Summary
Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.
Abstract
La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una tecnologia emergente nei sistemi e nella biologia sintetica per la produzione in vitro di proteine. Tuttavia, se CFPS sta per andare oltre il laboratorio e diventare una tecnologia di produzione diffusa e standard just in time, dobbiamo capire i limiti di prestazioni di questi sistemi. A questa domanda, abbiamo sviluppato un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato della pentosi, il ciclo dell'acido tricarboxillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo utilizza standard interni contrassegnati con 13C-anilina, mentre i composti nel campione vengono derivati con 12C-anilina. Gli standard e il campione interni sono stati miscelati e analizzati mediante spettrometria cromatografia-massa liquida in fase invertita (LC/MS). La co-eluzione dei composti ha eliminato la soppressione degli ioni, consentendo la quantificazione accurata delle concentrazioni di metaboliti su 2-3 ordini di grandezza dove il coefficiente di correlazione medio era 0,988. Cinque dei quaranta composti sono stati senza tag con anilina, tuttavia, sono stati ancora rilevati nel campione CFPS e quantificati con un metodo di curva standard. La corsa cromatica richiede circa 10 minuti per essere completata. Nel loro insieme, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per separare e quantificare con precisione 40 composti coinvolti nella CFPS in un'unica corsa LC/MS. Il metodo è un approccio completo e preciso per caratterizzare il metabolismo privo di cellule, in modo che in ultima analisi, possiamo comprendere e migliorare la resa, la produttività e l'efficienza energetica dei sistemi senza cellule.
Introduction
La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una piattaforma promettente per la produzione di proteine e sostanze chimiche, un'applicazione tradizionalmente riservata alle cellule viventi. I sistemi senza cellule sono derivati da estratti di cellule grezze ed eliminano le complicazioni associate alla crescita cellulare1. Inoltre, CFPS consente l'accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza l'interferenza di una parete cellulare. Tuttavia, è stata carente una comprensione fondamentale dei limiti di prestazioni dei processi senza cellule. I metodi ad alta produttività per la quantificazione dei metaboliti sono preziosi per la caratterizzazione del metabolismo e sono fondamentali per la costruzione di modelli metabolici computazionali2,3,4. I metodi più comuni utilizzati per determinare le concentrazioni di metaboliti includono la risonanza magnetica nucleare (NMR), la spettroscopia a infrarossi a infrarossi di Fourier (FT-IR), i saggi basati su enzimi e la spettrometria di massa (MS)5,6,7 ,8. Tuttavia, questi metodi sono spesso limitati dalla loro incapacità di misurare in modo efficiente più composti contemporaneamente e spesso richiedono una dimensione del campione maggiore rispetto alle tipiche reazioni senza cellule. Ad esempio, i saggi basati su enzimi spesso possono essere utilizzati solo per quantificare un singolo composto in una corsa e sono limitati quando la dimensione del campione è piccola, ad esempio nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule (tipicamente eseguite su una scala 10-15). Nel frattempo, NMR richiede un'elevata abbondanza di metaboliti per il rilevamento e la quantificazione5. Verso queste carenze, i metodi di cromatografia in tandem con la spettrometria di massa (LC/MS) offrono diversi vantaggi, tra cui l'elevata sensibilità e la capacità di misurare più specie contemporaneamente9; tuttavia, la complessità analitica aumenta considerevolmente con il numero e la diversità delle specie misurate. È quindi importante sviluppare metodi in grado di realizzare appieno il potenziale ad alta produttività dei sistemi LC/MS. I composti in un campione sono separati dalla cromatografia liquida e identificati attraverso la spettrometria di massa. Il segnale del composto dipende dalla sua efficienza di concentrazione e ionizzazione, dove la ionizzazione può variare tra i composti e può anche dipendere dalla matrice del campione.
Raggiungere la stessa efficienza di ionizzazione tra il campione e gli standard è una sfida quando si utilizza LC/MS per quantificare gli analiti. Inoltre, la quantificazione diventa più impegnativa con la diversità dei metaboliti a causa della divisione del segnale e dell'eterogeneità nell'affinità protonica e nella polarità10. Infine, la matrice di co-eluting del campione può anche influenzare l'efficienza della ionizzazione dei composti. Per risolvere questi problemi, i metaboliti possono essere derivati chimicamente, aumentando la risoluzione di separazione e la sensibilità da parte dei sistemi LC/MS, riducendo contemporaneamente la suddivisione del segnale in alcuni casi10,11. La derivazione chimica funziona etichettando specifici gruppi funzionali di metaboliti per regolare le loro proprietà fisiche come carica o idrofobicità per aumentare l'efficienza di ionizzazione11. Vari agenti di etichettatura possono essere utilizzati per indirizzare diversi gruppi funzionali (ad esempio, ammine, idrossidi, fosfati, acidi carboxylici, ecc.). Aniline, uno di questi agenti di derivazione, si rivolge a più gruppi funzionali contemporaneamente, e aggiunge un componente idrofobico in molecole idrofile, aumentando così la loro risoluzione di separazione e il segnale12. Per affrontare l'effetto di soppressione degli ioni a matrice co-elutazione, Yang e i colleghi hanno sviluppato una tecnica basata sull'etichettatura GSIST (Group Specific Internal Standard Technology) in cui gli standard sono contrassegnati con isotopi di anilinea 13C e mescolati con il campione 12,13. Il metabolita e il corrispondente standard interno hanno la stessa efficienza di ionizzazione dal momento che co-eluito, e il loro rapporto di intensità può essere utilizzato per quantificare la concentrazione nel campione sperimentale.
