Her præsenterer vi en robust protokol for at kvantificere 40 forbindelser involveret i Central Carbon og energimetabolisme i celle-fri proteinsyntese reaktioner. Den celle frie syntese blanding er derivatized med anilin for effektiv adskillelse ved hjælp af omvendt fase væskekromatografi og derefter kvantificeret ved massespektrometri ved hjælp af isotopisk mærkede interne standarder.
Celle-fri Proteinsyntese (CFP’ER) er en ny teknologi i systemer og syntetisk biologi til in vitro-produktion af proteiner. Men hvis CFP’ER kommer til at bevæge sig ud over laboratoriet og blive en udbredt og standard lige i tiden fremstillingsteknologi, skal vi forstå de præstationsgrænser for disse systemer. Mod dette spørgsmål, vi udviklet en robust protokol til kvantificere 40 forbindelser involveret i glycolyse, pentose fosfat pathway, tricarboxylsyre cyklus, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS reaktioner. Metoden bruger interne standarder Tagged med 13c-Anilin, mens forbindelser i prøven er derivatized med 12c-anilin. De interne standarder og prøven blev blandet og analyseret ved omvendt fase væskekromatografi-massespektrometri (LC/MS). Co-eluering af forbindelser eliminerede ionsuppression, hvilket gjorde det muligt nøjagtigt at kvantificere metabolitten koncentrationer over 2-3 størrelsesordener, hvor den gennemsnitlige korrelationskoefficient var 0,988. Fem af de 40 forbindelser blev ukodet med Anilin, men de blev stadig påvist i CFPS-prøven og kvantificerede med en standardkurve metode. Kromatografi kørslen tager ca. 10 min. for at fuldføre. Tilsammen udviklede vi en hurtig og robust metode til at adskille og præcist kvantificere 40-forbindelser, der er involveret i CFP’ER, i en enkelt LC/MS-løbetur. Metoden er en omfattende og præcis tilgang til at karakterisere cellefri metabolisme, så vi i sidste ende kan forstå og forbedre udbyttet, produktiviteten og energieffektiviteten af celle frie systemer.
Celle-fri Proteinsyntese (CFP’ER) er en lovende platform for fremstilling af proteiner og kemikalier, en applikation, der traditionelt har været forbeholdt levende celler. Celle frie systemer er afledt af rå celleekstrakter og eliminere komplikationer forbundet med cellevækst1. Derudover giver CFP’ER mulighed for direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden indblanding fra en cellevæg. Der har imidlertid manglet en grundlæggende forståelse af præstations grænserne for celle frie processer. High-gennemløb metoder til metabolisering kvantificering er værdifulde for karakterisering af stofskiftet og er afgørende for opførelsen af metaboliske beregningsmæssige modeller2,3,4. Fælles metoder, der anvendes til bestemmelse af metabolitten koncentrationer omfatter nuklear magnetisk resonans (NMR), Fourier transformation-infrarød spektroskopi (ft-IR), enzym-baserede assays, og massespektrometri (MS)5,6,7 ,8. Men, disse metoder er ofte begrænset af deres manglende evne til effektivt at måle flere forbindelser på én gang og ofte kræver en prøvestørrelse større end typiske celle-fri reaktioner. For eksempel kan enzym baserede assays ofte kun bruges til at kvantificere en enkelt forbindelse i en løbetur og er begrænset, når Prøvestørrelsen er lille, såsom i celle frie proteinsyntese reaktioner (typisk på en 10-15 μL skala). I mellemtiden kræver NMR en høj forekomst af metabolitter til påvisning og kvantificering5. Mod disse mangler, kromatografi metoder i tandem med massespektrometri (LC/MS) giver flere fordele, herunder høj følsomhed og evnen til at måle flere arter samtidigt9; den analytiske kompleksitet stiger imidlertid betydeligt med antallet og mangfoldigheden af de arter, der måles. Det er derfor vigtigt at udvikle metoder, der fuldt ud realisere de høje gennemløb potentiale LC/MS-systemer. Forbindelser i en prøve adskilles ved hjælp af væskekromatografi og identificeres gennem massespektrometri. Signalet af forbindelsen afhænger af dets koncentration og ioniserings effektivitet, hvor ioniseringen kan variere mellem forbindelser og kan også afhænge af prøve matrixen.
Opnåelse af samme ioniserings effektivitet mellem prøven og standarderne er en udfordring, når LC/MS bruges til at kvantificere analytter. Yderligere, kvantificering bliver mere udfordrende med metabolitten mangfoldighed på grund af signal opdeling og heterogenitet i proton affinitet og polaritet10. Endelig kan Co-eluting matrix af prøven også påvirke ioniserings effektiviteten af forbindelserne. For at løse disse problemer, metabolitter kan være kemisk derivatized, øge separation opløsning og følsomhed ved LC/MS-systemer, mens samtidig faldende signal opdeling i nogle tilfælde10,11. Kemisk derivatisering virker ved at tagge specifikke funktionelle grupper af metabolitter til at justere deres fysiske egenskaber som ladning eller hydrofobicitet for at øge ioniserings effektivitet11. Forskellige mærknings agenter kan anvendes til at målrette mod forskellige funktionelle grupper (f. eks. aminer, hydroxyls, phosphater, carboxylsyrer osv.). Aniline, en sådan forædling agent, mål flere funktionelle grupper på én gang, og tilføjer en hydrofobe komponent i hydrofile molekyler, og dermed øge deres separation opløsning og signal12. For at imødegå den Co-eluting matrix ion suppression effekt, Yang og kollegaer udviklet en teknik baseret på gruppe specifik intern standard teknologi (gsist) mærkning, hvor standarder er mærket med 13C anilin isotoper og blandes med prøven 12,13. Metabolitten og den tilsvarende interne standard har samme ioniserings effektivitet, da de er co-elute, og deres intensitets forhold kan anvendes til at kvantificere koncentrationen i den eksperimentelle prøve.
I denne undersøgelse udviklede vi en protokol til påvisning og kvantificering af 40-forbindelser, der er involveret i glykolyse, pentose-fosfat vejen, tricarboxylsyrecyklussen, energimetabolisme og cofaktor regenerering i CFPS-reaktioner. Metoden er baseret på GSIST tilgang, hvor vi brugte 12c-aniline og 13c-anilin til at mærke, opdage og kvantificere metabolitter ved hjælp af omvendt fase LC/MS. Det lineære område af alle forbindelser strakte 2-3 størrelsesordener med en gennemsnitlig korrelationskoefficient på 0,988. Således, metoden er en robust og præcis tilgang til afhøre celle-fri metabolisme, og muligvis helcelle ekstrakter.
Celle frie systemer har ingen cellevæg, og der er således direkte adgang til metabolitter og de biosyntetiske maskiner uden behov for kompleks prøveforberedelse. Men meget lidt arbejde er blevet gjort for at udvikle grundige og robuste protokoller til kvantitativt afhøre celle-fri reaktionssystemer. I denne undersøgelse udviklede vi en hurtig, robust metode til at kvantificere metabolitter i celle frie reaktionsblandinger og potentielt i helcelle ekstrakter. Individuel kvantificering af metabolitter i komplekse blan…
The authors have nothing to disclose.
Det beskrevne arbejde blev støttet af Center på fysik af kræft metabolisme gennem Award nummer 1U54CA210184-01 fra National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
Waters Empower 3 | Waters | Software | |
Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |