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Biochemistry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.

Abstract

무세포 단백질 합성(CFPS)은 체외 단백질 생산을 위한 시스템 및 합성 생물학의 새로운 기술입니다. 그러나 CFPS가 실험실을 넘어 제때 제조 기술에 대한 광범위하고 표준이 될 경우 이러한 시스템의 성능 한계를 이해해야 합니다. 이 질문으로, 우리는 GLYCOlysis, 펜토오스 인산 통로, 삼차 질산 주기, 에너지 대사 및 CFPS 반응에 있는 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 13C-aniline으로 태그가 지정된 내부 표준을 사용하는 반면 샘플의 화합물은 12C-aniline으로파생됩니다. 내부 표준 및 샘플을 역상 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC/MS)에 의해 혼합 및 분석하였다. 화합물의 공동 용출은 이온 억제를 제거하여 평균 상관 계수가 0.988인 2-3배 이상의 대사산물 농도를 정확하게 정량화할 수 있습니다. 40개의 화합물 중 5개는 아니라인으로 태그가 지정되지 않았지만, CFPS 샘플에서 여전히 검출되고 표준 곡선 방법으로 정량화되었습니다. 크로마토그래피 실행을 완료하는 데 약 10분이 걸립니다. 종합하면, 우리는 단일 LC/MS 실행에서 CFPS에 관련된 40개의 화합물을 분리하고 정확하게 정량화하는 빠르고 견고한 방법을 개발했습니다. 이 방법은 무세포 신진 대사를 특성화하는 포괄적이고 정확한 접근법으로 궁극적으로 무세포 시스템의 수율, 생산성 및 에너지 효율을 이해하고 향상시킬 수 있습니다.

Introduction

무세포 단백질 합성(CFPS)은 단백질과 화학 물질의 제조를 위한 유망한 플랫폼으로, 전통적으로 살아있는 세포를 위해 예약되어 있는 응용 프로그램입니다. 무세포 시스템은 조세포 추출물에서 유래하고 세포 성장과 관련된 합병증을제거1. 또한 CFPS는 세포벽의 간섭 없이 대사산물 및 생합성 기계에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 그러나, 무세포 프로세스의 성능 한계에 대한 근본적인 이해는 부족했습니다. 대사 산물 정량화를위한 높은 처리량 방법은 신진 대사의 특성화에 유용하며 대사 전산 모델2,3,4의구성에 중요합니다. 대사 산물 농도를 결정하는 데 사용되는 일반적인 방법은 핵 자기 공명 (NMR), 푸리에 변환 적외선 분광법 (FT-IR), 효소 기반 분석 및 질량 분광법 (MS)5,6,7을포함합니다 ,8. 그러나, 이러한 방법은 종종 한 번에 여러 화합물을 효율적으로 측정할 수 없기 때문에 제한되며 종종 일반적인 무세포 반응보다 더 큰 샘플 크기를 필요로 합니다. 예를 들어, 효소 기반 세포는 종종 실행에서 단일 화합물을 정량화하는 데만 사용될 수 있으며, 세포없는 단백질 합성 반응과 같이 샘플 크기가 작을 때 제한됩니다 (전형적으로 10-15 μL 척도에서 실행). 한편, NMR검출 및 정량화를 위해 대사산물의 풍부도가 요구된다5.  이러한 단점을 향해, 질량 분석법 (LC / MS)와 함께 크로마토그래피 방법은 높은 감도 및 동시에 여러 종을 측정하는 기능을 포함하여 여러 장점을 제공합니다9; 그러나 분석 복잡성은 측정되는 종의 수와 다양성에 따라 상당히 증가합니다. 따라서 LC/MS 시스템의 높은 처리량 잠재력을 완전히 실현하는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 견본에 있는 화합물은 액체 크로마토그래피에 의해 분리되고 질량 분석법을 통해 확인됩니다. 화합물의 신호는 이온화가 화합물 마다 다를 수 있고 또한 견본 매트릭스에 따라 달라질 수 있는 그것의 집중 그리고 이온화 효율성에 달려 있습니다.

