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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们提出了一个强大的协议，以量化40个化合物参与中央碳和能量代谢在无细胞蛋白质合成反应。无细胞合成混合物用抗氧化剂衍生，使用反相液相色谱进行有效分离，然后使用异位标记的内部标准通过质谱法进行量化。

Abstract

无细胞蛋白合成（CFPS）是蛋白质体外生产的系统和合成生物学的新兴技术。但是，如果 CFPS 要超越实验室，成为一种广泛而标准的及时制造技术，我们必须了解这些系统的性能限制。针对这个问题，我们开发了一个强大的协议，以量化参与糖解的40种化合物，磷酸五氯苯基，三聚碳酸循环，能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法使用带有13种C-单一体标记的内部标准，而样品中的化合物则用12种C-aniline进行衍生。通过反相液相色谱-质谱法（LC/MS）对内部标准和样品进行混合和分析。化合物的共洗脱消除了电子抑制，使代谢物浓度在平均相关系数为0.988的2-3个量级以上进行精确定量。四十种化合物中有五种未加用碱标记，然而，它们仍在CFPS样本中检测到，并采用标准曲线法进行量化。色谱运行大约需要 10 分钟才能完成。综合起来，我们开发了一种快速、可靠的方法，在一次LC/MS运行中分离和准确量化CFPS中涉及的40种化合物。该方法是描述无细胞代谢的一种全面而准确的方法，因此，我们最终能够了解并提高无细胞系统的产量、生产率和能源效率。

Introduction

无细胞蛋白质合成（CFPS）是制造蛋白质和化学品的有前途的平台，这种应用传统上是为活细胞保留的。无细胞系统来自粗细胞提取物，并消除与细胞生长相关的并发症1。此外，CFPS 允许直接访问代谢物和生物合成机械，无需细胞壁干扰。然而，对无细胞过程的性能限制缺乏基本的了解。高通量代谢物定量方法对代谢表征有价值，对代谢计算模型2、3、4的构建至关重要。用于确定代谢物浓度的常见方法包括核磁共振 （NMR）、傅立叶变换红外光谱 （FT-IR）、基于酶的测定法和质谱 （MS）5、6、7 ，8.然而，这些方法往往受限于它们无法同时有效地测量多种化合物，并且通常需要比典型的无细胞反应更大的样本大小。例如，基于酶的检测通常只能用于在运行中量化单个化合物，并且在样本量较小时（如无细胞蛋白合成反应（通常在 10-15 μL 尺度上运行）时受到限制。同时，NMR需要高丰度代谢物来检测和定量5。 针对这些缺点，色谱方法与质谱（LC/MS）结合提供了几个优点，包括高灵敏度和同时测量多个物种的能力9;然而，分析复杂性随着被测量物种的数量和多样性而大大增加。因此，开发能够充分实现LC/MS系统高通量潜力的方法非常重要。样品中的化合物通过液相色谱分离，并通过质谱法进行鉴定。化合物的信号取决于其浓度和电电化效率，其中电电化在化合物之间可能有所不同，也可能取决于样品矩阵。

在使用LC/MS对分析物进行量化时，在样品和标准之间实现相同的电电化效率是一项挑战。此外，由于质子亲和力和极性10的信号分裂和异质性，代谢物多样性的定量变得更加具有挑战性。最后，样品的共解基质也会影响化合物的电电化效率。为了解决这些问题，代谢物可以化学衍生，提高LC/MS系统的分离分辨率和灵敏度，同时在某些情况下减少信号分裂10，11。化学衍生的工作原理是标记代谢物的特定功能组，以调整其物理特性，如电荷或疏水性，以提高电化效率11。各种标记剂可用于针对不同的功能组（例如，胺、羟基、磷酸盐、碳化物酸等）。Aniline，一种这样的衍生剂，一次瞄准多个功能组，并在亲水分子中加入疏水成分，从而提高其分离分辨率和信号12。为了解决共发基质电抑制效应，杨和同事开发了一种基于组特定内部标准技术 （GSIST） 标签的技术，其中标准标有13 C阴宁同位素，并与样品混合12，13.代谢物和相应的内部标准自共溶以来具有相同的电化效率，其强度比可用于定量实验样品中的浓度。

