacar que as matrizes geradas com fibroblastos dos pacientes fazem o estudo personalizado de mecanismos stroma-relacionados nos tumores possíveis. Por exemplo, essa abordagem pode ser aplicada a estudos de resistência à quimioterapia, nos quais o ECM tem um papel importante. A tradução deste tipo de estudo poderia auxiliar na tomada de decisões para o tratamento de pacientes na prática clínica, implementando a medicina personalizada.
Mesmo que o protocolo de matriz 3D possa ser tedioso, resultados interessantes podem ser alcançados seguindo instruções. Deve-se notar que são necessárias múltiplas etapas de lavagem, portanto, evitar danos à matriz é essencial. Além disso, recomendamos que, quando diferentes condições de cultura celular são testadas com este protocolo, as matrizes devem ser geradas ao mesmo tempo devido a diferenças mínimas que podem ocorrer durante os experimentos (por exemplo, usando a mesma suspensão do fibroblasto ao semeadura placas pré-tratadas).
Outros métodos de engenharia de tecidos estão sendo desenvolvidos, mas etapas adicionais, como esterilização, são necessárias para criar ECM e tecidos compatíveis para uso humano. Embora as novas tecnologias estejam surgindo, elas podem ser caras e podem ser difíceis de se adaptar às instalações laboratoriais padrão. O uso de CAFs primários obtidos de pacientes possibilita a gerar "matrizes personalizadas" para testar diferentes tratamentos. Nesse meio, nosso grupo vem utilizando essa metodologia para demonstrar que as matrizes geradas pelos CAFs são diferentes das geradas por NFs, mostrando matrizes mais espessas e organizadas7. Nós relatamos que as estruturas capilar-como derivadas das pilhas endoteliis são dependentes da expressão do caracol1 do fibroblasto, e há uns estudos futuros para observar esse efeito em matrizes CAFs-derivadas.
ECM requer um estudo mais aprofundado antes que possamos entender os mecanismos subjacentes responsáveis pela resistência à quimioterapia ou recaída tumoral. Portanto, sugerimos o uso de matrizes derivadas da CAF de tecidos de pacientes com câncer como um procedimento para investigar o comportamento microambiental no câncer e comunicação de ECM com células cancerosas ou outras células estromais.
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Disclosures
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
O desenvolvimento deste protocolo contou com o apoio do PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 e RD12/0036/0041 do Instituto de Salud Carlos III; pelo Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); por "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 e CB16/12/00446, do Instituto de Salud Carlos III-FEDER; e pela Fundación Científica AECC (uma abordagem multifacetada para atingir o câncer de pâncreas). Cristina Peña é beneficiária de um Contrato Miguel Servet do Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ajudou com o texto em inglês. Agradecemos aos membros do laboratório por ajuda e conselhos ao longo desta pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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