LC/MS를 사용하여 시료와 표준 간에 동일한 이온화 효율을 달성하는 것은 어려운 과제입니다. 또한, 양성자 친화성 및극성(10)에서신호 분할 및 이질성으로 인한 대사 산물 다양성으로 정량화는 더욱 어려워진다. 마지막으로, 샘플의 공동 용출 매트릭스는 또한 화합물의 이온화 효율에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 대사 산물은 화학적으로 유도 될 수있다, LC / MS 시스템에 의해 분리 분해 및 감도를 증가, 동시에 어떤 경우에는 신호 분할을 감소하면서10,11. 화학적 유도체화는 대사산물의 특정 작용기를 태그하여 전하 또는 소수성 등의 물성을 조절하여 이온화 효율을 증가시킴으로써 작동한다11. 다양한 태깅 제제는 상이한 작용기(예를 들어, 아민, 하이드록실, 인산염, 카르복실산 등)를 표적으로 하는데 사용될 수 있다. 이러한 파생화 제중 하나인 Aniline은 한 번에 여러 작용체를 대상으로 하고 소수성 성분을 친수성 분자에 추가하여 분리 분해능 및신호(12)를증가시다. 공동 용출 매트릭스 이온 억제 효과를 해결하기 위해 Yang과 동료들은 표준에 13C이실린 동위원소와 태그를 지정하고 샘플과 혼합하는 그룹 별 내부 표준 기술(GSIST) 라벨링에 기반한 기술을 개발했습니다. 12,13. 대사 산물 및 해당 내부 표준은 공동 용해되기 때문에 동일한 이온화 효율을 가지며, 그들의 강도 비는 실험 샘플의 농도를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

이 연구에서는, 우리는 CFPS 반응에 있는 glycolysis, 펜토오스 인산 통로, tricarboxylic 산 주기, 에너지 물질 대사 및 동료 회생에 관련시킨 40의 화합물을 검출하고 정량화하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 역위상 LC/MS를 사용하여 대사 산물에 태그, 감지 및 정량화하기 위해 12C-aniline 및 13C-aniline을 사용한 GSIST 접근 방식을 기반으로 합니다. 모든 화합물의 선형 범위는 평균 상관 계수 0.988을 가진 크기의 2-3 순서에 걸쳐 있습니다. 따라서, 이 방법은 무세포 대사, 그리고 아마도 전체 세포 추출물을 심문하는 강력하고 정확한 접근법이다.

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Protocol

1. 항리 선 태그시약 준비

  1. pH 4.5에서 6M 아니라인 용액을 준비합니다. 후드에서 작업하여 550 μL의 애실린과 337.5 μL의 LCMS 등급의 물과 12M 염산(HCl)의 112.5 μL을 원심분리기 튜브에 결합합니다. 소용돌이잘 4 °C에서 저장합니다.
    참고: 아닐린은 2개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
    주의: 아닐린은 독성이 매우 높으며 연기 후드에서 작업해야 합니다. 염산은 매우 부식성이 높습니다.
  2. pH 4.5에서 6M 13C 이실린 용액을 준비합니다. 250 mg의 13C6-aniline과 132 μL의 물과 44 μL의 12 M HCl. 소용돌이를 잘 결합하고 4 °C에서 보관하십시오.
  3. 200 mg/mL N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디미드 염산염(EDC) 용액을 준비합니다. 10 μL의 물에 EDC 2 mg을 녹여 모든 시료에 태그를 지정하고 소용돌이가 잘 될 수 있습니다.
    참고 : EDC 용액은 반응과 같은 날에 준비되어야한다. EDC는 아니라인12를가진 화합물의 유도체화를 위한 촉매로서 작용한다.

2. 표준준비

  1. LC/MS 등급물에 용해된 모든 화합물의 개별 재고 용액을 만드십시오(표1).
  2. 내부 표준 재고 솔루션 준비
    1. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염(NADP), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 아세틸 코엔자임 A(ACA), 글리세롤 3-인산염(Gly3P)을 제외한 모든 화합물을 적절한 부피와 결합하여 적절한 부피를 모든 화합물의 2mMM 스톡 솔루션을 만듭니다.
  3. NAD, NADP, FAD, ACA 및 Gly3P를 적절한 볼륨과 결합하여 2mM 스톡 솔루션을 만듭니다.

3. 견본의 준비(그림 1)

  1. 반응에 얼음-차가운 100% 에탄올의 동일한 부피를 첨가하여 무세포 단백질 합성 반응에서 단백질을 담급질하고 침전시한다. 4 °C에서 15 분 동안 12,000 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 상급체를 새로운 원심분리기 튜브로 옮김.
    참고: 시료는 이 시점에서 -80°C에 보관하고 나중에 분석할 수 있습니다.

