Summary
Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.
Abstract
La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una tecnología emergente en sistemas y biología sintética para la producción in vitro de proteínas. Sin embargo, si CFPS va a ir más allá del laboratorio y convertirse en una tecnología de fabricación generalizada y estándar justo a tiempo, debemos entender los límites de rendimiento de estos sistemas. Hacia esta pregunta, desarrollamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método utiliza estándares internos etiquetados con 13C-anilina, mientras que los compuestos en la muestra se derivacon 12C-anilina. Las normas internas y la muestra se mezclaron y analizaron mediante cromatografía líquida en fase inversa-espectrometría de masas (LC/MS). La co-elución de compuestos eliminó la supresión iónial, permitiendo la cuantificación precisa de las concentraciones de metabolitos sobre 2-3 órdenes de magnitud donde el coeficiente de correlación promedio fue de 0,988. Cinco de los cuarenta compuestos no fueron etiquetados con anilina, sin embargo, todavía se detectaron en la muestra de CFPS y cuantificados con un método de curva estándar. La carrera cromatográfica tarda aproximadamente 10 minutos en completarse. En conjunto, desarrollamos un método rápido y robusto para separar y cuantificar con precisión 40 compuestos involucrados en CFPS en una sola ejecución de LC/MS. El método es un enfoque integral y preciso para caracterizar el metabolismo libre de células, de modo que, en última instancia, podamos comprender y mejorar el rendimiento, la productividad y la eficiencia energética de los sistemas libres de células.
Introduction
La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es una plataforma prometedora para la fabricación de proteínas y productos químicos, una aplicación que tradicionalmente se ha reservado para células vivas. Los sistemas libres de células se derivan de extractos de células brutas y eliminan las complicaciones asociadas con el crecimiento celular1. Además, CFPS permite el acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin la interferencia de una pared celular. Sin embargo, se ha escaso una comprensión fundamental de los límites de rendimiento de los procesos sin células. Los métodos de alto rendimiento para la cuantificación de metabolitos son valiosos para la caracterización del metabolismo y son críticos para la construcción de modelos computacionales metabólicos2,3,4. Los métodos comunes utilizados para determinar las concentraciones de metabolitos incluyen resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infrarrojo sórdida transformación de Fourier (FT-IR), ensayos basados en enzimas y espectrometría de masas (MS)5,6,7 ,8. Sin embargo, estos métodos a menudo están limitados por su incapacidad para medir eficientemente múltiples compuestos a la vez y a menudo requieren un tamaño de muestra mayor que las reacciones típicas libres de células. Por ejemplo, los ensayos basados en enzimas a menudo solo se pueden utilizar para cuantificar un solo compuesto en una carrera, y son limitados cuando el tamaño de la muestra es pequeño, como en las reacciones de síntesis de proteínas libres de células (normalmente se ejecutan en una escala de 10-15 l). Mientras tanto, la RMN requiere una gran abundancia de metabolitos para la detección y cuantificación5. Hacia estas deficiencias, los métodos de cromatografía en conjunto con la espectrometría de masas (LC/MS) proporcionan varias ventajas, incluyendo alta sensibilidad y la capacidad de medir múltiples especies simultáneamente9; sin embargo, la complejidad analítica aumenta considerablemente con el número y la diversidad de especies que se miden. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que se den cuenta plenamente del potencial de alto rendimiento de los sistemas LC/MS. Los compuestos de una muestra se separan mediante cromatografía líquida y se identifican mediante espectrometría de masas. La señal del compuesto depende de su concentración y eficiencia de ionización, donde la ionización puede variar entre compuestos y también puede depender de la matriz de muestra.
Lograr la misma eficiencia de ionización entre la muestra y los estándares es un desafío cuando se utiliza LC/MS para cuantificar analitos. Además, la cuantificación se vuelve más difícil con la diversidad de metabolitos debido a la división de señales y la heterogeneidad en la afinidad de protones y la polaridad10. Por último, la matriz de co-elución de la muestra también puede afectar a las eficiencias de ionización de los compuestos. Para abordar estos problemas, los metabolitos pueden ser derivados químicamente, aumentando la resolución de separación y la sensibilidad de los sistemas LC/MS, al mismo tiempo que disminuyen la división de señal en algunos casos10,11. La derivación química funciona etiquetando grupos funcionales específicos de metabolitos para ajustar sus propiedades físicas como la carga o la hidrofobicidad para aumentar la eficiencia de la ionización11. Se pueden utilizar varios agentes de etiquetado para dirigirse a diferentes grupos funcionales (por ejemplo, aminas, hidroxilo, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, uno de estos agentes de derivación, se dirige a múltiples grupos funcionales a la vez, y añade un componente hidrófobo en moléculas hidrófilas, aumentando así su resolución de separación y señal12. Para abordar el efecto de supresión de iones de matriz de elución conjunta, Yang y sus compañeros de trabajo desarrollaron una técnica basada en el etiquetado de la Tecnología Estándar Interna Específica del Grupo (GSIST) donde los estándares están etiquetados con 13isótopos de anilina C y se mezclan con la muestra 12,13. El metabolito y el estándar interno correspondiente tienen la misma eficiencia de ionización, ya que co-eluto, y su relación de intensidad se puede utilizar para cuantificar la concentración en la muestra experimental.
En este estudio, desarrollamos un protocolo para detectar y cuantificar 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorente en las reacciones de CFPS. El método se basa en el enfoque GSIST, donde usamos 12C-anilina y 13C-anilina para etiquetar, detectar y cuantificar metabolitos utilizando LC/MS de fase inversa. El rango lineal de todos los compuestos abarcó 2-3 órdenes de magnitud con un coeficiente de correlación promedio de 0.988. Por lo tanto, el método es un enfoque robusto y preciso para interrogar el metabolismo libre de células, y posiblemente extractos de células enteras.
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Protocol
1. Preparación de reactivos para el etiquetado de anilina
- Prepare una solución de anilina de 6 M a pH 4.5. Trabajando en una campana, combine 550 ml de anilina con 337,5 ml de agua de grado LCMS y 112,5 ml de ácido clorhídrico de 12 M (HCl) en un tubo de centrífuga. Vórtice bien y almacenar a 4oC.
NOTA: La anilina se puede almacenar a 4 oC durante 2 meses.
ADVERTENCIA: La anilina es altamente tóxica y debe trabajarse con ella en una campana de humos. El ácido clorhídrico es altamente corrosivo - Preparar una solución de anilina de 6 M 13C a pH 4.5. Combinar 250 mg de 13C6-anilina con 132 ml de agua y 44 ml de 12 M HCl. Vortex bien y almacenar a 4 oC.
- Preparar 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-etilcarbodiimide solución de clorhidrato (EDC). Disolver 2 mg de EDC en 10 ml de agua para cada muestra a etiquetar y vórtice bien.
NOTA: La solución edC debe prepararse el mismo día de la reacción. EdC actúa como catalizador para la derivación de compuestos con anilina12.
2. Preparación de normas
- Hacer soluciones de stock separadas de todos los compuestos disueltos en agua de grado LC/MS (Tabla 1).
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Preparación de la solución estándar interna
- Combine todos los compuestos excepto nicotinamida adenina dinucleótida (NAD), nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima aacetil A (ACA) y glicerol 3-fosfato (Gly3P), con los volúmenes adecuados para crear una solución de stock de 2 mM de todos los compuestos.
- Combine NAD, NADP, FAD, ACA y Gly3P con los volúmenes adecuados para crear una solución de stock de 2 mM.
3. Preparación de la muestra(Figura 1)
- Quench y precipitar las proteínas en una reacción de síntesis de proteínas libre de células mediante la adición de un volumen igual de etanol 100% helado a la reacción. Centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 15 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo.
NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC en este punto y analizarse en un momento posterior
4. Reacción de etiquetado
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Muestra de etiquetado con 12solución C-anilina
- Transfiera 6 l de muestra a un nuevo tubo centrífugo y lleve el volumen a 50 l conagua.
NOTA: El tamaño de la muestra de volumen puede depender de la reacción específica de CFPS. - Añadir 5 l de solución EDC de 200 mg/ml.
- Añadir 5 l de solución de 12C-anilina.
NOTA: La solución de anilina se separa en dos fases. Mezclar bien antes de añadir a la reacción. - Vórtice la reacción con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
- Después de 2 h, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 ml de trietilamina (TEA) a la reacción en una campana de humo.
NOTA: La trietilamina aumenta el pH de la solución que detiene la reacción de etiquetado de anilina y estabiliza los compuestos.
ADVERTENCIA: La trietilamina es tóxica y causa irritación de los ojos y las vías respiratorias. - Centrífuga a 13.500 x g durante 3 min.
- Transfiera 6 l de muestra a un nuevo tubo centrífugo y lleve el volumen a 50 l conagua.
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Etiquetado de normas internas con 13solución C-aniline
- Diluir la solución de material interno a 80 m con un volumen final de 50 l.
NOTA: La concentración de las normas internas se puede ajustar a niveles cercanos a la muestra experimental. - Añadir 5 l de solución EDC de 200 mg/ml.
- Añadir 5 l de solución de 13C-anilina.
- Vórtice la reacción con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
- Después de 2 h, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 ml de TEA a la reacción en una campana de humo.
- Centrífuga a 13.500 x g durante 3 min.
- Diluir la solución de material interno a 80 m con un volumen final de 50 l.
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Combinación de estándar interno etiquetado y muestra etiquetada
- Mezclar 25 ml de muestra etiquetada con 12C-anilina con 25 ml de 13C-anilina etiquetada estándar.
- Transfiera a un vial de toma de muestras automático y analice mediante el procedimiento LC/MS.
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Creación de una curva estándar para metabolitos sin etiquetar
- Solución en stock diluido de metabolitos sin etiquetar (NAD, NADP, FAD, ACA y Gly3P) a concentraciones finales de 320 m, 80 m, 20 m y 5 m con un volumen de 50 ml.
- Añadir 5 l de solución EDC de 200 mg/ml.
- Añadir 5 l de solución de 12C-anilina.
- Vórtice la reacción con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente.
- Después de 2 h, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 ml de TEA a la reacción en una campana de humo.
- Centrífuga a 13.500 x g durante 3 min.
- Transfiera el sobrenadante a un vial de toma de muestras automático y analice mediante el procedimiento LC/MS.
NOTA: Los metabolitos sin etiquetar siguen el mismo procedimiento que la muestra para replicar la matriz de muestra sin tener que mantener una eficiencia de ionización similar.
5. Configuración del procedimiento LC/MS
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Preparación de disolventes
- Preparar 5 mM de tributilamina (TBA) solución acuosa ajustada a pH 4.75 con ácido acético.
NOTA: TBA en la fase móvil ayuda a los analitos a lograr una buena resolución y separación14. - Preparar 5 mM TBA en acetonitrilo (ACN).
- Prepare el disolvente de lavado con 5% de agua y 95% de ACN.
- Prepare el disolvente de purga con 95% de agua y 5% de ACN.
- Preparar 5 mM de tributilamina (TBA) solución acuosa ajustada a pH 4.75 con ácido acético.
- Configuración de las condiciones de la EM
- Ajuste el espectrómetro de masas al modo iónico negativo con una temperatura de sonda de 520 oC, tensión capilar negativa de -0,8 kV, tensión capilar positiva de 0,8 kV y ajuste el software para que adquiera datos en 5 puntos/s.
- Ajuste las grabaciones iónicas seleccionadas (SIR) para cada metabolito con voltajes de cono especificados y valores de carga excesiva (m/z). Véase el Cuadro 1.
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Inicialización de LC/MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante
- Primeras líneas de disolvente en el gestor de disolventes durante 3 min.
- Disolvente de lavado de primera (5% agua, 95% ACN) y disolvente de purga (95% agua, 5% ACN) durante 15 s durante 5 ciclos.
- Establezca el gestor de muestras en 10 oC.
- Instale una columna C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) e inicialice la columna con 100% de ACN a 0,3 ml/min durante 10 min.
- Acondicionar la columna al 95% de agua y al 5% de ACN a 0,3 ml/min durante 10 minutos antes de introducir disolventes con tampones.
- Acondicionar la columna al 95% disolvente A (5mM TBA acuoso, pH 4.75) y 5% disolvente B (5 mM TBA en ACN) a 0,3 ml/min durante 10 min.
- Establecer un protocolo de gradiente con la elución a partir del 95% del disolvente A y del 5% del disolvente B, elevado al 70% disolvente B en 10 min, elevado al 100% disolvente B en 2 min y mantenido al 100% disolvente B durante 3 min. , 5% disolvente B) durante 1 min y mantener durante 9 min para volver a equilibrar la columna.
- Acondicione la columna con el protocolo de degradado 3 veces antes de cualquier inyección en la columna.
-
Inyección de muestras y estándares
- Inyectar 5 l de la muestra en la columna y adquirir las intensidades de iones m/z adecuadas para la muestra etiquetada de 12C-anilina.
- Inyectar de nuevo 5 l de la misma muestra, pero esta vez adquiera las intensidades de iones m/z para los estándares etiquetados con 13C-anilina.
NOTA: Nuestro sistema LC/MS no puede adquirir intensidades de 12C y 13C m/z en las ventanas de tiempo SIR especificadas, ya que es demasiados datos para adquirir en la ventana de tiempo especificada. Por lo tanto, inyectamos la misma muestra dos veces. - Inyectar los estándares de metabolitos sin etiquetar de la concentración más baja a la más alta y registrar las intensidades de iones m/z apropiadas.
6. Cuantificación
- Creación del método de exportación
- En el software de adquisición de datos, seleccione Archivo > Nuevo método > Métodode exportación .
- Especifique un nombre de archivo, como AnilineTagging_Date.
- Marque el archivo ASCII de la exportación y elija un directorio para exportar el archivo de texto a.
- En Tipo de informe, seleccione Resumen por todos.
- En Delimitadores, en Columna, seleccione un ,. En Fila, seleccione [cr][si].
- En Tabla, seleccione Exportar y, a continuación, Editar tabla para incluir SampleName, Area, Height, Amount y Units.
- Guardar método de exportación.
- Cuantificación de metabolitos con estándares internos mediante software de adquisición de datos
- En la pestaña Conjuntos de muestras, haga clic con el botón derecho en la ejecución de LC/MS correspondiente y seleccione Ver como > Canales.
- Seleccione todos los canales SIR para los 13estándares internos de C-aniline de una inyección, haga clic con el botón derecho y seleccione Revisar.
- Si la ventana Diseño del método de procesamiento de LC no aparece automáticamente, vaya a Ver > Diseño de métodode procesamiento .
- En Diseño de métodode procesamiento , vaya a la pestaña Integración y establezca ApexTrack como algoritmo.
- Vaya a la pestaña Suavizado y establezca el tipo en Media y el nivel de suavizado en 13.
NOTA: Se puede seleccionar cualquier nivel de suavizado, siempre y cuando sea coherente en todas las muestras. - En la ficha Canal mS, deshabilite Procesamiento MS 3D .
- En la ventana del canal SIR, integre cada pico, un canal a la vez. Una vez que se integra un pico, vaya a Opciones > Rellenar desde resultado y los detalles del pico se rellenarán en la pestaña Componentes.
- Una vez evaluados todos los canales SIR, guarde el método de procesamiento y cierre la ventana.
- Seleccione todos los canales SIR de la muestra etiquetada 13C-aniline y 12C-aniline, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar.
- Active la casilla Proceso, seleccione Usar método de procesamiento especificadoy elija el método de procesamiento que acaba de guardar. Marque también la casilla Exportar, seleccione Usar método de exportación especificado y elija el método de exportación guardado creado anteriormente. Haga clic en Aceptar.
- Abra el archivo de texto exportado con Excel y calcule la concentración del compuesto desconocido utilizando:
donde Cx,i es la concentración de la muestra desconocida para metabolito i, Ax,i es el área integrada del metabolito desconocido i, Astd,i es el área integrada del estándar interno de metabolito i, Cstd,i es el concentración del estándar interno de metabolito i, y D es el factor de dilución.
- Cuantificación de metabolitos sin etiquetar con curva estándar
- En la pestaña Conjuntos de muestras, haga clic con el botón derecho en la ejecución de LC/MS correspondiente y seleccione Ver como > Canales.
- Seleccione todos los canales SIR para los estándares sin etiquetar de una inyección, haga clic con el botón derecho y seleccione Revisar.
- Si la ventana Diseño del método de procesamiento de LC no aparece automáticamente, vaya a Ver > Diseño de métodode procesamiento .
- En Diseño del método de procesamiento, vaya a la pestaña Integración y establezca ApexTrack como algoritmo.
- Vaya a la pestaña Suavizado y establezca el tipo en Media y el nivel de suavizado en 13.
NOTA: Se puede seleccionar cualquier nivel de suavizado, siempre y cuando sea coherente en todas las muestras. - En la ficha Canal mS, deshabilite Procesamiento MS 3D .
- En la ventana del canal SIR, integre cada pico, un canal a la vez. Una vez que se integra un pico, vaya a Opciones > Rellenar desde resultado y los detalles del pico se rellenarán en la pestaña Componentes.
- Una vez evaluados todos los canales SIR, guarde el método de procesamiento y cierre la ventana.
- En la pestaña Conjuntos de muestras, haga clic con el botón derecho en el conjunto de muestras y seleccione Modificar muestra.
- Seleccione Importe en la nueva ventana.
- Seleccione Copiar en Método de proceso y elija el método de proceso que se acaba de guardar.
- Introduzca la concentración de cada metabolito para cada vial e introduzca la unidad como <-M para cada componente (o la unidad correspondiente) y seleccione OK.
- Seleccione el conjunto de muestras de nuevo, haga clic con el botón derecho, Ver como > Canales.
- Seleccione todos los canales SIR de los metabolitos sin etiquetar para los estándares, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar.
- Active la casilla Proceso y elija Usar método de procesamiento especificado. Seleccione el método de procesamiento adecuado y haga clic en Aceptar.
- Seleccione Canales SIR para todos los metabolitos sin etiquetar para las muestras, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar.
- Active la casilla Proceso, seleccione Usar método de procesamiento especificado y elija el método de procesamiento que se acaba de guardar. Marque también la casilla Exportar, seleccione Usar método de exportación especificado y elija el método de exportación guardado creado anteriormente. Haga clic en Aceptar.
- Cuantifique los metabolitos sin etiquetar con la curva estándar y exporte los resultados a un archivo de texto al directorio especificado.
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Representative Results
Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo para cuantificar metabolitos en un sistema CFPS basado en E. coli que expresa proteína fluorescente verde (GFP). La reacción de CFPS (14 l) se acalmó y se desproteinó con etanol. El ejemplo de CFPS fue etiquetado con 12C-aniline, mientras que los estándares fueron etiquetados con 13C-aniline. La muestra etiquetada y los estándares se combinaron e inyectaron en la LC/MS(Figura 1). También se desarrolló el protocolo detectado y cuantificado de 40 metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía utilizando normas internas, mientras que una curva estándar para 5 de los metabolitos que no fueron etiquetados con anilina(Figura 2). Los diversos metabolitos involucrados en estas vías fueron una clase de azúcares fosforilados, ácidos fosfocarboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleótidos y cofactores. La derivación con anilina introdujo una mitad hidrófoba en moléculas hidrófilas que facilitó una separación más eficaz utilizando cromatografía de fase inversa12. Además, el método permitió la separación de pares de isómeros estructurales como la glucosa 6-fosfato y la fructosa 6-fosfato en una sola ejecución LC/MS. La relación de masa sobre carga (m/z) y el tiempo de retención de cada compuesto se identificaron antes del experimento inyectando 1 mM de un compuesto a la vez y comparando el espectro de masa con el espacio en blanco(Tabla 1).
El límite de detección y el rango de linealidad para todos los compuestos se estimó mediante la producción de una curva estándar que oscilaba entre 0,10 m y 400 m(Tabla 2). El coeficiente de correlación promedio (R2) para todos los compuestos fue de 0,988 y la mayoría de los compuestos tenían un rango lineal de 3 órdenes de magnitud. Tres compuestos tuvieron efectos de saturación notables, especialmente alfa-cetoglutarato que tenía un rango lineal de 0.1 a 25 M. Isocitrato y citrato también tenían efectos de saturación por encima de 100 m.
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo para el etiquetado de anilina. La reacción de síntesis de proteínas sin células se desproteiniza y se etiqueta con 12C-anilina, mientras que una mezcla estándar de stock se etiqueta con 13C-anilina. Ambas mezclas se mezclan a una proporción volumétrica de 1:1 y son analizadas por LC/MS. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2: Cromatografías iónias seleccionadas superpuestas para 40 metabolitos. Cromatograma de masa de una sola ejecución DE LC/MS de una mezcla estándar de 40 M de 40 metabolitos. Los picos se identificaron por su tiempo de retención y valores m/z para cada compuesto. Los nombres completos de los compuestos y sus abreviaturas se enumeran en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número de pico | Metabolito | Abreviatura | ID de KEGG | Tiempo de retención (min) | 12C m/z | 13C m/z | sin etiqueta m/z | Cv | Especies de la Sra. | |
| 1 | Glicerol 3-fosfato | Gly3P | C00093 | 3.85 | 153 | 10 | M – H2O – H | |||
| 2 | Nicotinamida adenina dinucleótida | Nad | C00003 | 3.96 | 698 | 10 | M + Cl – H | |||
| 3 | Glucosa | Glc | C00031 | 4.06 | 289.9 | 296 | 15 | M + A + Cl - H | ||
| 4 | Sedoheptulosa 7-fosfato | S7P | C05382 | 5.41 | 364 | 370 | 10 | M + A – H | ||
| 5 | Fructosa 6-fosfato | F6P | C00085 | 5.48 | 334 | 340 | 10 | M + A – H | ||
| 6 | Monofosfato de guanosina | Gmp | C00144 | 5.57 | 437.05 | 443 | 10 | M + A – H | ||
| 7 | Ribulosa 5-fosfato | RL5P | C00199 | 5.58 | 304 | 310 | 10 | M + A – H | ||
| 8 | Monofosfato de citidina | Cmp | C00055 | 5.59 | 397.09 | 403 | 10 | M + A – H | ||
| 9 | Lactato | Lac | C00186 | 5.77 | 164.05 | 170 | 10 | M + A – H | ||
| 10 | Monofosfato de adenosina | Amp | C00020 | 5.85 | 421.1 | 427.1 | 10 | M + A – H | ||
| 11 | Monofosfato de uridina | Ump | C00105 | 5.88 | 398.07 | 404 | 10 | M + A – H | ||
| 12 | Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato | Nadp | C00006 | 6.39 | 724 | 10 | M - H2O – H | |||
| 13 | 3-ácido fosfogglicérico | 3PG | C00197 | 6.63 | 242 | 248.06 | 15 | M + A – H2O – H | ||
| 14 | Difosfato de citidina | Cdp | C00112 | 6.72 | 477 | 483 | 10 | M + A – H | ||
| 15 | Difosfato de guanosina | Pib | C00035 | 6.87 | 517 | 523 | 10 | M + A – H | ||
| 16 | Difosfato de adenosina | Adp | C00008 | 6.94 | 501 | 507 | 10 | M + A – H | ||
| 17 | Uridina difosfato | Udp | C00015 | 6.97 | 478 | 484 | 10 | M + A – H | ||
| 18 | Flavin adenina dinucleótido | Moda | C00016 | 7.03 | 784.15 | 15 | M – H | |||
| 19 | Fructosa 1,6-bisfosfato | F16P | C05378 | 7.1 | 395.95 | 402.1 | 10 | M + A – H2O – H | ||
| 20 | Gluconato 6-fosfato | 6PG | C00345 | 7.11 | 425.1 | 437 | 10 | M + 2A – H | ||
| 21 | Nicotinamida adenina dinucleótido reducido | Nadh | C00004 | 7.23 | 633.13 | 639.08 | 10 | M + A + H2O – nicotinamida – H | ||
| 22 | Glucosa 6-fosfato | G6P | C00668 | 7.32 | 409.1 | 421.1 | 10 | M + 2A – H | ||
| 23 | Ribosa 5-fosfato | R5P | C00117 | 7.54 | 379.1 | 391.1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 24 | Erytrosa 4-fosfato | E4P | C00279 | 7.71 | 348.9 | 361 | 10 | M + 2A – H | ||
| 25 | Trifosfato de citidina | Ctp | C00075 | 7.84 | 557 | 563 | 5 | M + A – H | ||
| 26 | Trifosfato de guanosina | Gtp | C00044 | 7.93 | 597 | 603 | 5 | M + A – H | ||
| 27 | Oxalacetato | Oaa | C00036 | 7.94 | 281 | 293 | 25 | M + 2A – H | ||
| 28 | Alfa-cetoglutarato | Akg | C00026 | 7.95 | 295 | 307.1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 29 | Trifosfato de uridina | Utp | C00075 | 7.97 | 558 | 564 | 10 | M + A – H | ||
| 30 | Trifosfato de adenosina | Atp | C00002 | 8.03 | 581 | 587 | 15 | M + A – H | ||
| 31 | Fumarato | Fum | C00122 | 8.09 | 265 | 277.1 | 10 | M + 2A – H | ||
| 32 | Piruvato | Pyr | C00022 | 8.09 | 162 | 168 | 25 | M + A – H | ||
| 33 | Malato | MAL | C00149 | 8.09 | 283.06 | 295.15 | 10 | M + 2A – H | ||
| 34 | D-gliceraldehyde de 3-fosfato | Brecha | C00118 | 8.09 | 319 | 331.1 | 5 | M + 2A – H | ||
| 35 | Acetil-coenzima A | ACA | C00024 | 8.16 | 790 | 10 | M – H2O – H | |||
| 36 | Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido | Nadph | C00005 | 8.23 | 694.92 | 700.82 | 10 | M + A – nicotinamida – H | ||
| 37 | Fosfoenolpiruvato | Pep | C00074 | 8.28 | 317 | 329.1 | 20 | M + 2A – H | ||
| 38 | Succinato | Succ | C00042 | 8.64 | 267.07 | 279.1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 39 | Isocitrato | ICIT | C00311 | 10.13 | 398 | 416 | 10 | M + 3A – H2O – H | ||
| 40 | Citrato | Cit | C00158 | 10.46 | 416.1 | 434.06 | 20 | M + 3A – H | ||
Tabla 1: Resultados de identificación y etiquetado de metabolitos. Número máximo correspondiente de cada compuesto, tiempo de retención, valor m/z para especies sin etiquetar, 12C y 13C y MS. MS Species, A significa etiqueta Aniline.
| Pico No. | Metabolito | Abreviatura | ID de KEGG | Concentración (mM) | SD (n a 3) | Límite de detección (M) | Límite del rango lineal (M) | R-2 | |
| 1 | Glicerol 3-fosfato | Gly3P | C00093 | 0.377 | 0.034 | 0.1 | 400 | 0.995 | |
| 2 | Nicotinamida adenina dinucleótida | Nad | C00003 | 0.052 | 0.010 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 3 | Glucosa | Glc | C00031 | 0.002 | 0.000 | 0.1 | 400 | 0.997 | |
| 4 | Sedoheptulosa 7-fosfato | S7P | C05382 | 0.007 | 0.000 | 0.16 | 400 | 0.988 | |
| 5 | Fructosa 6-fosfato | F6P | C00085 | 0.029 | 0.004 | 0.1 | 400 | 0.986 | |
| 6 | Monofosfato de guanosina | Gmp | C00144 | 0.007 | 0.001 | 0.39 | 100 | 0.992 | |
| 7 | Ribulosa 5-fosfato | RL5P | C00199 | 0.035 | 0.002 | 0.39 | 400 | 0.996 | |
| 8 | Monofosfato de citidina | Cmp | C00055 | 0.045 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 9 | Lactato | Lac | C00186 | 2.134 | 0.048 | 0.1 | 400 | 0.988 | |
| 10 | Monofosfato de adenosina | Amp | C00020 | 0.020 | 0.002 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 11 | Monofosfato de uridina | Ump | C00105 | 0.021 | 0.000 | 0.1 | 100 | 0.997 | |
| 12 | Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato | Nadp | C00006 | 0.014 | 0.002 | 0.34 | 400 | 0.950 | |
| 13 | 3-ácido fosfogglicérico | 3PG | C00197 | 6.125 | 0.239 | 0.1 | 100 | 0.996 | |
| 14 | Difosfato de citidina | Cdp | C00112 | 0.202 | 0.029 | 0.39 | 400 | 0.997 | |
| 15 | Difosfato de guanosina | Pib | C00035 | 0.146 | 0.027 | 1.5625 | 400 | 0.984 | |
| 16 | Difosfato de adenosina | Adp | C00008 | 0.797 | 0.161 | 0.39 | 400 | 0.995 | |
| 17 | Uridina difosfato | Udp | C00015 | 0.212 | 0.036 | 0.39 | 400 | 0.991 | |
| 18 | Flavin adenina dinucleótido | Moda | C00016 | 0.008 | 0.001 | 0.1 | 400 | 0.958 | |
| 19 | Fructosa 1,6-bisfosfato | F16P | C05378 | 3.643 | 0.105 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 20 | Gluconato 6-fosfato | 6PG | C00345 | 0.017 | 0.001 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 21 | Nicotinamida adenina dinucleótido reducido | Nadh | C00004 | 0.063 | 0.028 | 0.39 | 100 | 0.972 | |
| 22 | Glucosa 6-fosfato | G6P | C00668 | 0.046 | 0.002 | 0.1 | 400 | 0.984 | |
| 23 | Ribosa 5-fosfato | R5P | C00117 | 0.055 | 0.005 | 0.39 | 100 | 0.999 | |
| 24 | Erytrosa 4-fosfato | E4P | C00279 | 0.038 | 0.007 | 0.39 | 400 | 0.979 | |
| 25 | Trifosfato de citidina | Ctp | C00075 | 0.896 | 0.078 | 6.25 | 100 | 0.998 | |
| 26 | Trifosfato de guanosina | Gtp | C00044 | 0.870 | 0.109 | 6.25 | 100 | 0.993 | |
| 27 | Oxalacetato | Oaa | C00036 | 0.023 | 0.008 | 0.56 | 400 | 0.997 | |
| 28 | Alfa-cetoglutarato | Akg | C00026 | 0.391 | 0.020 | 0.1 | 25 | 0.979 | |
| 29 | Trifosfato de uridina | Utp | C00075 | 0.845 | 0.092 | 1.5625 | 400 | 0.998 | |
| 30 | Trifosfato de adenosina | Atp | C00002 | 1.557 | 0.188 | 1.5625 | 400 | 0.991 | |
| 31 | Fumarato | Fum | C00122 | 0.576 | 0.100 | 1.5625 | 100 | 0.999 | |
| 32 | Piruvato | Pyr | C00022 | 5.813 | 0.804 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 33 | Malato | MAL | C00149 | 2.548 | 0.269 | 0.1 | 400 | 0.991 | |
| 34 | D-gliceraldehyde de 3-fosfato | Brecha | C00118 | 2.194 | 0.367 | 0.1 | 100 | 0.974 | |
| 35 | Acetil-coenzima A | ACA | C00024 | 0.196 | 0.044 | 0.1 | 100 | 0.991 | |
| 36 | Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido | Nadph | C00005 | 0.006 | 0.010 | 0.14 | 100 | 0.990 | |
| 37 | Fosfoenolpiruvato | Pep | C00074 | 3.442 | 0.345 | 0.1 | 100 | 0.962 | |
| 38 | Succinato | Succ | C00042 | 5.683 | 0.573 | 0.1 | 320 | 0.999 | |
| 39 | Isocitrato | ICIT | C00311 | 0.003 | 0.006 | 0.39 | 100 | 0.998 | |
| 40 | Citrato | Cit | C00158 | 0.002 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.981 | |
Tabla 2: Cuantificación de metabolitos en una muestra representativa de CFPS. La concentración de cada metabolito y la desviación estándar. Límite de detección, rango de linealidad y coeficiente de correlación identificado a partir de curvas estándar.
