Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Abstract

Hücresiz protein sentezi (CFPS), proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Ancak, CFPS laboratuvar ötesine taşımak ve sadece zaman üretim teknolojisi yaygın ve standart haline gidiyor, biz bu sistemlerin performans sınırlarını anlamak gerekir. Bu soruya doğru, glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve CFPS reaksiyonlarında kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin ölçülmesi için sağlam bir protokol geliştirdik. Yöntem, 13C-aniline ile etiketlenmiş dahili standartları kullanırken, örnekteki bileşikler 12C-aniline ile türevleştirilmiştir. İç standartlar ve örnek, ters fazlı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC/MS) ile karıştırılarak analiz edildi. Bileşiklerin birlikte elüsyonu iyon bastırma ortadan kaldırarak, ortalama korelasyon katsayısının 0.988 olduğu 2-3 büyüklük sırası üzerinde metabolit konsantrasyonlarının doğru nicelemesini sağladı. Kırk bileşiğin beşi anilin ile etiketlenmemiş, ancak CFPS örneğinde hala tespit edilmiş ve standart bir eğri yöntemi ile ölçüldü. Kromatografik koşunun tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürer. Birlikte ele alındığında, tek bir LC/MS çalışmasında CFPS'de yer alan 40 bileşimi ayırmak ve doğru bir şekilde ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, hücresiz metabolizmayı karakterize etmek için kapsamlı ve doğru bir yaklaşımdır, böylece hücresiz sistemlerin verimini, üretkenliğini ve enerji verimliliğini anlayabilir ve geliştirebiliriz.

Introduction

Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS), geleneksel olarak canlı hücreler için ayrılmış bir uygulama olan protein ve kimyasalların üretimi için umut verici bir platformdur. Hücre içermeyen sistemler ham hücre özlerinden türetilmiştir ve hücre büyümesi ile ilişkili komplikasyonları ortadan kaldırır1. Buna ek olarak, CFPS bir hücre duvarının müdahalesi olmadan metabolitleri ve biyosentetik makine doğrudan erişim sağlar. Ancak, hücresiz süreçlerin performans limitleri temel bir anlayış eksik olmuştur. Metabolit nicelliği için yüksek iş yapma yöntemleri metabolizmanın karakterizasyonu için değerlidir ve metabolik hesaplamalı modellerin2,3,4'ünyapımı için çok önemlidir. Metabolit konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılan yaygın yöntemler nükleer manyetik rezonans (NMR), Fourier transform-kızılötesi spektroskopi (FT-IR), enzim bazlı tahliller ve kütle spektrometresi (MS)5,6,7 ,8. Ancak, bu yöntemler genellikle verimli bir kerede birden fazla bileşikleri ölçmek için onların yetersizlik ile sınırlıdır ve genellikle tipik hücre içermeyen reaksiyonlar daha büyük bir örnek boyutu gerektirir. Örneğin, enzim bazlı tahliller genellikle yalnızca bir çalışmada tek bir bileşiği ölçmek için kullanılabilir ve hücre içermeyen protein sentezreaksiyonları (genellikle 10-15 μL ölçekte çalıştırılır) gibi örnek boyutu küçük olduğunda sınırlıdır. Bu arada, NMR algılama ve nicelleştirme5için metabolitlerin yüksek bir bolluk gerektirir.  Bu eksikliklere doğru, kütle spektrometresi (LC/MS) ile birlikte kromatografi yöntemleri, yüksek duyarlılık ve aynı anda birden fazla türü ölçme yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar9; ancak, analitik karmaşıklık ölçülen türlerin sayısı ve çeşitliliği ile önemli ölçüde artmaktadır. Bu nedenle, LC/MS sistemlerinin yüksek iş verme potansiyelini tam olarak gerçekleştirecek yöntemler geliştirmek önemlidir. Numunedeki bileşikler sıvı kromatografi ile ayrılır ve kütle spektrometresi ile tanımlanır. Bileşiğin sinyali, iyonlaşmanın bileşikler arasında değişebileceği ve aynı zamanda numune matrisine de bağlı olabileceği konsantrasyon ve iyonizasyon verimliliğine bağlıdır.

Analizleri ölçmek için LC/MS kullanırken örnek ve standartlar arasında aynı iyonizasyon verimliliğini sağlamak zordur. Ayrıca, proton afinite ve polarite10sinyal bölünmesi ve heterojenite nedeniyle metabolit çeşitliliği ile nicel daha zor hale gelir. Son olarak, numunenin eş-eluting matris de bileşiklerin iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. Bu sorunları gidermek için, metabolitler kimyasal olarak türevlenebilir, LC/MS sistemleri tarafından ayırma çözünürlüğü ve hassasiyeti artırılarak, bazı durumlarda sinyal bölünmesi aynı anda azalırken10,11. Kimyasal türevleştirme, iyonizasyon verimliliğini artırmak için yük veya hidrofobiklik gibi fiziksel özelliklerini ayarlamak için belirli işlevsel metabolit gruplarını etiketleyerek çalışır11. Farklı fonksiyonel grupları (örneğin, aminler, hidroksiller, fosfatlar, karboksilik asitler vb.) hedeflemek için çeşitli etiketleme ajanları kullanılabilir. Anilin, böyle bir tür türtürasyon ajan, aynı anda birden fazla fonksiyonel grupları hedefler ve hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik bileşen ekler, bu nedenle onların ayırma çözünürlüğü ve sinyal12artırarak. Birlikte eluting matris iyon bastırma etkisi ele almak için, Yang ve iş arkadaşları standart 13C anilin izotopları ile etiketlenir ve örnek ile karıştırılır Grup Özel İç Standart Teknolojisi (GSIST) etiketleme dayalı bir teknik geliştirdi 12,13. Metabolit ve buna karşılık gelen iç standart, birlikte elute beri aynı iyonlaşma verimliliğine sahip, ve onların yoğunluk oranı deneysel örnek konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.

Bu çalışmada, CFPS reaksiyonlarında glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin saptanması ve ölçülmesi için bir protokol geliştirdik. Yöntem, ters fazLC/MS kullanarak metabolitleri etiketlemek, tespit etmek ve ölçmek için 12C-aniline ve 13C-aniline kullandığımız GSIST yaklaşımına dayanmaktadır. Tüm bileşiklerin doğrusal aralığı 0,988 ortalama korelasyon katsayısı ile 2-3 büyüklük sırasını kapsıyordu. Böylece, yöntem hücresiz metabolizma sorgulamak için sağlam ve doğru bir yaklaşımdır, ve muhtemelen bütün hücre özleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Aniline etiketleme için reaktiflerin hazırlanması

  1. pH 4.5'te 6 M aniline çözeltisi hazırlayın. Bir başlıkta çalışarak, 550 μL anilin il 337,5 l LCMS sınıfı su ve 112,5 μL 12 M hidroklorik asit (HCl) ile bir santrifüj tüpünde birleştirin. Girdap iyi ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Anilin 4 °C'de 2 ay saklanabilir.
    DİkKAT: Anilin son derece zehirlidir ve duman kaputunda çalışılmalıdır. Hidroklorik asit son derece aşındırıcıdır.
  2. pH 4.5'te 6 M 13C aniline çözeltisi hazırlayın. 250 mg 13C6-aniline 132 μL su ve 44 μL 12 M HCl. Vortex iyi ve 4 °C'de saklayın.
  3. Hazırlamak 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylkarbodiimid hidroklorür (EDC) çözeltisi. Etiketlenecek her numune için 10 μL suda 2 mg EDC çözünve girdap iyi.
    NOT: EDC çözeltisi reaksiyonla aynı gün hazırlanmalıdır. EDC anilin12ile bileşiklerin türevi için bir katalizör görevi görür.

2. Standartların hazırlanması

  1. LC/MS sınıfı suda çözünmüş tüm bileşiklerin ayrı stok çözeltilerini yapın(Tablo 1).
  2. Dahili standart stok çözeltisinin hazırlanması
    1. Nikotinamid adenin dinükleotid (NAD), nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADP), flavin adenin dinükleotid (FAD), asetil koenzim A (ACA) ve gliserol 3 fosfat (Gly3P) hariç tüm bileşikleri tüm bileşiklerin 2 mM stok çözeltisi oluşturun.
  3. 2 mM'lik bir stok çözümü oluşturmak için NAD, NADP, FAD, ACA ve Gly3P'yi uygun hacimlerle birleştirin.