在这项研究中，我们开发了一个协议来检测和量化参与糖解的40种化合物，磷酸五氯苯星通路，三聚碳酸循环，能量代谢和CFPS反应中的副因子再生。该方法基于GSIST方法，我们使用12种C-单一素和13种C-aniline来标记、检测和量化代谢物，使用逆相LC/MS。所有化合物的线性范围跨越2-3个数量级，平均相关系数为0.988。因此，该方法是一种可靠而准确的方法，用于询问无细胞代谢，以及可能全细胞提取物。

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Protocol

1. 制备用于使用线标的的试剂

  1. 在 pH 4.5 下制备 6 M 丙琳溶液。在发动机罩中工作，将 550 μL 的苯氨酸与 337.5 μL 的 LCMS 级水和 112.5 μL 的 12 M 盐酸 （HCl） 组合在离心管中。涡旋井，储存在4°C。
    注：Aniline 可在 4°C 下储存 2 个月。
    注意：Aniline 是剧毒的，应在烟罩中使用。盐酸具有很强的腐蚀性
  2. 在 pH 4.5 下制备 6 M 13C 丙宁溶液。将 250 mg的 13C6- 阴宁与 132 μL 的水和 44 μL 的 12 M HCl 涡流井结合，并储存在 4°C。
  3. 制备200mg/mL N-（3-二甲基氨基）-N-乙基甲酰盐酸（EDC）溶液。将2毫克EDC溶解在10μL水中，用于每个样品被标记和涡旋井。
    注：EDC溶液应在反应当天制备。EDC是使用一氧化二线的化合物衍生的催化剂。

2. 制定标准

  1. 对溶解在LC/MS级水中的所有化合物进行单独的库存溶液（表1）。
  2. 准备内部标准库存解决方案
    1. 除烟酰胺腺苷二核苷酸（NAD）、烟酰胺腺苷二核苷酸（NADP）、弗拉文腺苷二核苷酸（FAD）、乙酰辅酶A（ACA）和甘油3-磷酸盐（Gly3P）外的所有化合物，并适当体积为所有化合物创建 2 mM 库存溶液。
  3. 将 NAD、NADP、FAD、ACA 和 Gly3P 与适当的卷相结合，创建 2 mM 库存解决方案。

3. 样品制备（图1）

  1. 在无细胞蛋白合成反应中，通过在反应中加入同等量的冰冷100%乙醇，将蛋白质淬火和沉淀。在4°C下将样品在12，000 x g下离心15分钟。将上清液转移到新的离心管中。
    注：此时样品可储存在-80°C，稍后分析

4. 贴标反应

  1. 带有12 种C-单线溶液的标记样品
    1. 将6μL样品转移到新的离心管中，用水将体积调到50μL。
      注： 体积样本大小可能取决于特定的 CFPS 反应。
    2. 加入5μL的200毫克/毫克EDC溶液。
    3. 加入5 μL的12种C-单一碱溶液。
      注： 单一线溶液分为两个阶段。加入反应之前，先混合好。
    4. 在室温下，用轻柔的晃动涡旋反应2小时。
    5. 2小时后，从摇床中取出管子，并在烟机罩中向反应中加入1.5 μL的三乙胺（TEA）。
      注： Triethylamine 提高溶液的pH，从而停止苯胺标记反应并稳定化合物。
      注意：三乙胺是有毒的，会引起眼睛和呼吸道的刺激。
    6. 13，500 x g离心 3 分钟。
  2. 使用13 种C-单一解决方案标记内部标准
    1. 将内部库存溶液稀释至 80 μM，最终体积为 50 μL。
      注：内部标准的浓度可以调整到接近实验样品的水平。
    2. 加入5μL的200毫克/毫克EDC溶液。
    3. 加入5 μL的13种C-单一醇溶液。
    4. 在室温下，用轻柔的晃动涡旋反应2小时。
    5. 2小时后，从摇床中取出管子，在烟机罩中向反应中加入1.5 μL的TEA。
    6. 13，500 x g离心 3 分钟。
  3. 组合带标签的内部标准和带标签的样本
    1. 将 25 μL的 12 个C-aniline 标记样品与 25 μL 的13 个C-aniline 标配标准混合。
    2. 转移到自动取样器小瓶，并通过LC/MS程序进行分析。
  4. 为未标记的代谢物创建标准曲线
    1. 未标记代谢物（NAD、NADP、FAD、ACA 和 Gly3P）的稀释库存溶液，最终浓度为 320 μM、80 μM、20 μM 和 5 μM，体积为 50 μL。
    2. 加入5μL的200毫克/毫克EDC溶液。
    3. 加入5 μL的12种C-单一碱溶液。
    4. 在室温下，用轻柔的晃动涡旋反应2小时。
    5. 2小时后，从摇床中取出管子，在烟机罩中向反应中加入1.5 μL的TEA。
    6. 13，500 x g离心 3 分钟。
    7. 将上清液转移到自动取样器小瓶，并通过 LC/MS 程序进行分析。
      注： 未标记的代谢物遵循与样本相同的过程来复制样本矩阵，以保持类似的电电化效率。

5. LC/MS 程序的设置

  1. 溶剂制备
    1. 用醋酸制备5mM三丁胺（TBA）水溶液，经调节至pH 4.75。
      注：移动相中的TBA帮助分析物实现良好的分辨率和分离14。
    2. 在醋酸酯 （ACN） 中制备 5 mM TBA。
    3. 用5%水和95%ACN制备洗涤溶剂。
    4. 用 95% 水和 5% ACN 制备净化溶剂。
  2. 设置 MS 条件
    1. 将质谱仪设置为负孔模式，探头温度为520°C，负毛细管电压为-0.8 kV，正毛细管电压为0.8 kV，并将软件设置为5点/s采集数据。
    2. 使用指定的锥体电压和质量过充 （m/z） 值为每个代谢物设置选定的电位记录 （SIR）。参见表1。
  3. 根据制造商的说明初始化 LC/MS
    1. 溶剂管理器中的首要溶剂管线3分钟。
    2. 优质洗涤溶剂（5%水，95%ACN）和净化溶剂（95%水，5%ACN）15s，循环5次。
    3. 将示例管理器设置为 10°C。
    4. 安装 C18（1.7μm、2.1mm x 150mm）柱，并在 0.3 mL/min 时初始化 100% ACN 的列，10 分钟。
    5. 在引入带缓冲液的溶剂之前，将柱在 95% 水和 5% ACN 中以 0.3 mL/min 的浇塞 10 分钟。
    6. 将柱的容量为 95% 溶剂 A（5mM TBA 水性，pH 4.75）和 5% 溶剂 B（ACN 中的 5 mM TBA），以 0.3 mL/min 为 10 分钟。
    7. 建立梯度方案，洗脱从95%溶剂A和5%溶剂B开始，10分钟内提高到70%溶剂B，2分钟内提高到100%溶剂B，3分钟保持100%溶剂B。恢复到初始条件（95%溶剂A），5% 溶剂 B） 超过 1 分钟，保持 9 分钟以重新平衡柱。
    8. 在注入到该列之前，使用梯度协议对列进行 3 次条件。
  4. 注射样品和标准
    1. 将 5 μL 样品注入柱中，获取12 个C-aniline 标记样品的相应 m/z ion 强度。
    2. 再次注入5μL的相同样品，但这次获得13个C-aniline标记标准的m/z的8/z的抗大强度。
      注： 我们的 LC/MS 系统无法在指定的 SIR 时间窗口获取12C 和13C m/z 强度，因为在指定的时间窗口内获取的数据太多。因此，我们注入同一样品两次。
    3. 注入未标记的代谢物标准，从最低浓度到最高浓度，并记录适当的 m/z ion 强度。

6. 量化

  1. 创建导出方法
    1. 在数据采集软件中，选择"文件>新方法>导出方法"。
    2. 指定文件名，如AnilineTagging_Date。
    3. 检查导出 ASCII文件并选择要导出文本文件的目录。
    4. 在"报表类型"中，选择"全部摘要"。
    5. 在"分隔符"中，对于列，选择。对于行，选择[cr][if]。
    6. 在"表中"中，选择"导出"，然后编辑表以包括样本名称、面积、高度、数量和单位。
    7. 保存导出方法。
  2. 使用数据采集软件使用内部标准量化代谢物
    1. 在"示例集"选项卡下，右键单击相应的LC/MS运行并选择"视图为>通道"。
    2. 选择13个C-Aniline内部标准的1个注射的SIR通道，右键单击并选择"查看"。
    3. 如果LC 处理方法布局窗口未自动显示，则转到"查看 > 处理方法布局"。
    4. 在"处理方法布局"中，转到"集成"选项卡，并将ApexTrack设置为算法。
    5. 转到"平滑"选项卡，并将类型设置为平均值，将平滑级别设置为13。
      注： 只要在所有样本中一致，都可以选择任何平滑级别。
    6. 在"MS通道"选项卡中，禁用MS 3D 处理。
    7. 在 SIR 通道窗口中，集成每个峰值，一次一个通道。集成峰值后，转到"选项>从结果填充"，峰值的详细信息将在"组件"选项卡中填写。将峰值名称更改为相应的复合名称。
    8. 评估所有 SIR 通道后，保存处理方法和关闭窗口。
    9. 选择13 个C-aniline 和12 个C-aniline 标记样本的所有 SIR 通道，右键单击并选择"处理"。
    10. 选中"处理"框，选择"使用指定的处理方法"，然后选择刚刚保存的处理方法。此外，选中"导出"框，选择"使用指定的导出方法"，然后选择之前创建的保存导出方法。单击"确定"。
    11. 使用 Excel 打开导出的文本文件，并使用以下方法计算未知化合物的浓度：
      Equation 1
      其中 Cx，i是代谢物 i 的未知样本的浓度，Ax，i是未知代谢物 i 的集成区域，Astd，i是代谢物 i 的内部标准的集成区域，Cstd，i是代谢物i的内部标准浓度，D是稀释因子。
  3. 使用标准曲线量化未标记的代谢物
    1. 在"示例集"选项卡下，右键单击相应的 LC/MS 运行并选择"视图为>通道"。
    2. 选择所有 SIR 通道，用于一次注射的未标记标准，右键单击并选择"查看"。
    3. 如果LC 处理方法布局窗口未自动显示，则转到"查看 > 处理方法布局"。
    4. 在"处理方法布局"中，转到"集成"选项卡并将ApexTrack设置为算法。
    5. 转到"平滑"选项卡，并将类型设置为平均值，将平滑级别设置为13。
      注： 只要在所有样本中一致，都可以选择任何平滑级别。
    6. 在"MS通道"选项卡中，禁用MS 3D 处理。
    7. 在 SIR 通道窗口中，集成每个峰值，一次一个通道。集成峰值后，转到"选项>从结果填充"，峰值的详细信息将在"组件"选项卡中填写。将峰值名称更改为相应的复合名称。
    8. 评估所有 SIR 通道后，保存处理方法和关闭窗口。
    9. 在"示例集"选项卡下，右键单击示例集并选择"更改示例"。
    10. 在新窗口中选择"金额"。
    11. 从"进程"方法中选择副本，然后选择刚刚保存的过程方法。
    12. 输入每个小瓶的每个代谢物的浓度，并输入单位作为 <μM 每个组件 （或相应的单位） 并选择确定。
    13. 再次选择示例集，右键单击，以 > 通道 "查看。
    14. 选择标准中未标记代谢物的所有 SIR 通道，右键单击并选择"处理"。
    15. 选中"处理"框，然后选择"使用指定的处理方法"。选择适当的处理方法，然后单击"确定"。
    16. 为样本选择所有未标记代谢物的 SIR 通道，右键单击并选择"处理"。
    17. 选中"处理"框，选择"使用指定的处理方法"，然后选择刚刚保存的处理方法。此外，选中"导出"框，选择"使用指定的导出方法"，然后选择之前创建的保存导出方法。单击"确定"。
    18. 使用标准曲线量化未标记的代谢物，并将结果导出到指定的目录。

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Representative Results

作为概念验证，我们使用该协议对表达绿色荧光蛋白（GFP）的基于大肠杆菌的CFPS系统中的代谢物进行量化。 CFPS反应（14μL）用乙醇淬火和脱蛋白。然后，CFPS 样本用12 个C-aniline 标记，而标准用13 个C-aniline 标记。然后，将标记的样本和标准组合起来并注入 LC/MS（图 1）。该协议使用内部标准检测并量化了40种参与中央碳和能源代谢的代谢物，同时开发了5种未贴有甲酰甲酰标签的代谢物的标准曲线（图2）。这些途径所涉及的各种代谢物是一类磷酸化糖、磷脂酸、碳水化合物酸、核苷酸和辅助因子。利用苯氨酸的衍生，将疏水性莫伊蒂引入亲水分子中，使用反相色谱12促进更有效的分离。此外，该方法还实现了结构异构体对的分离，如葡萄糖6-磷酸盐和果糖6磷酸盐在一次LC/MS运行。在实验之前，通过一次注射1 mM的化合物并将质量谱与空白进行比较，确定了每种化合物的质量过充（m/z）比率和保留时间（表1）。

通过生成从 0.10 μM 到 400 μM 之间的标准曲线（表 2）， 估计所有化合物的检测极限和线性范围。所有化合物的平均相关系数（R2）为0.988，大多数化合物的线性范围为3级。三种化合物具有显著的饱和效应，特别是α-酮谷酸，其线性范围为0.1 μM至25 μM。

Figure 1
图 1：用于 aniline 标记的工作流架构。无细胞蛋白合成反应脱蛋白，并贴上12种C-苯基苯，标准库存混合物用13种C-苯二系标记。然后，两种混合物以1：1的体积比混合，并由LC/MS进行分析。

Figure 2
图2：40个代谢物的重叠选定环状色谱图。从单个 LC/MS 运行到 40 μM 标准混合物的 40 代谢物的质量色谱图。峰值由每个化合物的保留时间和 m/z 值标识。完整的复合名称及其缩写列在表1中。请点击此处查看此图的较大版本。

峰值编号 代谢 产物 缩写 KEGG ID 保留时间（最小） 12C m/z 13C m/z 非标签 m/z 简历 MS 物种
1 甘油 3 磷酸盐 格利3P C00093 3.85 153 10 M = H2O = H
2 烟酰胺脱丁二核苷酸 NAD C00003 3.96 698 10 M = Cl = H
3 葡萄糖 GLC C00031 4.06 289.9 296 15 M = A + Cl - H
4 塞多普图洛 7 磷酸盐 S7P C05382 5.41 364 370 10 M = A = H
5 果糖 6 磷酸盐 F6P C00085 5.48 334 340 10 M = A = H
6 瓜诺辛单磷酸盐 Gmp C00144 5.57 437.05 443 10 M = A = H
7 核糖5磷酸盐 RL5P C00199 5.58 304 310 10 M = A = H
8 西提丁单磷酸盐 Cmp C00055 5.59 397.09 403 10 M = A = H
9 乳酸 Lac C00186 5.77 164.05 170 10 M = A = H
10 腺苷单磷酸盐 放大 器 C00020 5.85 421.1 427.1 10 M = A = H
11 乌里丁单磷酸盐 UMP C00105 5.88 398.07 404 10 M = A = H
12 烟酰胺脱丁二核苷酸磷酸盐 国家民军 C00006 6.39 724 10 M - H2O = H
13 3-磷酸 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M = A = H2O = H
14 西蒂丁二磷酸盐 Cdp C00112 6.72 477 483 10 M = A = H
15 瓜诺辛二磷酸盐 Gdp C00035 6.87 517 523 10 M = A = H
16 腺苷二磷酸盐 Adp C00008 6.94 501 507 10 M = A = H
17 乌里丁二磷酸盐 Udp C00015 6.97 478 484 10 M = A = H
18 弗拉文·阿丁丁二核苷酸 时尚 C00016 7.03 784.15 15 M = H
19 果糖 1，6-磷酸盐 F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M = A = H2O = H
20 葡萄糖酸 6 磷酸盐 6PG C00345 7.11 425.1 437 10 M = 2A = H
21 烟酰胺脱丁二核苷酸减少 Nadh C00004 7.23 633.13 639.08 10 M = A = H2O + 烟酰胺 + H
22 葡萄糖 6-磷酸盐 G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M = 2A = H
23 核糖5磷酸盐 R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M = 2A = H
24 埃里塞4磷酸盐 E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M = 2A = H
25 三磷酸盐西蒂丁 Ctp C00075 7.84 557 563 5 M = A = H
26 瓜诺辛三磷酸盐 全球贸易点 C00044 7.93 597 603 5 M = A = H
27 奥萨莱西泰特 OAA C00036 7.94 281 293 25 M = 2A = H
28 阿尔法-酮谷酸盐 aKG C00026 7.95 295 307.1 15 M = 2A = H
29 乌里丁三磷酸盐 UTP C00075 7.97 558 564 10 M = A = H
30 三磷酸腺苷 Atp C00002 8.03 581 587 15 M = A = H
31 富马拉特 FUM C00122 8.09 265 277.1 10 M = 2A = H
32 丙酮 酸 皮尔 C00022 8.09 162 168 25 M = A = H
33 马拉提 马尔 C00149 8.09 283.06 295.15 10 M = 2A = H
34 D-甘油醛 3-磷酸盐 差距 C00118 8.09 319 331.1 5 M = 2A = H
35 乙酰辅酶A Aca C00024 8.16 790 10 M = H2O = H
36 尼古丁酰胺脱丁二核苷酸磷酸盐减少 Nadph C00005 8.23 694.92 700.82 10 M = A = 烟酰胺 = H
37 磷醇二恶症 Pep C00074 8.28 317 329.1 20 M = 2A = H
38 琥珀酸 SUCC C00042 8.64 267.07 279.1 15 M = 2A = H
39 异氰酸酯 ICIT C00311 10.13 398 416 10 M = 3A = H2O + H
40 柠檬酸 Cit C00158 10.46 416.1 434.06 20 M = 3A = H

