Summary
Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) è uno scaffold tridimensionale che funge da supporto principale per le cellule nei tessuti. Oltre alla sua funzione strutturale, l'ECM partecipa anche alla migrazione cellulare, alla proliferazione e alla differenziazione. I fibroblasti sono il principale tipo di cellule che modificano la disposizione e la produzione della fibra ECM. Nel cancro, i CAF (fibroblasti associati al cancro) sono in stato di attivazione permanente, partecipano al rimodellamento eCM, facilitano la migrazione delle cellule tumorali e stimolano l'angiogenesi associata al tumore, tra gli altri ruoli pro-tumorale. L'obiettivo di questo metodo è quello di creare una matrice tridimensionale con una composizione in fibra simile a matrici in vivo, utilizzando fibroblasti immortalati o CAF primari umani. I fibroblasti sono coltivati in placche di coltura cellulare pre-trattate e coltivati sotto stimolazione acida ascorbica. Quindi, i fibroblasti vengono rimossi e le matrici vengono bloccate per un ulteriore seeding cellulare. In questo modello ECM, i fibroblasti possono essere attivati o modificati per generare diversi tipi di matrice, i cui effetti possono essere studiati nella coltura cellulare. Le matrici 3D sono modellate anche da segnali cellulari, come la degradazione o gli enzimi che collegano estrai che potrebbero modificare la distribuzione della fibra. In questo contesto, l'angiogenesi può essere studiata, insieme ad altri tipi di cellule come le cellule tumorali epiteliali.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) è una struttura dinamica presente in tutti i tipi di tessuto. È costituito da proteine e polisaccauri che creano una rete di fibre cruciali per l'adesione cellulare, la migrazione e la comunicazione1. La composizione ECM varia a seconda del tessuto. Mentre il collagene di tipo I è la proteina strutturale più diffusa, i tipi di collagene II, III, V e XI possono anche essere trovati in vari tessuti2. La fibronectina generata dai fibroblasti è necessaria per l'adesione cellulare2. Inoltre, ci sono altre molecole strutturali come l'elastina, laminina e i recettori superficiali chiamati integrins che mediano l'assemblaggio della fibra e sono specifici per i diversi tessuti ECM2. L'ECM svolge un ruolo importante come scaffold cellulare e può anche essere coinvolto in processi fisiologici e patologici1. Le anomalie nell'ECM sono osservate in patologie come il cancro, che altera la composizione ECM e/o la sua organizzazione. Nei tumori, l'ECM rappresenta la componente non cellulare del microambiente tumorale (TME), un complesso ambiente di componenti cellulari come fibrolanti, cellule immunitarie, cellule endoteliali, periciti e una varietà di fattori solubili. È noto che il TME promuove la progressione del cancro e la metastasi; i fibroblasti associati al cancro, come tipo di cellula predominante nello stroma tumorale, prendono parte a questo processo3. A differenza dei fibroblasti normali, i CAF sono in attivazione permanente, mostrando una maggiore secrezione delle proteine ECM e dei fattori di crescita (ad es., Transforming Growth Factor-z, TGF-z), così come un'espressione più alta di alcuni marcatori, come l'actina muscolare s-liscia (z-SMA) e la proteina di attivazionefibroblasta(FAP) 4 . Tuttavia, i CAF sono una popolazione di celle eterogenea che mostra diversi livelli di attivazione o espressione del marcatore5. Si può quindi presumere che la composizione e la struttura delle matrici derivate dal fibroblasto dipenderanno dallo stato e dalle caratteristiche del fibroblasto.
In questo contesto, l'obiettivo di questa metodologia è quello di stabilire un modello in vitro appropriato per la generazione di ECM da fibroblasti equivalenti all'impostazione ECM in vivo. Proponiamo questo approccio come metodologia traslazionale in vitro per ulteriori studi sulle funzioni delle cellule tumorali, come la chemoresistance o la migrazione, mediata da ECM. Come il nostro gruppo ha pubblicato altrove, i CAF possono essere ottenuti da campioni di tessuto freschi, ma va notato che la sopravvivenza dei CAF nella coltura è limitata e il loro numero di passaggio cellulare è ridottodi 6. Inoltre, le colture primarie CAF stabilite dai campioni dei pazienti possono essere utilizzate per la generazione di matrici. La manipolazione dell'espressione genica nei fibroblasti è anche un modo interessante per produrre varie matrici in vitro per valutare i possibili effetti sulla composizione della matrice, sull'orientamento delle fibre, ecc. Lungo queste linee, il nostro gruppo ha recentemente riportato il ruolo dei fibroblasti che esprimono le lumache nella composizione e nell'orientamento della fibra di varie matrici derivate7.
Inoltre, i CAF e gli ECM sono coinvolti nel sistema vascolare, sia nella generazione dei vasi che come parte dello strato esterno del vaso8. Il rimodellamento ECM induce l'angiogenesi; le metalloproteine a matrice (MMP) sembrano essere il tipo di enzima più importante che contribuisce a questo processo9,10. La vascolarizzazione dei tessuti delle cellule primarie che generano le ECM, le macromolecole ECM, i fattori di crescita residui inclusi nell'ECM, l'elasticità della matrice e lo spessore della matrice sono descritti come fattori coinvolti nell'attivazione delle cellule endoteliali11. Nei tumori, l'ipossia aumenta la rigidità ECM e la generazione di germogli endoteliali12. Inoltre, i CAF secernono il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) che stimolano l'angiogenesi nello stroma tumorale13. In questo campo, la generazione di matrici in vitro potrebbe essere utilizzata per studiare i processi di angiogenesi o l'azione MMP in diverse condizioni sperimentali. Pertanto, la riproduzione in vitro della matrice in vivo più analoga potrebbe essere uno strumento prezioso per studiare il ruolo di ECM nell'angiogenesi o nelle interazioni cellulari micro-ambientali.
La stimolazione dei fibroblasti coltivati con acido ascorbico per migliorare la deposizione di matrice e generare un ECM è un modo accettato di produrre matrici analoghe in vivo. Le linee cellulari fibroblaste immortali sono facilmente coltibili e vengono attivate da diversi fattori di crescita, come il PDGF-BB, il Tumor Necrosis Factor-z (TNF-z) o ilTGF-14. All'interno del TME, i CAF sintetizzano il collagene e la fibronectina come componenti principali di ECM4. Analogamente, questi componenti si trovano come componenti principali delle matrici derivate dal fibroblasto generato in vitro (Figura 1).
Ci sono diverse metodologie in vitro per simulare ECM in vivo. L'uso di piatti di coltura rivestiti con miscele di fibre ECM è stato esteso negli anni passati, ma questo approccio 2D ha richiesto un miglioramento delle strutture 3D, come i gel cross-linked (ad esempio, Matrigel)1. L'impostazione simile a Matrigel è diventata il metodo standard per simulare una matrice 3D. Fibrin è anche un'alternativa quando si generano matrici, ma fallisce in termini di resistenza e durata dell'ECM1. Il collagene utilizzato in combinazione con altri componenti ECM modifica alcuni dei problemi di cui sopra. Tuttavia, questi gel di collagene formano una forte rete con fibre che possono essere orientate, ma sono altamente eterogenee, che possono essere un problema nelle ripetizioni degli esperimenti1. Tuttavia, si deve presumere che, a seconda dell'obiettivo degli esperimenti, l'uso di Matrigel o di altri idrogel sia più appropriato (ad esempio, negli studi di contrazione a matrice in cui la contrazione del gel può essere facilmente rilevata).
La potenziale immunogenicità delle matrici generate potrebbe essere un problema negli esperimenti con alcuni tipi di cellule. Pertanto, per ridurre la possibilità di risposte immunitarie dovute alle cellule che generano ECM quando si utilizza il nostro metodo, le matrici vengono decellularizzate e lavate, anche se la rimozione dei frammenti cellulari non poteva essere totale15. L'ECM ideale deve essere compatibile con la coltura cellulare e in grado di comunicare e reagire ai segnali cellulari. La nostra procedura consente l'introduzione di cambiamenti senza difficoltà durante la produzione di ECM (ad esempio, aggiungendo fattori di crescita stimolanti per il fibroblasto).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I campioni di tessuto umano sono stati ottenuti con l'approvazione del Research Ethics Board dell'Ospedale Ramàn y Cajal, Madrid.
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparare la soluzione di gelatina 0,2%: aggiungere 1 g di gelatina a 500 mL di PBS. Autoclave la soluzione e tenere a 4 gradi centigradi. Filtrare con un filtro di 0,22 m prima dell'uso.
- Preparare 1% glutaraldeide: Aggiungere 1 mL del 25% soluzione di brodo di glutaraldeide a 24 mL di PBS. Filtrare con un filtro di 0,22 m prima dell'uso.
- Preparare 1 M di etanolamina: preparare la soluzione di etanolamina con filtro sterile H2O. con un filtro da 0,22 m prima dell'uso.
NOTA: Poiché l'etanolamina è dotata di un tappo di sicurezza, saranno necessari un ago e una siringa. - Preparare l'acido ascorbico: aggiungere 0,1 mL di 50 mg/mL soluzione di stock ascorbico (sensibile alla luce) a 100 mL di mezzo.
- Preparare il buffer di lisi: preparare PBS 0.5% Triton 100X con 20 nM di NH4OH. Aggiungere NH4OH a destra prima dell'uso.
- Preparare PBS Pen/Strep: diluire la soluzione di scorta Pen/Strep a 100 U/mL Pen e 100 G/mL Strep.
- Preparare DMEM con 10% FBS: Aggiungere 10% FBS a 500 mL di DMEM. Supplemento con 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL streptomycin, 0,1 mg/mL Normocin e 0,25 g/mL amphotericin B.
- Preparare il 2% di BSA decedotto: aggiungere 2 g di BSA a 100 mL di acqua sterile. Riscaldare in acqua bollente per 7 min.
- Preparare FBS con antibiotici: supplemento FBS con 200 U/mL penicillina, 200 g/mL streptomycin, 100 gentamicin g/mL e 2,5 g/mL amphotericinB.
2. Preparazione della coltura cellulare
- Linea cellulare fibroblasta immortalale
- Le telomerasi ricombinanti della coltura trafette hanno immortalato i fibroblasti di prepuzio umano (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) in DMEM con il 10% di FBS e si mantengono a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
- Cellule endoteliche
- Coltura cellule endoteliali vena ombelicale umana (HUVECs, ATCC PCS-100-013) in EBM-2 medio contenente 2% FBS e mantenere a 37 C e 5% CO2.
- Cultura primaria della fibrosità
NOTA: Per la creazione e la cultura CAF, il protocollo precedentemente pubblicato dal nostro gruppo è stato seguito6.- In breve, tagliare campioni di tessuto in piccoli pezzi di circa 2-3 mm3 e semi in FBS con alta concentrazione di antibiotici.
- Quando sono apparsi i primi fibroblasti, sostituire il mezzo con il supporto FBM per la manutenzione cellulare.
NOTA: A seconda dell'origine del tessuto, le colture cellulari possono essere facilmente contaminate. Lavare i campioni in PBS integrati con antibiotici, con tessuto altamente contaminato (ad esempio, il colon6)e agitare per 30-45 min.
3. Matrici 3D derivate da fibroblasti (adattate da Castell-Cros e Cukierman16)
- Aggiungete 2 mL di soluzione di gelatina dello 0,2% ad ogni pozzo di una piastra a 6 pozze e incubate per 1 h a 37 gradi centigradi o peruna a 4 gradi centigradi.
- Aspirare la gelatina e lavarla in 2 mL di PBS.
- Aggiungere 2 mL di 1% glutaraldeide e incubare per 30 min a RT. Glutaraldeide si agcirà gelatina.
- Aspirare glutaraldeide e lavare pozzi in 2 mL di PBS per 5 min. Ripetere 3 volte.
- Aggiungere 2 mL di etanolamina da 1 M e incubare per 30 min al RT. Ethanolamina agirà per bloccare la glutaraldeide rimanente.
- Aspirare etanolamina e lavare pozzi in 2 mL di PBS per 5 min. Ripetere 3 volte.
- Aggiungere 1 mL di DMEM con 10% FBS. Se il mezzo diventa immediatamente rosa, rimuovere il mezzo, lavare in 2 mL di PBS e aggiungere nuovamente 1 mL di DMEM con 10% FBS.
- Seme 1 mL di sospensione fibroblasta, con 5 x 105 cellule in ogni pozzo. Il volume totale in ogni pozzo sarà di 2 mL.
- Cellule di coltura fino a raggiungere la confluenza al 100%. Quindi rimuovere il mezzo e sostituire con DMEM con 10% FBS con 50 g/mL di acido ascorbico e un trattamento aggiuntivo se usato.
- Sostituire il supporto con DMEM fresco con 10% FBS e 50 g/mL di acido ascorbico ogni 2 giorni per 6 giorni.
NOTA: Se si utilizza un trattamento supplementare (ad esempio, PDGF-BB, TGF-o/o altri fattori di coltivazione), aggiungerli gli stessi giorni del trattamento con acido ascorbico. - Due giorni dopo l'ultimo trattamento dell'acido ascorbico, rimuovere il mezzo e lavare in 2 mL di PBS.
- Aggiungere lentamente 1 mL di tampone di lisi, preriscaldato a 37 gradi centigradi, ad ogni pozzo. Incubare per 5-10 min a RT fino a quando i fibroblasti sono lised (osservabile al microscopio).
- Con attenzione e senza rimuovere il buffer di lisi, aggiungere 2 mL di PBS. Poi aspirare circa 2,5 mL di PBS. Ripetere due volte per un totale di tre fumi.
- Infine, rimuovere 2,5 mL di PBS e aggiungere 2 mL di PBS con Pen/Strep (100 U/mL e 100 g/mL, rispettivamente). Sigillare con pellicola e mantenere a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
NOTA: A seconda dell'esperimento, l'archiviazione a lungo termine delle matrici generate può influire sui risultati. Si consiglia di utilizzare le matrici il più presto possibile, e ancora di più se l'esperimento prevede la semina cellulare, a causa della possibile degradazione delle proteine. Se le matrici vengono utilizzate per i saggi strutturali, come l'osservazione del collagene, le matrici possono essere fissate e conservate per periodi più lunghi. Questo protocollo è indicato per una piastra di coltura a 6 ben. Altre piastre possono essere utilizzate, ma i volumi reattivi e la concentrazione delle sospensioni cellulari devono essere ricalcolati in base all'area del pozzo.
4. Saggio di formazione del tubo
- Coltivare le cellule HUVEC in EBM-2 2% FBS fino alla confluenza massima.
- Sostituire il supporto con EBM-2 senza FBS per 8 h.
- Preparare le matrici prima di seeding delle celle.
- Rimuovere le matrici dal frigorifero e mettere per 1 h a RT.
- Matrice a blocchi aggiungendo 2 mL di BSA con denaturato a caldo. Incubare 1 h a 37 .
- Aspirate BSA e lavare in 2 mL di PBS.
- Seme 2 x 105 cellule HUVEC in mezzo fBS impoverino su ogni pozzo di una piastra di 6 pozze precedentemente rivestita con matrici derivate dal fibroblasto 3D.
- Incubare le cellule endoteliali a 37 gradi centigradi per 16 h.
- Esaminare la formazione di struttura tubo-simile sotto un microscopio di campo luminoso standard di ingrandimento 20-40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I fibroblasti stimolati PDGF-BB creano un ECM più spesso. Herrera ealtri hanno mostrato come i fibroblasti stimolati da PDGF hanno generato una matrice più spessa e un maggiore orientamento della fibra7. I fibroblasti BJ-hTERT sono stati incubati con o senza PDGF e le aree rappresentative osservate hanno mostrato una distribuzione cellulare più allineata nelle matrici prodotte dal fibroblasto stimolato da PDGF (Figura 1a). L'espressione della proteina del collagene I e della fibronectina è stata aumentata nelle matrici derivate dai fibroblasti stimolati da PDGF (Figura 1b) e, di conseguenza, lo spessore della matrice è stato aumentato (Figura 1c). Inoltre, collagene I e fibronectin mostrano modelli paralleli, come mostrato negli istogrammi direzionalità (Figura 1d).
Le matrici 3D derivate dai fibroblasti stimolati da PDGF-BB inducono la tubulogenesi nelle cellule endoteliali. Le cellule HUVEC sono state semiate su matrici decellularizzate derivate da fibroblasti BJ-hTERT stimolati o non stimolati da PDGF. Le cellule endoteliali seminano su matrici generate dai fibroblasti stimolati dal PDGF hanno mostrato strutture più capillari rispetto a condizioni non stimolate (Figura 2).
Figura 1: I fibroblasti stimolati da PDGF migliorano l'ECM più spesso e anatropico. (A) Immagini binarie rappresentative dell'orientamento cellulare dei fibroblasti BJ-hTERT trattati o meno con istogrammi PDGF-BB (sopra) e di direzionalità (sotto), che rappresentano la frequenza di distribuzione degli angoli cellulari (centrata sull'angolo di 0). (B) Aumento dell'espressione proteica delle proteine extracellulari fibronectina e collagene I nei fibroblasti stimolati da PDGF derivati da ECM. (C) Aumento dello spessore dell'ECM in tali ECM derivati da fibroblasti stimolati dal PDGF. (D) Aumento delle proteine e dell'organizzazione di proteine extracellulari come fibronectina e collagene I nei fibroblasti stimolati da PDGF derivati dall'ECM. Di seguito, istogrammi direzionalità. < 0,05; p < 0.001. Adattato da Herrera et al.7Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: i fibroblasti stimolati dal PDGF promuovono l'attivazione delle cellule endoteliali, osservata dalla formazione di strutture capillari su matrici derivate da fibroblasti stimolati da PDGF. Lo strumento "Analisi delle particelle" di ImageJ ha mostrato un tasso di aumento di 1,81 in HUVEC seminato su matrici da fibroblasti stimolati da PDGF per quanto riguarda quelli semidati su matrici da fibroblasti non stimolati. Adattato da Herrera et al.7Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le matrici possono essere generate con fibroblasti immortalati o colture fibroblaste primarie. I fibroblasti sono facili da mantenere nella cultura in vitro con un alto tasso di crescita e resistenza allo stress. Possono anche essere isolati dal tessuto post-mortem3, anche se la contaminazione potrebbe essere una restrizione, a seconda dell'origine del tessuto.
Il modello a matrice 3D offre un nuovo ed efficace sistema per studiare con successo la composizione ECM e l'orientamento della fibra. È adatto anche per l'analisi dello stato di attivazione del fibroblasto, dell'espressione genica/proteina, delle interazioni con altri tipi di cellule, ecc. È importante sottolineare che le matrici generate con fibroblasti da pazienti rendono possibile lo studio personalizzato dei meccanismi correlati allo stroma nei tumori. Ad esempio, questo approccio può essere applicato agli studi sulla chemio-resistenza, in cui l'ECM ha un ruolo importante. La traduzione di questo tipo di studio potrebbe aiutare nel processo decisionale per il trattamento dei pazienti nella pratica clinica, implementando la medicina personalizzata.
Anche se il protocollo a matrice 3D può essere noioso, risultati interessanti possono essere raggiunti seguendo le istruzioni. Va notato che sono necessarie più fasi di lavaggio, quindi evitare danni alla matrice è essenziale. Inoltre, quando vengono testate diverse condizioni di coltura cellulare con questo protocollo, le matrici devono essere generate contemporaneamente a causa di differenze minime che possono verificarsi durante gli esperimenti (ad esempio, utilizzando la stessa sospensione fibroblasta durante il seeding placche pretrattate).
Altri metodi di ingegneria tissutale sono in fase di sviluppo, ma sono necessari ulteriori passaggi come la sterilizzazione per creare ECM e tessuti compatibili per l'uso umano. Anche se stanno sorgendo nuove tecnologie, possono essere costose e possono essere difficili da adattare alle strutture di laboratorio standard. L'uso di CAF primari ottenuti da pazienti consente di generare "matrici personalizzate" per testare diversi trattamenti. Lungo questa linea, il nostro gruppo ha utilizzato questa metodologia per dimostrare che le matrici generate dai CAF sono diverse da quelle generate dagli NF, mostrando matrici più spesse e organizzate7. Abbiamo riferito che le strutture capillari derivate dalle cellule endoteliali dipendono dall'espressione fibroblasta Snail1, e ci sono studi futuri per osservare tale effetto sulle matrici derivate dai CAF.
ECM richiede ulteriori studi prima di poter comprendere i meccanismi sottostanti responsabili della resistenza alla chemioterapia o ricaduta tumorale. Pertanto, suggeriamo l'uso di matrici derivate da CAF dai tessuti dei pazienti oncologici come procedura per studiare il comportamento microambientale nel cancro e la comunicazione ECM con cellule tumorali o altre cellule stromali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 e RD12/0036/0041 dell'Instituto de Salud Carlos III; dalla Fondo europeo de Desarrollo Regional (FEDER); da parte di "CIBER de Càncer", CB16/12/00273 e CB16/12/00446, dall'Instituto de Salud Carlos III-FEDER; e dal Fundaciàn Cient-fica AECC (un approccio multiforme al cancro al pancreas bersaglio). Cristina Pea è stata insignita di un contratto Miguel Servet dell'Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ha aiutato con il testo inglese. Ringraziamo i membri del laboratorio per l'aiuto e i consigli durante questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