3. Numunenin hazırlanması (Şekil 1)

  1. Reaksiyona eşit hacimde buz soğuğu %100 etanol ekleyerek hücre içermeyen protein sentezreaksiyonundaki proteinleri söndürün ve çökeltin. Numuneyi 12.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Numuneler bu noktada -80 °C'de saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir

4. Etiketleme reaksiyonu

  1. Numuneyi 12C-aniline çözeltisi ile etiketleme
    1. 6 μL numuneyi yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hacmi su yla birlikte 50°L'yegetirin.
      NOT: Birim örneklem boyutu belirli CFPS reaksiyonuna bağlı olabilir.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 12C-aniline çözeltisi ekleyin.
      NOT: Aniline çözeltisi iki aşamaya ayrılır. Reaksiyona eklemeden önce iyice karıştırın.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona triethylammine (TEA) 1.5 μL ekleyin.
      NOT: Trietitamin anilin etiketleme reaksiyonunu durduran ve bileşikleri stabilize eden çözeltinin pH'ını yükseltir.
      DİkKAT: Trietitamin toksiktir ve gözlerde ve solunum yollarında tahrişe neden olur.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
  2. İç standartları 13C-aniline çözeltisi ile etiketleme
    1. Son hacmi 50 μL olan iç stok çözeltisini 80 μM'ye seyreltin.
      NOT: İç standartların konsantrasyonu deneysel örneğe yakın seviyelere ayarlanabilir.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 13C-aniline çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona TEA 1.5 μL ekleyin.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
  3. Etiketli dahili standardı ve etiketli örneği birleştirme
    1. 25 μL 12C-aniline etiketli numuneyi 25 μL 13C-aniline etiketli standartla karıştırın.
    2. Otomatik numune leyici şişeye aktarın ve LC/MS yordamı ile analiz edin.
  4. Etiketlenmemiş metabolitler için standart bir eğri oluşturma
    1. Etiketlenmemiş metabolitlerin (NAD, NADP, FAD, ACA ve Gly3P) 320 μM, 80 μM, 20 μM ve 5 μM'lik son konsantrasyonlara 50 μL hacimli seyreltilmiş stok çözeltisi.
    2. 200 mg/mL EDC çözeltisi 5 μL ekleyin.
    3. 5 μL 12C-aniline çözeltisi ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafif sallayarak reaksiyon girdap.
    5. 2 saat sonra, çalkalayıcı tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona TEA 1.5 μL ekleyin.
    6. Santrifüj 13.500 x g 3 dk.
    7. Supernatant'ı otomatik numuneleyici şişesine aktarın ve LC/MS yordamı ile analiz edin.
      NOT: Etiketsiz metabolitler, benzer iyonizasyon verimliliğini korumak için örnek matrisi çoğaltmak için örnekle aynı yordamı izlerler.

5. LC/MS prosedürünün kurulumu

  1. Çözücülerin hazırlanması
    1. Asetik asit ile pH 4.75'e ayarlanmış 5 mM tri-bülalamin (TBA) sulu çözelti hazırlayın.
      NOT: Mobil fazdaki TBA, analitlerin iyi çözünürlük ve ayırma elde edilmesine yardımcı olur14.
    2. Asetonitril (ACN) içinde 5 mM TBA hazırlayın.
    3. %5 su ve %95 ACN ile yıkama solventi hazırlayın.
    4. %95 su ve %5 ACN ile temizleme çözücüsü hazırlayın.
  2. MS koşullarının kurulumu
    1. Kütle spektrometresini 520 °C sonda sıcaklığı, -0,8 kV negatif kapiller gerilim, 0,8 kV pozitif kapiller gerilimi ile negatif iyon moduna ayarlayın ve yazılımı 5 noktada/s'de veri elde etmek için ayarlayın.
    2. Belirtilen koni gerilimleri ve yük (m/z) değerleri üzerinde kütle ile her metabolit için seçili iyon kayıtlarını (SIR) ayarlayın. Bkz. Tablo 1.
  3. Üreticinin talimatlarına göre LC/MS başlatma
    1. 3 dk için solvent yöneticisi prime çözücü hatları.
    2. 5 devre için 15 s için prime yıkama çözücüsü (%5 su, %95 ACN) ve temizleme solventi (%95 su, %5 ACN).
    3. Örnek yöneticiyi 10 °C'ye ayarlayın.
    4. C18 (1,7μm, 2,1mm x 150mm) kolonu kurun ve 10 dk boyunca 0,3 mL/dk'da %100 ACN ile kolon başlatın.
    5. Tamponlu çözücüler kullanılmadan önce kolona %95 su ve %5 ACN'yi 0,3 mL/dk olarak 10 dakika süreyle koşullandırma.
    6. Kolonun %95 çözücü A (%5mM TBA sulu, pH 4,75) ve %5 çözücü B (ACN'de 5 mM TBA) 0,3 mL/dk'da 10 dk.'da koşullandırması.
    7. %95 solvent A ve %5 çözücü B ile başlayan bir degrade protokolü ayarlayın, 10 dakika içinde %70 solvent B'ye yükseltildi, 2 dakika içinde %100 solvent B'ye yükseltildi ve 3 dk için %100 solvent B'de tutuldu. , 5% çözücü B) üzerinde 1 dk ve sütun yeniden dengelemek için 9 dk tutun.
    8. Sütuna herhangi bir enjeksiyondan önce kolona degrade protokolü ile 3 kez koşullandırın.
  4. Enjekte numune ve standartlar
    1. Numunenin 5 μL'sini kolona enjekte edin ve 12C-aniline etiketli numune için uygun m/z iyon yoğunluklarını elde edin.
    2. Aynı numuneden 5 μL tekrar enjekte edin, ancak bu kez 13C-aniline etiketli standartlar için m/z iyon yoğunluklarını elde edin.
      NOT: LC/MS sistemimiz belirtilen SIR zaman pencerelerinde hem 12C hem de 13C m/z yoğunlukları elde edemez, çünkü belirtilen zaman penceresinde elde edilemeyecek kadar fazla veri dir. Bu nedenle, aynı örneği iki kez enjekte ediyoruz.
    3. Etiketsiz metabolit standartlarını en düşük konsantrasyondan en yükseğe enjekte edin ve uygun m/z iyon yoğunluklarını kaydedin.

6. Niceleme

  1. Dışa Aktarma yöntemi oluşturma
    1. Veri toplama yazılımında Dosya > Yeni Yöntem > Dışa Aktarma Yöntemi'niseçin.
    2. AnilineTagging_Dategibi bir Dosya adı belirtin.
    3. ASCII Dosyasını Dışa Aktar'ı denetleyin ve metin dosyasını dışa aktarmak için bir dizini seçin.
    4. RaporTürü'nde, Tümüne Göre Özet'iseçin.
    5. Delimiters'da, Sütun için bir ,. Satıriçin [cr][if] seçeneğini belirleyin.
    6. Tablo'da Dışa Aktar'ı seçin ve ardından Örnek Ad, Alan, Yükseklik, Miktar ve Birimleri içerecek şekilde Tabloyu Edit' iseçin.
    7. Dışa aktarma yöntemini kaydedin.
  2. Veri toplama yazılımlarını kullanarak metabolitlerin iç standartlarla ölçülmesi
    1. Örnek Kümeler sekmesinin altında, ilgili LC/MS çalıştır'ı sağ tıklatın ve > Kanallar olarak Görünüm'üseçin.
    2. Bir enjeksiyonun 13C-anilin iç standardı için tüm SIR kanallarını seçin, sağ tıklayın ve Gözden Geçir'iseçin.
    3. LC İşlem Yöntemi Düzeni penceresi otomatik olarak görünmüyorsa, Görünüm > İşlem Yöntemi Düzeni'negidin.
    4. İşlem Yöntemi Düzeni'nde, Tümleştirme sekmesine gidin ve ApexTrack'i algoritma olarak ayarlayın.
    5. Yumuşatma sekmesine gidin ve türü Ortalama ve yumuşatma düzeyini 13olarak ayarlayın.
      NOT: Tüm örneklerde tutarlı olduğu sürece herhangi bir yumuşatma düzeyi seçilebilir.
    6. MS Kanalı sekmesinde, MS 3D İşleme'yidevre dışı
    7. SIR kanal penceresinde, her tepeyi, her seferinde bir kanalı tümleştirin. Bir tepe tümleşik olduktan sonra Seçenekler > Sonuç'tan Dolgu'ya gidin ve tepenin ayrıntıları Bileşenler sekmesinde doldurulur.
    8. Tüm SIR kanalları değerlendirildikten sonra işleme yöntemini kaydedin ve pencereyi kapatın.
    9. 13C-anilin ve 12C-anilin etiketli örnek tüm SIR kanallarını seçin, sağ tıklayın ve İşlemseçin.
    10. İşlem kutusunu işaretleyin, belirtilen işleme yöntemini kullan'ıseçin ve yeni kaydedilen işleme yöntemini seçin. Ayrıca Dışa Aktarma kutusunu işaretleyin, belirtilen dışa aktarma yöntemini kullan'ı seçin ve daha önce oluşturulan kaydedilen dışa aktarma yöntemini seçin. Tamam'ı tıklatın.
    11. Dışa aktarılan metin dosyasını Excel ile açın ve bilinmeyen bileşiğin konsantrasyonunu şu kullanarak hesaplayın:
      Equation 1
      cx,i metabolit i için bilinmeyen örnek konsantrasyonu nerede, Ax,i bilinmeyen metabolit i entegre alandır, Astd,i metabolit i iç standardının entegre alandır, Cstd,i olduğunu metabolit i iç standardının konsantrasyonu ve D seyreltme faktörüdür.
  3. Etiketlenmemiş metabolitlerin standart eğri ile ölçülmesi
    1. Örnek Kümeler sekmesinin altında, ilgili LC/MS çalıştır'ı sağ tıklatın ve > Kanallar olarak Görünüm'üseçin.
    2. Bir enjeksiyonun etiketlenmemiş standartları için tüm SIR kanallarını seçin, sağ tıklayın ve Gözden Geçir'iseçin.
    3. LC İşlem Yöntemi Düzeni penceresi otomatik olarak görünmüyorsa, Görünüm > İşlem Yöntemi Düzeni'negidin.
    4. İşlem Yöntemi Düzeni'nde Tümleştirme sekmesine gidin ve ApexTrack'i algoritma olarak ayarlayın.
    5. Yumuşatma sekmesine gidin ve türü Ortalama ve yumuşatma düzeyini 13olarak ayarlayın.
      NOT: Tüm örneklerde tutarlı olduğu sürece herhangi bir yumuşatma düzeyi seçilebilir.
    6. MS Kanalı sekmesinde, MS 3D İşleme'yidevre dışı
    7. SIR kanal penceresinde, her tepeyi, her seferinde bir kanalı tümleştirin. Bir tepe tümleşik olduktan sonra Seçenekler > Sonuç'tan Dolgu'ya gidin ve tepenin ayrıntıları Bileşenler sekmesinde doldurulur.
    8. Tüm SIR kanalları değerlendirildikten sonra işleme yöntemini kaydedin ve pencereyi kapatın.
    9. Örnek Setleri sekmesinin altında, örnek setine sağ tıklayın ve Örnek Değiştir'iseçin.
    10. Yeni pencerede Tutar'ı seçin.
    11. İşlem yönteminden kopyayı seçin ve yeni kaydedilen işlem yöntemini seçin.
    12. Her şişe için her metabolitin konsantrasyonuna girin ve üniteyi her bileşen (veya ilgili birim) için <μM olarak girin ve Tamam'ıseçin.
    13. Örnek kümesini yeniden seçin, sağ tıklatın, > Kanallar olarak görüntüle.
    14. Standartlar için etiketlenmemiş metabolitlerin tüm SIR kanallarını seçin, sağ tıklayın ve İşlem'iseçin.
    15. İşlem kutusunu işaretleyin ve belirtilen işleme yöntemini kullan'ıseçin. Uygun işleme yöntemini seçin ve Tamam'ıtıklatın.
    16. Örnekler için etiketlenmemiş tüm metabolitler için SIR kanallarını seçin, sağ tıklayın ve İşlem'iseçin.
    17. İşlem kutusunu işaretleyin, belirtilen işleme yöntemini kullan'ı seçin ve yeni kaydedilmiş işleme yöntemini seçin. Ayrıca Dışa Aktarma kutusunu işaretleyin, belirtilen dışa aktarma yöntemini kullan'ı seçin ve daha önce oluşturulan kaydedilen dışa aktarma yöntemini seçin. Tamam'ıtıklatın.
    18. Etiketlenmemiş metabolitleri standart eğriyle ölçün ve sonuçları belirtilen dizine bir metin dosyasına aktarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kavram kanıtı olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden E. coli tabanlı CFPS sistemindeki metabolitleri ölçmek için protokolü kullandık.  CFPS reaksiyonu (14 μL) söndürüldü ve etanol ile deproteinize edildi. CFPS örneği daha sonra 12C-aniline ile etiketlenirken, standartlar 13C-aniline ile etiketlendi. Etiketlenen örnek ve standartlar daha sonra birleştirildi ve LC/MS'ye enjekte edildi (Şekil 1). Protokol, iç standartlar kullanılarak merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 metaboliti tespit ve ölçtü, anilin ile etiketlenmemiş metabolitlerin 5'i için standart bir eğri de geliştirilmiştir(Şekil 2). Bu yollarda yer alan çeşitli metabolitler fosforilasyonlu şekerler, fosfokarboksilik asitler, karboksilik asitler, nükleotitler ve kofaktörlerden oluşan bir sınıftı. Anilin ile türevleştirme ters faz kromatografi12kullanarak daha etkili ayırma kolaylaştırdı hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik moiety tanıttı. Buna ek olarak, yöntem tek bir LC/MS çalışmasında glikoz 6-fosfat ve fruktoz 6-fosfat gibi yapısal izomer çiftlerin ayrılmasını sağladı. Deneyden önce her bileşiğin yük (m/z) üzerindeki kütlesi ve bekletme süresi, bir seferde bir bileşiğin 1 mM'si enjekte edilerek ve kütle spektrumunun boşla karşılaştırılması yla tespit edilmiştir(Tablo 1).

Tüm bileşikler için algılama ve doğrusallık aralığı, 0,10 μM ile 400 μM arasında değişen standart bir eğri üretilerek tahmin edilmiştir(Tablo 2). Tüm bileşikler için ortalama korelasyon katsayısı (R2)0.988 idi ve çoğu bileşik 3-büyüklük sırası doğrusal bir aralık vardı. Üç bileşiğin önemli doygunluk etkileri vardı, özellikle 0.1 μM ile 25 μM arasında doğrusal bir aralıkta olan alfa-ketoglutarate isocitrate ve sitrat da 100 μM'nin üzerinde doygunluk etkileri vardı.

Figure 1
Şekil 1: Aniline etiketleme için iş akışının şeması. Hücre içermeyen protein sentezreaksiyonu deproteinize edilir ve 12C-aniline ile etiketlenirken, standart bir stok karışımı 13C-aniline ile etiketlenir. Her iki karışım daha sonra 1:1 hacimsel oranda karıştırılır ve LC /MS tarafından analiz edilir.

Figure 2
Şekil 2: 40 metabolit için seçili iyon kromatogramları çakışıyor. 40 metabolitin 40 μM standart karışımının tek bir LC/MS çalışmasından kütle kromatogramı. Zirveler, her bileşik için bekletme süresi ve m/z değerleri ile tanımlanmıştır. Tam bileşik adlar ve bunların kısaltmaları Tablo 1'delistelenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tepe Numarası Metabolit Kısaltma KEGG Kimliği Bekletme Süresi (dk) 12C m/z 13C m/z etiket dışı m/z Cv MS Türleri
1 Gliserol 3-fosfat Gly3P C00093 3.85 153 10 M – H2O – H
2 Nikotinamid adenin dinükleotid Nad C00003 3.96 698 10 M + Cl – H
3 Glikoz Glc C00031 4.06 289.9 296 15 M + A + Cl - H
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 5.41 364 370 10 M + A – H
5 Fruktoz 6-fosfat F6P C00085 5.48 334 340 10 M + A – H
6 Guanozin monofosfat Gmp C00144 5.57 437.05 443 10 M + A – H
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 5.58 304 310 10 M + A – H
8 Sitidin monofosfat CMP C00055 5.59 397.09 403 10 M + A – H
9 Laktat Lac C00186 5.77 164.05 170 10 M + A – H
10 Adenozin monofosfat Amp C00020 5.85 421.1 427.1 10 M + A – H
11 Uridine monofosfat Ump C00105 5.88 398.07 404 10 M + A – H
12 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat NADP C00006 6.39 724 10 M - H2O – H
13 3-Fosfoglisik asit 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M + A – H2O – H
14 Sitidin difosfat Cdp C00112 6.72 477 483 10 M + A – H
15 Guanozin difosfat Gsyih C00035 6.87 517 523 10 M + A – H
16 Adenozin difosfat Adp C00008 6.94 501 507 10 M + A – H
17 Uridin difosfat Udp C00015 6.97 478 484 10 M + A – H
18 Flavin adenin dinükleotid Fad C00016 7.03 784.15 15 M – H
19 Fruktoz 1,6-bifosfat F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A – H2O – H
20 Glukonat 6-fosfat 6 PG C00345 7.11 425.1 437 10 M + 2A – H
21 Nikotinamid adenin dinükleotid azaltılmış NADH C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O – nikotinamid – H
22 Glikoz 6-fosfat G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M + 2A – H
23 Riboz 5-fosfat R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M + 2A – H
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M + 2A – H
25 Sitidin trifosfat CTP C00075 7.84 557 563 5 M + A – H
26 Guanozin trifosfat Gtp C00044 7.93 597 603 5 M + A – H
27 Oxalacetate OAA C00036 7.94 281 293 25 M + 2A – H
28 Alfa-ketoglutarate Akg C00026 7.95 295 307.1 15 M + 2A – H
29 Uridin trifosfat Utp C00075 7.97 558 564 10 M + A – H
30 Adenozin trifosfat Atp C00002 8.03 581 587 15 M + A – H
31 Fumarate FUM C00122 8.09 265 277.1 10 M + 2A – H
32 Piruvat Pyr C00022 8.09 162 168 25 M + A – H
33 Malate MAL C00149 8.09 283.06 295.15 10 M + 2A – H
34 D-gliserinaldehit 3-fosfat Boşluk C00118 8.09 319 331.1 5 M + 2A – H
35 Asetil-koenzim A Aca C00024 8.16 790 10 M – H2O – H
36 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış NADPH C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A – nikotinamid – H
37 Fosfoenolpyruvate Pep C00074 8.28 317 329.1 20 M + 2A – H
38 Succinate SUCC C00042 8.64 267.07 279.1 15 M + 2A – H
39 Isokitrat ICIT C00311 10.13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 Sitrat Cıt C00158 10.46 416.1 434.06 20 M + 3A – H

Tablo 1: Metabolitlerin tanımlanması ve etiketleme sonuçları. Her bileşiğin karşılık gelen tepe numarası, bekletme süresi, etiketlenmemiş için m/z değeri, 12C ve 13C etiketli ve MS türleri. MS Species, A Aniline etiketi anlamına gelir.

Tepe No Metabolit Kısaltma KEGG Kimliği Konsantrasyon (mM) SD (n = 3) Algılama Sınırı (μM) Doğrusal Aralık Sınırı (μM) R^2
1 Gliserol 3-fosfat Gly3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 Nikotinamid adenin dinükleotid Nad C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 Glikoz Glc C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 Sedoheptulose 7-fosfat S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 Fruktoz 6-fosfat F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 Guanozin monofosfat Gmp C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 Ribulose 5-fosfat RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 Sitidin monofosfat CMP C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 Laktat Lac C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 Adenozin monofosfat Amp C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 Uridine monofosfat Ump C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat NADP C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-Fosfoglisik asit 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 Sitidin difosfat Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 Guanozin difosfat Gsyih C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 Adenozin difosfat Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 Uridin difosfat Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 Flavin adenin dinükleotid Fad C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 Fruktoz 1,6-bifosfat F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 Glukonat 6-fosfat 6 PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 Nikotinamid adenin dinükleotid azaltılmış NADH C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 Glikoz 6-fosfat G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 Riboz 5-fosfat R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 Erythrose 4-fosfat E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 Sitidin trifosfat CTP C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 Guanozin trifosfat Gtp C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 Oxalacetate OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 Alfa-ketoglutarate Akg C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 Uridin trifosfat Utp C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 Adenozin trifosfat Atp C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 Fumarate FUM C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 Piruvat Pyr C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 Malate MAL C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 D-gliserinaldehit 3-fosfat Boşluk C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 Asetil-koenzim A Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış NADPH C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 Fosfoenolpyruvate Pep C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 Succinate SUCC C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 Isokitrat ICIT C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 Sitrat Cıt C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

Tablo 2: Temsili cfps örneğinde metabolit nicelleştirme. Her metabolitin konsantrasyonu ve standart sapma. Algılama sınırı, doğrusallık aralığı ve standart eğrilerden tanımlanan korelasyon katsayısı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücresiz sistemlerin hücre duvarı yoktur, bu nedenle karmaşık numune hazırlamaya gerek kalmadan metabolitlere ve biyosentetik makinelere doğrudan erişim vardır. Ancak, hücreiçermeyen reaksiyon sistemlerini nicel olarak sorgulamak için kapsamlı ve sağlam protokoller geliştirmek için çok az çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada, hücresiz reaksiyon karışımlarında ve potansiyel olarak tüm hücre ekstrelerinde metabolitleri ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Hücreiçermeyen reaksiyonlarda veya tüm hücre özlerinde bulunanlar gibi karmaşık karışımlarda metabolitlerin bireysel olarak sayısallaştırılması çeşitli nedenlerle zordur. Bu nedenler arasında merkezi kimyasal çeşitliliktir. Bu karışımlarda aynı anda bulunan fonksiyonel gruplar dizisi (örneğin, karboksilik asitler, aminler, fosfatlar, hidroksiller, vb.) analitik karmaşıklığı büyük ölçüde artırır. Bunu atlatmak için, metabolit karışımlarına hidrofobik bileşenleri tanıtmak için 13C dahili standartları ile birlikte bir aniline türevleştirme yöntemi kullandık. Bu yöntemi kullanarak, tek bir LC/MS çalışmasında hücresiz bir reaksiyonda 40 metaboliti sağlam bir şekilde tespit ettik ve ölçtük. Protokol bu çalışmada 40 bileşiğin 35'ini işaretederken, geri kalan 5 bileşik standart eğri yöntemi ile ölçüldü. Daha önceki çalışmalarda reaksiyon koşullarının amin ve fosfat grubu arasında intramolekülertuz oluşturduğu ileri sürülmüştür. 40 bileşiğin aynı anda türemiş olarak tevdii için reaksiyon koşulları belirlenemedi; ancak, mevcut alternatif standart bir eğri yöntemi ile nicelleştirme olduğunu. Biz hücresiz bir reaksiyon karışımı bu tekniği gösterdi iken, aynı zamanda büyük olasılıkla tüm hücre özleri uygulanabilir, böylece potansiyel hücre içi metabolitleri konsantrasyonlarının mutlak nicel izin. İkinci uygulama biyoteknoloji ve insan sağlığı önemli sorular çeşitli ilgi vardır.