表1：代谢物的识别和标记结果。每个化合物的相应峰值数、保留时间、未标记的 m/z 值、标记 12C 和13C 以及 MS 物种。MS 物种，A 代表 Aniline 标签。

峰值号 代谢 产物 缩写 KEGG ID 浓度（mM） SD （n = 3） 检测限制 （μM） 线性范围限制 （μM） R=2
1 甘油 3 磷酸盐 格利3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 烟酰胺脱丁二核苷酸 NAD C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 葡萄糖 GLC C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 塞多普图洛 7 磷酸盐 S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 果糖 6 磷酸盐 F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 瓜诺辛单磷酸盐 Gmp C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 核糖5磷酸盐 RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 西提丁单磷酸盐 Cmp C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 乳酸 Lac C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 腺苷单磷酸盐 放大 器 C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 乌里丁单磷酸盐 UMP C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 烟酰胺脱丁二核苷酸磷酸盐 国家民军 C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-磷酸 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 西蒂丁二磷酸盐 Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 瓜诺辛二磷酸盐 Gdp C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 腺苷二磷酸盐 Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 乌里丁二磷酸盐 Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 弗拉文·阿丁丁二核苷酸 时尚 C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 果糖 1，6-磷酸盐 F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 葡萄糖酸 6 磷酸盐 6PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 烟酰胺脱丁二核苷酸减少 Nadh C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 葡萄糖 6-磷酸盐 G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 核糖5磷酸盐 R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 埃里塞4磷酸盐 E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 三磷酸盐西蒂丁 Ctp C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 瓜诺辛三磷酸盐 全球贸易点 C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 奥萨莱西泰特 OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 阿尔法-酮谷酸盐 aKG C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 乌里丁三磷酸盐 UTP C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 三磷酸腺苷 Atp C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 富马拉特 FUM C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 丙酮 酸 皮尔 C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 马拉提 马尔 C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 D-甘油醛 3-磷酸盐 差距 C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 乙酰辅酶A Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 尼古丁酰胺脱丁二核苷酸磷酸盐减少 Nadph C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 磷醇二恶症 Pep C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 琥珀酸 SUCC C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 异氰酸酯 ICIT C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 柠檬酸 Cit C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

表2：具有代表性的CFPS样本中的代谢物定量。每个代谢物的浓度和标准偏差。从标准曲线中识别的检测极限、线性范围和相关系数。

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Discussion

无细胞系统没有细胞壁，因此可以直接获得代谢物和生物合成机械，而无需复杂的样品制备。然而，在开发彻底和可靠的协议以定量询问无细胞反应系统方面，我们几乎没有做多少工作。在这项研究中，我们开发了一种快速、可靠的方法，用于量化无细胞反应混合物中的代谢物，并可能在全细胞提取物中量化代谢物。复杂混合物中代谢物的单独定量，如无细胞反应或全细胞提取物中的代谢物，由于多种原因具有挑战性。其中一个主要原因就是化学多样性。这些混合物中同时存在的功能组阵列（例如，碳化物酸、胺、磷酸盐、羟基等）大大增加了分析的复杂性。为了规避这种情况，我们结合13C内部标准，使用一种抗氧化剂衍生方法，将疏水性成分引入代谢物混合物中。使用这种方法，我们在单个LC/MS运行中，在无细胞反应中可靠检测并量化了40种代谢物。该协议对本研究中的40种化合物中的35种进行了标记，其余5种化合物采用标准曲线法进行量化。早期的研究表明，反应条件在胺和磷酸盐组之间形成分子内盐，抑制衍生12。未确定所有40种化合物同时衍生的反应条件;但是，目前的替代方法是使用标准曲线方法进行量化。虽然我们在无细胞反应混合物中演示了这项技术，但它也可能应用于全细胞提取物，从而有可能允许细胞内代谢物浓度的绝对定量。后一种应用与生物技术和人类健康中的各种重要问题有关。

这里介绍的方法是基于以前的技术（GSIST），应用于酵母S.cerevisiae12，13的全细胞提取物。在这项研究中，我们扩大了可检测和量化的化合物的数量，包括所有12个核苷酸（xMP，xDP，xTP，其中x是A、C、G和U）。添加这些化合物可能具有重要的生物学意义。例如，这些核苷酸大量参与转录和转化过程，这是CFPS应用中关注的核心过程之一，更一般来说，化合物在各种生理功能中都很重要。此外，在检查溢出代谢时，我们能够检测醋酸，这是一种重要的代谢物。然而，我们并没有将其纳入研究，因为当醋酸时，多种化合物的信号显著减少，特别是烟酰胺腺苷二核苷酸减少（NADH）和烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸盐减少（NADPH）添加到标准混合物中。醋酸的检测限值为612μM，因此在这些高水平下对其他代谢物的信号有负面影响。尽管如此，通过在小瓶中只产生醋酸的标准曲线，在样品中仍可检测和量化醋酸。醋酸的m/z值为134.0，保留时间为5.78分钟，当用12种C-aniline标记时，线性范围为612 μM至5000μM（R2 = 0.986）。剩余的代谢物没有改变彼此的发信号，并代表一个全面的混合物来描述CFPS代谢。这里提出的协议仅限于参与中央碳和能量代谢的代谢物。因此，目前的方法无法从其他可能重要的途径（如脂肪酸和氨基酸代谢）测量代谢物丰度。

综合起来，我们开发了一种快速、可靠的方案，用于在CFPS中对参与糖解、磷酸五氯苯星通路、三聚苯乙烯循环、能量代谢和共因子再生的40种化合物进行表征和绝对定量反应。该方法依赖于使用13 个C-aniline 标记的内部标准，而样本则标有12 个C-aniline 标记。内部标准和样品化合物共洗和消除的孔抑制作用，使复杂代谢物混合物中的单个代谢物能够准确定量。我们共鉴定了40种化合物（41种，如果包括醋酸），这些化合物可以在无细胞反应混合物中检测和量化;然而，代谢物的清单可以进一步扩大和调整，以适应感兴趣的特定生化过程。因此，该方法为无细胞代谢表征提供了一种可靠而准确的方法，这对提高无细胞过程的产量、生产率和能源效率具有潜在的关键性。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

所述工作通过国家癌症研究所（https://www.cancer.gov/）颁发的第1U54CA210184-01奖，得到了癌症代谢物理中心的支持。内容完全由作者负责，不一定代表国家癌症研究所或国家卫生研究院的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有作用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

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References

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生物化学， 问题 152， 无细胞蛋白质合成， 液相色谱-质谱， 银氨酸标记， 中央碳， 能量代谢， 内部标准， 代谢网络， 同位素标签
通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量
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Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

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