Summary

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Published: October 25, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Abstract

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een opkomende technologie in systemen en synthetische biologie voor de in vitro productie van eiwitten. Als CFP’S echter verder gaan dan het laboratorium en een wijdverspreide en standaard just-in-time productietechnologie worden, moeten we de prestatielimieten van deze systemen begrijpen. In de richting van deze vraag, ontwikkelden we een robuust protocol om te kwantificeren 40 verbindingen die betrokken zijn bij glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, energiemetabolisme en cofactor regeneratie in CFPS reacties. De methode maakt gebruik van interne normen gelabeld met 13c-aniline, terwijl verbindingen in het monster zijn guarderivaten met 12c-aniline. De interne normen en het monster werden gemengd en geanalyseerd met reversed-phase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC/MS). De co-elutie van verbindingen geëlimineerd ionen onderdrukking, waardoor de nauwkeurige kwantificering van metaboliet concentraties over 2-3 ordes van grootte, waar de gemiddelde correlatiecoëfficiënt 0,988 was. Vijf van de 40-verbindingen waren niet gelabeld met aniline, maar ze werden nog steeds gedetecteerd in het CFPS-monster en gekwantificeerd met een standaard curve methode. De chromatografische uitvoering duurt ongeveer 10 minuten om te voltooien. Samen hebben we een snelle, robuuste methode ontwikkeld voor het scheiden en nauwkeurig kwantificeren van 40-verbindingen die betrokken zijn bij CFP’S in één LC/MS-run. De methode is een uitgebreide en nauwkeurige benadering om het celvrije metabolisme te karakteriseren, zodat we uiteindelijk de opbrengst, productiviteit en energie-efficiëntie van cel-vrije systemen kunnen begrijpen en verbeteren.

Introduction

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een veelbelovend platform voor de vervaardiging van eiwitten en chemicaliën, een toepassing die traditioneel is gereserveerd voor levende cellen. Cel-vrije systemen zijn afgeleid van ruwe celextracten en elimineren de complicaties geassocieerd met celgroei1. Bovendien biedt CFPS directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder interferentie van een celwand. Een fundamenteel begrip van de prestatiegrenzen van de cel-vrije processen ontbreekt echter. High-throughput methoden voor de kwantificering van metaboliet zijn waardevol voor de karakterisering van het metabolisme en zijn van cruciaal belang voor de bouw van metabole computationele modellen2,3,4. Veelgebruikte methoden voor het bepalen van de metaboliet concentraties zijn nucleaire magnetische resonantie (NMR), Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR), enzym gebaseerde testen en massaspectrometrie (MS)5,6,7 ,8. Echter, deze methoden worden vaak beperkt door hun onvermogen om efficiënt te meten van meerdere verbindingen tegelijk en vereisen vaak een steekproefgrootte groter is dan de typische cel-vrije reacties. Bijvoorbeeld, enzym gebaseerde assays kunnen vaak alleen worden gebruikt voor het kwantificeren van één samengestelde in een run, en zijn beperkt wanneer de grootte van het monster klein is, zoals in de cel-vrije eiwitsynthese Reacties (meestal uitgevoerd op een schaal van 10-15 μL). Ondertussen vereist NMR een grote overvloed aan metabolieten voor detectie en kwantificering5.  In de richting van deze tekortkomingen bieden chromatografie methoden in combinatie met massaspectrometrie (LC/MS) verschillende voordelen, waaronder hoge gevoeligheid en de mogelijkheid om meerdere soorten gelijktijdig te meten9; de analytische complexiteit neemt echter aanzienlijk toe met het aantal en de diversiteit van de soorten die worden gemeten. Het is daarom belangrijk om methoden te ontwikkelen die het hoge doorvoer potentieel van LC/MS-systemen volledig realiseren. Verbindingen in een monster worden gescheiden door vloeistofchromatografie en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie. Het signaal van de verbinding hangt af van de concentratie en de ionisatie-efficiëntie, waarbij de ionisatie kan variëren tussen verbindingen en kan ook afhangen van de monstermatrix.