Burada sunulan yöntem maya s. cerevisiae12,13bütün hücre özleri uygulanan bir önceki teknik (GSIST) dayanmaktadır. Bu çalışmada, 12 nükleotitin tümü (xMP, xDP, xTP, x'in A, C, G ve U olduğu) dahil olmak üzere tespit edilebilen ve ölçülebilen bileşiklerin sayısını genişlettik. Bu bileşiklerin eklenmesi önemli biyolojik etkileri olabilir. Örneğin, bu nükleotidler cfps uygulamalarında ilgi merkezi süreçlerden biri olan transkripsiyon ve çeviri süreçlerinde yoğun olarak yer alır ve daha genel olarak bileşikler çeşitli fizyolojik fonksiyonlarda önemlidir. Buna ek olarak, taşma metabolizmasını incelerken önemli bir metabolit olan asetik asidi tespit etmeyi başardık. Ancak, birden fazla bileşiğin sinyalin önemli bir azalma vardı çünkü çalışmaya dahil etmedi, özellikle nikotinamid adenin dinükleotid azaltılmış (NADH) ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat azaltılmış (NADPH) asetik asit standart karışıma eklendi. Asetik asit 612 μM'lik yüksek bir algılama limitine sahipti, bu nedenle bu yüksek seviyelerde diğer metabolitlerin sinyalleri üzerinde olumsuz bir etki yaratmıştı. Buna rağmen, asetik asit hala tespit edilebilir ve şişe sadece asetik asit ile standart bir eğri oluşturarak örneklerde ölçülebilir. Asetik asit 134.0 m/z değerine, tutma süresi 5.78 dk ve 12C-anilin ile etiketlendiğinde 612 μM ile 5000 μM (R2 = 0,986) arasında doğrusal bir aralık vardı. Kalan metabolitler birbirlerinin iyon sinyalini değiştirmedi ve CFPS metabolizmasını karakterize edecek kapsamlı bir karışımı temsil etti. Burada sunulan protokol merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan metabolitlerle sınırlıdır. Bu nedenle, mevcut yöntem, yağ asidi ve amino asit metabolizması gibi önemli olabilecek diğer yollardan metabolit bolluğunu ölçmek mümkün değildir.

Birlikte ele alındığında, glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve CFPS kofaktör rejenerasyonu dahil 40 bileşiklerin karakterizasyonu ve mutlak nicelleştirme için hızlı, sağlam bir protokol geliştirdi Reaksiyon. Yöntem 13C-anilin ile etiketlenmiş dahili standartlara güvenirken, örnek 12C-anilin ile etiketlendi. İç standartlar ve örnek bileşikler, kompleks metabolit karışımlarında bireysel metabolitlerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan iyon bastırma etkilerini birlikte eluted ve ortadan kaldırmış. Hücreiçermeyen reaksiyon karışımında tespit edilebilen ve ölçülebilen toplam 40 bileşik (asetik asit de dahil olmak üzere 41) belirledik; ancak, metabolitlerin listesi daha da genişletilebilir ve ilgi belirli biyokimyasal sürecine doğru ayarlanabilir. Böylece, yöntem hücresiz süreçlerin verim, verimlilik ve enerji verimliliğini artırmak için potansiyel olarak kritik olan hücresiz metabolizmayı karakterize etmek için sağlam ve doğru bir yaklaşım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (https://www.cancer.gov/) 1U54CA210184-01 ödül numarası ile Kanser Metabolizması Fiziği Merkezi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü'nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Tags

Biyokimya Sayı 152 hücresiz protein sentezi sıvı kromatografi-kütle spektrometresi aniline etiketleme merkezi karbon enerji metabolizması iç standart metabolik ağ izotopik etiketleme
Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter