Summary
Le colture organoidi derivate dal paziente dell'adenocarcinoma duttale pancreatico sono un modello tridimensionale rapidamente stabilito che rappresenta i compartimenti delle cellule tumorali epiteliali con alta fedeltà, consentendo la ricerca traslazionale in questa malignità letale. Qui, forniamo metodi dettagliati per stabilire e propagare gli organoidi, nonché per eseguire saggi biologici pertinenti utilizzando questi modelli.
Abstract
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra le neoplasie più letali. Recentemente, sono stati descritti metodi di coltura organoide di nuova generazione che consentono la modellazione tridimensionale (3D) di questa malattia. I modelli organoidi (PDO) derivati dal paziente possono essere isolati sia da campioni chirurgici che da piccole biopsie e si formano rapidamente nella coltura. È importante sottolineare che i modelli organoidi conservano le alterazioni genetiche patogene rilevate nel tumore del paziente e sono predittivi della risposta al trattamento del paziente, consentendo così studi traslazionali. Qui, forniamo protocolli completi per adattare il flusso di lavoro della coltura tissutale per studiare modelli 3D, a matrice incorporata e organoidi. Vengono descritti in dettaglio i metodi e le considerazioni per l'isolamento e la propagazione degli organoid PDAC primari. Inoltre, descriviamo come i supporti organoidi su misura sono preparati e la qualità controllata in laboratorio. Infine, descriviamo i saggi per la caratterizzazione a valle dei modelli organoidi come l'isolamento degli acidi nucleici (DNA e RNA) e il test farmacologico. È importante sottolineare che forniamo considerazioni critiche per l'implementazione della metodologia organoide in un laboratorio di ricerca.
Introduction
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una malattia letale caratterizzata da diagnosi tardiva nella maggior parte dei pazienti, mancanza di terapie efficaci e un basso tasso di sopravvivenza globale a 5 anni che rimane inferiore al 10%1. Solo il 20% dei pazienti viene diagnosticato con una malattia localizzata adatta per l'intervento chirurgico curativo2,3. I restanti pazienti sono tipicamente trattati con una combinazione di agenti chemioterapici che sono efficaci in una minoranza di pazienti4,5. Per rispondere a queste pressanti esigenze cliniche, i ricercatori stanno lavorando attivamente su strategie di diagnosi precoce e sullo sviluppo di terapie più efficaci. Per accelerare la traduzione clinica di importanti scoperte, gli scienziati stanno impiegando modelli murini geneticamente ingegnerizzati, xenotrapianto derivati dal paziente, linee di cellule monostrato e, più recentemente, modelli organoidi6.
La coltura organoide epiteliale tridimensionale utilizzando il fattore di crescita e le ricche condizioni Wnt-ligand per stimolare la proliferazione delle cellule progenitrici non trasformate sono state descritte per la prima volta per l'intestino del topo7 e sono state rapidamente adattate al normale tessuto pancreatico umano8. Oltre al normale tessuto duttale, la metodologia organoide consente l'isolamento, l'espansione e lo studio del PDAC8umano. È importante sottolineare che il metodo supporta la creazione di organoidi da campioni chirurgici, così come biopsie di aghi fini e core, permettendo ai ricercatori di studiare tutte le fasi della malattia9,10. È interessante notare che gli organoidi derivati dal paziente riassumono sottotipi trascrittomici tumorali ben descritti e possono consentire lo sviluppo di piattaforme di medicina di precisione9,11.
Gli attuali protocolli organoidi per il PDAC consentono il successo dell'espansione di oltre il 70% dei campioni di pazienti da pazienti chemio-naive9. Qui presentiamo i metodi standard impiegati dal nostro laboratorio per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Altre metodologie organoidi PDAC sono state descritte12,13 ma nessun confronto di questi metodi è stato accuratamente eseguito. Poiché questa tecnologia è relativamente nuova e avanza rapidamente, prevediamo che questi protocolli continueranno ad evolversi e migliorare; tuttavia i principi della manipolazione dei tessuti e della coltura organoide continueranno ad essere utili.
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Protocol
Tutta la raccolta di tessuti umani per uso di ricerca è stata rivista e approvata dal nostro Internal Review Board (IRB). Tutti i seguenti protocolli vengono eseguiti in condizioni asettiche in un ambiente di laboratorio di coltura dei tessuti mammiferi.
1. Preparazione dei supporti
- Preparazione dei supporti condizionati.
NOTA: I supporti organoidi pancreatici umani richiedono abbondanti fattori di crescita e sostanze nutritive, nonché il completamento dei supporti condizionati per fornire una stimolazione sufficiente della crescita per l'espansione degli organiidi. Entrambi i mezzi condizionati descritti di seguito sono preparati da linee cellulari disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali). Per protocolli e materiali completi, si prega di fare riferimento ai siti web dei produttori.- Produrre supporti condizionati R-spondin1 secondo il protocollo del produttore.
- In primo luogo, espandere le cellule 293T che esprimono R-spondin1 utilizzando metodi di selezione antibiotici appropriati (zeocina) in presenza di siero abbondante (10%). Quando si producono supporti condizionati, ritirare e lavare via la selezione di antibiotici e siero in modo che nessun antibiotico e siero sono presenti nel supporto condizionato finale. È importante sottolineare che i supporti condizionati devono essere sterilizzati dopo la raccolta (0,2 m) per evitare la contaminazione incrociata.
- Conservare i supporti condizionati con aliquota a 4 gradi centigradi per l'uso a breve termine (entro 6 mesi) o a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine (più di 6 mesi). I cicli di congelamento-disgelo dovrebbero essere evitati.
- Produrre supporti condizionati L-Wnt-3A secondo il protocollo del produttore.
- In primo luogo, espandere le cellule L-M(TK-) che esprimono L-Wnt-3A utilizzando metodi di selezione antibiotici appropriati (G-418) in presenza di siero abbondante (10%). Quando si producono supporti condizionati, ritirare e lavare via la selezione antibiotica in modo che nessun antibiotico è presente nel supporto condizionato finale; tuttavia, mantenere il siero durante la coltura e il condizionamento. È importante sottolineare che i supporti condizionati raccolti devono essere sterilizzati (0,2 m) per evitare la contaminazione incrociata.
- Conservare il supporto condizionato con aliquota a 4 gradi centigradi per un uso a breve termine, o -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine. I cicli di congelamento-disgelo dovrebbero essere evitati.
- Per il controllo della qualità, eseguire un saggio TOPFLASH per testare l'attività Wnt di R-spondin1 e il supporto condizionato L-Wnt-3A da solo e in combinazione secondo un protocollo pubblicato in precedenza14.
- Produrre supporti condizionati R-spondin1 secondo il protocollo del produttore.
- Preparazione dei supporti basali: utilizzare supporti basali per la preparazione di supporti organoidi completi e passaggi di lavaggio per il lavoro organoide. Supplemento avanzato DMEM/F-12 con Glutamina ad una concentrazione finale di 1x, HEPES (10 mM), e Penicillin/Streptomycin (100 U/mL). Conservare i supporti basali a 4 gradi centigradi.
- Organoide Preparazione completa dei supporti: Integrare il supporto basale con supporti condizionati da R-spondin1 ad una concentrazione finale del 10% v/v, l--Wnt-3A con una concentrazione finale del 50% v/v, Human EGF (50 ng/mL), Human FGF (100 ng/mL), Human Gastrin I (10 nM), Mouse Noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), integratore B27 (1x), Nicotinamide (10 mM), N-acetylcysteine (1,25 mM) e Primocin (100 g/mL).
- Per gli isolamenti organoidi primari, le colture organoidi scongelate e le colture a partire da singole cellule, includono l'inibitore della chinasi Di Rho Y-27632 ad una concentrazione finale di 10,5 M.
- Preparare l'organoide umano completo sul ghiaccio e conservare a 4 gradi centigradi per l'uso entro un mese. Per questo motivo, si consiglia una preparazione settimanale fresca dei media.
2. Isolamento degli organoidi PDAC
NOTA: Scongelare la soluzione di estratto di membrana seminterrato (BME) (fattore di crescita ridotto; vedere Tabella dei materiali) sul ghiaccio in un ambiente a 4 gradi centigradi (frigo o stanza fredda) per almeno 12 h prima dell'uso. Incubare le piastre di coltura dei tessuti per la coltura organoide in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per almeno 12 h prima dell'uso.
