Summary
Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.
Abstract
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie zur In-vitro-Produktion von Proteinen. Wenn CFPS jedoch über das Labor hinausgehen und zu einem weit verbreiteten und standardgerechten Fertigungstechnologie werden, müssen wir die Leistungsgrenzen dieser Systeme verstehen. Zu dieser Frage haben wir ein robustes Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode verwendet interne Standards mit 13C-Aniline markiert, während Verbindungen in der Probe mit 12C-Aniline derivatisiert werden. Die internen Standards und Proben wurden durch die umgekehrte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) gemischt und analysiert. Die Ko-Elution von Verbindungen eliminierte die Ionenunterdrückung, was eine genaue Quantifizierung der Metabolitenkonzentrationen über 2-3 Größenordnungen ermöglichte, wobei der durchschnittliche Korrelationskoeffizient 0,988 betrug. Fünf der vierzig Verbindungen wurden mit Aniline nicht markiert, wurden jedoch noch in der CFPS-Probe nachgewiesen und mit einer Standardkurvenmethode quantifiziert. Der chromatographische Lauf dauert ca. 10 min. Zusammen genommen haben wir eine schnelle, robuste Methode entwickelt, um 40 Verbindungen, die an CFPS beteiligt sind, in einem einzigen LC/MS-Lauf zu trennen und genau zu quantifizieren. Die Methode ist ein umfassender und genauer Ansatz zur Charakterisierung des zellfreien Stoffwechsels, so dass wir letztendlich die Ausbeute, Produktivität und Energieeffizienz zellfreier Systeme verstehen und verbessern können.
Introduction
Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist eine vielversprechende Plattform für die Herstellung von Proteinen und Chemikalien, eine Anwendung, die traditionell lebenden Zellen vorbehalten ist. Zellfreie Systeme werden aus rohen Zellextrakten abgeleitet und eliminieren die Komplikationen im Zusammenhang mit dem Zellwachstum1. Darüber hinaus ermöglicht CFPS den direkten Zugang zu Metaboliten und biosynthetischen Maschinen ohne Die Interferenz einer Zellwand. Es fehlt jedoch an einem grundlegenden Verständnis der Leistungsgrenzen zellfreier Prozesse. Hochdurchsatzmethoden zur Metabolitenquantifizierung sind wertvoll für die Charakterisierung des Stoffwechsels und entscheidend für den Aufbau metabolischer Rechenmodelle2,3,4. Häufige Methoden zur Bestimmung der Metabolitenkonzentrationen sind Kernspinresonanz (NMR), Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR), enzymbasierte Assays und Massenspektrometrie (MS)5,6,7 ,8. Diese Methoden sind jedoch oft durch ihre Unfähigkeit, mehrere Verbindungen gleichzeitig effizient zu messen, begrenzt und erfordern oft eine Probengröße, die größer ist als typische zellfreie Reaktionen. Beispielsweise können enzymbasierte Assays oft nur zur Quantifizierung einer einzelnen Verbindung in einem Lauf verwendet werden und sind begrenzt, wenn die Stichprobengröße klein ist, z. B. bei zellfreien Proteinsynthesereaktionen (in der Regel auf einer Skala von 10-15 L). In der Zwischenzeit erfordert NMR eine hohe Fülle von Metaboliten für die Detektion und Quantifizierung5. Angesichts dieser Unzulänglichkeiten bieten Chromatographiemethoden in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC/MS) mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit und die Fähigkeit, mehrere Arten gleichzeitig zu messen9; Die analytische Komplexität nimmt jedoch erheblich zu, da die Anzahl und Vielfalt der Arten gemessen wird. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die das Hohe Durchsatzpotenzial von LC/MS-Systemen voll ausschöpfen. Verbindungen in einer Probe werden durch flüssige Chromatographie getrennt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Das Signal der Verbindung hängt von seiner Konzentration und Ionisationseffizienz ab, wobei die Ionisation zwischen Verbindungen variieren kann und auch von der Probenmatrix abhängen kann.
Die gleiche Ionisationseffizienz zwischen der Probe und den Standards zu erreichen, ist eine Herausforderung, wenn LC/MS zur Quantifizierung von Analyten verwendet wird. Darüber hinaus wird die Quantifizierung mit der Metabolitenvielfalt aufgrund der Signalspaltung und Heterogenität in Protonenaffinität und Polarität10schwieriger. Schließlich kann die Co-Eluing-Matrix der Probe auch die Ionisierungseffizienz der Verbindungen beeinflussen. Um diese Probleme zu lösen, können Metaboliten chemisch ableitungsiert werden, wodurch die Trennungsauflösung und Empfindlichkeit durch LC/MS-Systeme erhöht wird, während gleichzeitig die Signalspaltung in einigen Fällen10,11verringert wird. Chemische Derivatisierung funktioniert durch Tagging bestimmte funktionelle Gruppen von Metaboliten, um ihre physikalischen Eigenschaften wie Ladung oder Hydrophobizität anzupassen, um die Ionisationseffizienz zu erhöhen11. Verschiedene Tagging-Mittel können verwendet werden, um verschiedene funktionelle Gruppen (z.B. Aumine, Hydroxyle, Phosphate, Carbonsäuren usw.) anzusprechen. Aniline, ein solches Derivatisierungsmittel, zielt auf mehrere funktionelle Gruppen gleichzeitig ab und fügt eine hydrophobe Komponente in hydrophile Moleküle ein, wodurch ihre Trennungsauflösung und das Signal12erhöht werden. Um den Co-Eluing-Matrix-Ionenunterdrückungseffekt zu beheben, entwickelten Yang und seine Mitarbeiter eine Technik, die auf der Group Specific Internal Standard Technology (GSIST)-Kennzeichnung basiert, bei der Standards mit 13C-Aniline-Isotopen markiert und mit der Probe gemischt werden. 12,13. Der Metabolit und der entsprechende interne Standard haben die gleiche Ionisationseffizienz, da sie ko-elute, und ihr Intensitätsverhältnis kann verwendet werden, um die Konzentration in der experimentellen Probe zu quantifizieren.
In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, um 40 Verbindungen zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Kofaktorregeneration in CFPS-Reaktionen beteiligt sind. Die Methode basiert auf dem GSIST-Ansatz, bei dem wir 12C-Aniline und 13C-Aniline verwendet haben, um Metaboliten mit umgekehrter Phase LC/MS zu markieren, zu erkennen und zu quantifizieren. Der lineare Bereich aller Verbindungen umfasste 2-3 Größenordnungen mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,988. Somit ist die Methode ein robuster und genauer Ansatz, um den zellfreien Stoffwechsel und möglicherweise Vollzellextrakte abzuhören.
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Protocol
1. Herstellung von Reagenzien zur Aniline-Kennzeichnung
- Bereiten Sie eine 6 M Anilinelösung bei pH 4,5 vor. In einer Haube arbeiten, kombinieren Sie 550 l Aniin mit 337,5 l LCMS-Wasser und 112,5 l 12 M Salzsäure (HCl) in einem Zentrifugenrohr. Vortex gut und lagern bei 4 °C.
HINWEIS: Aniline kann 2 Monate lang bei 4 °C gelagert werden.
VORSICHT: Aniline ist hochgiftig und sollte mit einer Dunstabzugshaube bearbeitet werden. Salzsäure ist hochkorrosiv - Bereiten Sie eine 6 M 13C Anilinelösung bei pH 4,5 vor. Kombinieren Sie 250 mg 13C 6-Aniin mit 132 l Wasser und 44 l von 12 M HCl. Vortex gut und lagern bei 4 °C.
- Bereiten Sie 200 mg/ml N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) Lösung vor. Lösen Sie 2 mg EDC in 10 l Wasser für jede Probe, die getaggt werden soll, und wirbeln Sie gut.
HINWEIS: EdC-Lösung sollte am selben Tag wie die Reaktion vorbereitet werden. EDC wirkt als Katalysator für die Ableitung von Verbindungen mit Aniline12.
2. Vorbereitung von Normen
- Stellen Sie separate Lagerlösungen für alle Verbindungen vor, die in LC/MS-Wasser gelöst sind (Tabelle 1).
-
Erstellung einer internen Standard-Lagerlösung
- Kombinieren Sie alle Verbindungen mit Ausnahme von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Acetyl-Coenzym A (ACA) und Glycerin-3-Phosphat (Gly3P) mit den entsprechenden eine 2 mM Stofflösung aller Compounds zu erstellen.
- Kombinieren Sie NAD, NADP, FAD, ACA und Gly3P mit den entsprechenden Volumes, um eine 2 mM-Lagerlösung zu erstellen.
3. Vorbereitung der Probe (Abbildung 1)
- Die Proteine in einer zellfreien Proteinsynthesereaktion zu löschen und auszufällen, indem sie der Reaktion ein gleiches Volumen eiskaltes 100% Ethanol hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr.
ANMERKUNG: Proben können an dieser Stelle bei -80 °C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden
4. Etikettierreaktion
-
Etikettierprobe mit 12C-Aniline-Lösung
- Übertragen Sie die Probe mit 6 l in ein neues Zentrifugenrohr und bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 50l.
HINWEIS: Der Volumenstichprobenumfang kann von der spezifischen CFPS-Reaktion abhängen. - Fügen Sie 5 l von 200 mg/ml EDC-Lösung hinzu.
- Fügen Sie 5 L von 12C-Aniline-Lösung hinzu.
HINWEIS: Die Anilinelösung gliedert sich in zwei Phasen. Mischen Sie gut, bevor Sie die Reaktion hinzufügen. - Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für 2 h bei Raumtemperatur.
- Nach 2 h die Rohre aus dem Shaker nehmen und 1,5 l Triethylamin (TEA) in einer Dunstabzugshaube zur Reaktion hinzufügen.
HINWEIS: Triethylamin erhöht den pH-Wert der Lösung, die die Aniline-Tagging-Reaktion stoppt und die Verbindungen stabilisiert.
VORSICHT: Triethylamin ist giftig und verursacht Reizungen der Augen und Atemwege. - Zentrifuge bei 13.500 x g für 3 min.
- Übertragen Sie die Probe mit 6 l in ein neues Zentrifugenrohr und bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 50l.
-
Kennzeichnung interner Standards mit 13C-Aniline-Lösungen
- Verdünnung der internen Lagerlösung auf 80 m mit einem Endvolumen von 50 l.
ANMERKUNG: Die Konzentration interner Standards kann auf Niveaus in der Nähe der Versuchsprobe angepasst werden. - Fügen Sie 5 l von 200 mg/ml EDC-Lösung hinzu.
- Fügen Sie 5 L von 13C-Aniline-Lösung.
- Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für 2 h bei Raumtemperatur.
- Nach 2 h die Rohre vom Shaker entfernen und 1,5 L TEA in einer Dunstabzugshaube zur Reaktion hinzufügen.
- Zentrifuge bei 13.500 x g für 3 min.
- Verdünnung der internen Lagerlösung auf 80 m mit einem Endvolumen von 50 l.
-
Kombinieren von getaggtem internen Standard und getaggtem Beispiel
- Mischen Sie 25 l 12C-Aniline-beschriftete Probe mit 25 l von 13C-Aniline-beschrifteten Standard.
- Übertragen Sie auf eine Auto-Sampler-Durchstechflasche und analysieren Sie sie nach dem LC/MS-Verfahren.
-
Erstellen einer Standardkurve für nicht markierte Metaboliten
- Verdünnung der Stammlösung von nicht markierten Metaboliten (NAD, NADP, FAD, ACA und Gly3P) auf Endkonzentrationen von 320 M, 80 m, 20 m und 5 M bei einem Volumen von 50 l.
- Fügen Sie 5 l von 200 mg/ml EDC-Lösung hinzu.
- Fügen Sie 5 L von 12C-Aniline-Lösung hinzu.
- Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für 2 h bei Raumtemperatur.
- Nach 2 h die Rohre vom Shaker entfernen und 1,5 L TEA in einer Dunstabzugshaube zur Reaktion hinzufügen.
- Zentrifuge bei 13.500 x g für 3 min.
- Überstand auf eine Auto-Sampler-Durchstechflasche übertragen und nach dem LC/MS-Verfahren analysieren.
HINWEIS: Die nicht markierten Metaboliten folgen dem gleichen Verfahren wie die Probe, um die Probenmatrix zu replizieren, um eine ähnliche Ionisierungseffizienz aufrechtzuerhalten.
5. Einrichtung des LC/MS-Verfahrens
-
Herstellung von Lösungsmitteln
- Bereiten Sie 5 mM Tri-Butylamin (TBA) wässrige Lösung auf pH 4,75 mit Essigsäure eingestellt.
HINWEIS: TBA in der mobilen Phase hilft den Analyten eine gute Auflösung und Trennung14zu erreichen. - Bereiten Sie 5 mM TBA in Acetonitril (ACN).
- Bereiten Sie Waschlösungsmittel mit 5% Wasser und 95% ACN vor.
- Spüllösungsmittel mit 95% Wasser und 5% ACN aufbereiten.
- Bereiten Sie 5 mM Tri-Butylamin (TBA) wässrige Lösung auf pH 4,75 mit Essigsäure eingestellt.
- Einrichtung von MS-Bedingungen
- Stellen Sie das Massenspektrometer auf den negativen Ionenmodus mit einer Sondentemperatur von 520 °C, einer negativen Kapillarspannung von -0,8 kV, einer positiven Kapillarspannung von 0,8 kV und stellen Sie die Software ein, um Daten auf 5 Punkte/s zu erfassen.
- Legen Sie ausgewählte Ionenaufzeichnungen (SIR) für jeden Metaboliten mit angegebenen Kegelspannungen und Massenüberladungswerten (m/z) fest. Siehe Tabelle 1.
-
Initialisierung von LC/MS gemäß Herstelleranleitung
- Prime Lösungsmittellinien im Lösungsmittelmanager für 3 min.
- Prime Waschlösungsmittel (5% Wasser, 95% ACN) und Spüllösungsmittel (95% Wasser, 5% ACN) für 15 s für 5 Zyklen.
- Stellen Sie den Probenmanager auf 10 °C ein.
- Installieren Sie eine C18-Säule (1,7 mm, 2,1 mm x 150 mm) und initialisieren Sie die Säule mit 100 % ACN bei 0,3 mL/min für 10 min.
- Konditionieren Sie die Säule bei 95% Wasser und 5% ACN bei 0,3 ml/min für 10 min vor der Einführung von Lösungsmitteln mit Puffern.
- Konditionieren Sie die Säule bei 95% Lösungsmittel A (5mM TBA wässrig, pH 4,75) und 5% Lösungsmittel B (5 mM TBA in ACN) bei 0,3 ml/min für 10 min.
- Aufbau eines Gradientenprotokolls mit der Elution ab 95% Lösungsmittel A und 5% Lösungsmittel B, erhöht auf 70% Lösungsmittel B in 10 min, erhöht auf 100% Lösungsmittel B in 2 min und gehalten bei 100% Lösungsmittel B für 3 min. Rückkehr zu Ausgangsbedingungen (95% Lösungsmittel A , 5% Lösungsmittel B) über 1 min und halten Sie für 9 min, um die Säule wieder auszuausgleichen.
- Konditionieren Sie die Spalte mit dem Gradientenprotokoll dreimal vor Injektionen auf die Spalte.
-
Injektion von Proben und Standards
- In jizieren Sie 5 l der Probe in die Spalte und erfassen Sie die entsprechenden m/z Ionenintensitäten für die 12C-Aniline-markierte Probe.
- Injizieren Sie 5 l der gleichen Probe erneut, erfassen Sie aber dieses Mal die m/z-Ionenintensitäten für die 13C-Aniline-markierten Standards.
HINWEIS: Unser LC/MS-System ist nicht in der Lage, sowohl 12C- als auch 13C-m/z-Intensitäten in den angegebenen SIR-Zeitfenstern zu erfassen, da es zu viele Daten ist, die im angegebenen Zeitfenster erfasst werden können. Daher injizieren wir die gleiche Probe zweimal. - Injizieren Sie nicht markierte Metabolitenstandards von der niedrigsten Konzentration auf die höchste Konzentration und erfassen Sie die entsprechenden m/z Ionenintensitäten.
6. Quantifizierung
- Exportieren-Methode erstellen
- Wählen Sie in der Datenerfassungssoftware Datei > Neue Methode > Exportmethodeaus.
- Geben Sie einen Dateinamen an, z. B. AnilineTagging_Date.
- Überprüfen Sie die ASCII-Datei exportieren, und wählen Sie ein Verzeichnis aus, in das die Textdatei exportiert werden soll.
- Wählen Sie im Berichtstyp Zusammenfassung nach Alleaus.
- Wählen Sie unter Trennzeichenfür Spalte eine aus. Wählen Sie für Zeile [cr][if]aus.
- Wählen Sie in Tabelle aus, und bearbeiten Sie dann die Tabelle, um SampleName, Bereich, Höhe, Betrag und Einheiteneinzuschließen .
- Exportmethode speichern.
- Quantifizierung von Metaboliten mit internen Standards mithilfe von Datenerfassungssoftware
- Klicken Sie auf der Registerkarte Sample Sets mit der rechten Maustaste auf die entsprechende LC/MS-Ausführung, und wählen Sie Ansicht als > Kanäle aus.
- Wählen Sie alle SIR-Kanäle für die 13C-Aniline-internen Standards einer Injektion aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Überprüfenaus.
- Wenn das Fenster LC-Verarbeitungsmethodenlayout nicht automatisch angezeigt wird, wechseln Sie zu Anzeigen > Verarbeitungsmethodenlayout.
- Wechseln Sie im Verarbeitungsmethodenlayoutzur Registerkarte Integration, und legen Sie ApexTrack als Algorithmus fest.
- Wechseln Sie zur Registerkarte Glätten, und legen Sie den Typ auf Mittelwert und die Glättungsstufe auf 13fest.
HINWEIS: Jede Glättungsstufe kann ausgewählt werden, solange sie in allen Proben konsistent ist. - Deaktivieren Sie auf der Registerkarte MS Channel die MS 3D-Verarbeitung .
- Integrieren Sie im SIR-Kanalfenster jeden Peak, jeweils einen Kanal. Sobald ein Peak integriert ist, gehen Sie zu Optionen > Füllen aus Ergebnis und die Details der Spitze werden auf der Registerkarte Komponenten ausgefüllt. Ändern Sie den Peak-Namen in den entsprechenden zusammengesetzten Namen.
- Nachdem alle SIR-Kanäle ausgewertet wurden, speichern Sie die Verarbeitungsmethode und schließen Sie das Fenster.
- Wählen Sie alle SIR-Kanäle des 13C-Aniline- und 12C-Aniline-Getagt-Beispiels aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Prozessaus.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess, wählen Sie Angegebene Verarbeitungsmethode verwendenaus, und wählen Sie die Verarbeitungsmethode aus, die gerade gespeichert wird. Aktivieren Sie auch das Kontrollkästchen Exportieren, wählen Sie Angegebene Exportmethode verwenden aus, und wählen Sie die zuvor erstellte gespeicherte Exportmethode aus. Klicken Sie auf OK.
- Öffnen Sie die exportierte Textdatei mit Excel und berechnen Sie die Konzentration der unbekannten Verbindung mit:
wobei Cx,i die Konzentration der unbekannten Probe für Metaboliten i, Ax,i ist der integrierte Bereich des unbekannten Metaboliten i, Astd,i ist der integrierte Bereich des internen Standards von Metaboliten i, Cstd,i ist die Konzentration des internen Standards von Metabolit i, und D ist der Verdünnungsfaktor.
- Quantifizierung nicht markierter Metaboliten mit Standardkurve
- Klicken Sie auf der Registerkarte Sample Sets mit der rechten Maustaste auf die entsprechende LC/MS-Ausführung, und wählen Sie Ansicht als > Kanäle aus.
- Wählen Sie alle SIR-Kanäle für die nicht markierten Standards einer Injektion aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Überprüfenaus.
- Wenn das Fenster LC-Verarbeitungsmethodenlayout nicht automatisch angezeigt wird, wechseln Sie zu Anzeigen > Verarbeitungsmethodenlayout.
- Wechseln Sie im Verarbeitungsmethodenlayout zur Registerkarte Integration, und legen Sie ApexTrack als Algorithmus fest.
- Wechseln Sie zur Registerkarte Glätten, und legen Sie den Typ auf Mittelwert und die Glättungsstufe auf 13fest.
HINWEIS: Jede Glättungsstufe kann ausgewählt werden, solange sie in allen Proben konsistent ist. - Deaktivieren Sie auf der Registerkarte MS Channel die MS 3D-Verarbeitung .
- Integrieren Sie im SIR-Kanalfenster jeden Peak, jeweils einen Kanal. Sobald ein Peak integriert ist, gehen Sie zu Optionen > Füllen aus Ergebnis und die Details der Spitze werden auf der Registerkarte Komponenten ausgefüllt. Ändern Sie den Peak-Namen in den entsprechenden zusammengesetzten Namen.
- Nachdem alle SIR-Kanäle ausgewertet wurden, speichern Sie die Verarbeitungsmethode und schließen Sie das Fenster.
- Klicken Sie unter der Registerkarte Sample Sets mit der rechten Maustaste auf den Sample-Set, und wählen Sie Alter Sampleaus.
- Wählen Sie Betrag im neuen Fenster aus.
- Wählen Sie Kopieren aus der Prozessmethode aus, und wählen Sie die Prozessmethode aus, die gerade gespeichert wurde.
- Geben Sie die Konzentration jedes Metaboliten für jede Durchstechflasche ein, und geben Sie die Einheit als <-M für jede Komponente (oder die entsprechende Einheit) ein und wählen Sie OK.
- Wählen Sie das Sample-Set erneut aus, mit der rechten Maustaste, Als > Kanäle anzeigen.
- Wählen Sie alle SIR-Kanäle der nicht markierten Metaboliten für die Standards aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Prozessaus.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess, und wählen Sie Angegebene Verarbeitungsmethode verwendenaus. Wählen Sie die entsprechende Verarbeitungsmethode aus, und klicken Sie auf OK.
- Wählen Sie SIR-Kanäle für alle nicht markierten Metaboliten für die Samples, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Prozessaus.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess, wählen Sie Angegebene Verarbeitungsmethode verwenden aus, und wählen Sie die Verarbeitungsmethode aus, die gerade gespeichert wurde. Aktivieren Sie auch das Kontrollkästchen Exportieren, wählen Sie Angegebene Exportmethode verwenden aus, und wählen Sie die zuvor erstellte gespeicherte Exportmethode aus. Klicken Sie auf OK.
- Quantifizieren Sie die nicht markierten Metaboliten mit der Standardkurve, und exportieren Sie die Ergebnisse in eine Textdatei in das angegebene Verzeichnis.
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Representative Results
Als Proof-of-Concept haben wir das Protokoll verwendet, um Metaboliten in einem E. coli-basierten CFPS-System zu quantifizieren, das grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exemittiert. Die CFPS-Reaktion (14 l) wurde abgeschreckt und mit Ethanol deproteinisiert. Die CFPS-Probe wurde dann mit 12C-Aniline markiert, während Standards mit 13C-Aniline markiert wurden. Die markierte Probe und die Standards wurden dann kombiniert und in das LC/MS injiziert (Abbildung 1). Das Protokoll erkannte und quantifizierte 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt waren, mit internen Standards, während eine Standardkurve für 5 der Metaboliten, die nicht mit Aniline markiert waren, ebenfalls entwickelt wurde (Abbildung 2). Die verschiedenen Metaboliten, die an diesen Bahnen beteiligt waren, waren eine Klasse von phosphorylierten Zuckern, Phosphocarbonsäuren, Carbonsäuren, Nukleotiden und Kofaktoren. Die Derivatisierung mit Aniline führte einen hydrophoben Moiety in hydrophile Moleküle ein, der eine effektivere Trennung mittels umgekehrter Phasenchromatographie ermöglichte12. Darüber hinaus ermöglichte das Verfahren die Trennung von strukturellen Isomerpaaren wie Glucose 6-Phosphat und Fructose 6-Phosphat in einem einzigen LC/MS-Lauf. Das Verhältnis und die Retentionszeit jeder Verbindung wurden vor dem Experiment durch Injektion von 1 mM einer Verbindung zu einander und einen Vergleich des Massenspektrums mit dem Rohling identifiziert (Tabelle 1).
Die Nachweisgrenze und der Linearitätsbereich für alle Verbindungen wurden geschätzt, indem eine Standardkurve erstellt wurde, die zwischen 0,10 m und 400 m lag (Tabelle 2). Der durchschnittliche Korrelationskoeffizient (R2) für alle Verbindungen betrug 0,988 und die meisten Verbindungen hatten einen linearen Bereich von 3-Größenordnungen. Drei Verbindungen hatten bemerkenswerte Sättigungseffekte, insbesondere Alpha-Ketoglutarat, das einen linearen Bereich von 0,1 bis 25 m hatte. Isocitrat und Citrat hatten auch Sättigungseffekte über 100 m.
Abbildung 1: Schematic des Workflows für Aniline-Tagging. Die zellfreie Proteinsynthese-Reaktion wird deproteinisiert und mit 12C-Aniline markiert, während eine Standard-Lagermischung mit 13C-Aniline markiert ist. Beide Mischungen werden dann mit einem Volumenverhältnis von 1:1 gemischt und von LC/MS analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Überlappende ausgewählte Ionenchromatogramme für 40 Metaboliten. Massenchromatogramm aus einem einzigen LC/MS-Lauf einer 40-M-Standardmischung aus 40 Metaboliten. Peaks wurden durch ihre Retentionszeit und m/z-Werte für jede Verbindung identifiziert. Vollständige zusammengesetzte Namen und deren Abkürzungen sind in Tabelle 1aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Peak Number | Metabolit | abkürzung | KEGG ID | Aufbewahrungszeit (min) | 12C m/z | 13C m/z | nicht-Label m/z | Lebenslauf | MS-Arten | |