In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo per rilevare e quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato pentosi, il ciclo dell'acido tricarboxyillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo si basa sull'approccio GSIST, dove abbiamo usato 12C-anilina e 13C-anilina per etichettare, rilevare e quantificare i metaboliti utilizzando LC/MS in fase invertita. La gamma lineare di tutti i composti si estendeva su 2-3 ordini di grandezza con un coefficiente di correlazione medio di 0,988. Così, il metodo è un approccio robusto e preciso per interrogare il metabolismo senza cellule, e possibilmente estratti interi cellulari.
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Protocol
1. Preparazione dei reagenti per l'etichettatura di anilina
- Preparare una soluzione di anilina da 6 M a pH 4.5. Lavorando in una cappa, unire 550 l di anilina con 337,5 l di acqua di grado LCMS e 112,5 -L di acido cloridrico 12 M (HCl) in un tubo centrifuga. Vortice bene e conservare a 4 gradi centigradi.
NOTA: Aniline può essere conservato a 4 gradi centigradi per 2 mesi.
AVVISO: L'anilina è altamente tossica e deve essere lavorata in un cofano di fumi. L'acido cloridrico è altamente corrosivo - Preparare una soluzione di anilina 6 M 13C a pH 4.5. Unire 250 mg di 13C6-anilina con 132 gradi centigradi d'acqua e 44 luna di 12 M HCl. Vorticare bene e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione EDC (200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrocloride (EDC). Sciogliere 2 mg di EDC in 10 gradi centigradi di acqua per ogni campione da etichettare e vortice bene.
NOTA: la soluzione EDC deve essere preparata lo stesso giorno della reazione. EDC funge da catalizzatore per la derivazione di composti con anilina12.
2. Preparazione delle norme
- Creare soluzioni di stock separate di tutti i composti disciolti nell'acqua di grado LC/MS (tabella 1).
-
Preparazione della soluzione interna per lo stock standard
- Combina tutti i composti ad eccezione di dinucleotide adenina nicotinamide (NAD), didenina didenina didenina didenina digastide fosfato (NADP), dinucleotide di flanutta (FAD), coenzima adenilale A (ACA) e glicerolo 3 fosfato (Gly3P), con i volumi appropriati per creare una soluzione di 2 mM di tutti i composti.
- Combinare NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P con i volumi appropriati per creare una soluzione stock da 2 mM.
3. Preparazione del campione (Figura 1)
- Quench e precipitare le proteine in una reazione di sintesi proteica priva di cellule aggiungendo un volume uguale di ghiaccio-freddo 100% etanolo alla reazione. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga.
NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi a questo punto e analizzati in un secondo momento
4. Reazione di etichettatura
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Esempio di etichettatura con soluzione a 12c-anilina
- Trasferire 6 l di l di campione in un nuovo tubo di centrifuga e portare il volume a 50 o L con acqua.
NOTA: la dimensione del campione di volume può dipendere dalla specifica reazione CFPS. - Aggiungere 5 soluzione EDC da 200 mg/mL.
- Aggiungete 5 -L di 12C-anilina.
NOTA: la soluzione anilina si separa in due fasi. Mescolare bene prima di aggiungere alla reazione. - Vortice la reazione con agitazione delicata per 2 h a temperatura ambiente.
- Dopo 2 h, togliere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 l di triethylamine (TEA) alla reazione in un cappuccio fumato.
NOTA: La trietilamina aumenta il pH della soluzione che ferma la reazione di marcatura dell'anilina e stabilizza i composti.
AGGIORNAMENTO: La trietilmia è tossica e causa irritazione degli occhi e delle vie respiratorie. - Centrifuga a 13.500 x g per 3 min.
- Trasferire 6 l di l di campione in un nuovo tubo di centrifuga e portare il volume a 50 o L con acqua.
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Etichettatura degli standard interni con 13soluzione C-anilina
- Diluire la soluzione interna a 80 M con un volume finale di 50 .L.
NOTA: la concentrazione degli standard interni può essere regolata a livelli vicini al campione sperimentale. - Aggiungere 5 soluzione EDC da 200 mg/mL.
- Aggiungete 5 -L di 13c-anilina.
- Vortice la reazione con agitazione delicata per 2 h a temperatura ambiente.
- Dopo 2 h, togliere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 l di TEA alla reazione in un cappuccio fumatore.
- Centrifuga a 13.500 x g per 3 min.
- Diluire la soluzione interna a 80 M con un volume finale di 50 .L.
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Combinazione di standard interni con tag e esempio con tag
- Mescolare 25 l di 12campioni con etichetta a C con 25 luna di 13standard con etichetta C-anilina.
- Trasferire a una fiala auto-campionatore e analizzare dalla procedura LC/MS.
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Creazione di una curva standard per metaboliti senza tag
- Soluzione di stock diluito di metaboliti senza tag (NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P) a concentrazioni finali di 320 M, 80 M, 20 M e 5 M con un volume di 50 L.
- Aggiungere 5 soluzione EDC da 200 mg/mL.
- Aggiungete 5 -L di 12C-anilina.
- Vortice la reazione con agitazione delicata per 2 h a temperatura ambiente.
- Dopo 2 h, togliere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 l di TEA alla reazione in un cappuccio fumatore.
- Centrifuga a 13.500 x g per 3 min.
- Trasferire supernatante a una fiala auto-campionatore e analizzare con la procedura LC/MS.
NOTA: I metaboliti senza tag seguono la stessa procedura del campione per replicare la matrice del campione al fine di mantenere un'efficienza di ionizzazione simile.
5. Configurazione della procedura LC/MS
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Preparazione dei solventi
- Preparare una soluzione acquiuna di 5 mM tri-butylamina (TBA) adattata al pH 4,75 con acido acetico.
NOTA: TBA nella fase mobile aiuta gli analiti a raggiungere una buona risoluzione e separazione14. - Preparare 5 mM TBA in acetonitrile (ACN).
- Preparare il solvente di lavaggio con 5% di acqua e 95% ACN.
- Preparare solvente di spurgo con 95% acqua e 5% ACN.
- Preparare una soluzione acquiuna di 5 mM tri-butylamina (TBA) adattata al pH 4,75 con acido acetico.
- Configurazione delle condizioni MS
- Impostare lo spettrometro di massa sulla modalità ione negativo con una temperatura sonda di 520 gradi centigradi, una tensione capillare negativa di -0,8 kV, una tensione capillare positiva di 0,8 kV, e impostare il software per acquisire dati a 5 punti/s.
- Impostare le registrazioni ioniche selezionate (SIR) per ogni metabolita con i valori di massa e carica (m/z) specificati. Vedere tabella 1.
-
Inizializzazione LC/MS secondo le istruzioni del produttore
- Prime linee solventi nel solvente manager per 3 min.
- Prime solvente di lavaggio (5% acqua, 95% ACN) e solvente di spurgo (95% acqua, 5% ACN) per 15 s per 5 cicli.
- Impostare il gestore di esempio su 10 .
- Installare una colonna C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) e inizializzare la colonna con ACN 100% a 0,3 mL/min per 10 min.
- Condizionare la colonna al 95% di acqua e 5% ACN a 0,3 mL/min per 10 min prima di introdurre solventi con buffer.
- Condizionare la colonna al 95% solvente A (5mM TBA aqueous, pH 4.75) e 5% solvente B (5 mM TBA in ACN) a 0,3 mL/min per 10 min.
- Impostare un protocollo di gradiente con eluizione a partire da 95% solvente A e 5% solvente B, elevato al 70% solvente B in 10 min, portato al 100% solvente B in 2 min e tenuto al 100% solvente B per 3 min. Ritorno alle condizioni iniziali (95% solvente A in 2 min e tenuto al 100% solvente B per 3 min. Ritorno alle condizioni iniziali (95% solvente A in 2 min e tenuto al 100% solvente B per 3 min. Ritorno alle condizioni iniziali (95% solvente A in 2 min , 5% solvente B) su 1 min e tenere premuto per 9 min per ri-colonna equilibrata.
- Condizionare la colonna con il protocollo di gradiente 3 volte prima di eventuali iniezioni sulla colonna.
-
Iniezione di campioni e standard
- Iniettare 5 l del campione nella colonna e acquisire le intensità ioni m/z appropriate per il campione con etichetta 12C-anilina.
- Iniettare di nuovo 5 L dello stesso campione, ma questa volta acquisire le intensità degli ioni m/z per gli standard con etichettatura 13C-anilina.
NOTA: Il nostro sistema LC/MS non è in grado di acquisire intensità 12C e 13C m/z ai tempi SIR specificati, poiché si tratta di troppi dati da acquisire nell'intervallo di tempo specificato. Pertanto, iniettiamo lo stesso campione due volte. - Iniettare gli standard di metaboliti senza tag dalla concentrazione più bassa alla più alta e registrare le intensità di ioni m/z appropriate.
6. Quantificazione
- Creazione del metodo Export
- Nel software di acquisizione dati, selezionare File > Nuovo metodo > Metodo di esportazione.
- Specificare un nome file, ad esempio AnilineTagging_Date.
- Selezionare Esporta file ASCII e scegliere una directory in cui esportare il file di testo.
- In Tipo di rapportoselezionare Riepilogo per tutti.
- In Delimitatori, per Colonna selezionare un ,. Per Riga, selezionare [cr][se].
- In Tabellaselezionare Esporta e quindi Modifica tabella per includere NomeEsempio, Area, Altezza, Quantità e Unità.
- Metodo di esportazione di salvataggio.
- Quantificare i metaboliti con standard interni utilizzando il software di acquisizione dati
- Nella scheda Insiemi di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla conduzione LC/MS corrispondente e selezionare Visualizza come > Canali.
- Selezionare tutti i canali SIR per i 13standard interni C-anilina di una iniezione, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Revisione.
- Se la finestra Layout metodo di elaborazione LC non viene visualizzata automaticamente, passare a Visualizza > Layout metododi elaborazione .
- In Processing Method Layout (Layout metodo di elaborazione)passare alla scheda Integration (Integrazione) e impostare ApexTrack come algoritmo.
- Vai alla scheda Arrotondamento e imposta il tipo su Mezzo e il livello di levigatura su 13.
NOTA: è possibile selezionare qualsiasi livello di levigatezza, purché sia coerente in tutti i campioni. - Nella scheda Canale MS, disattivare l'elaborazione MS 3D .
- Nella finestra del canale SIR, integrare ogni picco, un canale alla volta. Una volta integrato un picco, vai su Opzioni > Riempi da risultato e i dettagli del picco verranno compilati nella scheda Componenti. Modificare il nome del picco con il nome composto corrispondente.
- Una volta valutati tutti i canali SIR, salvare il metodo di elaborazione e chiudere la finestra.
- Selezionare tutti i canali SIR del 13C-anilina e 12C-anilina taggato esempio, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Processo.
- Selezionare la casella Processo, selezionare Usa metodo di elaborazione specificatoe scegliere il metodo di elaborazione appena salvato. Selezionare anche la casella Esporta, selezionare Usa il metodo di esportazione specificato e scegliere il metodo di esportazione salvato creato in precedenza. Fare clic su OK.
- Aprire il file di testo esportato con Excel e calcolare la concentrazione del composto sconosciuto utilizzando:
dove Cx,i è la concentrazione del campione sconosciuto per metabolita i, Ax,i è l'area integrata del metabolita sconosciuto i, Astd,i è l'area integrata dello standard interno di metabolita i, Cstd,i è il concentrazione dello standard interno di metabolita i, e D è il fattore di diluizione.
- Quantificazione dei metaboliti senza tag con curva standard
- Nella scheda Insiemi di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla conduzione LC/MS corrispondente e selezionare Visualizza come > Canali.
- Selezionare tutti i canali SIR per gli standard senza tag di un'iniezione, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Revisione.
- Se la finestra Layout metodo di elaborazione LC non viene visualizzata automaticamente, passare a Visualizza > Layout metododi elaborazione .
- In Processing Method Layout passare alla scheda Integration e impostare ApexTrack come algoritmo.
- Vai alla scheda Arrotondamento e imposta il tipo su Mezzo e il livello di levigatura su 13.
NOTA: è possibile selezionare qualsiasi livello di levigatezza, purché sia coerente in tutti i campioni. - Nella scheda Canale MS, disattivare l'elaborazione MS 3D .
- Nella finestra del canale SIR, integrare ogni picco, un canale alla volta. Una volta integrato un picco, vai su Opzioni > Riempi da risultato e i dettagli del picco verranno compilati nella scheda Componenti. Modificare il nome del picco con il nome composto corrispondente.
- Una volta valutati tutti i canali SIR, salvare il metodo di elaborazione e chiudere la finestra.
- Nella scheda Insiemi di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sul set di campioni e selezionare Altera campione.
- Selezionare Importo nella nuova finestra.
- Selezionare copia dal metodo di processo e scegliere il metodo di processo appena salvato.
- Immettere la concentrazione di ciascun metabolita per ciascuna flacone e l'unità come < s per ogni componente (o l'unità corrispondente) e selezionare OK.
- Selezionare nuovamente il set di campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse su Visualizza come > Canali.
- Selezionare tutti i canali SIR dei metaboliti senza tag per gli standard, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elabora.
- Selezionare la casella Processo e scegliere Usa metodo di elaborazione specificato. Selezionare il metodo di elaborazione appropriato e fare clic su OK.
- Selezionare i canali SIR per tutti i metaboliti senza tag per i campioni, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elabora.
- Selezionare la casella Processo, selezionare Usa metodo di elaborazione specificato e scegliere il metodo di elaborazione appena salvato. Selezionare anche la casella Esporta, selezionare Usa il metodo di esportazione specificato e scegliere il metodo di esportazione salvato creato in precedenza. Fare clic su OK.
- Quantificare i metaboliti senza tag con la curva standard ed esportare i risultati in un file di testo nella directory specificata.