- Raccogliere e trasportare un campione di tumore rimosso chirurgicamente per la ricerca in una soluzione di stoccaggio tampone per mantenere la vitalità del tessuto. Utilizzare supporti basali o una soluzione di archiviazione dei tessuti disponibile in commercio.
- Procedere per isolare gli organoidi il prima possibile dopo aver ricevuto il campione. I tessuti possono essere immagazzinati nella soluzione di stoccaggio fino a 24 ore dopo la chirurgia e producono ancora organoidi.
- Una volta in laboratorio, trasferire il tumore in un piatto di coltura dei tessuti di 10 cm e rimuovere la soluzione di stoccaggio.
- Durante la gestione del tessuto con pinze metalliche, macinare il tumore con un #10 bisturi in piccoli frammenti di 1 mm3 o più piccoli. Frammenti più grandi richiederà più tempo per digerire; pertanto, mirano a generare dimensioni di frammenti di tessuto omogeneo. Se il tessuto è già disaggregato o in frammenti di dimensioni inferiori a 1 mm3, saltare questo passaggio.
- Trasferire i frammenti di tessuto in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di supporti basali. Mescolare invertendo il tubo più volte. Centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min. Dopo lo spin, rimuovere il supporto basale con attenzione per evitare di perdere frammenti di tessuto.
- Al tubo contenente i frammenti di tessuto aggiungere 9 mL di supporti basali e 1 mL di 10x Gentle Collagenase/Hyaluronidase soluzione. Per evitare l'agglomeramento delle cellule durante la digestione, integrare questa soluzione con 20 -L di 10 mg/mL di DNAse I soluzione. Mescolare invertendo il tubo più volte.
- Incubare la digestione ezimatica a 37 gradi centigradi su un nutatore o un rotatore. Per un'adeguata miscelazione durante la digestione, i frammenti di tessuto devono essere costantemente in movimento attraverso la soluzione.
NOTA: La tempistica per questa dissociazione enzimatica del tumore deve essere determinata empiricamente per ogni esemplare. Una digestione di successo del tumore è caratterizzata dalla diminuzione delle dimensioni dei frammenti di tessuto fino a quando non sono chiaramente distinguibili ad occhio nudo. Concomitante, l'opacità della soluzione aumenterà man mano che vengono rilasciati frammenti di tessuto microscopico. - Dopo 30 min, togliere il tubo conico dall'incubatrice a 37 gradi centigradi e osservare. Se i frammenti di tessuto sono ancora chiaramente visibili, continuare la dissociazione a 37 gradi centigradi con una miscelazione costante. Ripetere questa osservazione ogni 30 min fino a quando la maggior parte o tutti i frammenti di tessuto sono stati dissociati. A seconda della severità della miscelazione così come la dimensione e la quantità di frammenti tumorali, questo passaggio può richiedere appena 30 min per piccoli campioni o fino a 12 h per campioni di tumore più grandi.
- Una volta completata la dissociazione enzimatica, centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min. Dopo lo spin, un pellet cellulare dovrebbe essere visibile e il supernatale dovrebbe essere chiaro, indicando che tutte le cellule sono state filate fuori soluzione. In caso contrario, ripetere la rotazione.
- Rimuovere con attenzione il supernatante per evitare di perdere il pellet cellulare. Lavare immediatamente le cellule con supporti basali da 10 ml mescolando delicatamente i tubi con l'inversione. Centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min. rimuovere con attenzione il supporto basale per evitare di perdere le cellule e ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta per un totale di due lavaggi.
- Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutti i supporti basali con attenzione e posizionare il tubo sul ghiaccio per 5 min.
- In questo momento, mettere un'aliquota di supporto organoide completo in un bagno d'acqua 37 gradi centigradi per pre-riscaldare.