| 1 | Glycerin 3-Phosphat | Gly3P | C00093 | 3.85 | 153 | 10 | M – H2O – H | |||
| 2 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid | Nad | C00003 | 3.96 | 698 | 10 | M + Cl – H | |||
| 3 | glukose | Glc | C00031 | 4.06 | 289.9 | 296 | 15 | M + A + Cl - H | ||
| 4 | Sedoheptulose 7-Phosphat | S7P | C05382 | 5.41 | 364 | 370 | 10 | M + A – H | ||
| 5 | Fructose 6-Phosphat | F6P | C00085 | 5.48 | 334 | 340 | 10 | M + A – H | ||
| 6 | Guanosinmonophosphat | Gmp | C00144 | 5.57 | 437.05 | 443 | 10 | M + A – H | ||
| 7 | Ribulose 5-Phosphat | RL5P | C00199 | 5.58 | 304 | 310 | 10 | M + A – H | ||
| 8 | Cytidinmonophosphat | Cmp | C00055 | 5.59 | 397.09 | 403 | 10 | M + A – H | ||
| 9 | Laktat | Lac | C00186 | 5.77 | 164.05 | 170 | 10 | M + A – H | ||
| 10 | Adenosinmonophosphat | ampere | C00020 | 5.85 | 421.1 | 427.1 | 10 | M + A – H | ||
| 11 | Uridinmonophosphat | Ump | C00105 | 5.88 | 398.07 | 404 | 10 | M + A – H | ||
| 12 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat | NADP | C00006 | 6.39 | 724 | 10 | M - H2O – H | |||
| 13 | 3-Phosphoglycersäure | 3PG | C00197 | 6.63 | 242 | 248.06 | 15 | M + A – H2O – H | ||
| 14 | Cytidindiphosphat | Cdp | C00112 | 6.72 | 477 | 483 | 10 | M + A – H | ||
| 15 | Guanosindiphosphat | Bip | C00035 | 6.87 | 517 | 523 | 10 | M + A – H | ||
| 16 | Adenosindiphosphat | Adp | C00008 | 6.94 | 501 | 507 | 10 | M + A – H | ||
| 17 | Uridindiphosphat | Udp | C00015 | 6.97 | 478 | 484 | 10 | M + A – H | ||
| 18 | Flavin Adenin-Dinukleotid | schrei in etwas | C00016 | 7.03 | 784.15 | 15 | M – H | |||
| 19 | Fructose 1,6-Bisphosphat | F16P | C05378 | 7.1 | 395.95 | 402.1 | 10 | M + A – H2O – H | ||
| 20 | Gluconat 6-Phosphat | 6PG | C00345 | 7.11 | 425.1 | 437 | 10 | M + 2A – H | ||
| 21 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid reduziert | Nadh | C00004 | 7.23 | 633.13 | 639.08 | 10 | M + A + H2O – Nicotinamid – H | ||
| 22 | Glukose 6-Phosphat | G6P | C00668 | 7.32 | 409.1 | 421.1 | 10 | M + 2A – H | ||
| 23 | Ribose 5-Phosphat | R5P | C00117 | 7.54 | 379.1 | 391.1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 24 | Erythrose 4-Phosphat | E4P | C00279 | 7.71 | 348.9 | 361 | 10 | M + 2A – H | ||
| 25 | Cytidintriphosphat | Ctp | C00075 | 7.84 | 557 | 563 | 5 | M + A – H | ||
| 26 | Guanosintriphosphat | Gtp | C00044 | 7.93 | 597 | 603 | 5 | M + A – H | ||
| 27 | Oxalacetat | OAA | C00036 | 7.94 | 281 | 293 | 25 | M + 2A – H | ||
| 28 | Alpha-Ketoglutarat | Akg | C00026 | 7.95 | 295 | 307.1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 29 | Uridintriphosphat | Utp | C00075 | 7.97 | 558 | 564 | 10 | M + A – H | ||
| 30 | Adenosintriphosphat | Atp | C00002 | 8.03 | 581 | 587 | 15 | M + A – H | ||
| 31 | Fumarate | FUM | C00122 | 8.09 | 265 | 277.1 | 10 | M + 2A – H | ||
| 32 | Pyruvat | Pyr | C00022 | 8.09 | 162 | 168 | 25 | M + A – H | ||
| 33 | Malate | MAL | C00149 | 8.09 | 283.06 | 295.15 | 10 | M + 2A – H | ||
| 34 | D-Glyceraldehyd 3-Phosphat | lücke | C00118 | 8.09 | 319 | 331.1 | 5 | M + 2A – H | ||
| 35 | Acetyl-Coenzym A | Aca | C00024 | 8.16 | 790 | 10 | M – H2O – H | |||
| 36 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat reduziert | NADPH | C00005 | 8.23 | 694.92 | 700.82 | 10 | M + A – Nicotinamid – H | ||
| 37 | Phosphoenolpyruvat | pep | C00074 | 8.28 | 317 | 329.1 | 20 | M + 2A – H | ||
| 38 | Succinat | SUCC | C00042 | 8.64 | 267.07 | 279.1 | 15 | M + 2A – H | ||
| 39 | Isokitrat | ICIT | C00311 | 10.13 | 398 | 416 | 10 | M + 3A – H2O – H | ||
| 40 | Citrat | Cit | C00158 | 10.46 | 416.1 | 434.06 | 20 | M + 3A – H | ||
Tabelle 1: Identifizierungs- und Kennzeichnungsergebnisse von Metaboliten. Die entsprechende Spitzenzahl jeder Verbindung, die Retentionszeit, der m/z-Wert für unbeschriftete, 12C und 13C markierte und MS-Arten. MS Species, A steht für Aniline-Tag.