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Representative Results
Come prova di concetto, abbiamo usato il protocollo per quantificare i metaboliti in un sistema CFPS basato su E. coli che esprimeva proteine fluorescenti verdi (GFP). La reazione della CFPS (14) è stata spenta e deproteinizzata con etanolo. Il campione CFPS è stato quindi contrassegnato con 12C-anilina, mentre gli standard sono stati contrassegnati con 13C-anilina. Il campione e gli standard contrassegnati sono stati quindi combinati e iniettati in LC/MS (Figura 1). Il protocollo ha rilevato e quantificato 40 metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia utilizzando standard interni, mentre è stata sviluppata anche una curva standard per 5 dei metaboliti che non sono stati etichettati con l'anilina (Figura 2). I diversi metaboliti coinvolti in queste vie erano una classe di zuccheri fosforelati, acidi fosfocarboxylici, acidi carboxilici, nucleotidi e cofattori. La derivazione con anilina ha introdotto una moiety idrofobica in molecole idrofile che hanno facilitato una separazione più efficace utilizzando la cromatografia a fase invertita12. Inoltre, il metodo ha permesso la separazione di coppie di isometori strutturali come glucosio 6 fosfato e fruttozolo 6-fosfato in una singola corsa LC/MS. Il rapporto massa sovracarica (m/z) di ciascun composto e il tempo di ritenzione sono stati identificati prima dell'esperimento iniettando 1 mM di un composto alla volta e confrontando lo spettro di massa con lo spettro vuoto (Tabella 1).
Il limite di rilevazione e l'intervallo di linearità per tutti i composti è stato stimato producendo una curva standard che variava da 0,10 M a 400 M (Tabella 2). Il coefficiente di correlazione medio (R2) per tutti i composti era 0,988 e la maggior parte dei composti aveva un intervallo lineare di 3 ordini di grandezza. Tre composti hanno avuto notevoli effetti di saturazione, in particolare alfa-ketoglutarate che avevano un'oscillazione lineare da 0,1 M a 25 M. Isocitrate e citrato aveva anche effetti di saturazione superiori a 100 M.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro per l'assegnazione di tag anilina. La reazione di sintesi proteica priva di cellule è deproteinizzata e contrassegnata con 12Anilina C, mentre una miscela di stock standard è etichettata con 13C-anilina. Entrambe le miscele vengono quindi mescolate ad un rapporto volumetrico 1:1 e analizzate da LC/MS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: cromatogrammi ionici sovrapposti per 40 metaboliti. Cromatogramma di massa da una singola conduzione LC/MS di una miscela standard di 40 m di 40 metaboliti. I picchi sono stati identificati dal loro tempo di ritenzione e dai valori m/z per ogni composto. I nomi composti completi e le relative abbreviazioni sono elencati nella Tabella 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero di picco | Metabolita | abbreviazione | ID KEGG | Tempo di conservazione (min) | 12C m/z | 13C m/z | nonetichetta m/z | CV | Specie MS | |
| 1 | Glicerolo 3 fosfato | Gly3P | C00093 | 3.85 | 153 | 10 | M – H2O – H | |||
| 2 | Dinucleotide di adenina alla nicotinamina | Nad | C00003 | 3.96 | 698 | 10 | M - Cl – H | |||
| 3 | glucosio | Glc | C00031 | 4.06 | 289.9 | 296 | 15 | M - A - Cl - H | ||
| 4 | Sedoeptolo 7 fosfati | S7P | C05382 | 5.41 | 364 | 370 | 10 | M - A – H | ||
| 5 | Fruttosio 6 fosfato | F6P | C00085 | 5.48 | 334 | 340 | 10 | M - A – H | ||
| 6 | Monoffato di Guanosina | Gmp | C00144 | 5.57 | 437.05 | 443 | 10 | M - A – H | ||
| 7 | Ribulose 5 fosfato | RL5P | C00199 | 5.58 | 304 | 310 | 10 | M - A – H | ||
| 8 | Cindino monofosfato | Cmp | C00055 | 5.59 | 397.09 | 403 | 10 | M - A – H | ||
| 9 | Lattato | Lac | C00186 | 5.77 | 164.05 | 170 | 10 | M - A – H | ||
| 10 | Adenosina monofosfato | ampère | C00020 | 5.85 | 421.1 | 427.1 | 10 | M - A – H | ||
| 11 | Polidino monofosfato | Ump | C00105 | 5.88 | 398.07 | 404 | 10 | M - A – H | ||
| 12 | Fosfato dinucleotide alla nicotinamide adenina | Nadp | C00006 | 6.39 | 724 | 10 | M - H2O – H | |||
| 13 | 3-Acido fosforilico | 3PG | C00197 | 6.63 | 242 | 248.06 | 15 | M - A – H2O – H | ||
| 14 | Citidina difosato | Cdp | C00112 | 6.72 | 477 | 483 | 10 | M - A – H | ||
| 15 | Guanosina difosato | Pil | C00035 | 6.87 | 517 | 523 | 10 | M - A – H | ||
| 16 | Difosato di adenosina | Adp | C00008 | 6.94 | 501 | 507 | 10 | M - A – H | ||
| 17 | Difosfato di uridina | Udp | C00015 | 6.97 | 478 | 484 | 10 | M - A – H | ||
| 18 | Flavin adenine dinucleotide | Moda | C00016 | 7.03 | 784.15 | 15 | M – H | |||
| 19 | Fruttosio 1,6-bisfosfato | F16P (in inglese) | C05378 | 7.1 | 395.95 | 402.1 | 10 | M - A – H2O – H | ||
| 20 | Gluconato 6 fosfato | 6PG | C00345 | 7.11 | 425.1 | 437 | 10 | M - 2A – H | ||
| 21 | Nicotinamide adenina dinucleotide ridotta | Nadh | C00004 | 7.23 | 633.13 | 639.08 | 10 | M - A - H2O – nicotinamide – H | ||
| 22 | Glucosio 6 fosfato | G6P | C00668 | 7.32 | 409.1 | 421.1 | 10 | M - 2A – H | ||
| 23 | Ribosodo 5-fosfato | R5P | C00117 | 7.54 | 379.1 | 391.1 | 15 | M - 2A – H | ||
| 24 | Erithrose 4-fosfato | E4P | C00279 | 7.71 | 348.9 | 361 | 10 | M - 2A – H | ||
| 25 | Tripfosfato di cisidina | Ctp | C00075 | 7.84 | 557 | 563 | 5 | M - A – H | ||
| 26 | Trefosdo di Guanosina | Gtp | C00044 | 7.93 | 597 | 603 | 5 | M - A – H | ||
| 27 | Oxalacetate | OAA | C00036 | 7.94 | 281 | 293 | 25 | M - 2A – H | ||
| 28 | Alfa-ketoglutarate | Akg | C00026 | 7.95 | 295 | 307.1 | 15 | M - 2A – H | ||
| 29 | Trasfato uridino | Utp | C00075 | 7.97 | 558 | 564 | 10 | M - A – H | ||
| 30 | Trifosfato adenosina | Atp | C00002 | 8.03 | 581 | 587 | 15 | M - A – H | ||
| 31 | Fumarato | FUM | C00122 | 8.09 | 265 | 277.1 | 10 | M - 2A – H | ||
| 32 | Piruvato | Pyr | C00022 | 8.09 | 162 | 168 | 25 | M - A – H | ||
| 33 | Malato | MAL | C00149 (in questo stati) | 8.09 | 283.06 | 295.15 | 10 | M - 2A – H | ||
| 34 | D-gliceralde 3-fosfato | Divario | C00118 | 8.09 | 319 | 331.1 | 5 | M - 2A – H | ||
| 35 | Acetil-coenzima A | Aca | C00024 | 8.16 | 790 | 10 | M – H2O – H | |||
| 36 | Nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ridotto | Nadph | C00005 | 8.23 | 694.92 | 700.82 | 10 | M - A – nicotinamide – H | ||
| 37 | Fosfoenolpyruvate | dinamismo | C00074 | 8.28 | 317 | 329.1 | 20 | M - 2A – H | ||
| 38 | Succinato | SUCC | C00042 | 8.64 | 267.07 | 279.1 | 15 | M - 2A – H | ||
| 39 | Isocitato | ICIT | C00311 | 10.13 | 398 | 416 | 10 | M - 3A – H2O – H | ||
| 40 | Citrato | Cit | C00158 | 10.46 | 416.1 | 434.06 | 20 | M - 3A – H | ||
Tabella 1: Identificazione ed etichettatura dei risultati dei metaboliti. Numero di picco corrispondente di ogni composto, tempo di ritenzione, valore m/z per le specie senza etichetta, 12C e 13C etichettati e specie MS. MS Species, A sta per Aniline tag.
| N. di picco | Metabolita | abbreviazione | ID KEGG | Concentrazione (mM) | SD (n - 3) | Limite di rilevamento (M) | Limite dell'intervallo lineare | R2 | |
| 1 | Glicerolo 3 fosfato | Gly3P | C00093 | 0.377 | 0.034 | 0.1 | 400 | 0.995 | |
| 2 | Dinucleotide di adenina alla nicotinamina | Nad | C00003 | 0.052 | 0.010 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 3 | glucosio | Glc | C00031 | 0.002 | 0.000 | 0.1 | 400 | 0.997 | |
| 4 | Sedoeptolo 7 fosfati | S7P | C05382 | 0.007 | 0.000 | 0.16 | 400 | 0.988 | |
| 5 | Fruttosio 6 fosfato | F6P | C00085 | 0.029 | 0.004 | 0.1 | 400 | 0.986 | |
| 6 | Monoffato di Guanosina | Gmp | C00144 | 0.007 | 0.001 | 0.39 | 100 | 0.992 | |
| 7 | Ribulose 5 fosfato | RL5P | C00199 | 0.035 | 0.002 | 0.39 | 400 | 0.996 | |
| 8 | Cindino monofosfato | Cmp | C00055 | 0.045 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 9 | Lattato | Lac | C00186 | 2.134 | 0.048 | 0.1 | 400 | 0.988 | |
| 10 | Adenosina monofosfato | ampère | C00020 | 0.020 | 0.002 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 11 | Polidino monofosfato | Ump | C00105 | 0.021 | 0.000 | 0.1 | 100 | 0.997 | |
| 12 | Fosfato dinucleotide alla nicotinamide adenina | Nadp | C00006 | 0.014 | 0.002 | 0.34 | 400 | 0.950 | |
| 13 | 3-Acido fosforilico | 3PG | C00197 | 6.125 | 0.239 | 0.1 | 100 | 0.996 | |
| 14 | Citidina difosato | Cdp | C00112 | 0.202 | 0.029 | 0.39 | 400 | 0.997 | |
| 15 | Guanosina difosato | Pil | C00035 | 0.146 | 0.027 | 1.5625 | 400 | 0.984 | |
| 16 | Difosato di adenosina | Adp | C00008 | 0.797 | 0.161 | 0.39 | 400 | 0.995 | |
| 17 | Difosfato di uridina | Udp | C00015 | 0.212 | 0.036 | 0.39 | 400 | 0.991 | |
| 18 | Flavin adenine dinucleotide | Moda | C00016 | 0.008 | 0.001 | 0.1 | 400 | 0.958 | |
| 19 | Fruttosio 1,6-bisfosfato | F16P (in inglese) | C05378 | 3.643 | 0.105 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 20 | Gluconato 6 fosfato | 6PG | C00345 | 0.017 | 0.001 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 21 | Nicotinamide adenina dinucleotide ridotta | Nadh | C00004 | 0.063 | 0.028 | 0.39 | 100 | 0.972 | |
| 22 | Glucosio 6 fosfato | G6P | C00668 | 0.046 | 0.002 | 0.1 | 400 | 0.984 | |
| 23 | Ribosodo 5-fosfato | R5P | C00117 | 0.055 | 0.005 | 0.39 | 100 | 0.999 | |
| 24 | Erithrose 4-fosfato | E4P | C00279 | 0.038 | 0.007 | 0.39 | 400 | 0.979 | |
| 25 | Tripfosfato di cisidina | Ctp | C00075 | 0.896 | 0.078 | 6.25 | 100 | 0.998 | |
| 26 | Trefosdo di Guanosina | Gtp | C00044 | 0.870 | 0.109 | 6.25 | 100 | 0.993 | |
| 27 | Oxalacetate | OAA | C00036 | 0.023 | 0.008 | 0.56 | 400 | 0.997 | |
| 28 | Alfa-ketoglutarate | Akg | C00026 | 0.391 | 0.020 | 0.1 | 25 | 0.979 | |
| 29 | Trasfato uridino | Utp | C00075 | 0.845 | 0.092 | 1.5625 | 400 | 0.998 | |
| 30 | Trifosfato adenosina | Atp | C00002 | 1.557 | 0.188 | 1.5625 | 400 | 0.991 | |
| 31 | Fumarato | FUM | C00122 | 0.576 | 0.100 | 1.5625 | 100 | 0.999 | |
| 32 | Piruvato | Pyr | C00022 | 5.813 | 0.804 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 33 | Malato | MAL | C00149 (in questo stati) | 2.548 | 0.269 | 0.1 | 400 | 0.991 | |
| 34 | D-gliceralde 3-fosfato | Divario | C00118 | 2.194 | 0.367 | 0.1 | 100 | 0.974 | |
| 35 | Acetil-coenzima A | Aca | C00024 | 0.196 | 0.044 | 0.1 | 100 | 0.991 | |
| 36 | Nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ridotto | Nadph | C00005 | 0.006 | 0.010 | 0.14 | 100 | 0.990 | |
| 37 | Fosfoenolpyruvate | dinamismo | C00074 | 3.442 | 0.345 | 0.1 | 100 | 0.962 | |
| 38 | Succinato | SUCC | C00042 | 5.683 | 0.573 | 0.1 | 320 | 0.999 | |
| 39 | Isocitato | ICIT | C00311 | 0.003 | 0.006 | 0.39 | 100 | 0.998 | |
| 40 | Citrato | Cit | C00158 | 0.002 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.981 | |
Tabella 2: Quantificazione dei metaboliti in un campione rappresentativo di CFPS. La concentrazione di ogni metabolita e la deviazione standard. Limite di rilevazione, gamma di linearità e coefficiente di correlazione identificato dalle curve standard.
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Discussion
I sistemi privi di cellule non hanno una parete cellulare, quindi c'è accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza la necessità di una complessa preparazione del campione. Tuttavia, è stato fatto molto poco lavoro per sviluppare protocolli approfonditi e robusti per interrogare quantitativamente sistemi di reazione privi di cellule. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo veloce e robusto per quantificare i metaboliti nelle miscele di reazione prive di cellule e potenzialmente in estratti interi cellulari. La quantificazione individuale dei metaboliti in miscele complesse, come quelle che si trovano nelle reazioni prive di cellule, o estratti interi cellulari, è impegnativa per diversi motivi. Tra questi motivi c'è la diversità chimica. La serie di gruppi funzionali contemporaneamente presenti in queste miscele (ad esempio, acidi carboxylici, ammine, fosfati, idrossili, ecc.) aumenta notevolmente la complessità analitica. Per aggirare questo, abbiamo usato un metodo di derivazione anilina in combinazione con 13standard interni C per introdurre componenti idrofobici alle miscele di metaboliti. Utilizzando questo metodo, abbiamo robustamente rilevato e quantificato 40 metaboliti in una reazione priva di cellule in una singola corsa LC/MS. Il protocollo ha etichettato 35 dei 40 composti in questo studio, mentre i restanti 5 composti sono stati quantificati con un metodo di curva standard. Il lavoro precedente ha suggerito che le condizioni di reazione formavano un sale intramolecolare tra il gruppo amminella e fosfato che inibiva la derivazione12. Le condizioni di reazione non sono state identificate per la derivazione simultanea di tutti i 40 composti; tuttavia, l'alternativa attuale è la quantificazione con un metodo di curva standard. Mentre abbiamo dimostrato questa tecnica in una miscela di reazione priva di cellule, potrebbe anche essere applicata a estratti interi cellulari, permettendo potenzialmente la quantificazione assoluta delle concentrazioni di metaboliti intracellulari. Quest'ultima applicazione ha rilevanza per una serie di questioni importanti in materia di biotecnologia e salute umana.
Il metodo qui presentato si basava su una tecnica precedente (GSIST) che è stata applicata agli estratti interi del lievito S. cerevisiae12,13. In questo studio, abbiamo ampliato il numero di composti che potrebbero essere rilevati e quantificati, compresi tutti i 12 nucleotidi (xMP, xDP, xTP, dove x è A, C, G e U). L'aggiunta di questi composti potrebbe avere importanti implicazioni biologiche. Ad esempio, questi nucleotidi sono fortemente coinvolti nei processi di trascrizione e traduzione, che è uno dei processi centrali di interesse per le applicazioni CFPS, e più in generale i composti sono importanti in una varietà di funzioni fisiologiche. Inoltre, siamo stati in grado di rilevare l'acido acetico che è un metabolita importante quando si esamina il metabolismo di overflow. Tuttavia, non lo abbiamo incluso nello studio perché c'era una significativa riduzione del segnale in composti multipli, in particolare dinucleotide adenina di nicotinamide ridotta (NADH) e dinucleotide dianucleotide alla nicotinamide ridotta (NADPH) quando l'acido acetico ridotto è stato aggiunto alla miscela standard. L'acido acetico aveva un alto limite di rilevazione di 612 M, quindi a questi livelli elevati ha avuto un effetto negativo sui segnali degli altri metaboliti. Nonostante questo, l'acido acetico può ancora essere rilevato e quantificato nei campioni creando una curva standard con solo acido acetico nella fiala. L'acido acetico aveva un valore m/z di 134,0, un tempo di ritenzione di 5,78 min e un intervallo lineare compreso tra 612 M e 5000 M (R2 x 0,986) quando contrassegnato con 12C-anilina. I restanti metaboliti non hanno alterato il segnale iostico reciproco e rappresentano una miscela completa per caratterizzare il metabolismo cfPS. Il protocollo qui presentato è limitato ai metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia. Così, il metodo attuale non è in grado di misurare l'abbondanza di metaboliti da altre vie che possono essere di importanza, come l'acido grasso e metabolismo degli amminoacidi.
Nel loro insieme, abbiamo sviluppato un protocollo veloce e robusto per la caratterizzazione e la quantificazione assoluta di 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato pentosi, il ciclo dell'acido tricarboxylico, il metabolismo energetico e la rigenerazione dei cofattori in CFPS Reazioni. Il metodo si basava su standard interni contrassegnati con 13C-anilina, mentre il campione è stato contrassegnato con 12C-anilina. Gli standard interni e i composti campione hanno co-eluito ed eliminato gli effetti di soppressione degli ioni che hanno permesso una quantificazione accurata dei singoli metaboliti in miscele di metaboliti complessi. Abbiamo identificato un totale di 40 composti (41, se incluso l'acido acetico) che possono essere rilevati e quantificati in una miscela di reazione priva di cellule; tuttavia, l'elenco dei metaboliti potrebbe essere ulteriormente ampliato e adattato al particolare processo biochimico di interesse. Così, il metodo fornisce un approccio robusto e preciso per caratterizzare il metabolismo senza cellule, che è potenzialmente fondamentale per migliorare la resa, la produttività e l'efficienza energetica dei processi senza cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro descritto è stato supportato dal Centro sulla Fisica del Metabolismo del Cancro attraverso il premio numero 1U54CA210184-01 del National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/ ). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Cancer Institute o dei National Institutes of Health. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