- Mescolare il pellet cellulare con ghiaccio freddo BME mantenendo il tubo sul ghiaccio. La densità di seeding dovrebbe essere elevata per l'isolamento organoide. Per un piccolo pellet (volume da 50 dollari) utilizzare 200 L di BME, mentre per un grande pellet (volume di 200 dollari) utilizzare 800 L di BME. Mescolare le celle e BME sul ghiaccio utilizzando una pipetta p200 fino a quando la soluzione appare omogenea, evitando di creare bolle nella soluzione.
- Avvistare una cupola da 100 l'una al centro di un pozzo di un piatto preriscaldato di 12 pozzetto utilizzando una pipetta p200. Ripetere l'operazione fino a soppertutto fino a quando tutta la soluzione BME non è stata erogata. Trasferire con cura la piastra sull'incubatrice a 37 gradi centigradi per consentire al gel BME di solidificare.
- Dopo 10 minuti, recuperare la piastra e aggiungere 1 mL di supporti organoidi preriscaldati per pozzo. Distribuisci i media sul lato del pozzo per evitare interruzioni della cupola BME.
- Osservare i frammenti cellulari utilizzando un microscopio a coltura tissutale invertito utilizzando una lente 4x in campo luminoso.
NOTA: Le cellule singole e i frammenti di tessuto microscopico devono essere chiaramente visibili. Un isolamento riuscito è caratterizzato dalla comparsa di più di 10 organoidi dopo 24-48 h; la cultura dovrebbe essere confluente entro una settimana. Poiché i campioni tumorali sono eterogenei, alcuni isolamenti organoidi sono più impegnativi in quanto solo pochi organoidi crescono per bene, come mostrato nella Figura 1. In questo caso, consentire alla coltura di continuare fino a due settimane per massimizzare il numero di cellule disponibili per il passaggio. Per tenere conto del consumo e dell'evaporazione dei media durante la coltura, ricaricare le colture con 200 -L di supporti organoidi preriscaldati ogni 5 giorni.
3. Passaggio degli organoidi PDAC
- Recuperare la piastra dall'incubatrice della coltura tissutale. Con un sollevatore di cellule sterile, sollevare delicatamente la cupola BME in modo che sia galleggiante nel supporto completo. Evitare di raschiare il fondo del pozzo in modo da non rimuovere le cellule monostrato attaccate alla plastica, in quanto si tratta in genere di fibroblasti.
- Con una pipetta p1000, trasferire con attenzione la cupola e il supporto BME in un tubo conico da 15 mL. Ripetere questo passaggio per ogni pozzo contenente organoidi.
- Lavare delicatamente ogni pozzo che è stato raccolto con 1 mL di supporti basali freddi e trasferirli al tubo da 15 mL contenente gli organoidi.
- Mescolare accuratamente la soluzione e gli organoidi con una pipetta p1000 e girare verso il basso a 200 x g per 5 min. Dopo la filatura, uno strato BME contenente organoidi in sospensione e un pellet organoide apparirà nella parte inferiore del tubo. Rimuovere con attenzione il supernatante, evitando la perdita dello strato BME/organoide. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Aggiungere 10 mL di soluzione di recupero delle celle ghiacciate (CRS) al tubo e mescolare accuratamente per inversione. Questo depolimerà le matrici proteiche della BME gelata a 4 gradi centigradi. Incubare sul ghiaccio per 30 min mescolando ogni 3 min per inversione. Se disponibile, posizionare il tubo su un miscelatore rotante in una stanza fredda o in un frigorifero di 4 gradi centigradi per 30 min.
- Dopo l'incubazione di 30 min, girare verso il basso a 200 x g per 5 min. Il pellet organoide dovrebbe essere evidente mentre lo strato BME dovrebbe essere andato. Se lo strato BME è diminuito di dimensioni ma ancora visibile, incubare per ulteriori 30 min a 4 gradi centigradi con miscelazione e ripetizione di spin.
- Una volta che il BME è stato depolimerato, rimuovere il CRS lasciando dietro di sé il pellet organoide. Lavare gli organoidi con supporti basali da 10 mL mescolando con inversione. Girare verso il basso a 200 x g per 5 min e rimuovere il supernatante. Mettere il tubo con il pellet organoide sul ghiaccio per almeno 5 min.
- Facoltativamente, se si desidera la preparazione di una singola cellula, incubare gli organoidi con 3 mL di trypsin integrati con 30 :L di 10 mg/mL di soluzione DNAse I per evitare l'agglomerazione delle cellule durante la digestione.
- Incubare la reazione antinziolatica a 37 gradi centigradi con una leggera inversione mescolando ogni 2 min fino a 10 min. Monitor e confermare la dissociazione a singola cellula di successo al microscopio a campo luminoso.
- Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 10 mL di supporti basali ghiacciati e girare verso il basso a 200 x g per 5 min.
- Lavare le cellule con supporti basali da 10 ml mescolando con una leggera inversione. Ruotare verso il basso a 200 x g per 5 min e rimuovere il supernatante e ripetere il lavaggio ancora una volta. Posizionare il tubo con il pellet cellulare sul ghiaccio per almeno 5 min.
NOTA: Si consiglia di eseguire questo passaggio ogni 3-5 passaggi durante la manutenzione regolare degli organoidi per generare coltura omogenea con un gran numero di organoidi.
- Aggiungere il BME ghiacciato al pellet cellulare e mescolare delicatamente sul ghiaccio fino a quando la soluzione è omogenea utilizzando una pipetta p200. Evitando di generare bolle nella miscela, pipette su e giù almeno 5–10x, ponendo la punta della pipetta vicino al fondo del tubo per aiutare a rompere meccanicamente gli organoidi. Come guida, utilizzare 4-6 x il volume del pellet BME/cellulare in modo che il rapporto di divisione non sia più di 1:2 da un passaggio all'altro.
- Avvistare una cupola da 100 l'una al centro di un pozzo di un piatto preriscaldato di 12 pozzetto utilizzando una pipetta p200; ripetere fino a quando tutta la soluzione BME è stata erogata. Trasferire con cura la piastra sull'incubatrice a 37 gradi centigradi per consentire al gel BME di solidificare. Dopo 10 minuti, recuperare la piastra e aggiungere 1 mL di supporti organoidi preriscaldati per pozzo. Distribuisci i media sul lato del pozzo per evitare interruzioni della cupola BME.
- Gli organiidi dovrebbero riformarsi e iniziare a crescere entro 24 h. Le colture organoidi sono tipicamente accompagnate da 7-10 giorni a seconda della densità di coltura e della proliferazione cellulare. Se necessario, ricaricare le colture con 200-L di supporti organoidi preriscaldati ogni 5 giorni per compensare l'esaurimento e l'evaporazione del fattore di crescita.
4. Congelamento e scongelamento degli organoidi PDAC
- Per congelare gli organoidi, procedere alla raccolta degli organoidi e depolimerare il BME come descritto nei passaggi da 3.1 a 3,7.
- Al pellet cellulare, aggiungere 1 mL di supporti di congelamento, mescolare delicatamente e trasferire la miscela in un crioviale pre-etichettato.
- Mettere il crioviale in un contenitore di congelamento per mantenere una diminuzione costante della temperatura sicura e mettere in un congelatore -80 gradi centigradi. Dopo 24-48 h, trasferire le fiale congelate allo stoccaggio di azoto liquido. Gli organiidi possono essere crioconservati per mesi o anni utilizzando questo metodo.
- Per scongelare gli organoidi, recuperare il crioviale congelato dallo stoccaggio di azoto liquido. Trasportare la fiala ghiacciata sul ghiaccio secco nella stanza della coltura dei tessuti.
- Collocare il crioviale congelato nel bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per scongelare rapidamente gli organoidi e trasferire il contenuto della fiala in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di supporti basali riscaldati a temperatura ambiente.
- Girare verso il basso a 200 x g per 5 min e rimuovere il supernatante. Mettere il tubo con il pellet organoide sul ghiaccio per almeno 5 min.
- Procedere a risospendere in BME e placcare gli organoidi come descritto nei passaggi da 3.9–3.11.
NOTA: le colture organoidi si riprendono lentamente dopo un ciclo di congelamento/scongelamento, pertanto le colture possono essere coltivate fino a due settimane prima di passare.
5. Caratterizzazione degli organoidi PDAC
NOTA: La caratterizzazione degli organoidi deve essere eseguita su una coltura stabilita dopo diversi passaggi per diminuire il rischio di contaminazione da tipi di cellule non epiteliali come fibroblasti e cellule immunitarie.
- Estrazione di acido nucleico dagli organoidi PDAC
- Organidi piastra su un pozzo 12 dedicato all'estrazione di acido nucleico. Piastra non superiore a 100 L di BME per pozzo. Per un'adeguata resa di DNA/RNA, piastrare almeno 2-4 pozzi per coltura. Crescere organoidi fino a 5 giorni fino a quando le colture sono vicine ai confluenti ma prive dell'eccessivo detriti cellulari che si accumula nelle culture a lungo termine.
- Recuperare la piastra dall'incubatrice a 37 gradi centigradi e rimuovere completamente ogni traccia di supporti organoidi completi, lasciando solo la cupola BME contenente gli organoidi sulla piastra.
- Aggiungere a ogni pozzo 900 l di reagente fenolo acido (vedi Tabella dei materiali)e mescolare accuratamente utilizzando una pipetta p1000 fino a quando la soluzione diventa omogenea. Il BME sarà completamente disciolto nel reagente fenolo acido e gli organoidi saranno lyse dopo una breve incubazione di 5 min.
AVVISO: il fenolo acido è una sostanza chimica pericolosa che può causare ustioni chimiche. Maneggiare con cura utilizzando protezioni e tecniche adeguate. - Trasferire la soluzione omogenea in un tubo da 2 mL e aggiungere 200 l di cloroformio. Incubare 5 min e centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
- Procedere all'estrazione dell'RNA e del DNA secondo il protocollo del produttore. L'RNA può essere estratto dalla fase acquosa, mentre il DNA può essere estratto dalla fase interfase e organica. Una volta purificati e quantificati, l'RNA e il DNA isolati da diversi pozzi della stessa cultura possono essere raggruppati per aumentare la resa.
NOTA: (1) Sebbene si consiglia vivamente di utilizzare questo metodo di estrazione dell'acido nucleico per l'RNA, esistono molti buoni metodi per isolare il DNA dalle cellule coltivate. (2) Per accertare la presenza di cellule tumorali all'interno della coltura organoide, si consiglia di sequenziare il DNA utilizzando il metodo di sequenziamento di prossima generazione preferito per identificare le mutazioni all'interno dei geni del marchio di riferimento PDAC (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Farmacotipizzazione di organoidi PDAC
- Isolare singole celle dagli organoidi come descritto in precedenza nei passaggi da 3.1 a 3,8. Per massimizzare il numero di cellule, raccogliere almeno 10 pozzi confluenti di una piastra di 12 pozzi
- Risospendere le singole cellule in un supporto completo di 1 mL di organoide umano. La presenza di piccoli grumi di cellule (2-10 cellule) è accettabile, tuttavia i grumi cellulari più grandi influenzeranno negativamente l'analisi a valle.
- Contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato e registrare la fattibilità delle celle. Calcolare il numero totale di celle e cellule vitali presenti nella sospensione da 1 mL.
- Per i test terapeutici, piastra 1.000 cellule vitali per pozzo di un 384 bene piastra. Per una piastra 384 bene stimiamo che useremo 400.000 cellule vitali (calcolate per 400 pozzi).
- Preparare le cellule per la placcatura mescolando sul ghiaccio 800 ll di BME con 7,2 mL di supporti completi organoidi contenenti le cellule. Tenere il composto sul ghiaccio e la piastra 20 l per pozzo di un pozzo 384. Utilizzare una pipetta a 12 canali e un serbatoio conservati sul ghiaccio per placcare in modo efficiente le cellule. Per evitare un'eccessiva evaporazione dalla piastra, i pozzi esterni possono essere utilizzati come serbatoio (60 gradi L PBS o acqua per pozzo), ma questo porterà a una perdita di 76 pozzi sperimentali.
- Ruotare la piastra verso il basso a 100 x g per 1 min in un secchio a battente. In questo modo il piccolo volume di 20 L e gli organoidi si depositano nella parte inferiore della piastra.
- Collocare la piastra nell'incubatrice a coltura tissutale a 37 gradi centigradi per consentire la formazione di organoidi. Dopo 24 h, verificare la presenza di organoidi utilizzando un microscopio a campo luminoso.
- Procedere al dosso composti terapeutici disciolti in DMSO sulla piastra utilizzando una stampante di farmaci o uno strumento equivalente. Testare ogni dose di droga in almeno pozzi triplicati. Per eseguire un'analisi efficace dose-risposta, determinare la gamma di dose per ogni farmaco empiricamente, a partire da una dose bassa, inefficace, e termina con una dose elevata in cui si osserva il massimo effetto. Esempi di intervalli di dose per composti chemioterapici sono stati recentemente pubblicati9.
- Esporre le cellule ai composti terapeutici per 3-5 giorni.
- Facoltativamente, alla fine del saggio, immaginare la piastra per valutare l'effetto terapeutico sulla dimensione degli organoidi, numero e morfologia.
- Valutare la fattibilità utilizzando 20 - l per pozzo di reagente di viabilità delle cellule di luminescenza (vedi Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore. Un luminometro sarà necessario per l'acquisizione dei dati e un software grafico per l'analisi dei dati.
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Representative Results
Per illustrare le sfide associate all'isolamento degli organoidi dal PDAC, mostriamo la creazione di una coltura organoide derivata dal paziente da un piccolo campione di tumore ipocellulare. Dopo la placcatura iniziale, solo pochi organoidi erano visibili per bene, come mostrato Figura 1. Gli organiidi sono stati autorizzati a crescere più grande nel corso della durata di 2 settimane e sono stati passaggi secondo il nostro protocollo per stabilire una cultura più robusta, come mostrato nel passaggio iniziale e tardi 1 immagini rappresentative (Figura 1). È importante notare che gli organoidi cistici più grandi osservati nel tardo isolato primario sono stati facilmente suddivisi in frammenti più piccoli durante la miscelazione di organoidi con BME ghiacciato, come descritto al punto 2.13.
Per dimostrare l'esito del protocollo pharmacotyping, abbiamo preparato singole cellule da un organoid pDAC rappresentativo consolidato e in rapida crescita, come descritto in questo protocollo. 1.000 cellule vitali sono state placcate per bene e hanno permesso di recuperare oltre 24 h prima che gli agenti chemioterapici citotossici, Gemcitabine e Paclitaxel, fossero dosati. Abbiamo eseguito un saggio di risposta alla dose di 9 punti in triplice copiandosi con una dose bassa di 100 pM e terminando con una dose elevata di 2 M. Dopo un trattamento di 5 giorni, sono state scattate immagini rappresentative per veicoli (DMSO), 2 Gemcitabine M e 2 pozzi trattati da Paclitaxel (Figura 2). Immediatamente dopo aver scattato le foto, la fattibilità delle cellule è stata valutata utilizzando il reagente di vitalità delle cellule di luminescenza e tracciata utilizzando un software grafico (Figura 2).
Figura 1: Immagini rappresentative vengono visualizzate per un isolamento organoide PDAC e dopo il primo passaggio. Sia i punti temporali anticipati (1-3 giorni) che i punti temporali in ritardo (7-10 giorni) sono mostrati per illustrare la crescita organoide nel tempo. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi della risposta alla dose. (Sinistra) Analisi rappresentativa della risposta alla dose ottenuta utilizzando una coltura organoide PDAC stabilita, con la deviazione standard dei triplicati visualizzati come barre di errore. (A destra) Immagini che illustrano l'effetto alla fine del trattamento di analisi del veicolo (DMSO) e 2 Gemcitabine M e 2.M Paclitaxel. Barra di scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui presentiamo i protocolli attuali per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Il nostro attuale tasso di successo nell'stabilire la cultura organoide è superiore al 70%; pertanto, questi metodi non sono ancora stati perfezionati e si prevede che miglioreranno ed evolvono nel tempo. Si dovrebbe considerare importante la dimensione del campione, in quanto il PDAC ha una bassa cellularità neoplastica. Di conseguenza, piccoli esemplari conterranno poche cellule tumorali e genereranno solo una manciata di organoidi. Inoltre, molti pazienti ricevono chemioterapia e/o trattamento neoadjuvant a base di chemioterapia prima dell'intervento chirurgico15. Se il trattamento è efficace per un particolare paziente, il tessuto tumorale può essere privo di cellule vitali. L'acquisizione di campioni di pazienti chemio-ingenui è preferibile per l'ottimizzazione iniziale di questi metodi, ma questo non è sempre possibile. È interessante notare che abbiamo scoperto che il tempo di ischemia dopo la rimozione chirurgica del tessuto tumorale non è un criterio importante per il successo dell'isolamento organoide, purché il campione venga elaborato entro 24 h.
L'adenocarcinoma duttale pancreatico è una malattia caratterizzata da una forte reazione desmoplastica e dalla deposizione di una densa matrice stromale. Mentre gli organoidi sono un ottimo strumento per il rapido isolamento e l'espansione del compartimento epiteliale, il modello non riassume il complesso stroma del PDAC. Altre metodologie come gli xenografi derivati dal paziente16 o la coltura dell'interfaccia del liquido dell'aria17 consentono un compartimento stroforme, tuttavia possono essere difficili da espandere rapidamente. Quando si sceglie un sistema modello, il ricercatore deve considerare attentamente i punti di forza e di debolezza di ogni6.
La biologia eterogenea di questa malattia influisce sull'istituzione degli organiidi, poiché alcuni organoidi derivati dal paziente crescono molto bene nelle nostre condizioni, mentre altri sono molto più lenti rispetto al confronto. I protocolli di cui sopra descrivono una condizione ricca di ligando Wnt per isolare ed espandere tutti gli organoidi di derivazione del paziente, altri hanno dimostrato che alcuni tumori del paziente sono in grado di crescere in assenza di supporti condizionati Wnt11,12. Saranno necessari ulteriori test per determinare se l'utilizzo di una serie di condizioni dei media migliora la corretta creazione di organoidi, come è stato recentemente dimostrato per gli organoidi tumorali ovarici18. Questo approccio multiplex è tuttavia limitato dal basso numero di cellule tumorali che possono essere isolate da piccoli campioni di pazienti. Inoltre, i normali organoidi duttili non trasformati possono derivare da un isolamento organoide, in particolare se il tessuto tumorale è adiacente al tessuto normale9. Per ridurre il rischio di contaminazione organoide normale, campioni di tessuto più grandi possono essere suddivisi in piccoli frammenti indipendenti utilizzando differenze morfologiche come il sangue vascolarizzato (il sangue è visibile) rispetto alle regioni ipovascolari e dei noduli duri rispetto ai tessuti molli.
I metodi e i protocolli qui descritti sono gli attuali approcci standard utilizzati nel nostro laboratorio per l'isolamento degli organiidi e dovrebbero essere testati e adattati per ogni ambiente di laboratorio. Per esempio, la dissociazione enzimatica (passaggi da 2.6 a 2.9) del tessuto tumorale è particolarmente importante da ottimizzare. Piccole differenze di attrezzature (nutator vs mixer rotatore) possono portare a tempi significativamente diversi per questo passaggio. Inoltre, la dissociazione tissutale può essere messa a punto aumentando o riducendo la concentrazione della miscela Collagenase/Hyaluronidase. Occorre prestare attenzione a non trattare tutti i campioni nello stesso modo. Ad esempio, in alcuni casi gli organoidi possono essere isolati dal liquido ascite da pazienti PDAC avanzati senza dissociazione meccanica o enzimatica.
Il sequenziamento del DNA è l'attuale gold standard per determinare la presenza o l'assenza di organoidi tumorali poiché il PDAC è guidato da frequenti mutazioni in KRAS, TP53, SMAD4 e CDKN2A. L'analisi trascrizione può rivelare diversi sottotipi di tumore, mentre la farmacotipizzazione può scoprire vulnerabilità terapeutiche specifiche del paziente9. Questi protocolli consentono ai ricercatori PDAC di sviluppare una propria libreria di organoidi derivati dal paziente e di profilare la biologia di questi modelli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati per il supporto dell'UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, membri del laboratorio Lowy, e del Dipartimento di Chirurgia UC San Diego, Divisione di Oncologia Chirurgica. AML è generosamente sostenuta da NIH CA155620, un SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), e donatori del Fondo per la cura del cancro pancreatico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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