| Peak No. | Metabolit | abkürzung | KEGG ID | Konzentration (mM) | SD (n = 3) | Nachweisgrenze (M) | Grenze des linearen Bereichs (M) | R2 | |
| 1 | Glycerin 3-Phosphat | Gly3P | C00093 | 0.377 | 0.034 | 0.1 | 400 | 0.995 | |
| 2 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid | Nad | C00003 | 0.052 | 0.010 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 3 | glukose | Glc | C00031 | 0.002 | 0.000 | 0.1 | 400 | 0.997 | |
| 4 | Sedoheptulose 7-Phosphat | S7P | C05382 | 0.007 | 0.000 | 0.16 | 400 | 0.988 | |
| 5 | Fructose 6-Phosphat | F6P | C00085 | 0.029 | 0.004 | 0.1 | 400 | 0.986 | |
| 6 | Guanosinmonophosphat | Gmp | C00144 | 0.007 | 0.001 | 0.39 | 100 | 0.992 | |
| 7 | Ribulose 5-Phosphat | RL5P | C00199 | 0.035 | 0.002 | 0.39 | 400 | 0.996 | |
| 8 | Cytidinmonophosphat | Cmp | C00055 | 0.045 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 9 | Laktat | Lac | C00186 | 2.134 | 0.048 | 0.1 | 400 | 0.988 | |
| 10 | Adenosinmonophosphat | ampere | C00020 | 0.020 | 0.002 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 11 | Uridinmonophosphat | Ump | C00105 | 0.021 | 0.000 | 0.1 | 100 | 0.997 | |
| 12 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat | NADP | C00006 | 0.014 | 0.002 | 0.34 | 400 | 0.950 | |
| 13 | 3-Phosphoglycersäure | 3PG | C00197 | 6.125 | 0.239 | 0.1 | 100 | 0.996 | |
| 14 | Cytidindiphosphat | Cdp | C00112 | 0.202 | 0.029 | 0.39 | 400 | 0.997 | |
| 15 | Guanosindiphosphat | Bip | C00035 | 0.146 | 0.027 | 1.5625 | 400 | 0.984 | |
| 16 | Adenosindiphosphat | Adp | C00008 | 0.797 | 0.161 | 0.39 | 400 | 0.995 | |
| 17 | Uridindiphosphat | Udp | C00015 | 0.212 | 0.036 | 0.39 | 400 | 0.991 | |
| 18 | Flavin Adenin-Dinukleotid | schrei in etwas | C00016 | 0.008 | 0.001 | 0.1 | 400 | 0.958 | |
| 19 | Fructose 1,6-Bisphosphat | F16P | C05378 | 3.643 | 0.105 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 20 | Gluconat 6-Phosphat | 6PG | C00345 | 0.017 | 0.001 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 21 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid reduziert | Nadh | C00004 | 0.063 | 0.028 | 0.39 | 100 | 0.972 | |
| 22 | Glukose 6-Phosphat | G6P | C00668 | 0.046 | 0.002 | 0.1 | 400 | 0.984 | |
| 23 | Ribose 5-Phosphat | R5P | C00117 | 0.055 | 0.005 | 0.39 | 100 | 0.999 | |
| 24 | Erythrose 4-Phosphat | E4P | C00279 | 0.038 | 0.007 | 0.39 | 400 | 0.979 | |
| 25 | Cytidintriphosphat | Ctp | C00075 | 0.896 | 0.078 | 6.25 | 100 | 0.998 | |
| 26 | Guanosintriphosphat | Gtp | C00044 | 0.870 | 0.109 | 6.25 | 100 | 0.993 | |
| 27 | Oxalacetat | OAA | C00036 | 0.023 | 0.008 | 0.56 | 400 | 0.997 | |
| 28 | Alpha-Ketoglutarat | Akg | C00026 | 0.391 | 0.020 | 0.1 | 25 | 0.979 | |
| 29 | Uridintriphosphat | Utp | C00075 | 0.845 | 0.092 | 1.5625 | 400 | 0.998 | |
| 30 | Adenosintriphosphat | Atp | C00002 | 1.557 | 0.188 | 1.5625 | 400 | 0.991 | |
| 31 | Fumarate | FUM | C00122 | 0.576 | 0.100 | 1.5625 | 100 | 0.999 | |
| 32 | Pyruvat | Pyr | C00022 | 5.813 | 0.804 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 33 | Malate | MAL | C00149 | 2.548 | 0.269 | 0.1 | 400 | 0.991 | |
| 34 | D-Glyceraldehyd 3-Phosphat | lücke | C00118 | 2.194 | 0.367 | 0.1 | 100 | 0.974 | |
| 35 | Acetyl-Coenzym A | Aca | C00024 | 0.196 | 0.044 | 0.1 | 100 | 0.991 | |
| 36 | Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat reduziert | NADPH | C00005 | 0.006 | 0.010 | 0.14 | 100 | 0.990 | |
| 37 | Phosphoenolpyruvat | pep | C00074 | 3.442 | 0.345 | 0.1 | 100 | 0.962 | |
| 38 | Succinat | SUCC | C00042 | 5.683 | 0.573 | 0.1 | 320 | 0.999 | |
| 39 | Isokitrat | ICIT | C00311 | 0.003 | 0.006 | 0.39 | 100 | 0.998 | |
| 40 | Citrat | Cit | C00158 | 0.002 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.981 | |
Tabelle 2: Metabolitenquantifizierung in einer repräsentativen CFPS-Stichprobe. Die Konzentration jedes Metaboliten und die Standardabweichung. Erfassungsgrenze, Linearitätsbereich und Korrelationskoeffizient, die anhand von Standardkurven identifiziert werden.
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Discussion
Zellfreie Systeme haben keine Zellwand, so dass es direkten Zugang zu Metaboliten und den biosynthetischen Maschinen ohne komplexe Probenvorbereitung gibt. Es wurde jedoch nur sehr wenig an der Entwicklung gründlicher und robuster Protokolle zur quantitativen Abhörung zellfreier Reaktionssysteme gearbeitet. In dieser Studie haben wir eine schnelle, robuste Methode zur Quantifizierung von Metaboliten in zellfreien Reaktionsgemischen und potenziell in Ganzzellextrakten entwickelt. Die individuelle Quantifizierung von Metaboliten in komplexen Mischungen, wie sie in zellfreien Reaktionen oder Vollzellextrakten gefunden werden, ist aus mehreren Gründen eine Herausforderung. Im Mittelpunkt dieser Gründe steht die chemische Vielfalt. Die gleichzeitig in diesen Mischungen vorhandene Reihe funktioneller Gruppen (z.B. Carbonsäuren, Aumine, Phosphate, Hydroxyle usw.) erhöht die analytische Komplexität erheblich. Um dies zu umgehen, haben wir eine aniline Derivatisierungsmethode in Kombination mit 13C internen Standards verwendet, um hydrophobe Komponenten in die Metabolitengemische einzuführen. Mit dieser Methode haben wir 40 Metaboliten in einer zellfreien Reaktion in einem einzigen LC/MS-Lauf robust erkannt und quantifiziert. Das Protokoll markierte 35 der 40 Verbindungen in dieser Studie, während die restlichen 5 Verbindungen mit einer Standardkurvenmethode quantifiziert wurden. Frühere Arbeiten legten nahe, dass die Reaktionsbedingungen ein intramolekulares Salz zwischen der Amin- und Phosphatgruppe bildeten, das die Derivatisierung hemmte12. Reaktionsbedingungen wurden für die gleichzeitige Ableitung aller 40 Verbindungen nicht identifiziert; Die aktuelle Alternative ist jedoch die Quantifizierung mit einer Standardkurvenmethode. Während wir diese Technik in einem zellfreien Reaktionsgemisch demonstrierten, könnte sie wahrscheinlich auch auf Vollzellextrakte angewendet werden, wodurch möglicherweise die absolute Quantifizierung intrazellulärer Metabolitenkonzentrationen möglich ist. Die letztgenannte Anwendung ist für eine Vielzahl wichtiger Fragen in der Biotechnologie und der menschlichen Gesundheit relevant.
Die hier vorgestellte Methode basierte auf einer früheren Technik (GSIST), die auf Ganzzellextrakte der Hefe S. cerevisiae12,13angewendet wurde. In dieser Studie haben wir die Anzahl der Verbindungen erweitert, die nachgewiesen und quantifiziert werden konnten, einschließlich aller 12 Nukleotide (xMP, xDP, xTP, wobei x A, C, G und U ist). Die Zugabe dieser Verbindungen könnte wichtige biologische Implikationen haben. Zum Beispiel sind diese Nukleotide stark in Transkriptions- und Übersetzungsprozessen beteiligt, was einer der zentralen Prozesse von Interesse in CFPS-Anwendungen ist, und im Allgemeinen sind die Verbindungen in einer Vielzahl von physiologischen Funktionen wichtig. Darüber hinaus konnten wir Essigsäure, die ein wichtiger Metabolit bei der Untersuchung des Überlaufstoffwechsels ist, erkennen. Wir haben es jedoch nicht in die Studie aufgenommen, da es eine signifikante Reduktion des Signals in mehreren Verbindungen gab, insbesondere Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid reduziert (NADH) und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat reduziert (NADPH), wenn Essigsäure wurde der Standardmischung hinzugefügt. Essigsäure hatte eine hohe Nachweisgrenze von 612 M, also auf diesen hohen Konzentrationen hatte sie einen negativen Einfluss auf die Signale der anderen Metaboliten. Trotzdem kann Essigsäure in Proben noch nachgewiesen und quantifiziert werden, indem eine Standardkurve mit nur Essigsäure in der Durchstechflasche erstellt wird. Essigsäure hatte einen m/z-Wert von 134,0, eine Retentionszeit von 5,78 min und einen linearen Bereich von 612 m bis 5000 m (R2 = 0,986), wenn sie mit 12C-Aniline markiert ist. Die verbleibenden Metaboliten veränderten sich nicht gegenseitig das Ionensignal und stellen eine umfassende Mischung dar, um den CFPS-Stoffwechsel zu charakterisieren. Das hier vorgestellte Protokoll beschränkt sich auf Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt sind. Daher ist die aktuelle Methode nicht in der Lage, metaboliten Fülle von anderen Pfaden zu messen, die von Bedeutung sein können, wie Fettsäure und Aminosäurestoffwechsel.
Zusammen genommen haben wir ein schnelles, robustes Protokoll zur Charakterisierung und absoluten Quantifizierung von 40 Verbindungen entwickelt, die an der Glykolyse, dem Pentosephosphatweg, dem Tricarbonsäurezyklus, dem Energiestoffwechsel und der Cofaktorregeneration in CFPS beteiligt sind. Reaktionen. Die Methode stützte sich auf interne Standards mit 13C-Aniline, während die Probe mit 12C-Aniline markiert wurde. Die internen Standards und Probenverbindungen koluden und eliminierten Ionenunterdrückungseffekte, die eine genaue Quantifizierung einzelner Metaboliten in komplexen Metabolitenmischungen ermöglichten. Wir identifizierten insgesamt 40 Verbindungen (41, wenn auch Essigsäure), die in einem zellfreien Reaktionsgemisch nachgewiesen und quantifiziert werden können; die Liste der Metaboliten könnte jedoch weiter erweitert und an den jeweiligen biochemischen Prozess von Interesse angepasst werden. Somit bietet die Methode einen robusten und genauen Ansatz zur Charakterisierung des zellfreien Stoffwechsels, der potenziell entscheidend für die Verbesserung der Ausbeute, Produktivität und Energieeffizienz zellfreier Prozesse ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die beschriebene Arbeit wurde vom Center on the Physics of Cancer Metabolism durch den Award Nummer 1U54CA210184-01 des National Cancer Institute ( https://www.cancer.gov/ ) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder der National Institutes of Health dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
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