Het bereiken van dezelfde ionisatie-efficiëntie tussen het monster en de normen is een uitdaging bij het gebruik van LC/MS om analyten te kwantificeren. Verder wordt kwantificering uitdagender met de diversiteit van de metaboliet als gevolg van signaal splitsing en heterogeniteit in Proton affiniteit en polariteit10. Ten slotte kan de co-eluting-matrix van het monster ook invloed hebben op de ionisatie-efficiëntie van de verbindingen. Om deze problemen aan te pakken, kunnen metabolieten chemisch worden afgeleid, waardoor de scheidings resolutie en gevoeligheid door LC/MS-systemen worden vergroot, terwijl tegelijkertijd de signaal splitsing in sommige gevallen10,11wordt verlaagd. Chemische derivatisatie werkt door specifieke functionele groepen van metabolieten te taggen om hun fysische eigenschappen zoals charge of hydrofobiciteit aan te passen om de ionisatie-efficiëntie te verhogen11. Verschillende tagstoffen kunnen worden gebruikt om verschillende functionele groepen te targeten (bijv. amines, hydroxyls, fosfaten, carbonzuren, enz.). Aniline, een dergelijke derivatisatie-agent, richt zich op meerdere functionele groepen tegelijk, en voegt een hydrofobe component toe aan hydrofiele moleculen, waardoor hun scheidings resolutie en signaal12toenemen. Om het co-eluting-matrix-ionen onderdrukkings effect aan te pakken, ontwikkelden Yang en collega’s een techniek op basis van groepsspecifieke interne standaard technologie (GSIST)-labeling waarbij normen zijn gelabeld met 13C aniline-isotopen en vermengd met het monster 12,13. De metaboliet en de corresponderende interne standaard hebben dezelfde ionisatie-efficiëntie omdat ze co-elute, en hun intensiteit ratio kan worden gebruikt om de concentratie in het experimentele monster te kwantificeren.

In deze studie ontwikkelden we een protocol voor het opsporen en kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij de glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, het energiemetabolisme en de cofactor-regeneratie bij CFPS-reacties. De methode is gebaseerd op de GSIST-benadering, waarbij we 12c-aniline en 13c-aniline gebruikten om metabolieten te taggen, te detecteren en te kwantificeren met behulp van omgekeerde fase LC/MS. Het lineaire bereik van alle verbindingen omspannen 2-3 ordes van grootte met een gemiddelde correlatiecoëfficiënt van 0,988. Dus, de methode is een robuuste en nauwkeurige benadering van interrogaat cel-vrije metabolisme, en eventueel hele-celextracten.

Protocol

1. bereiding van reagentia voor aniline-tagging Bereid een aniline oplossing van 6 M bij pH 4,5. Werk in een afzuigkap, combineer 550 μL aniline met 337,5 μL LCMS water en 112,5 μL van 12 M zoutzuur (HCl) in een centrifugebuis. Vortex goed en bewaren bij 4 °C.Opmerking: aniline kan gedurende 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.Let op: aniline is zeer giftig en moet in een rook afzuigkap worden bewerkt. Zoutzuur is zeer corrosief Bereid een aniline oplossing van 6 M 13C bij pH 4,5…

Representative Results

Als proof-of-concept gebruikten we het protocol om metabolieten te kwantificeren in een E. coli gebaseerd CFPS systeem dat groen fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukt.  De CFPS-reactie (14 μL) werd uitgeblust en gedeproteïniseerd met ethanol. De CFPS sample werd vervolgens getagd met 12c-aniline, terwijl de normen werden getagd met 13c-aniline. Het gelabelde monster en de normen werden vervolgens gecombineerd en geïnjecteerd in de LC/MS (Figuur 1). Het pro…

Discussion

Cel-vrije systemen hebben geen celwand, dus er is directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder dat complexe monstervoorbereiding nodig is. Er is echter heel weinig werk verzet om grondige en robuuste protocollen te ontwikkelen voor het meten van de celvrije reactie systemen. In deze studie ontwikkelden we een snelle, robuuste methode om metabolieten te kwantificeren in celvrije reactie mengsels en mogelijk in hele celextracten. Individuele kwantificering van metabolieten in complexe mengsels, zo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het beschreven werk werd gesteund door het centrum op de fysica van kanker metabolisme door middel van Award nummer 1U54CA210184-01 van het National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Cancer Institute of de National Institutes of Health. De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

Materials

12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Play Video

Cite This Article
Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

View Video