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Discussion
Los sistemas libres de células no tienen pared celular, por lo que hay acceso directo a metabolitos y la maquinaria biosintética sin necesidad de una preparación compleja de la muestra. Sin embargo, se ha hecho muy poco trabajo para desarrollar protocolos exhaustivos y robustos para interrogar cuantitativamente a los sistemas de reacción libres de células. En este estudio, desarrollamos un método rápido y robusto para cuantificar metabolitos en mezclas de reacción sin células y potencialmente en extractos de células enteras. La cuantificación individual de metabolitos en mezclas complejas, como las que se encuentran en reacciones libres de células, o extractos de células enteras, es un desafío por varias razones. Entre estas razones es fundamental la diversidad química. La gama de grupos funcionales presentes simultáneamente en estas mezclas (por ejemplo, ácidos carboxílicos, aminas, fosfatos, hidroxilo, etc.) aumenta en gran medida la complejidad analítica. Para evitar esto, utilizamos un método de derivación de anilina en combinación con estándares internos de 13C para introducir componentes hidrófobos en las mezclas de metabolitos. Usando este método, detectamos y cuantificamos robustamente 40 metabolitos en una reacción libre de células en una sola ejecución DE LC/MS. El protocolo etiquetó 35 de los 40 compuestos en este estudio, mientras que los 5 compuestos restantes se cuantificaron con un método de curva estándar. Trabajos anteriores sugirieron que las condiciones de reacción formaban una sal intramolecular entre el grupo de aminas y fosfato sin inhibición de la derivación12. No se identificaron condiciones de reacción para la derivación simultánea de los 40 compuestos; sin embargo, la alternativa actual es la cuantificación con un método de curva estándar. Si bien demostramos esta técnica en una mezcla de reacción libre de células, también podría aplicarse a extractos de células enteras, lo que podría permitir la cuantificación absoluta de las concentraciones de metabolitos intracelulares. Esta última aplicación tiene relevancia para una variedad de cuestiones importantes en biotecnología y salud humana.
El método presentado aquí se basó en una técnica anterior (GSIST) que se aplicó a extractos de células enteras de la levadura S. cerevisiae12,13. En este estudio, ampliamos el número de compuestos que podrían ser detectados y cuantificados, incluyendo los 12 nucleótidos (xMP, xDP, xTP, donde x es A, C, G y U). La adición de estos compuestos podría tener importantes implicaciones biológicas. Por ejemplo, estos nucleótidos están muy involucrados en los procesos de transcripción y traducción, que es uno de los procesos centrales de interés en aplicaciones CFPS, y más generalmente los compuestos son importantes en una variedad de funciones fisiológicas. Además, pudimos detectar ácido acético que es un metabolito importante al examinar el metabolismo del desbordamiento. Sin embargo, no lo incluimos en el estudio porque hubo una reducción significativa de la señal en múltiples compuestos, especialmente nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH) y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH) cuando ácido acético se añadió a la mezcla estándar. El ácido acético tenía un alto límite de detección de 612 m, por lo que en estos niveles altos tuvo un efecto negativo en las señales de los otros metabolitos. A pesar de esto, el ácido acético todavía se puede detectar y cuantificar en muestras mediante la creación de una curva estándar con sólo ácido acético en el vial. El ácido acético tenía un valor m/z de 134,0, un tiempo de retención de 5,78 min y un rango lineal de 612 a 5000 m (R2 a 0,986) cuando se etiqueta con 12C-anilina. Los metabolitos restantes no alteraron la señal ióniforme entre sí y representan una mezcla completa para caracterizar el metabolismo de CFPS. El protocolo presentado aquí se limita a los metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía. Por lo tanto, el método actual es incapaz de medir la abundancia de metabolitos de otras vías que pueden ser de importancia, como el metabolismo de ácidos grasos y aminoácidos.
En conjunto, desarrollamos un protocolo rápido y robusto para la caracterización y cuantificación absoluta de 40 compuestos involucrados en la glucólisis, la vía del fosfato de pentosa, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo energético y la regeneración cofactorial en CFPS Reacciones. El método se basó en estándares internos etiquetados con 13C-anilina, mientras que la muestra fue etiquetada con 12C-anilina. Las normas internas y los compuestos de muestra co-eluyaron y eliminaron los efectos de supresión de iones que permitieron la cuantificación precisa de metabolitos individuales en mezclas de metabolitos complejos. Identificamos un total de 40 compuestos (41, si incluye ácido acético) que pueden ser detectados y cuantificados en una mezcla de reacción libre de células; sin embargo, la lista de metabolitos podría ampliarse y ajustarse hacia el proceso bioquímico particular de interés. Por lo tanto, el método proporciona un enfoque robusto y preciso para caracterizar el metabolismo libre de células, lo que es potencialmente crítico para mejorar el rendimiento, la productividad y la eficiencia energética de los procesos libres de células.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo descrito fue apoyado por el Centro de Física del Metabolismo del Cáncer a través del Premio Número 1U54CA210184-01 del Instituto Nacional del Cáncer ( https://www.cancer.gov/ ). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o de los Institutos Nacionales de Salud. Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
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