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Biochemistry

उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण चयापचय का निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में केंद्रीय कार्बन और ऊर्जा चयापचय में शामिल 40 यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सेल मुक्त संश्लेषण मिश्रण उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर प्रभावी जुदाई के लिए aniline के साथ derivatized है और फिर समस्थानिक आंतरिक मानकों का उपयोग कर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा परिमाणित.

Abstract

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपी) प्रोटीन के इन विट्रो उत्पादन के लिए सिस्टम और सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक उभरती हुई तकनीक है। हालांकि, अगर CFPS प्रयोगशाला से परे ले जाने के लिए और सिर्फ समय विनिर्माण प्रौद्योगिकी में एक व्यापक और मानक बन जा रहा है, हम इन प्रणालियों के प्रदर्शन की सीमा को समझना चाहिए. इस प्रश्न की ओर, हमने ग्लाइकोलिसिस में शामिल 40 यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल विकसित किया है, पेंटोज फॉस्फेट मार्ग, ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र, ऊर्जा चयापचय और सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं में सहकारक पुनर्जनन। विधि 13सी-एनलाइन के साथ टैग आंतरिक मानकों का उपयोग करता है, जबकि नमूने में यौगिकों के साथ derivatized हैं 12सी-एनलाइन. आंतरिक मानकों और नमूना मिश्रित और उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / यौगिकों के सह-उत्सर्जन आयन दमन का सफाया, जहां औसत सहसंबंध गुणांक 0.988 था परिमाण के 2-3 आदेश पर चयापचय सांद्रता का सही परिमाण की अनुमति. चालीस यौगिकों में से पांच aniline के साथ untagged थे, तथापि, वे अभी भी CFPS नमूना में पाया गया और एक मानक वक्र विधि के साथ परिमाणित. क्रोमैटोग्राफी रन को पूरा करने के लिए लगभग 10 मिनट लगते हैं। एक साथ लिया, हम एक एकल LC/MS रन में CFPS में शामिल 40 यौगिकों को अलग और सही मात्रा में करने के लिए एक तेजी से, मजबूत विधि विकसित की है। विधि सेल मुक्त चयापचय की विशेषता के लिए एक व्यापक और सटीक दृष्टिकोण है, ताकि अंततः, हम समझते हैं और उपज, उत्पादकता और सेल मुक्त प्रणाली की ऊर्जा दक्षता में सुधार कर सकते हैं.

Introduction

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (CFPS) प्रोटीन और रसायनों के निर्माण के लिए एक आशाजनक मंच है, एक आवेदन है कि परंपरागत रूप से जीवित कोशिकाओं के लिए आरक्षित किया गया है. सेल-मुक्त प्रणालियां कच्चे सेल निष्कर्षों से प्राप्त होती हैं और सेल वृद्धि1से जुड़ी जटिलताओं को समाप्त करती हैं। इसके अलावा, CFPS एक सेल दीवार के हस्तक्षेप के बिना चयापचयों और जैव संश्लेषण मशीनरी के लिए सीधी पहुँच के लिए अनुमति देता है. हालांकि, सेल मुक्त प्रक्रियाओं के प्रदर्शन की सीमा की एक मौलिक समझ की कमी रही है. मेटाबोलाइट परिमाणीकरण के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियां चयापचय की विशेषता के लिए मूल्यवान हैं और चयापचय अभिकलन मॉडल2,3,4के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं। मेटाबोलाइट सांद्रता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य तरीकों में परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), फूरिये ट्रांसफॉर्म-इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटी-आईआर), एंजाइम-आधारित परख, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)5,6,7 शामिल हैं ,8. हालांकि, इन विधियों अक्सर कुशलतापूर्वक एक बार में कई यौगिकों को मापने के लिए अपनी असमर्थता द्वारा सीमित कर रहे हैं और अक्सर एक नमूना आकार ठेठ सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं से अधिक की आवश्यकता होती है. उदाहरण के लिए, एंजाइम-आधारित assays अक्सर केवल एक रन में एक एकल यौगिक मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और सीमित कर रहे हैं जब नमूना आकार छोटा है, जैसे सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में (आमतौर पर एक 10-15 डिग्री सेल्सियस पैमाने पर चला). इस बीच, NMR का पता लगाने और परिमाणीकरण5के लिए चयापचयों की एक उच्च बहुतायत की आवश्यकता है.  इन कमियों की ओर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस) के साथ मिलकर क्रोमैटोग्राफी विधियों में कई लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें उच्च संवेदनशीलता और एक साथ कई प्रजातियों को मापने की क्षमता9; हालांकि, संख्या और प्रजातियों की विविधता मापा जा रहा है के साथ विश्लेषणात्मक जटिलता काफी बढ़ जाती है। इसलिए, ऐसे तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो एलसी/एमएस प्रणालियों की उच्च-थ्रूपुट क्षमता को पूरी तरह से महसूस करते हैं। एक नमूने में यौगिकों तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कर रहे हैं और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पहचान की. यौगिक के संकेत अपनी एकाग्रता और आयनन दक्षता पर निर्भर करता है, जहां आयनन यौगिकों के बीच भिन्न हो सकते हैं और भी नमूना मैट्रिक्स पर निर्भर हो सकता है.

नमूने और मानकों के बीच एक ही आयनन दक्षता प्राप्त करना एक चुनौती है जब LC/MS का उपयोग करने के लिए analytes मात्रा. इसके अतिरिक्त, प्रोटॉन आत्मीयता और ध्रुवता10में संकेत विभाजन और विषमता के कारण मेटाबोलाइट विविधता के साथ परिमाणीकरण अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। अंत में, नमूने के सह-इल्ाउटिंग मैट्रिक्स भी यौगिकों के आयनन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, चयापचयों को रासायनिक रूप से derivatized किया जा सकता है, LC/MS सिस्टम द्वारा पृथक्करण संकल्प और संवेदनशीलता में वृद्धि, जबकि साथ ही कुछ मामलों में संकेत विभाजन को कम करते हुए10,11. रासायनिक व्युत्पत्तीकरण आयनन दक्षता 11 में वृद्धि करने के लिए आवेश या हाइड्रोफोबिकिटी जैसे भौतिक गुणों को समायोजित करने के लिए चयापचयों के विशिष्ट कार्यात्मक समूहों को टैग करके काम करताहै। विभिन्न टैगिंग एजेंटों विभिन्न कार्यात्मक समूहों (उदा., amines, hydroxyls, फॉस्फेट, carboxylic एसिड, आदि) को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एनिलिन, एक ऐसा ही व् युद्धिकरण एजेंट, एक ही बार में अनेक कार्यात्मक समूहों को लक्षित करता है, और हाइड्रोफिलिक अणुओं में हाइड्रोफोबिक घटक जोड़ता है, जिससे उनके पृथक्करण संकल्प और संकेत12में वृद्धि होती है। सह-eluting मैट्रिक्स आयन दमन प्रभाव को संबोधित करने के लिए, यांग और सहकर्मियों समूह विशिष्ट आंतरिक मानक प्रौद्योगिकी (GSIST) लेबलिंग जहां मानकों 13सी anisopes के साथ टैग और नमूने के साथ मिश्रित कर रहे हैं पर आधारित एक तकनीक विकसित 12,13. चयापचय और इसी आंतरिक मानक एक ही आयनन दक्षता के बाद से वे सह-ल्यूट है, और उनकी तीव्रता अनुपात प्रयोगात्मक नमूना में एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल का पता लगाने और ग्लाइकोलिसिस में शामिल 40 यौगिकों की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित की है, पेंटोज फॉस्फेट मार्ग, tricarboxylic एसिड चक्र, ऊर्जा चयापचय और CFPS प्रतिक्रियाओं में cofactor पुनर्जनन. विधि GSIST दृष्टिकोण पर आधारित है, जहां हम 12सी-एनलाइन और 13सी-एनिलाइन का उपयोग टैग करने के लिए, का पता लगाने, और उलट चरण LC /MS का उपयोग चयापचयों मात्रा निर्धारित. सभी यौगिकों की रैखिक श्रेणी 0ण्988 के औसत सहसंबंध गुणांक के साथ परिमाण के 2-3 क्रम फैला हुआ है। इस प्रकार, विधि सेल मुक्त चयापचय पूछताछ करने के लिए एक मजबूत और सटीक दृष्टिकोण है, और संभवतः पूरे सेल अर्क.

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Protocol

1. एनिलाइन टैगिंग के लिए अभिकर्मकों की तैयारी

  1. पीएच 4.5 पर 6 एम एनलाइन समाधान तैयार की। एक हुड में कार्य करना, एलसीएमएस ग्रेड पानी के 337.5 डिग्री सेल्सियस और 12 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के 112.5 डिग्री सेल्सियस के साथ एनलाइन के 550 डिग्री एल को एक अपकेंद्रण ट्यूब में संयोजित करें। भंवर अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
    नोट: Aniline 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    चेतावनी: Aniline अत्यधिक विषाक्त है और एक धूआं हुड में साथ काम किया जाना चाहिए. हाइड्रोक्लोरिक एसिड अत्यधिक संक्षारक है
  2. पीएच 4.5 पर 6 एम 13सी ऐनिलाइन समाधान तैयार करें। 13ब् 6-एनिलाइन के 250 मिलीग्राम को 132 डिग्री सेल्सियस जल के साथ तथा 12 उचक् ट भंवर के 44 डिग्री सेल्सियस को अच्छी तरह से मिलाकर 4 डिग्री सेल्सियस पर Store करें।
  3. 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (EDC) समाधान तैयार करें। हर नमूने को टैग करने और भंवर को अच्छी तरह से टैग करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पानी में 2 मिलीग्राम ईडीसी को भंग करें।
    नोट: EDC समाधान प्रतिक्रिया के रूप में एक ही दिन तैयार किया जाना चाहिए. ईडीसी एनीलाइन12के साथ यौगिकों के व्युत्पत्ति के लिए उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है।

2. मानकों की तैयारी

  1. एलसी/एमएस ग्रेड वाटर (सारणी 1)में घुले हुए सभी यौगिकों के अलग-अलग स्टॉक समाधान करें।
  2. आंतरिक मानक स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. निकोटिनमाइड एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड (एनएडी), निकोटिनामिडी एडेनेडिन डेन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (एनएडीपी), फ्लेविन एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड (एफएडी), एसिटाइल कोएंजाइम ए (एसीए), और ग्लिसरोल 3-फॉस्फेट (ग्लि3पी) को छोड़कर सभी यौगिकों का मिश्रण करें। सभी यौगिकों का 2 एमएम स्टॉक समाधान बनाएं।
  3. एक 2 m स्टॉक समाधान बनाने के लिए उपयुक्त वॉल्यूम के साथ NAD, NADP, FAD, ACA, और Gly3P का मिश्रण करें।

3. नमूने की तैयारी (चित्र 1)

  1. Quench और प्रतिक्रिया करने के लिए बर्फ ठंडा 100% इथेनॉल के एक बराबर मात्रा जोड़कर एक सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया में प्रोटीन वेग. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर नमूना सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेटेंट को एक नई अपकेंद्रण नली में स्थानांतरित करें।
    नोट: नमूने इस बिंदु पर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण किया

4. लेबलिंग प्रतिक्रिया

  1. 12C-aniline समाधान के साथ लेबलिंग नमूना
    1. 6 डिग्री सेल्सियस नमूने को एक नई अपकेंद्री नली में स्थानांतरित करें और मात्रा को पानी के साथ 50 डिग्री सेल्सियस तक लाएं.
      नोट: वॉल्यूम नमूना आकार विशिष्ट CFPS प्रतिक्रिया पर निर्भर हो सकता है।
    2. 200 मिलीग्राम/एमएल ईडीसी समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें।
    3. 12C-aniline समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें.
      नोट: एनिलाइन समाधान दो चरणों में अलग करता है। प्रतिक्रिया को जोड़ने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं.
    4. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ प्रतिक्रिया भंवर.
    5. 2 ज के बाद, शेकर से ट्यूब ों को हटा दें और एक धूआं हुड में प्रतिक्रिया करने के लिए ट्राइएथिलामाइन (टीईए) के 1.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
      नोट: Triethylamine समाधान है जो एनिलाइन टैगिंग प्रतिक्रिया बंद हो जाता है और यौगिकों को स्थिर के पीएच उठाती है.
      चेतावनी: Triethylamine विषाक्त है और आंखों और श्वसन पथ की जलन का कारण बनता है.
    6. 3 मिनट के लिए 13,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  2. 13सी-एनिलाइन समाधान के साथ आंतरिक मानकों को लेबल करना
    1. 50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा के साथ 80 डिग्री सेल्सियस के लिए आंतरिक स्टॉक समाधान को विलेय करें।
      नोट: आंतरिक मानकों की एकाग्रता प्रयोगात्मक नमूना के करीब स्तरों के लिए समायोजित किया जा सकता है.
    2. 200 मिलीग्राम/एमएल ईडीसी समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें।
    3. 13C-aniline समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें.
    4. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ प्रतिक्रिया भंवर.
    5. 2 ज के बाद, शेकर से ट्यूबों को हटा दें और एक धूआं हुड में प्रतिक्रिया करने के लिए टीईए के 1.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    6. 3 मिनट के लिए 13,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. टैग किए गए आंतरिक मानक और टैग किए गए नमूने का संयोजन
    1. 12सी-एनलाइन के मिश्रण 25 डिग्री सेल्सियस लेबल नमूना 13सी-एनलाइन लेबल मानक के 25 डिग्री एल के साथ।
    2. एक ऑटो-नमूना शीशी के लिए स्थानांतरण और LC/MS प्रक्रिया द्वारा विश्लेषण।
  4. अनटैग चयापचयों के लिए एक मानक वक्र बनाना
    1. अनटैग ्ड मेटाबोलाइट्स (एनएडीपी, एफएडी, एसीए, और Gly3P) के स्टॉक समाधान को 320 $M, 80 डिग्री एम, 20 डिग्री एम और 50 डिग्री सेल्सियस की मात्रा के साथ अंतिम सांद्रता के लिए।
    2. 200 मिलीग्राम/एमएल ईडीसी समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें।
    3. 12C-aniline समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें.
    4. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ प्रतिक्रिया भंवर.
    5. 2 ज के बाद, शेकर से ट्यूबों को हटा दें और एक धूआं हुड में प्रतिक्रिया करने के लिए टीईए के 1.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    6. 3 मिनट के लिए 13,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    7. एक ऑटो-प्रतिदर्शी शीशी के लिए supernatant स्थानांतरण और LC/MS प्रक्रिया द्वारा विश्लेषण।
      नोट: untagged चयापचयों नमूना मैट्रिक्स समान आयनन दक्षता बनाए रखने के लिए प्रतिकृति करने के लिए नमूना के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें।

5. एलसी/एमएस प्रक्रिया का सेटअप

  1. विलायकों की तैयारी
    1. एसिटिक एसिड के साथ पीएच 4.75 को समायोजित 5 एमएम त्रि-ब्यूटिलामाइन (टीबीए) जलीय समाधान तैयार करें।
      नोट: मोबाइल चरण में TBA analytes अच्छा संकल्प और जुदाई14को प्राप्त करने में मदद करता है।
    2. एसीटोनिट्रिल (एसीएन) में 5 एमएम टीबीए तैयार करें।
    3. 5% पानी और 95% एसीएन के साथ धोने विलायक तैयार करें।
    4. 95% पानी और 5% ए सी एन के साथ शुद्ध विलायक तैयार करें।
  2. एमएस शर्तों का सेटअप
    1. 520 डिग्री सेल्सियस, -0.8 केवी के नकारात्मक केशिका वोल्टता, 0.8 केवी के सकारात्मक केशिका वोल्टता के साथ जांच तापमान के साथ द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को नकारात्मक आयन मोड में सेट करें, और सॉफ्टवेयर को 5 बिंदु/s पर डेटा प्राप्त करने के लिए सेट करें।
    2. निर्दिष्ट शंकु voltages और बड़े पैमाने पर चार्ज (m/z) मान के साथ प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए चयनित आयन रिकॉर्डिंग (SIR) सेट करें। तालिका 1देखें.
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार LC/MS प्रारंभ करना
    1. 3 मिनट के लिए विलायक प्रबंधक में प्रधानमंत्री विलायक लाइनों।
    2. प्रधानमंत्री धोने विलायक (5% पानी, 95% एसीएन) और पर्ज विलायक (95% पानी, 5% ACN) के लिए 15 s के लिए 5 चक्र.
    3. नमूना प्रबंधक को 10 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें.
    4. एक C18 (1.7 डिग्री, 2.1 मिमी x 150 मिमी) स्तंभ स्थापित करें और 10 मिनट के लिए 0.3 एमएल/मिनट पर 100% ACN के साथ स्तंभ प्रारंभ करें।
    5. बफर्स के साथ सॉल्वैंट्स शुरू करने से पहले 10 मिनट के लिए 0.3 एमएल/मिन पर कॉलम को 95% पानी और 5% ACN पर शर्त करें।
    6. स्थिति 95% विलायक ए (5 mM TBA जलीय, पीएच 4.75) और 5% विलायक बी (5 एमएम TBA ACN में) पर 0.3 mL/min पर 10 मिनट के लिए स्तंभ.
    7. 95% विलायक ए और 5% विलायक बी पर शुरू करने के साथ एक ढाल प्रोटोकॉल सेट करें, 10 मिनट में 70% विलायक बी के लिए उठाया, 2 मिनट में 100% विलायक बी के लिए उठाया और 3 मिनट के लिए 100% विलायक बी पर आयोजित किया। प्रारंभिक स्थितियों के लिए वापसी (95% विलायक ए , 5% विलायक बी) 1 मिनट से अधिक और 9 मिनट के लिए पकड़ करने के लिए फिर से स्तंभ समानता.
    8. ग्रेडिएंट प्रोटोकॉल के साथ स्तंभ को स्तंभ पर किसी भी इंजेक्शन से 3 बार पहले शर्त करें।
  4. नमूना और मानकों इंजेक्शन
    1. कॉलम में नमूने के 5 डिग्री सेल्सियस को इंजेक्ट करें और 12C-aniline टैग किए गए नमूने के लिए उपयुक्त m/z आयन तीव्रता प्राप्त करें।
    2. एक ही नमूने के 5 डिग्री सेल्सियस को फिर से इंजेक्ट करें, लेकिन इस बार 13सी-एनलाइन टैग किए गए मानकों के लिए m/z आयन तीव्रता प्राप्त करें।
      नोट: हमारे LC/MS सिस्टम निर्दिष्ट SIR समय विंडो पर 12C और 13C m/z तीव्रता दोनों प्राप्त करने में असमर्थ है, क्योंकि यह निर्दिष्ट समय विंडो में प्राप्त करने के लिए बहुत अधिक डेटा है। इसलिए, हम एक ही नमूना दो बार इंजेक्ट.
    3. सबसे कम एकाग्रता से उच्चतम करने के लिए अनटैग्ड चयापचय मानकों इंजेक्शन और उपयुक्त m/z आयन तीव्रता रिकॉर्ड।

6. परिमाणीकरण

  1. निर्यात विधि बनाना
    1. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, फ़ाइल का चयन करें और नई विधि gt; निर्यात विधि|
    2. कोई फ़ाइल नाम निर्दिष्ट करें, जैसे AnilineTagging]दिनांक.
    3. ASCII निर्यात करें फ़ाइल की जाँच करें और करने के लिए पाठ फ़ाइल निर्यात करने के लिए कोई निर्देशिका का चयन करें।
    4. रिपोर्ट प्रकारमें, सभी के द्वारा सारांशका चयन करें.
    5. सीमांककमें, स्तंभ के लिए,एक का चयन करें . पंक्तिके लिए, [cr]if]का चयन करें.
    6. तालिकामें, नमूना नाम, क्षेत्र, ऊँचाई, राशि और इकाइयाँशामिल करने के लिए निर्यात करें और फिर तालिका संपादित करें का चयन करें .
    7. निर्यात विधि सहेजें.
  2. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आंतरिक मानकों के साथ चयापचयों की मात्रा
    1. नमूना सेट टैब के अंतर्गत, संबंधित LC/MS चलाने के लिए राइट क्लिक करें और चैनल के रूप में देखेंका चयन करें।
    2. एक इंजेक्शन के 13सी-एनलाइन आंतरिक मानकों के लिए सभी SIR चैनलों का चयन करें, राइट क्लिक करें और समीक्षाका चयन करें।
    3. LC संसाधन विधि लेआउट विंडो स्वचालित रूप से प्रकट नहीं होता है, तो देखें और संसाधन विधि लेआउटपर जाएँ।
    4. प्रसंस्करण विधि लेआउटमें, एकीकरण टैब पर जाएँ और एल्गोरिथ्म के रूप में ApexTrack सेट.
    5. चिकना टैब पर जाएँ और प्रकार को माध्य और स्मूथिंग स्तर को 13पर सेट करें.
      नोट: किसी भी smoothing स्तर के रूप में लंबे समय के रूप में यह सभी नमूनों में संगत है, चुना जा सकता है.
    6. एमएस चैनल टैब में, एमएस 3 डी प्रसंस्करणअक्षम करें।
    7. SIR चैनल विंडो में, एक समय में प्रत्येक पीक, एक चैनल एकीकृत करें। एक बार एक चोटी एकीकृत हो जाने पर, विकल्प पर जाएँ और परिणाम से भरें और शिखर का विवरण घटक टैब में भरा जाएगा. पीक नाम को संगत यौगिक नाम में बदलें.
    8. एक बार सभी SIR चैनलों का मूल्यांकन किया गया है, प्रसंस्करण विधि और बंद विंडो सहेजें।
    9. 13सी-एनलाइन और 12सी-एनिलाइन टैग किए गए नमूने के सभी SIR चैनलों का चयन करें, राइट क्लिक करें और प्रक्रियाका चयन करें।
    10. प्रक्रिया बॉक्स की जाँच करें, निर्दिष्ट संसाधन विधि का उपयोग करें का चयन करें,और संसाधन विधि है कि अभी सहेजा गया है का चयन करें. निर्यात बॉक्स भी चेक करें, निर्दिष्ट निर्यात विधि का उपयोग करें का चयन करें और पहले बनाई गई सहेजी गई निर्यात विधि चुनें. ठीक क्लिक करें.
    11. Excel के साथ निर्यात की गई पाठ फ़ाइल खोलें और उपयोग करके अज्ञात यौगिक की सांद्रता की गणना करें:
      Equation 1
      जहां सीएक्स, मैं मेटाबोलाइट मैं, एकएक्स, मैं अज्ञात मेटाबोलाइट मैं, एकstd, मैं चयापचय मैं, सीएसटीडी, मैं के आंतरिक मानक के एकीकृत क्षेत्र है के लिए अज्ञात नमूना की एकाग्रता है मेटाबोलाइट i के आंतरिक मानक की एकाग्रता, और डी कमजोर पड़ने कारक है.
  3. मानक वक्र के साथ अनटैग्ड चयापचयों की मात्रा
    1. नमूना सेट टैब के अंतर्गत, संबंधित LC/MS चलाने के लिए राइट क्लिक करें और चैनल के रूप में देखेंका चयन करें।
    2. एक इंजेक्शन के अनटैग किए गए मानकों के लिए सभी SIR चैनलों का चयन करें, राइट क्लिक करें और समीक्षाका चयन करें।
    3. LC संसाधन विधि लेआउट विंडो स्वचालित रूप से प्रकट नहीं होता है, तो देखें और संसाधन विधि लेआउटपर जाएँ।
    4. प्रसंस्करण विधि लेआउट में, एकीकरण टैब पर जाएँ और एल्गोरिथ्म के रूप में ApexTrack सेट.
    5. चिकना टैब पर जाएँ और प्रकार को माध्य और स्मूथिंग स्तर को 13पर सेट करें.
      नोट: किसी भी smoothing स्तर के रूप में लंबे समय के रूप में यह सभी नमूनों में संगत है, चुना जा सकता है.
    6. एमएस चैनल टैब में, एमएस 3 डी प्रसंस्करणअक्षम करें।
    7. SIR चैनल विंडो में, एक समय में प्रत्येक पीक, एक चैनल एकीकृत करें। एक बार एक चोटी एकीकृत हो जाने पर, विकल्प पर जाएँ और परिणाम से भरें और शिखर का विवरण घटक टैब में भरा जाएगा. पीक नाम को संगत यौगिक नाम में बदलें.
    8. एक बार सभी SIR चैनलों का मूल्यांकन किया गया है, प्रसंस्करण विधि और बंद विंडो सहेजें।
    9. नमूना सेट टैब के अंतर्गत, नमूना सेट पर राइट क्लिक करें और वैकल्पिक नमूनाका चयन करें.
    10. नई विंडो में मात्रा चुनें.
    11. प्रक्रिया विधि से प्रतिलिपि का चयन करें और प्रक्रिया विधि है कि अभी सहेजा गया था का चयन करें।
    12. प्रत्येक शीशी के लिए प्रत्येक मेटाबोलाइट की सांद्रता दर्ज करें और प्रत्येक घटक (या संबंधित इकाई) के लिए इकाई को $lt; $M के रूप में दर्ज करें और ठीकका चयन करें।
    13. नमूना सेट फिर से चयन करें, राइट क्लिक करें, के रूप में देखें और चैनल|
    14. मानकों के लिए अनटैग किए गए चयापचयों के सभी SIR चैनलों का चयन करें, राइट क्लिक करें और प्रक्रियाका चयन करें।
    15. प्रक्रिया बॉक्स चेक करें और निर्दिष्ट संसाधन विधि का उपयोग करेंचुनें. उपयुक्त संसाधन विधि का चयन करें और ठीकक्लिक करें.
    16. नमूने के लिए सभी untagged चयापचयों के लिए SIR चैनलका चयन करें, सही क्लिक करें और प्रक्रियाका चयन करें।
    17. प्रक्रिया बॉक्स चेक करें, निर्दिष्ट संसाधन विधि का उपयोग करें का चयन करें, और संसाधन विधि है कि अभी सहेजा गया था का चयन करें। निर्यात बॉक्स भी चेक करें, निर्दिष्ट निर्यात विधि का उपयोग करें का चयन करें और पहले बनाई गई सहेजी गई निर्यात विधि चुनें. ठीकक्लिक करें.
    18. मानक वक्र के साथ अनटैग ्डमेटालाइट्स को क्वांटिफयित करें और परिणामों को निर्दिष्ट निर्देशिका में किसी पाठ फ़ाइल में निर्यात करें.

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Representative Results

एक सबूत के अवधारणा के रूप में, हम एक ई कोलाई आधारित CFPS प्रणाली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त में चयापचयों की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया.  CFPS प्रतिक्रिया (14 जेडएल) बुझा दिया गया था और इथेनॉल के साथ deproteinized. CFPS नमूना तो 12सी-एनलाइन के साथ टैग किया गया था, जबकि मानकों 13सी-एनलाइन के साथ टैग किया गया था। टैग किए गए नमूने और मानकों को तब संयुक्त किया गया था और एलसी/एमएस में इंजेक्ट किया गया था (चित्र 1)। प्रोटोकॉल का पता लगाया और मात्रा निर्धारित 40 चयापचयों केंद्रीय कार्बन और ऊर्जा चयापचय में शामिल आंतरिक मानकों का उपयोग कर, जबकि के लिए एक मानक वक्र चयापचयों कि aniline के साथ टैग नहीं किया गया था के 5 भी विकसित किया गया था (चित्र 2). इन मार्गों में शामिल विविध चयापचयों फॉस्फोरोलेट शर्करा का एक वर्ग थे, फॉस्फोकार्बोक्सिलिक एसिड, carboxylic एसिड, न्यूक्लिओटाइड, और cofactors. ऐनिलाइन के साथ व्युत्पत्ति ने हाइड्रोफिलिक अणुओं में हाइड्रोफोबिक मोइटी की शुरुआत की जिससे उत्क्रमित चरण वर्णलेखोग्राफी12का उपयोग करके अधिक प्रभावी पृथक्करण में मदद की गई. इसके अतिरिक्त, विधि ने संरचनात्मक समीपीय युग्मों जैसे ग्लूकोज 6-फॉस्फेट और फ्रुक्टोज 6-फॉस्फेट को एकल एलसी/एमएस रन में अलग करने में सक्षम किया। प्रत्येक यौगिक के द्रव्यमान ओवर चार्ज (म/ज) अनुपात और प्रतिधारण समय की पहचान प्रयोग से पहले एक समय में एक यौगिक के 1 mM इंजेक्शन लगाकर और द्रव्यमान स्पेक्ट्रम की तुलना रिक्त (सारणी 1)से की गई थी।

एक मानक वक्र का उत्पादन करके सभी यौगिकों के लिए रेखीयता का पता लगाने और श्रेणी की सीमा का अनुमान लगाया गया था जो 0ण्10 उ से 400 उ (सारणी 2)तक था। सभी यौगिकों के लिए औसत सहसंबंध गुणांक (त्2) 0ण्988 था तथा अधिकांश यौगिकों की रैखिक श्रेणी 3-आदेशों का परिमाण था। तीन यौगिकों उल्लेखनीय संतृप्ति प्रभाव था, विशेष रूप से अल्फा-केटोग्लूटारेट जो एक रैखिक रेंज से था 0.1 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस. आइसोसिट्रेट और साइट्रेट भी 100 डिग्री से ऊपर संतृप्ति प्रभाव था.

Figure 1
चित्र 1: एनिलाइन टैगिंग के लिए कार्यप्रवाह का Schematic. सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया deproteinized और 12सी-एनिलीन के साथ टैग किया गया है, जबकि एक मानक स्टॉक मिश्रण 13सी-एनलाइन के साथ टैग किया गया है। दोनों मिश्रण तो एक 1:1 volumetric अनुपात में मिलाया जाता है और LC/MS द्वारा विश्लेषण किया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 2
चित्रा 2: 40 चयापचयों के लिए चयनित आयन क्रोमैटोग्राम को अधिविक्त किया गया। 40 चयापचयों के एक 40 डिग्री मीटर मानक मिश्रण के एक एकल एलसी/एमएस रन से मास क्रोमैटोग्राम। चोटियों को उनके प्रतिधारण समय और प्रत्येक यौगिक के लिए m/z मूल्यों द्वारा पहचाना गया. पूर्ण यौगिक नाम और उनके संक्षिप्त नाम तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीक संख्या Metabolite संक्षिप्तिकरण केजीजी आईडी अवधारण समय (न्यूनतम) 12C m/z 13C m/z nonlabel m/z Cv एमएस प्रजाति
1 ग्लिसरोल 3-फॉस्फेट Gly3P C00093 3.85 153 10 एम - H2O - एच
2 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड Nad C00003 3.96 698 10 एम + सीएल - एच
3 ग्लूकोज जीएलसी C00031 4.06 289.9 296 15 एम + ए + सीएल - एच
4 सेडोहेप्टुलोस 7-फॉस्फेट S7P C05382 5.41 364 370 10 एम + ए - एच
5 फ्रुक्टोज 6-फॉस्फेट F6P C00085 5.48 334 340 10 एम + ए - एच
6 ग्वानोसाइन मोनोफॉस्फेट जीएमपी C00144 5.57 437.05 443 10 एम + ए - एच
7 रिबूलोस 5-फॉस्फेट आरएल 5 पी C00199 5.58 304 310 10 एम + ए - एच
8 साइटिडीन मोनोफॉस्फेट Cmp C00055 5.59 397.09 403 10 एम + ए - एच
9 लैक्टेट Lac C00186 5.77 164.05 170 10 एम + ए - एच
10 एडिनोसाइन मोनोफॉस्फेट Amp C00020 5.85 421.1 427.1 10 एम + ए - एच
11 यूरिडीन मोनोफॉस्फेट Ump C00105 5.88 398.07 404 10 एम + ए - एच
12 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट एनएडीपी C00006 6.39 724 10 एम - H2O - एच
13 3-फॉस्फोग्लिसेरिक अम्ल 3पीजी C00197 6.63 242 248.06 15 M + A - H2O - H
14 साइटिडीन डाइफॉस्फेट Cdp C00112 6.72 477 483 10 एम + ए - एच
15 ग्वानोसाइन डाइफॉस्फेट सकल घरेलू उत्पाद C00035 6.87 517 523 10 एम + ए - एच
16 एडेनोसाइन डाइफॉस्फेट Adp C00008 6.94 501 507 10 एम + ए - एच
17 यूरिडीन डाइफॉस्फेट Udp C00015 6.97 478 484 10 एम + ए - एच
18 फ्लेविन एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड सनक C00016 7.03 784.15 15 एम - एच
19 फ्रुक्टोज 1,6-बिसफॉस्फेट एफ 16 पी C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A - H2O - H
20 ग्लूकोनेट 6-फॉस्फेट 6पीजी C00345 7.11 425.1 437 10 एम + 2A - एच
21 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड कम NADH (नाड) C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O - निकोटिनमाइड - एच
22 ग्लूकोज 6-फॉस्फेट जी 6पी C00668 7.32 409.1 421.1 10 एम + 2A - एच
23 रिबोस 5-फॉस्फेट R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 एम + 2A - एच
24 एरिथ्रोस 4-फॉस्फेट E4P C00279 7.71 348.9 361 10 एम + 2A - एच
25 साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट Ctp C00075 7.84 557 563 5 एम + ए - एच
26 ग्वानोसाइन ट्राइफॉस्फेट Gtp C00044 7.93 597 603 5 एम + ए - एच
27 ऑक्सालेटेट OAA C00036 7.94 281 293 25 एम + 2A - एच
28 अल्फा-केटोग्लूटारेट Akg C00026 7.95 295 307.1 15 एम + 2A - एच
29 यूरिडीन ट्राइफॉस्फेट Utp C00075 7.97 558 564 10 एम + ए - एच
30 एडिनोसाइन ट्राइफॉस्फेट एटीपी C00002 8.03 581 587 15 एम + ए - एच
31 फ्यूरेट FUM C00122 8.09 265 277.1 10 एम + 2A - एच
32 पायरूवट PYR C00022 8.09 162 168 25 एम + ए - एच
33 मलेट मल C00149 8.09 283.06 295.15 10 एम + 2A - एच
34 डी-ग्लिसेरल्डिहाइड 3-फॉस्फेट अंतर C00118 8.09 319 331.1 5 एम + 2A - एच
35 एसिटाइल-कोएंजाइम ए Aca C00024 8.16 790 10 एम - H2O - एच
36 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट कम एनएडीपीएच C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A - निकोटिनामिडी - एच
37 फॉस्फोनेनोलपाइरुटेट पीईपी C00074 8.28 317 329.1 20 एम + 2A - एच
38 ससिनेट एसयूसीसी C00042 8.64 267.07 279.1 15 एम + 2A - एच
39 आइसोसिट्रेट आईसीआईटी C00311 10.13 398 416 10 M + 3A - H2O - एच
40 साइट्रेट सीआईटी C00158 10.46 416.1 434.06 20 एम + 3A - एच

तालिका 1: चयापचयों की पहचान और लेबलिंग परिणाम। प्रत्येक यौगिक की संगत शिखर संख्या, प्रतिधारण समय, बिना लेबल के लिए m/z मान, 12C और 13C लेबल, और एमएस प्रजातियों. एमएस प्रजाति, Aniline टैग के लिए एक खड़ा है.

पीक नं. Metabolite संक्षिप्तिकरण केजीजी आईडी एकाग्रता (एमएम) एसडी (n ] 3) जांच की सीमा (जेडएम) रैखिक श्रेणी की सीमा ($M) R$ 2
1 ग्लिसरोल 3-फॉस्फेट Gly3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड Nad C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 ग्लूकोज जीएलसी C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 सेडोहेप्टुलोस 7-फॉस्फेट S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 फ्रुक्टोज 6-फॉस्फेट F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 ग्वानोसाइन मोनोफॉस्फेट जीएमपी C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 रिबूलोस 5-फॉस्फेट आरएल 5 पी C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 साइटिडीन मोनोफॉस्फेट Cmp C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 लैक्टेट Lac C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 एडिनोसाइन मोनोफॉस्फेट Amp C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 यूरिडीन मोनोफॉस्फेट Ump C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट एनएडीपी C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-फॉस्फोग्लिसेरिक अम्ल 3पीजी C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 साइटिडीन डाइफॉस्फेट Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 ग्वानोसाइन डाइफॉस्फेट सकल घरेलू उत्पाद C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 एडेनोसाइन डाइफॉस्फेट Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 यूरिडीन डाइफॉस्फेट Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 फ्लेविन एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड सनक C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 फ्रुक्टोज 1,6-बिसफॉस्फेट एफ 16 पी C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 ग्लूकोनेट 6-फॉस्फेट 6पीजी C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड कम NADH (नाड) C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 ग्लूकोज 6-फॉस्फेट जी 6पी C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 रिबोस 5-फॉस्फेट R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 एरिथ्रोस 4-फॉस्फेट E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट Ctp C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 ग्वानोसाइन ट्राइफॉस्फेट Gtp C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 ऑक्सालेटेट OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 अल्फा-केटोग्लूटारेट Akg C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 यूरिडीन ट्राइफॉस्फेट Utp C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 एडिनोसाइन ट्राइफॉस्फेट एटीपी C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 फ्यूरेट FUM C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 पायरूवट PYR C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 मलेट मल C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 डी-ग्लिसेरल्डिहाइड 3-फॉस्फेट अंतर C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 एसिटाइल-कोएंजाइम ए Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 निकोटिनामिडी एडेनेन डेन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट कम एनएडीपीएच C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 फॉस्फोनेनोलपाइरुटेट पीईपी C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 ससिनेट एसयूसीसी C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 आइसोसिट्रेट आईसीआईटी C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 साइट्रेट सीआईटी C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

तालिका 2: एक प्रतिनिधि CFPS नमूने में चयापचय परिमाणीकरण. प्रत्येक चयापचय और मानक विचलन की एकाग्रता. पता लगाने की सीमा, रैखिकता और सहसंबंध गुणांक मानक घटता से पहचान की सीमा.

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Discussion

सेल मुक्त सिस्टम कोई सेल दीवार है, इस प्रकार जटिल नमूना तैयार करने के लिए आवश्यकता के बिना चयापचयों और जैव संश्लेषी मशीनरी के लिए सीधी पहुँच है. तथापि, सेल-मुक्त प्रतिक्रिया प्रणालियों पर मात्रात्मक रूप से पूछताछ करने के लिए गहन और मजबूत प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए बहुत कम कार्य किया गया है। इस अध्ययन में, हम सेल मुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण में चयापचयों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तेजी से, मजबूत विधि विकसित की है और संभवतः पूरे सेल के अर्क में. जटिल मिश्रण में चयापचयों के व्यक्तिगत परिमाणीकरण, जैसे कि सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं, या पूरे सेल के अर्क में पाया उन लोगों के रूप में, कई कारणों के लिए चुनौतीपूर्ण है. इन कारणों के बीच केंद्रीय रासायनिक विविधता है. कार्यात्मक समूहों की सरणी एक साथ इन मिश्रण में मौजूद (उदा., carboxylic एसिड, amines, फॉस्फेट, hydroxyls, आदि) बहुत विश्लेषणात्मक जटिलता बढ़ जाती है. इसे दरकिनार करने के लिए, हमने मेटाबोलाइट मिश्रण के लिए हाइड्रोफोबिक घटकों को पेश करने के लिए 13सी आंतरिक मानकों के संयोजन में एक एनिलाइन व्युत्पत् ति विधि का उपयोग किया। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने एक एलसी/एमएस रन में सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में 40 चयापचयों का मजबूती से पता लगाया और मात्रा निर्धारित की। प्रोटोकॉल इस अध्ययन में 40 यौगिकों में से 35 टैग, जबकि शेष 5 यौगिकों एक मानक वक्र विधि के साथ परिमाणित किया गया. पहले कार्य से पता चलता था कि अभिक्रिया स्थितियों ने अमीन और फॉस्फेट समूह के बीच एक अंतराअणुक लवण बनाया जो विपरित व्युत्पत्ति12को बाधित करता था . सभी 40 यौगिकों के एक साथ व्युत्पत्ति के लिए प्रतिक्रिया स्थितियों की पहचान नहीं की गई; तथापि, वर्तमान विकल्प एक मानक वक्र विधि के साथ परिमाणीकरण है. जबतक हम एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण में इस तकनीक का प्रदर्शन किया, यह भी संभावना पूरे सेल अर्क के लिए लागू किया जा सकता है, इस प्रकार, संभवतः intracellular चयापचयों सांद्रता के निरपेक्ष परिमाणीकरण की अनुमति. बाद आवेदन जैव प्रौद्योगिकी और मानव स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण सवालों की एक किस्म के लिए प्रासंगिकता है.

यहाँ प्रस्तुत विधि एक पिछले तकनीक पर आधारित था (GSIST) कि खमीर एस cerevisiae12,13के पूरे सेल अर्क के लिए लागू किया गया था . इस अध्ययन में, हमने उन यौगिकों की संख्या का विस्तार किया जिनका पता लगाया जा सकता है और उन्हें मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जिनमें सभी 12 न्यूक्लियोटाइड (एक्सएमपी, एक्सडीपी, एक्सटीपी, जहां एक्स ए, सी, जी और यू है) शामिल हैं। इन यौगिकों के अतिरिक्त महत्वपूर्ण जैविक प्रभाव हो सकता है. उदाहरण के लिए, इन न्यूक्लियोटाइड भारी प्रतिलेखन और अनुवाद प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जो CFPS अनुप्रयोगों में ब्याज की केंद्रीय प्रक्रियाओं में से एक है, और अधिक आम तौर पर यौगिकों शारीरिक कार्यों की एक किस्म में महत्वपूर्ण हैं. इसके अलावा, हम एसिटिक एसिड जो एक महत्वपूर्ण चयापचय है जब अतिप्रवाह चयापचय की जांच का पता लगाने में सक्षम थे. हालांकि, हम इसे अध्ययन में शामिल नहीं किया था क्योंकि वहाँ कई यौगिकों में संकेत की एक महत्वपूर्ण कमी थी, विशेष रूप से nicotinamide adenine dinucleotide कम (NADH) और nicotinamide adenine dinucleotide फॉस्फेट कम (NADPH) जब एसिटिक एसिड मानक मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया था. एसिटिक एसिड का पता लगाने की एक उच्च सीमा थी 612 $M, इस प्रकार इन उच्च स्तर पर यह अन्य चयापचयों के संकेतों पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ा. इस के बावजूद, एसिटिक एसिड अभी भी पता लगाया जा सकता है और शीशी में सिर्फ एसिटिक एसिड के साथ एक मानक वक्र बनाने के द्वारा नमूनों में मात्रा निर्धारित. एसिटिक अम्ल का मान 134.0, 5ण्78 मि़म का अवधारण समय तथा रेखीय श्रेणी 612 दृM से 5000 उ (त्2 र् 0ण्986) तथा 12ब्-एनिलाइन के साथ टैग किया गया था। शेष चयापचयों एक दूसरे के आयन संकेत को बदल नहीं किया और CFPS चयापचय की विशेषता के लिए एक व्यापक मिश्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल केंद्रीय कार्बन और ऊर्जा चयापचय में शामिल चयापचयों तक ही सीमित है. इस प्रकार, वर्तमान विधि अन्य रास्ते है कि महत्व का हो सकता है से मेटाबोलाइट बहुतायत को मापने में असमर्थ है, फैटी एसिड और एमिनो एसिड चयापचय के रूप में.

एक साथ लिया, हम विशेषता और ग्लाइकोलिसिस में शामिल 40 यौगिकों की निरपेक्ष परिमाणीकरण के लिए एक तेजी से, मजबूत प्रोटोकॉल विकसित, pentose फॉस्फेट मार्ग, tricarboxylic एसिड चक्र, ऊर्जा चयापचय, और CFPS में cofactor पुनर्जनन प्रतिक्रियाओं. विधि 13सी-एनलाइन के साथ टैग आंतरिक मानकों पर भरोसा किया, जबकि नमूना 12सी-एनलाइन के साथ टैग किया गया था। आंतरिक मानकों और नमूना यौगिकों सह-euted और समाप्त आयन दमन प्रभाव जो जटिल चयापचय मिश्रण में व्यक्तिगत चयापचयों की सटीक परिमाणीकरण सक्षम. हम 40 यौगिकों की कुल की पहचान की (41, अगर एसिटिक एसिड सहित) कि पता लगाया जा सकता है और एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया मिश्रण में मात्रा निर्धारित; हालांकि, चयापचयों की सूची आगे विस्तार किया जा सकता है और ब्याज की विशेष जैव रासायनिक प्रक्रिया की ओर समायोजित. इस प्रकार, विधि सेल मुक्त चयापचय की विशेषता के लिए एक मजबूत और सटीक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो संभावित रूप से सेल मुक्त प्रक्रियाओं की उपज, उत्पादकता और ऊर्जा दक्षता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (https://www.cancer.gov/ ) से पुरस्कार संख्या 1U54CA210184-01 के माध्यम से कैंसर चयापचय के भौतिकी पर केंद्र द्वारा वर्णित काम का समर्थन किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

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References

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जैव रसायन अंक 152 सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री एनिलाइन टैगिंग केंद्रीय कार्बन ऊर्जा चयापचय आंतरिक मानक चयापचय नेटवर्क समस्थानिक लेबलिंग
उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण चयापचय का निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन
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Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

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