4. 라벨링 반응

  1. 12C-아니라인솔루션으로 시료 라벨링
    1. 6 μL의 샘플을 새로운 원심 분리관으로 옮기고 물로 50 μL의 부피를가져옵니다.
      참고: 부피 샘플 크기는 특정 CFPS 반응에 따라 달라질 수 있습니다.
    2. 200 mg/mL EDC 용액 5 μL을 첨가합니다.
    3. 12C-아니린용액 5 μL을 추가합니다.
      참고: 아니라인 솔루션은 두 단계로 구분됩니다. 반응에 추가하기 전에 잘 섞으세요.
    4. 상온에서 2 시간 동안 부드럽게 흔들어 반응을 소용돌이.
    5. 2 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고 연기 후드의 반응에 트리에틸아민 (TEA)의 1.5 μL을 추가합니다.
      참고 : 트리에틸아민은 항문 태그 반응을 중지하고 화합물을 안정화 용액의 pH를 제기.
      주의: 트리에틸아민은 독성이 있으며 눈과 호흡기의 자극을 유발합니다.
    6. 13,500 x g에서 3 분 동안 원심 분리기.
  2. 13C-aniline 솔루션으로 내부 표준 라벨 링
    1. 최종 부피 50 μL로 내부 재고 용액을 80 μM으로 희석합니다.
      참고: 내부 표준의 농도는 실험 샘플에 가까운 수준으로 조정할 수 있습니다.
    2. 200 mg/mL EDC 용액 5 μL을 첨가합니다.
    3. 13C-아니린용액 5 μL을 추가합니다.
    4. 상온에서 2 시간 동안 부드럽게 흔들어 반응을 소용돌이.
    5. 2 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고 연기 후드의 반응에 TEA 1.5 μL을 추가합니다.
    6. 13,500 x g에서 3 분 동안 원심 분리기.
  3. 태그가 지정된 내부 표준 및 태그가 지정된 샘플 결합
    1. 12C-aniline 표지 샘플 의 25 μL을 13C-aniline 라벨 표준의 25 μL과 섞습니다.
    2. 자동 샘플러 바이알로 전송하고 LC/MS 프로시저에 의해 분석합니다.
  4. 태그가 지정되지 않은 대사 산물에 대한 표준 곡선 만들기
    1. 태그가 지정되지 않은 대사 산물(NAD, NADP, FAD, ACA 및 Gly3P)의 재고 용액을 320 μM, 80 μM, 20 μM 및 50 μL의 부피로 최종 농도로 희석합니다.
    2. 200 mg/mL EDC 용액 5 μL을 첨가합니다.
    3. 12C-아니린용액 5 μL을 추가합니다.
    4. 상온에서 2 시간 동안 부드럽게 흔들어 반응을 소용돌이.
    5. 2 시간 후, 셰이커에서 튜브를 제거하고 연기 후드의 반응에 TEA 1.5 μL을 추가합니다.
    6. 13,500 x g에서 3 분 동안 원심 분리기.
    7. 상급자를 자동 샘플러 바이알로 옮기고 LC/MS 프로시저에 의해 분석합니다.
      참고: 태그가 지정되지 않은 대사 산물은 유사한 이온화 효율을 유지하기 위해 샘플 매트릭스를 복제하기 위해 샘플과 동일한 절차를 따릅니다.

5. LC/MS 절차 설정

  1. 용매의 준비
    1. 아세트산으로 pH 4.75로 조정된 5 mMM 트라이 부틸라민(TBA) 수성 용액을 준비합니다.
      참고: 이월 단계에서TBA는 분석에 도움이 양호한 분해능과 분리14.
    2. 아세토니트릴(ACN)에서 5mM TBA를 준비합니다.
    3. 5 % 물과 95 % ACN으로 세척 용제를 준비하십시오.
    4. 95% 물과 5% ACN으로 용매를 제거합니다.
  2. MS 조건 설정
    1. 질량 분석기를 프로브 온도 520°C, 음수 모세관 전압 -0.8 kV, 0.8 kV의 양수 모세관 전압으로 음수 이온 모드로 설정하고 소프트웨어를 설정하여 5포인트/s에서 데이터를 수집합니다.
    2. 지정된 원뿔 전압및 질량 과충전(m/z) 값을 가진 각 대사 산물에 대해 선택한 이온 기록(SIR)을 설정합니다. 표 1을참조하십시오.
  3. 제조업체의 지침에 따라 LC/MS 초기화
    1. 3 분 동안 용매 관리자의 주요 용매 라인.
    2. 프라임 워시 용매 (5 % 물, 95 % ACN) 및 5 사이클 동안 15 s동안 용매 (95 % 물, 5 % ACN)를 제거하십시오.
    3. 시료 관리자를 10°C로 설정합니다.
    4. C18(1.7μm, 2.1mm x 150mm) 컬럼을 설치하고 10분 동안 0.3mL/min에서 100% ACN으로 컬럼을 초기화합니다.
    5. 완충제가 있는 용매를 도입하기 전에 컬럼을 95% 물과 5% ACN에서 0.3 mL/min로 10분 동안 조절합니다.
    6. 컬럼을 95% 용매 A(5mM TBA 수성, pH 4.75) 및 5% 용매 B(ACN의 5mM TBA)에서 0.3 mL/min에서 10분 동안 조건화합니다.
    7. 용출 95% 용매 A와 5% 용매 B에서 시작하여 10분 만에 70% 용매 B로 올리고 2분 만에 100% 용매 B로 올리고 3분 동안 100% 용매 B로 유지하여 초기 조건(95% 용매 A)으로 복귀 , 5% 용매 B) 1분 이상 및 컬럼을 다시 평형화하기 위해 9분 동안 유지한다.
    8. 컬럼에 주사하기 전에 그라데이션 프로토콜로 컬럼을 3번 컨디셔닝합니다.
  4. 샘플 및 표준 주입
    1. 시료의 5 μL을 컬럼에 주입하고 12C-aniline 태그가 지정된 샘플에 대해 적절한 m/z 이온 강도를 얻습니다.
    2. 동일한 시료의 5 μL을 다시 주입하지만, 이번에는 13C-aniline 태그가 지정된 표준에 대한 m/z 이온 강도를 획득합니다.
      참고: 지정된 시간 창에서 수집하기에는 데이터가 너무 많기 때문에 LC/MS 시스템은 지정된 SIR 시간 창에서 12C및 13Cm/z 강도를 모두 획득할 수 없습니다. 따라서 동일한 샘플을 두 번 주입합니다.
    3. 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 태그가 지정되지 않은 대사 산물 표준을 주입하고 적절한 m/z 이온 강도를 기록합니다.

6. 정량화

  1. 내보내기 메서드 만들기
    1. 데이터 수집 소프트웨어에서 파일 > 새 방법 > 내보내기 방법을선택합니다.
    2. AnilineTagging_Date와같은 파일 이름을 지정합니다.
    3. ASCII 파일 내보내기를 확인하고 텍스트 파일을 내보낼 디렉토리를 선택합니다.
    4. 보고서 유형에서 모두의 요약을선택합니다.
    5. 구분 기호에서 열에 대해 을 선택합니다. 행의경우 [cr][if]을선택합니다.
    6. 표에서 내보내기를 선택한 다음 편집 테이블을 선택하여 샘플 이름, 영역, 높이, 양 및 단위를포함합니다.
    7. 내보내기 메서드를 저장합니다.
  2. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 내부 표준으로 대사 산물 정량화
    1. 샘플 세트 탭에서 해당 LC/MS 실행을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 보기를 > 채널로선택합니다.
    2. 한 번의 주사로 13C-aniline내부 표준에 대한 모든 SIR 채널을 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 검토를선택합니다.
    3. LC 처리 방법 레이아웃 창이 자동으로 나타나지 않으면 보기 > 메서드 레이아웃 처리로이동합니다.
    4. 방법 레이아웃 처리에서 통합 탭으로 이동하여 ApexTrack을 알고리즘으로 설정합니다.
    5. 스무딩 탭으로 이동하여 형식을 평균으로 설정하고 스무딩 레벨을 13으로설정합니다.
      참고: 모든 샘플에서 일관된 경우 모든 스무딩 레벨을 선택할 수 있습니다.
    6. MS 채널 탭에서 MS 3D 처리를사용하지 않도록 설정합니다.
    7. SIR 채널 창에서 각 피크를 한 번에 하나의 채널을 통합합니다. 피크가 통합되면 결과에서 옵션 > 채우기로 이동하면 피크의 세부 정보가 구성 요소 탭에 채워집니다.
    8. 모든 SIR 채널이 평가되면 처리 방법을 저장하고 창을 닫습니다.
    9. 13C-aniline 및 12C-aniline 태그샘플의 모든 SIR 채널을 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 프로세스를선택합니다.
    10. 프로세스 확인란을 선택하고 지정된 처리 방법 사용을선택하고 방금 저장된 처리 방법을 선택합니다. 또한 내보내기 확인란을 선택하고 지정된 내보내기 방법 사용을 선택하고 이전에 만든 저장된 내보내기 방법을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
    11. Excel을 사용하여 내보낸 텍스트 파일을 열고 다음을 사용하여 알 수 없는 화합물의 농도를 계산합니다.
      Equation 1
      여기서 Cx,i는 대사 산물 i, Ax, i는 알 수없는 대사 산물 i, Astd의 통합 영역이며, 나는 대사 산물 i, Cstd의 내부 표준의 통합 영역입니다. 대사 산물 i의 내부 표준의 농도, D는 희석 인자입니다.
  3. 표준 곡선으로 태그가 지정되지 않은 대사 산물 정량화
    1. 샘플 세트 탭에서 해당 LC/MS 실행을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 보기를 > 채널로선택합니다.
    2. 한 번의 주입의 태그가 지정되지 않은 표준에 대한 모든 SIR 채널을 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 검토를선택합니다.
    3. LC 처리 방법 레이아웃 창이 자동으로 나타나지 않으면 보기 > 메서드 레이아웃 처리로이동합니다.
    4. 방법 레이아웃 처리에서 통합 탭으로 이동하여 ApexTrack을 알고리즘으로 설정합니다.
    5. 스무딩 탭으로 이동하여 형식을 평균으로 설정하고 스무딩 레벨을 13으로설정합니다.
      참고: 모든 샘플에서 일관된 경우 모든 스무딩 레벨을 선택할 수 있습니다.
    6. MS 채널 탭에서 MS 3D 처리를사용하지 않도록 설정합니다.
    7. SIR 채널 창에서 각 피크를 한 번에 하나의 채널을 통합합니다. 피크가 통합되면 결과에서 옵션 > 채우기로 이동하면 피크의 세부 정보가 구성 요소 탭에 채워집니다.
    8. 모든 SIR 채널이 평가되면 처리 방법을 저장하고 창을 닫습니다.
    9. 샘플 집합 탭에서 샘플 집합을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 샘플 변경을 선택합니다.
    10. 새 창에서 양을 선택합니다.
    11. Process 메서드에서 복사본을 선택하고 방금 저장된 프로세스 메서드를 선택합니다.
    12. 각 바이알에 대한 각 대사 산물의 농도를 입력하고 각 구성 요소 (또는 해당 단위)에 대해 <μM으로 단위를 입력하고 확인을선택합니다.
    13. 샘플 세트를 다시 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 > 채널로 보기.
    14. 표준에 대한 태그가 지정되지 않은 대사 산물의 모든 SIR 채널을 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 프로세스를선택합니다.
    15. 프로세스 확인란을 선택하고 지정된 처리 방법 사용을선택합니다. 적절한 처리 방법을 선택하고 확인을클릭합니다.
    16. 샘플에 대한 태그가 지정되지 않은 모든 대사 산물에 대해 SIR 채널을 선택하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 프로세스를선택합니다.
    17. 프로세스 확인란을 선택하고 지정된 처리 방법 사용을 선택하고 방금 저장된 처리 방법을 선택합니다. 또한 내보내기 확인란을 선택하고 지정된 내보내기 방법 사용을 선택하고 이전에 만든 저장된 내보내기 방법을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
    18. 태그가 지정되지 않은 대사 산물을 표준 곡선으로 정량화하고 결과를 지정된 디렉터리로 텍스트 파일로 내보냅니다.

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Representative Results

개념 증명으로, 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현하는 대장균 기반 CFPS 시스템에서 대사 산물을 정량화하기 위해 프로토콜을 사용했습니다.  CFPS 반응(14 μL)을 담금질하고 에탄올로 탈단백질화하였다. CFPS 샘플은 12C-aniline으로 태그된 다음 표준은 13C-aniline으로태그가 지정되었습니다. 태그가 지정된 샘플 및 표준을 결합하여 LC/MS(그림1)에주입하였다. 이 프로토콜은 내부 표준을 사용하여 중앙 탄소 및 에너지 대사에 관여하는 40개의 대사산물을 검출하고 정량화했으며, 아닐린으로 태그되지 않은 대사산물 5개에 대한 표준 곡선도 개발되었다(그림2). 이 통로에서 관련시킨 다양한 대사 산물은 인산화된 설탕, 인산화환균산, 카르복실산, 뉴클레오티드 및 보조 인자의 부류였다. aniline을 이용한 유도체화는 친수성 분자에 소수성 모이티를 도입하여 역상 크로마토그래피12를사용하여 보다 효과적인 분리를 촉진시켰다. 또한, 이 방법은 단일 LC/MS 실행에서 포도당 6-인산염 및 과당 6-인산염과 같은 구조이온기 쌍을 분리할 수 있게 하였다. 각 화합물의 질량 과충전(m/z) 비율 및 유지 시간은 한 번에 1 mMM의 화합물을 주입하고 질량 스펙트럼을 블랭크와 비교하여 실험 전에 확인하였다(표1).

모든 화합물에 대한 검출 및 선형 범위의 한계는 0.10 μM 내지 400 μM 범위의 표준 곡선을 생성함으로써 추정되었다(표2). 모든 화합물에 대한평균 상관 계수(R2)는 0.988이고 대부분의 화합물은 3배의 선형 범위의 크기였다. 3개의 화합물은 주목할만한 포화 효과를 가졌으며, 특히 0.1 μM ~ 25 μM의 선형 범위를 가진 알파 케토글루타레이트도 100 μM 이상의 포화 효과를 가졌다.

Figure 1
그림 1: 항선 태그 지정을 위한 워크플로의 회로도입니다. 무세포 단백질 합성 반응은 12C-aniline으로 탈단백질화되고 태그가 지정되며, 표준 스톡 혼합물은 13C-aniline으로 태그가 지정됩니다. 두 혼합물은 1:1 체적 비율로 혼합되고 LC/MS에 의해 분석됩니다.

Figure 2
그림 2: 40개의 대사 산물에 대해 선택된 이온 크로마토그램을 중첩. 40 μM 표준 혼합물의 단일 LC/MS 실행에서 질량 크로마토그램 40 대사 산물. 피크는 각 화합물에 대한 보존 시간 및 m/z 값으로 식별되었습니다. 전체 복합 이름과 해당 약어는 표 1에나열되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

피크 번호 대사 산물 약어 케그 ID 보존 시간(최소) 12C m/z 13C m/z 비레이블 m/z 이력서 MS 종
1 글리세롤 3-인산염 글리3P C00093 3.85 153 10 M – H2O – H
2 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 Nad C00003 3.96 698 10 M + Cl – H
3 포도 당 GLC C00031 4.06 289.9 296 15 M + A + Cl - H
4 세도헵툴로오스 7-인산염 S7P C05382 5.41 364 370 10 M + A – H
5 과당 6-인산염 F6P C00085 5.48 334 340 10 M + A – H
6 과노신 모노포스페이트 Gmp C00144 5.57 437.05 443 10 M + A – H
7 리볼로오스 5-인산염 RL5P C00199 5.58 304 310 10 M + A – H
8 사이티딘 모노포스페이트 Cmp C00055 5.59 397.09 403 10 M + A – H
9 락 테이트 락 C00186 5.77 164.05 170 10 M + A – H
10 아데노신 모노포스페이트 앰프 C00020 5.85 421.1 427.1 10 M + A – H
11 우리딘 모노포스페이트 Ump C00105 5.88 398.07 404 10 M + A – H
12 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 NADP C00006 6.39 724 10 M - H2O - H
13 3-인산 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M + A – H2O – H
14 사이티딘 이산염 Cdp C00112 6.72 477 483 10 M + A – H
15 과노신 디포스페이트 Gdp C00035 6.87 517 523 10 M + A – H
16 아데노신 디포스페이트 Adp C00008 6.94 501 507 10 M + A – H
17 우리딘 디포스페이트 Udp C00015 6.97 478 484 10 M + A – H
18 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 유행 C00016 7.03 784.15 15 M – H
19 과당 1,6-비스포스페이트 F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A – H2O – H
20 글루코네이트 6-인산염 6PG C00345 7.11 425.1 437 10 M + 2A – H
21 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 감소 나드 (미국)의 C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O – 니코틴아미드 – H
22 포도당 6-인산염 G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M + 2A – H
23 리보오스 5-인산염 R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M + 2A – H
24 에리스로즈 4-인산염 E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M + 2A – H
25 사이티딘 트리포스페이트 Ctp C00075 7.84 557 563 5 M + A – H
26 과노신 트리포스페이트 Gtp C00044 7.93 597 603 5 M + A – H
27 옥사세테이트 OAA C00036 7.94 281 293 25 M + 2A – H
28 알파 케토글루타레이트 Akg C00026 7.95 295 307.1 15 M + 2A – H
29 우리딘 삼인조스페이트 Utp C00075 7.97 558 564 10 M + A – H
30 아데노신 삼인산 Atp C00002 8.03 581 587 15 M + A – H
31 푸마레이트 ()와 FUM (훈무) C00122 8.09 265 277.1 10 M + 2A – H
32 피루바테 PYR C00022 8.09 162 168 25 M + A – H
33 Malate 말 C00149 8.09 283.06 295.15 10 M + 2A – H
34 D-글리세랄데히드 3-인산염 간격 C00118 8.09 319 331.1 5 M + 2A – H
35 아세틸 코엔자임 A Aca C00024 8.16 790 10 M – H2O – H
36 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 감소 나드프 (있는) C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A – 니코틴아미드 – H
37 포스포네놀피루바트 Pep C00074 8.28 317 329.1 20 M + 2A – H
38 수시 네이트 수CC (주) C00042 8.64 267.07 279.1 15 M + 2A – H
39 이시레이트 (이시타) 아이티 (오)(약가 C00311 10.13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 시트르산 Cit C00158 10.46 416.1 434.06 20 M + 3A – H

표 1: 대사 산물의 식별 및 라벨링 결과. 각 화합물의 해당 피크 수, 보존 시간, 라벨이 지정되지 않은 m/z 값, 12C및 13C라벨, 및 MS 종. MS 종, A는 Aniline 태그를 의미합니다.

피크 번호 대사 산물 약어 케그 ID 농도 (mM) SD (n = 3) 검출 한계(μM) 선형 범위의 한계(μM) R^2
1 글리세롤 3-인산염 글리3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 Nad C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 포도 당 GLC C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 세도헵툴로오스 7-인산염 S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 과당 6-인산염 F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 과노신 모노포스페이트 Gmp C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 리볼로오스 5-인산염 RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 사이티딘 모노포스페이트 Cmp C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 락 테이트 락 C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 아데노신 모노포스페이트 앰프 C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 우리딘 모노포스페이트 Ump C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 NADP C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-인산 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 사이티딘 이산염 Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 과노신 디포스페이트 Gdp C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 아데노신 디포스페이트 Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 우리딘 디포스페이트 Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 유행 C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 과당 1,6-비스포스페이트 F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 글루코네이트 6-인산염 6PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 감소 나드 (미국)의 C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 포도당 6-인산염 G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 리보오스 5-인산염 R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 에리스로즈 4-인산염 E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 사이티딘 트리포스페이트 Ctp C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 과노신 트리포스페이트 Gtp C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 옥사세테이트 OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 알파 케토글루타레이트 Akg C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 우리딘 삼인조스페이트 Utp C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 아데노신 삼인산 Atp C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 푸마레이트 ()와 FUM (훈무) C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 피루바테 PYR C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 Malate 말 C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 D-글리세랄데히드 3-인산염 간격 C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 아세틸 코엔자임 A Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 감소 나드프 (있는) C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 포스포네놀피루바트 Pep C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 수시 네이트 수CC (주) C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 이시레이트 (이시타) 아이티 (오)(약가 C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 시트르산 Cit C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

표 2: 대표적인 CFPS 샘플에서 대사산물 정량화. 각 대사 산물및 표준 편차의 농도. 표준 곡선에서 식별된 검출 범위, 선형 범위 및 상관 계수의 제한입니다.

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Discussion

무세포 시스템에는 세포벽이 없으므로 복잡한 시료 전처리없이 대사산물과 생합성 기계에 직접 접근할 수 있습니다. 그러나 세포 없는 반응 시스템을 정량적으로 심문하기 위한 철저하고 견고한 프로토콜을 개발하기 위한 작업은 거의 이루어지지 않았습니다. 이 연구에서는 무세포 반응 혼합물과 잠재적으로 전세포 추출물에서 대사 산물을 정량화하는 빠르고 강력한 방법을 개발했습니다. 세포가 없는 반응또는 전세포 추출물에서 발견되는 것과 같은 복잡한 혼합물에서 대사 산물의 개별 정량화는 여러 가지 이유로 도전적입니다. 이러한 이유 중 중심은 화학적 다양성입니다. 이러한 혼합물(예를 들어, 카르복실산, 아민, 인산염, 하이드록실 등)에 동시에 존재하는 작용기의 배열은 분석복잡성을 크게 증가시킨다. 이를 우회하기 위해 13C내부 표준과 결합하여 대사 산물 혼합물에 소수성 성분을 도입하는 항염 유도법을 사용했습니다. 이 방법을 사용하여 단일 LC/MS 실행에서 무세포 반응에서 40개의 대사 산물을 강력하게 검출하고 정량화했습니다. 이 연구에서 40개의 화합물 중 35개에 태그를 지정한 프로토콜을, 나머지 5개의 화합물은 표준 곡선 방법으로 정량화하였다. 이전 작업은 아민과 인산염 그룹 사이에 분자내 염을 형성하여 유도체화를 억제한 반응 조건을 제안했다12. 반응 조건은 모든 40 화합물의 동시 유도에 대해 확인되지 않았다; 그러나 현재의 대안은 표준 곡선 방법으로 정량화하는 것입니다. 우리는 무세포 반응 혼합물에서이 기술을 시연하는 동안, 그것은 또한 가능성이 전체 세포 추출물에 적용 될 수있다, 따라서, 잠재적으로 세포 내 대사 산물 농도의 절대 정량화를 허용. 후자의 응용 프로그램은 생명 공학 및 인간의 건강에 중요한 질문의 다양한 관련이있다.

여기서 제시된 방법은 효모 S. 세레비시아12,13의전세포 추출물에 적용된 이전 기술(GSIST)을 기초로 하였다. 이 연구에서는, 우리는 모든 12 개의 뉴클레오티드 (xMP, xDP, xTP, x가 A, C, G 및 U인) 를 포함하여 검출되고 정량화 될 수있는 화합물의 수를 확장했습니다. 이 화합물의 추가는 중요한 생물학 연루가 있을 수 있었습니다. 예를 들어, 이들 뉴클레오티드는 CFPS 응용분야에서 관심있는 중심 과정 중 하나인 전사 및 번역 과정에 크게 관여하며, 보다 일반적으로 화합물은 다양한 생리학적 기능에서 중요하다. 또한, 오버플로우 대사를 검사할 때 중요한 대사산물인 아세트산을 검출할 수 있었습니다. 그러나, 우리는 여러 화합물에서 신호의 현저한 감소가 있었기 때문에 연구에 포함되지 않았다, 특히 니코틴 아데닌 디뉴클레오티드 감소 (NADH) 및 니코틴 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 감소 (NADPH) 때 아세트산 표준 혼합물에 첨가되었다. 아세트산은 612 μM의 검출의 높은 한계를 가졌고, 따라서 이러한 높은 수준에서 다른 대사 산물의 신호에 부정적인 영향을 미쳤다. 그럼에도 불구하고, 아세트산은 여전히 바이알에 아세트산만있는 표준 곡선을 만들어 샘플에서 검출되고 정량화 될 수 있습니다. 아세트산은 m/z 값 134.0, 보유 시간 5.78분, 선형 범위를 612 μM 내지 5000 μM(R2 = 0.986)으로 태그했을 때 12C-aniline으로태그하였다. 나머지 대사 산물은 서로의 이온 신호를 변경하지 않았고 CFPS 대사를 특성화하는 포괄적 인 혼합물을 나타낸다. 여기에 제시된 프로토콜은 중앙 탄소 및 에너지 대사에 관여하는 대사 산물로 제한됩니다. 따라서, 현재의 방법은 지방산 및 아미노산 대사와 같이 중요할 수 있는 다른 경로로부터 대사산물 풍부도를 측정할 수 없다.

종합하면, 당사는 글리콜분해, 펜토오스 인산염 경로, 트리카르복실산 주기, 에너지 대사 및 CFPS의 코팩터 재생에 관여하는 40가지 화합물의 특성화 및 절대 정량화를 위한 빠르고 강력한 프로토콜을 개발했습니다. 반응. 이 방법은 13C-aniline으로 태그가 지정된 내부 표준에 의존했으며 샘플은 12C-aniline으로태그가 지정되었습니다. 내부 표준 및 샘플 화합물은 이온 억제 효과를 공동으로 용출하고 제거하여 복잡한 대사 산물 혼합물에서 개별 대사 산물의 정확한 정량화를 가능하게했습니다. 우리는 무세포 반응 혼합물에서 검출 및 정량화될 수 있는 총 40가지 화합물(41, 아세트산을 포함하는 경우)을 확인하였다; 그러나, 대사 산물의 목록은 관심의 특정 생화확적인 프로세스로 더 확장되고 조정될 수 있었습니다. 따라서, 이 방법은 무세포 물질 대사를 특성화하는 견고하고 정확한 접근법을 제공하며, 이는 무세포 공정의 수율, 생산성 및 에너지 효율을 향상시키는 데 잠재적으로 중요하다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

기술된 일은 국립 암 학회 (https://www.cancer.gov/)에서 수상 번호 1U54CA210184-01을 통해 암 물질 대사의 물리학에 센터에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

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References

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