Summary
Здесь мы представляем надежный протокол для количественной оценки 40 соединений, участвующих в центральном метаболизме углерода и энергии в реакции синтеза белка без клеток. Смесь синтеза без клеток производная с анилином для эффективного разделения с использованием обратной фазы жидкой хроматографии, а затем количественно масс-спектрометрии с использованием изотопно обозначенных внутренних стандартов.
Abstract
Синтез белка без клеток (CFPS) является новой технологией в системах и синтетической биологии для производства белков in vitro. Однако, если CFPS собирается выйти за пределы лаборатории и стать широко распространенной и стандартной как раз вовремя технологии производства, мы должны понимать пределы производительности этих систем. На этот вопрос мы разработали надежный протокол для количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфата пути, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод использует внутренние стандарты, отмеченные 13C-анилин, в то время как соединения в образце производные с 12C-анилин. Внутренние стандарты и образец были смешаны и проанализированы с помощью обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS). Со-элютация соединений устранила подавление иона, позволив точно количественно определить концентрацию метаболитов на 2-3 порядка, где средний коэффициент корреляции составлял 0,988. Пять из сорока соединений были не отмечены анилином, однако они все еще были обнаружены в образце CFPS и количественно с помощью стандартного метода кривой. Хроматографический пробег занимает около 10 минут. В совокупности мы разработали быстрый и надежный метод разделения и точной количественной оценки 40 соединений, участвующих в CFPS в одном запуске LC/MS. Этот метод представляет собой комплексный и точный подход к характеристике метаболизма без клеток, так что в конечном счете, мы можем понять и улучшить урожайность, производительность и энергоэффективность систем, свободных от клеток.
Introduction
Синтез белка без клеток (CFPS) является перспективной платформой для производства белков и химических веществ, приложение, которое традиционно зарезервировано для живых клеток. Системы, свободные от клеток, получены из экстрактов сырой клетки и устраняют осложнения, связанные с ростом клеток1. Кроме того, CFPS обеспечивает прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без вмешательства клеточной стенки. Однако фундаментальное понимание пределов производительности процессов, свободных от клеток, отсутствует. Высокопроизводительные методы метаболитной количественной оценки имеют важное значение для характеристики метаболизма и имеют решающее значение для построения метаболических вычислительных моделей2,3,4. Общие методы, используемые для определения концентрации метаболита включают ядерный магнитный резонанс (NMR), Фурье трансинфракрасной спектроскопии (FT-IR), ферментнаосновения и масс-спектрометрии (MS)5,6,7 ,8. Однако эти методы часто ограничиваются их неспособностью эффективно измерять несколько соединений одновременно и часто требуют размера выборки, превышающее типичные реакции, свободные от клеток. Например, анализы на основе ферментов часто могут использоваться только для количественной оценки одного соединения в пробеге, и ограничены, когда размер выборки мал, например, в реакции синтеза белка без клеток (обычно работают по шкале 10-15 л). Между тем, ЯМР требует высокого изобилия метаболитов для обнаружения и количественной оценки5. К этим недостаткам, методы хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (LC/MS) обеспечивают несколько преимуществ, включая высокую чувствительность и возможность измерения нескольких видов одновременно9; однако сложность аналитических исследований значительно возрастает по мере измерения количества и разнообразия видов. Поэтому важно разработать методы, которые в полной мере реализуют высокопроизводительный потенциал систем LC/MS. Соединения в образце разделены жидкой хроматографией и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии. Сигнал соединения зависит от его концентрации и эффективности ионизации, где ионизация может варьироваться между соединениями, а также может зависеть от матрицы образца.
Достижение той же эффективности ионизации между образцом и стандартами является сложной задачей при использовании LC/MS для количественной оценки анализов. Кроме того, количественная оценка становится все более сложной задачей с метаболитным разнообразием из-за расщепления сигналов и неоднородности в сродстве протона и полярности10. Наконец, матрица совместного использования образца может также влиять на эффективность ионизации соединений. Для решения этих проблем метаболиты могут быть химически производными, увеличивая разрешение разделения и чувствительность систем LC/MS, одновременно уменьшая расщепление сигнала в некоторых случаях10,11. Химическая произвена работает путем пометки конкретных функциональных групп метаболитов, чтобы настроить их физические свойства, такие как заряд или гидрофобность для повышения эффективности ионизации11. Различные метки могут быть использованы для целевых различных функциональных групп (например, амины, гидроксилы, фосфаты, карбоксиловая кислоты и т.д.). Анилин, один из таких агентов производной, цели нескольких функциональных групп одновременно, и добавляет гидрофобный компонент в гидрофильных молекул, тем самым увеличивая их разделение резолюции исигнал12. Для решения эффекта подавления ко-элюлинга матрицы Ян и его коллеги разработали методику, основанную на маркировке групповых специфических внутренних стандартных технологий (GSIST), где стандарты маркируются 13-c-изотопов анилина и смешиваются с образцом 12,13. Метаболит и соответствующий внутренний стандарт имеют одинаковую эффективность ионизации, поскольку они совместно элютируются, и коэффициент их интенсивности может быть использован для количественной оценки концентрации в экспериментальной выборке.
В этом исследовании мы разработали протокол для обнаружения и количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфатпуть, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод основан на подходе GSIST, где мы использовали 12C-анилин и 13C-анилин для тегов, обнаружения и количественной оценки метаболитов с помощью обратной фазы LC/MS. Линейный диапазон всех соединений охватывал 2-3 порядка величины со средним коэффициентом корреляции 0,988. Таким образом, метод является надежным и точным подходом к допросу клеточного метаболизма, и, возможно, цельноклеточных экстрактов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов для анилиновых пометок
- Подготовьте анилинный раствор 6 M на уровне pH 4.5. Работая в капюшоне, смешайте 550 л анилина с 337,5 л воды класса LCMS и 112,5 л соляной кислоты (HCl) в центрифуговой трубке. Вихрь хорошо и хранить при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анилин может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 2 месяцев.
ВНИМАНИЕ: Анилин является высокотоксичным и должны работать с в дым капот. Гидрохлорная кислота очень коррозионная - Подготовьте анилинный раствор 6 M 13C на pH 4.5. Смешайте 250 мг 13C 6-анилин с 132 л воды и 44 Л 12 М HCl. Вихрь хорошо и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Приготовьте 200 мг/мл N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодимид гидрохлорид (EDC) раствор. Растворите 2 мг EDC в 10 л воды для каждого образца, который должен быть помечен и вихрь хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: решение EDC должно быть подготовлено в тот же день, что и реакция. EDC выступает в качестве катализатора для произвобления соединений с анилин12.
2. Подготовка стандартов
- Сделайте отдельные стоковые растворимые в воде lc/MS класса(таблица 1).
-
Подготовка внутреннего стандартного акционерного решения
- Комбинат всех соединений, за исключением никотинамида аденин динуклеотид (NAD), никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADP), флавин аденин динуклеотид (FAD), ацетил коэнзим А (ACA), и глицерол 3-фосфат (Gly3P), с соответствующими объемами создать 2 мМ бульонный раствор всех соединений.
- Объедините NAD, NADP, FAD, ACA и Gly3P с соответствующими объемами для создания акционерного решения объемом 2 мМ.
3. Подготовка образца(рисунок 1)
- Утолить и осаждать белки в реакции синтеза белка без клеток, добавляя в реакцию равный объем ледяного 100% этанола. Центрифуги образца при 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию. Перенесите супернатант в новую центрифужную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 градусах по Цельсию в этот момент и анализироваться в более позднее время
4. Реакция маркировки
-
Выборка маркировки с 12C-анилином
- Передача 6 л образца в новую центрифужную трубку и довести объем до 50 зл сводой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер выборки может зависеть от конкретной реакции CFPS. - Добавьте 5 л из 200 мг/мл EDC раствора.
- Добавьте 5 зл из 12C-анилина раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анилиное решение разделяется на две фазы. Хорошо перемешайте, прежде чем добавить к реакции. - Вихрь реакция с нежной тряской в течение 2 ч при комнатной температуре.
- После 2 ч, удалить трубки из шейкера и добавить 1,5 л триэтиламин (TEA) к реакции в дым капот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Триэтиламин повышает рН раствора, который останавливает реакцию анилина и стабилизирует соединения.
ВНИМАНИЕ: Триэтиламин является токсичным и вызывает раздражение глаз и дыхательных путей. - Центрифуга при 13500 х г в течение 3 мин.
- Передача 6 л образца в новую центрифужную трубку и довести объем до 50 зл сводой.
-
Маркировка внутренних стандартов с 13C-анилином
- Разбавить раствор внутреннего запаса до 80 мкм с окончательным объемом 50 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация внутренних стандартов может быть скорректирована с уровнями, близкими к экспериментальной выборке. - Добавьте 5 л из 200 мг/мл EDC раствора.
- Добавьте 5 зл из 13C-анилина раствора.
- Вихрь реакция с нежной тряской в течение 2 ч при комнатной температуре.
- После 2 ч, удалить трубки из шейкера и добавить 1,5 л TEA к реакции в дым капот.
- Центрифуга при 13500 х г в течение 3 мин.
- Разбавить раствор внутреннего запаса до 80 мкм с окончательным объемом 50 л.
-
Объединение помеченных внутренних стандартов и отмеченных образцов
- Смешайте 25 Зл из 12C-анилина помеченных образца с 25 Зл из 13C-анилин помечены стандартные.
- Передача на флакон авто-сэмплер и анализ по процедуре LC/MS.
-
Создание стандартной кривой для метаболитов с немаркированными квагарами
- Разбавить запасной раствор немаркированных метаболитов (NAD, NADP, FAD, ACA и Gly3P) до конечной концентрации 320 мкм, 80 мкм, 20 мкм и 5 мкм с объемом 50 мл.
- Добавьте 5 л из 200 мг/мл EDC раствора.
- Добавьте 5 зл из 12C-анилина раствора.
- Вихрь реакция с нежной тряской в течение 2 ч при комнатной температуре.
- После 2 ч, удалить трубки из шейкера и добавить 1,5 л TEA к реакции в дым капот.
- Центрифуга при 13500 х г в течение 3 мин.
- Передача супернатанта на флакон авто-сэмплер и анализ по процедуре LC/MS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неотмеченные метаболиты следуют той же процедуре, что и образец для репликации матрицы образца, чтобы сохранить аналогичную эффективность ионизации.
5. Настройка процедуры LC/MS
-
Подготовка растворителей
- Приготовьте 5 мМ трибутиламин (TBA) aqueous раствор, скорректированный на рН 4,75 с уксусной кислотой.
ПРИМЕЧАНИЕ: TBA в мобильной фазе помогает аналитикам достичь хорошего разрешения и разделения14. - Подготовка 5 мМ TBA в ацетонитриле (ACN).
- Приготовьте растворитель для мытья с 5% водой и 95% ACN.
- Подготовка очистки растворителя с 95% воды и 5% ACN.
- Приготовьте 5 мМ трибутиламин (TBA) aqueous раствор, скорректированный на рН 4,75 с уксусной кислотой.
- Настройка условий MS
- Установите масс-спектрометр в отрицательный ионный режим с температурой зонда 520 градусов по Цельсию, отрицательным капиллярным напряжением -0,8 кВ, положительным капиллярным напряжением 0,8 кВ, и установите программное обеспечение для получения данных на уровне 5 баллов/с.
- Установите выбранные ионные записи (SIR) для каждого метаболита с указанными значениями конуса и массой над зарядом (м/z). Смотрите таблицу 1.
-
Инициализация LC/MS в соответствии с инструкциями производителя
- Основные линии растворителя в диспетчере растворителя в течение 3 мин.
- Прайм растворитель для мытья (5% воды, 95% ACN) и очищают растворитель (95% воды, 5% ACN) для 15 s для 5 циклов.
- Установите диспетчер апроб до 10 градусов по Цельсию.
- Установите столбец C18 (1,7 мм, 2,1 мм x 150 мм) и инициализировать колонку со 100% ACN на 0,3 мл/мин в течение 10 минут.
- Состояние колонны на 95% воды и 5% ACN на 0,3 мл/мин в течение 10 минут до введения растворителей с буферами.
- Состояние колонки на 95% растворителя A (5мМ TBA aqueous, pH 4.75) и 5% растворителя B (5 мМ TBA в ACN) на 0,3 мл/мин в течение 10 мин.
- Настройка протокола градиента с elution, начиная с 95% растворителя A и 5% растворителя B, поднятого до 70% растворителя B за 10 мин, поднятого до 100% растворителя B за 2 мин и удерживаемого при 100% растворителе B в течение 3 мин. Возвращение к первоначальным условиям (95% растворителя A A , 5% растворитель B) более 1 мин и удерживайте в течение 9 мин, чтобы повторно уравновесить столбец.
- Состояние столбца с протоколом градиента 3 раза до любых инъекций на столбец.
-
Инъекционная пробы и стандарты
- Введите 5 зЛ образца в столбец и приобретете соответствующую интенсивность ионных м/з для 12C-анилина отмеченный образец.
- Введите 5 зл и того же образца снова, но на этот раз приобрести интенсивность м / z иондля 13C-анилин тегами стандартов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наша система LC/MS не может приобретать как 12C, так и 13C/z интенсивности в указанных временных окнах SIR, так как это слишком много данных, чтобы приобрести в указанном временном окне. Поэтому мы вводим один и тот же образец дважды. - Вводят немаркированные стандарты метаболита от самой низкой концентрации до самой высокой и фиксируют соответствующую интенсивность ионных м/з.
6. Количественная оценка
- Создание метода экспорта
- В программном обеспечении для сбора данных, выберите файла (new Method)
- Укажите имя файла, например AnilineTagging -Дата.
- Проверьте файл Экспорт ASCII и выберите каталог для экспорта текстового файла.
- В типе отчетавыберите Резюме для всех.
- В Делимитеры,для колонки выберите ,. Для строки, выберите «cr», если ».
- В таблице, выберите Экспорт, а затем отобразить таблицу, чтобы включить SampleName, Область, Высота, Количество и единицы.
- Сохранить метод экспорта.
- Количественная оценка метаболитов с внутренними стандартами с использованием программного обеспечения для сбора данных
- Под вкладкой «Образец наборов» нажмите на соответствующий запуск LC/MS и выберите View в качестве
- Выберите все каналы SIR для 13C-анилин внутренних стандартов одной инъекции, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Обзор.
- Если окно LC Processing Method Layout не отображается автоматически, перейдите в View
- В обработке метода Layout, перейдите на вкладку интеграции и установить ApexTrack в качестве алгоритма.
- Перейти к вкладке Сглаживание и установить тип среднего и уровня сглаживания до 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой уровень сглаживания может быть выбран, до тех пор, пока он соответствует во всех образцах. - Во вкладке MS Channel отработка обработки MS 3D.
- В окне канала SIR интегрируйте каждый пик, один канал за один раз. Как только пик интегрирован, перейдите к Опционам (gt; Заполните от результата, и детали пика будут заполнены во вкладке Компоненты.
- После того, как все каналы SIR были оценены, сохраните метод обработки и закройте окно.
- Выберите все каналы SIR 13C-анилин и 12C-анилин помечены образца, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс.
- Проверьте окно процесса, выберите Метод обработки ивыберите только что сохраненный метод обработки. Также проверьте поле Экспорта, выберите метод экспорта и выберите сохраненный метод экспорта, созданный ранее. Нажмите OK.
- Откройте экспортированный текстовый файл с помощью Excel и вычислите концентрацию неизвестного соединения с помощью:
где Cx,i является концентрация неизвестного образца для метаболита я,Х, я является интегрированной области неизвестного метаболита я,StD, я является интегрированной области внутреннего стандарта метаболита я, Cstd, я концентрация внутреннего стандарта метаболита i, и D является фактором разбавления.
- Количественная оценка метаболитов со стандартной кривой
- Под вкладкой «Образец наборов» нажмите на соответствующий запуск LC/MS и выберите View в качестве
- Выберите все каналы SIR для немаркированных стандартов одной инъекции, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Обзор.
- Если окно LC Processing Method Layout не отображается автоматически, перейдите в View
- В обработке метода Layout перейдите на вкладку Интеграция и установите ApexTrack в качестве алгоритма.
- Перейти к вкладке Сглаживание и установить тип среднего и уровня сглаживания до 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой уровень сглаживания может быть выбран, до тех пор, пока он соответствует во всех образцах. - Во вкладке MS Channel отработка обработки MS 3D.
- В окне канала SIR интегрируйте каждый пик, один канал за один раз. Как только пик интегрирован, перейдите к Опционам (gt; Заполните от результата, и детали пика будут заполнены во вкладке Компоненты.
- После того, как все каналы SIR были оценены, сохраните метод обработки и закройте окно.
- Под вкладкой Sample Sets нажмите правое нажатие на набор образцов и выберите Alter Sample.
- Выберите Сумму в новом окне.
- Выберите копию из метода Process и выберите только что сохраненный метод процесса.
- Введите концентрацию каждого метаболита для каждого флакона и введите единицу в качестве lt;qM для каждого компонента (или соответствующего блока) и выберите OK.
- Выберите образец набор еще раз, правый клик, Посмотреть как
- Выберите все каналы SIR неотмеченных метаболитов для стандартов, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс.
- Проверьте поле Process и выберите метод обработки. Выберите подходящий метод обработки и нажмите OK.
- Выберите каналы SIR для всех метаболитов без метки для образцов, нажмите правой кнопкой мыши и выберите процесс.
- Проверьте поле Process, выберите метод обработки и выберите только что сохраненный метод обработки. Также проверьте поле Экспорта, выберите метод экспорта и выберите сохраненный метод экспорта, созданный ранее. Нажмите OK.
- Количественное оснащение метаболитов стандартной кривой и экспорт результатов в текстовый файл в указанный каталог.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве доказательства концепции мы использовали протокол для количественной оценки метаболитов в системе CFPS на основе кишечной палочки, выражающей зеленый флуоресцентный белок (GFP). Реакция CFPS (14 л) была утоплена и депротеинизирована этанолом. Образец CFPS был затем помечен 12C-анилин, в то время как стандарты были помечены 13C-анилин. Помеченный образец и стандарты затем были объединены и введены в LC/MS(рисунок 1). Протокол обнаружил и количественно 40 метаболитов, участвующих в центральном метаболизме углерода и энергии с использованием внутренних стандартов, в то время как стандартная кривая для 5 метаболитов, которые не были помечены анилин был также разработан(Рисунок 2). Разнообразные метаболиты, участвующие в этих путях были класс фосфорилированных сахаров, фосфокарбоксиловых кислот, карбокиловыкислот, нуклеотидов и кофакторов. Производная с анилин ввел гидрофобных moiety в гидрофильных молекул, которые способствовали более эффективному разделению с помощью обратной фазы хроматографии12. Кроме того, метод позволил разделить структурные пары изомеров, таких как глюкоза 6-фосфат и фруктоза 6-фосфат в одном LC / MS перспективе. Масса каждого соединения над зарядом (м/з) соотношение и время удержания были определены до эксперимента путем введения 1 мМ одного соединения в то время, и сравнивая массовый спектр с пустым (Таблица 1).
Предел обнаружения и диапазон линейности для всех соединений был оценен путем создания стандартной кривой, которая колебалась от 0,10 мкм до 400 мкм(Таблица 2). Средний коэффициент корреляции (R2) для всех соединений составлял 0,988, а большинство соединений имели линейный диапазон 3-порядков величины. Три соединения имели заметные эффекты насыщения, особенно альфа-кетоглутарат, который имел линейный диапазон от 0,1 мкм до 25 м. М. Изоцитрат и цитрат также имели эффекты насыщения выше 100 мкм.
Рисунок 1: Схема рабочего процесса для анилина пометки. Реакция синтеза белка без клеток депротеинизирована и помечена 12C-анилин, в то время как стандартная смесь запасов помечена 13C-анилин. Обе смеси затем смешиваются в 1:1 объемного соотношения и анализируются LC/ MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Перекрываемые выбранные ионные хроматограммы для 40 метаболитов. Массовая хроматограмма из одного LC/MS- пробега стандартной смеси 40 метаболитов. Пики были определены по их времени удержания и значениям м/з для каждого соединения. Полные имена составных соединений и их аббревиатив перечислены в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Пиковое число | Метаболит | Сокращение | Идентификатор KEGG | Время удержания (мин) | 12C м/з | 13C м/з | немаркированные м/з | Резюме | MS Виды | |
| 1 | Глицерол 3-фосфат | Gly3P | C00093 | 3.85 | 153 | 10 | M - H2O - H | |||
| 2 | Никотинамид аденин динуклеотид | Nad | C00003 | 3.96 | 698 | 10 | М и Cl - H | |||
| 3 | Глюкозы | GLC | C00031 | 4.06 | 289.9 | 296 | 15 | М и КЛ - H | ||
| 4 | Седохептулоза 7-фосфат | S7P | C05382 | 5.41 | 364 | 370 | 10 | М - H | ||
| 5 | Фруктоза 6-фосфат | F6P | C00085 | 5.48 | 334 | 340 | 10 | М - H | ||
| 6 | Монофосфат гуанозина | Gmp | C00144 | 5.57 | 437.05 | 443 | 10 | М - H | ||
| 7 | Рибулоза 5-фосфат | RL5P | C00199 | 5.58 | 304 | 310 | 10 | М - H | ||
| 8 | Цицидин монофосфат | Cmp | C00055 | 5.59 | 397.09 | 403 | 10 | М - H | ||
| 9 | Лактат | Lac | C00186 | 5.77 | 164.05 | 170 | 10 | М - H | ||
| 10 | Монофосфат аденозина | Amp | C00020 | 5.85 | 421.1 | 427.1 | 10 | М - H | ||
| 11 | Уридин монофосфат | Ump | C00105 | 5.88 | 398.07 | 404 | 10 | М - H | ||
| 12 | Никотинамид аденин динуклеотид фосфат | NADP | C00006 | 6.39 | 724 | 10 | M - H2O - H | |||
| 13 | 3-фоспогликерная кислота | 3PG | C00197 | 6.63 | 242 | 248.06 | 15 | М - H2O - H | ||
| 14 | Цитидин дифосфат | Cdp | C00112 | 6.72 | 477 | 483 | 10 | М - H | ||
| 15 | Дифосфат гуанозина | Ввп | C00035 | 6.87 | 517 | 523 | 10 | М - H | ||
| 16 | Аденозиндий дифосфат | Adp | C00008 | 6.94 | 501 | 507 | 10 | М - H | ||
| 17 | Уридинедина дифосфата | Udp | C00015 | 6.97 | 478 | 484 | 10 | М - H | ||
| 18 | Флавин аденин динуклеотид | Причуды | C00016 | 7.03 | 784.15 | 15 | M - H | |||
| 19 | Фруктоза 1,6-бисфосфат | F16P | C05378 | 7.1 | 395.95 | 402.1 | 10 | М - H2O - H | ||
| 20 | Глюконат 6-фосфат | 6PG | C00345 | 7.11 | 425.1 | 437 | 10 | М 2А - H | ||
| 21 | Никотинамид аденин динуклеотид сокращен | Надн | C00004 | 7.23 | 633.13 | 639.08 | 10 | М и А и H2O - никотинамид - H | ||
| 22 | Глюкоза 6-фосфат | G6p | C00668 | 7.32 | 409.1 | 421.1 | 10 | М 2А - H | ||
| 23 | Рибоза 5-фосфат | R5P | C00117 | 7.54 | 379.1 | 391.1 | 15 | М 2А - H | ||
| 24 | Эритроза 4-фосфат | E4P | C00279 | 7.71 | 348.9 | 361 | 10 | М 2А - H | ||
| 25 | Цитидин трифосфат | Ctp | C00075 | 7.84 | 557 | 563 | 5 | М - H | ||
| 26 | Гуанозин трифосфат | Gtp | C00044 | 7.93 | 597 | 603 | 5 | М - H | ||
| 27 | Оксалецетат | ОАА | C00036 | 7.94 | 281 | 293 | 25 | М 2А - H | ||
| 28 | Альфа-кетоглутарат | Akg | C00026 | 7.95 | 295 | 307.1 | 15 | М 2А - H | ||
| 29 | Уридин трифосфат | Utp | C00075 | 7.97 | 558 | 564 | 10 | М - H | ||
| 30 | Аденозинтрифосфат | Atp | C00002 | 8.03 | 581 | 587 | 15 | М - H | ||
| 31 | Фумарат | ФУМ | C00122 | 8.09 | 265 | 277.1 | 10 | М 2А - H | ||
| 32 | Пирувате | Pyr | C00022 | 8.09 | 162 | 168 | 25 | М - H | ||
| 33 | Malate | Мэл | C00149 | 8.09 | 283.06 | 295.15 | 10 | М 2А - H | ||
| 34 | D-глицеральдегид 3-фосфат | Разрыв | C00118 | 8.09 | 319 | 331.1 | 5 | М 2А - H | ||
| 35 | Ацетил-кофермент А | Aca | C00024 | 8.16 | 790 | 10 | M - H2O - H | |||
| 36 | Никотинамид аденин динуклеотид фосфат уменьшается | НАДФ | C00005 | 8.23 | 694.92 | 700.82 | 10 | М - никотинамид - H | ||
| 37 | Фосфоненолпирубвате | Pep | C00074 | 8.28 | 317 | 329.1 | 20 | М 2А - H | ||
| 38 | Сукцинат | СУКК | C00042 | 8.64 | 267.07 | 279.1 | 15 | М 2А - H | ||
| 39 | Изоцитрат | ИСИТ | C00311 | 10.13 | 398 | 416 | 10 | М 3А - H2O - H | ||
| 40 | Цитрат | Cit | C00158 | 10.46 | 416.1 | 434.06 | 20 | М 3А - H | ||
Таблица 1: Выявление и маркировка результатов метаболитов. Соответствующее пиковое число каждого соединения, время удержания, значение м/з для немаркированных, 12C и 13C помечены, и MS видов. MS Виды, А означает анилин тег.
| Номер пика | Метаболит | Сокращение | Идентификатор KEGG | Концентрация (мМ) | SD (n No 3) | Предел обнаружения (ММ) | Предел линейного диапазона (км) | РЗ2 | |
| 1 | Глицерол 3-фосфат | Gly3P | C00093 | 0.377 | 0.034 | 0.1 | 400 | 0.995 | |
| 2 | Никотинамид аденин динуклеотид | Nad | C00003 | 0.052 | 0.010 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 3 | Глюкозы | GLC | C00031 | 0.002 | 0.000 | 0.1 | 400 | 0.997 | |
| 4 | Седохептулоза 7-фосфат | S7P | C05382 | 0.007 | 0.000 | 0.16 | 400 | 0.988 | |
| 5 | Фруктоза 6-фосфат | F6P | C00085 | 0.029 | 0.004 | 0.1 | 400 | 0.986 | |
| 6 | Монофосфат гуанозина | Gmp | C00144 | 0.007 | 0.001 | 0.39 | 100 | 0.992 | |
| 7 | Рибулоза 5-фосфат | RL5P | C00199 | 0.035 | 0.002 | 0.39 | 400 | 0.996 | |
| 8 | Цицидин монофосфат | Cmp | C00055 | 0.045 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 9 | Лактат | Lac | C00186 | 2.134 | 0.048 | 0.1 | 400 | 0.988 | |
| 10 | Монофосфат аденозина | Amp | C00020 | 0.020 | 0.002 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 11 | Уридин монофосфат | Ump | C00105 | 0.021 | 0.000 | 0.1 | 100 | 0.997 | |
| 12 | Никотинамид аденин динуклеотид фосфат | NADP | C00006 | 0.014 | 0.002 | 0.34 | 400 | 0.950 | |
| 13 | 3-фоспогликерная кислота | 3PG | C00197 | 6.125 | 0.239 | 0.1 | 100 | 0.996 | |
| 14 | Цитидин дифосфат | Cdp | C00112 | 0.202 | 0.029 | 0.39 | 400 | 0.997 | |
| 15 | Дифосфат гуанозина | Ввп | C00035 | 0.146 | 0.027 | 1.5625 | 400 | 0.984 | |
| 16 | Аденозиндий дифосфат | Adp | C00008 | 0.797 | 0.161 | 0.39 | 400 | 0.995 | |
| 17 | Уридинедина дифосфата | Udp | C00015 | 0.212 | 0.036 | 0.39 | 400 | 0.991 | |
| 18 | Флавин аденин динуклеотид | Причуды | C00016 | 0.008 | 0.001 | 0.1 | 400 | 0.958 | |
| 19 | Фруктоза 1,6-бисфосфат | F16P | C05378 | 3.643 | 0.105 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 20 | Глюконат 6-фосфат | 6PG | C00345 | 0.017 | 0.001 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 21 | Никотинамид аденин динуклеотид сокращен | Надн | C00004 | 0.063 | 0.028 | 0.39 | 100 | 0.972 | |
| 22 | Глюкоза 6-фосфат | G6p | C00668 | 0.046 | 0.002 | 0.1 | 400 | 0.984 | |
| 23 | Рибоза 5-фосфат | R5P | C00117 | 0.055 | 0.005 | 0.39 | 100 | 0.999 | |
| 24 | Эритроза 4-фосфат | E4P | C00279 | 0.038 | 0.007 | 0.39 | 400 | 0.979 | |
| 25 | Цитидин трифосфат | Ctp | C00075 | 0.896 | 0.078 | 6.25 | 100 | 0.998 | |
| 26 | Гуанозин трифосфат | Gtp | C00044 | 0.870 | 0.109 | 6.25 | 100 | 0.993 | |
| 27 | Оксалецетат | ОАА | C00036 | 0.023 | 0.008 | 0.56 | 400 | 0.997 | |
| 28 | Альфа-кетоглутарат | Akg | C00026 | 0.391 | 0.020 | 0.1 | 25 | 0.979 | |
| 29 | Уридин трифосфат | Utp | C00075 | 0.845 | 0.092 | 1.5625 | 400 | 0.998 | |
| 30 | Аденозинтрифосфат | Atp | C00002 | 1.557 | 0.188 | 1.5625 | 400 | 0.991 | |
| 31 | Фумарат | ФУМ | C00122 | 0.576 | 0.100 | 1.5625 | 100 | 0.999 | |
| 32 | Пирувате | Pyr | C00022 | 5.813 | 0.804 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 33 | Malate | Мэл | C00149 | 2.548 | 0.269 | 0.1 | 400 | 0.991 | |
| 34 | D-глицеральдегид 3-фосфат | Разрыв | C00118 | 2.194 | 0.367 | 0.1 | 100 | 0.974 | |
| 35 | Ацетил-кофермент А | Aca | C00024 | 0.196 | 0.044 | 0.1 | 100 | 0.991 | |
| 36 | Никотинамид аденин динуклеотид фосфат уменьшается | НАДФ | C00005 | 0.006 | 0.010 | 0.14 | 100 | 0.990 | |
| 37 | Фосфоненолпирубвате | Pep | C00074 | 3.442 | 0.345 | 0.1 | 100 | 0.962 | |
| 38 | Сукцинат | СУКК | C00042 | 5.683 | 0.573 | 0.1 | 320 | 0.999 | |
| 39 | Изоцитрат | ИСИТ | C00311 | 0.003 | 0.006 | 0.39 | 100 | 0.998 | |
| 40 | Цитрат | Cit | C00158 | 0.002 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.981 | |
Таблица 2: Метаболитная количественная оценка в репрезентативной выборке CFPS. Концентрация каждого метаболита и стандартное отклонение. Предел обнаружения, диапазон линейности и коэффициент корреляции, определенный из стандартных кривых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Системы, свободные от клеток, не имеют клеточной стенки, поэтому существует прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без необходимости сложной подготовки образцов. Тем не менее, было проделано очень мало работы по разработке тщательных и надежных протоколов для количественного допроса систем реакции, свободных от клеток. В этом исследовании мы разработали быстрый, надежный метод количественной оценки метаболитов в клеточных смесях реакции и, возможно, в цельноклеточных экстрактах. Индивидуальная количественная оценка метаболитов в сложных смесях, таких как те, которые содержатся в реакции, свободные от клеток, или экстракты из цельных клеток, является сложной задачей по нескольким причинам. Центральной из этих причин является химическое разнообразие. Массив функциональных групп, одновременно присутствующих в этих смесях (например, карбоксиловая кислота, амины, фосфаты, гидроксилы и т.д.) значительно повышает сложность аналитической системы. Чтобы обойти это, мы использовали метод анилиновой произвиотизации в сочетании с 13C внутренних стандартов для внедрения гидрофобных компонентов метаболитных смесей. Используя этот метод, мы надежно обнаружили и количественно 40 метаболитов в реакции, свободной от клеток, в одном запуске LC/MS. Протокол отметил 35 из 40 соединений в этом исследовании, в то время как остальные 5 соединений были количественно со стандартным методом кривой. Ранее работа показала, что условия реакции образовали внутримолекулярную соль между амином и фосфатной группой, которая ингибировала произвобить12. Условия реакции не были определены для одновременной производности всех 40 соединений; однако в настоящее время альтернативой является количественная оценка методом стандартной кривой. Хотя мы продемонстрировали этот метод в смеси реакции, свободной от клеток, он также может быть применен к цельноклеточным экстрактам, таким образом, потенциально позволяя абсолютную количественную концентрацию внутриклеточных метаболитов. Последнее применение имеет отношение к целому ряду важных вопросов в области биотехнологии и здоровья человека.
Представленный здесь метод был основан на предыдущей методике (GSIST), которая применялась к цельноклеточным экстрактам дрожжей S. cerevisiae12,13. В этом исследовании мы расширили количество соединений, которые могут быть обнаружены и количественно, в том числе все 12 нуклеотидов (xMP, xDP, xTP, где x является A, C, G и U). Добавление этих соединений может иметь важные биологические последствия. Например, эти нуклеотиды активно участвуют в процессах транскрипции и перевода, что является одним из центральных процессов, представляющих интерес для применения CFPS, и в целом соединения играют важную роль в различных физиологических функциях. Кроме того, мы смогли обнаружить уксусную кислоту, которая является важным метаболитом при изучении метаболизма переполнения. Тем не менее, мы не включили его в исследование, потому что было значительное сокращение сигнала в нескольких соединений, особенно никотинамид аденин динуклеотид снижается (NADH) и никотинамид аденин динуклеотид фосфатов снижение (NADPH) при уксусной кислоты была добавлена в стандартную смесь. Ацетическая кислота имела высокий предел обнаружения 612 км, таким образом, на этих высоких уровнях она оказала негативное влияние на сигналы других метаболитов. Несмотря на это, уксусная кислота все еще может быть обнаружена и количественно в образцах, создавая стандартную кривую только с уксусной кислотой во флаконе. Ацетическая кислота имела значение м/з 134,0, время удержания 5,78 мин, а линейный диапазон от 612 мкм до 5000 мкм (R2 и 0,986) при маркировке 12C-анилин. Остальные метаболиты не изменяют ионный сигнал друг друга и представляют собой комплексную смесь для характеристики метаболизма CFPS. Представленный здесь протокол ограничивается метаболитами, участвующими в центральном углеродном и энергетическом метаболизме. Таким образом, нынешний метод не в состоянии измерить изобилие метаболитов от других путей, которые могут иметь важное значение, такие как жирные кислоты и аминокислоты метаболизма.
В совокупности мы разработали быстрый, надежный протокол для характеристики и абсолютной количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пути фосфата пентоза, трикарбоксиловатового кислотного цикла, энергетического метаболизма и регенерации кофактора в CFPS Реакции. Метод опирался на внутренние стандарты, отмеченные 13C-анилин, в то время как образец был помечен 12C-анилин. Внутренние стандарты и образец соединений совместно eluted и устранены ионно-подавления эффекты, которые позволили точной количественной оценки отдельных метаболитов в сложных метаболитных смесей. Мы определили в общей сложности 40 соединений (41, если в том числе уксусной кислоты), которые могут быть обнаружены и количественно в смеси реакции, свободной от клеток; однако перечень метаболитов можно было бы еще больше расширить и скорректировать в сторону конкретного биохимического процесса, представляющих интерес. Таким образом, метод обеспечивает надежный и точный подход к характеристике метаболизма без клеток, который потенциально имеет решающее значение для повышения урожайности, производительности и энергоэффективности процессов, свободных от клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Описанная работа была поддержана Центром по физике метаболизма рака через премию Номер 1U54CA210184-01 от Национального института рака (https://www.cancer.gov/). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения. Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
