Summary
Patientenabgeleitete organoide Kulturen des pankreatischen duktodalen Adenokarzinoms sind ein schnell etabliertes dreidimensionales Modell, das epitheliale Tumorzellkompartimente mit hoher Genauigkeit darstellt und translationale Forschung entoliert. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Etablierung und Vermehrung von Organoiden sowie zur Durchführung relevanter biologischer Assays mit diesen Modellen.
Abstract
Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) gehört zu den tödlichsten Malignitäten. Kürzlich wurden Organoidkulturmethoden der nächsten Generation beschrieben, die die dreidimensionale (3D) Modellierung dieser Krankheit ermöglichen. Patientenabgeleitete Organoidmodelle (g.U.) können sowohl aus chirurgischen Proben als auch aus kleinen Biopsien isoliert werden und sich schnell in der Kultur bilden. Wichtig ist, dass Organoidmodelle die pathogenen genetischen Veränderungen, die im Tumor des Patienten festgestellt wurden, erhalten und die Behandlungsreaktion des Patienten vorhersagen und so translationale Studien ermöglichen. Hier bieten wir umfassende Protokolle zur Anpassung des Gewebekultur-Workflows zur Untersuchung von 3D-, Matrix-Eingebetteten, Organoidmodellen. Wir beschreiben Methoden und Überlegungen zur Isolierung und Verbreitung primärer PDAC-Organoide. Darüber hinaus beschreiben wir, wie maßgeschneiderte organoide Medien im Labor hergestellt und qualitätskontrolliert werden. Schließlich beschreiben wir Assays zur nachgelagerten Charakterisierung der Organoidmodelle wie Isolierung von Nukleinsäuren (DNA und RNA) und Arzneimitteltests. Wichtig ist, dass wir kritische Überlegungen für die Implementierung der organoiden Methodik in einem Forschungslabor liefern.
Introduction
Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) ist eine tödliche Erkrankung, die durch eine späte Diagnose bei den meisten Patienten, einen Mangel an wirksamen Therapien und eine daraus resultierende niedrige 5-Jahres-Gesamtüberlebensrate gekennzeichnet ist, die unter 10%1bleibt. Nur 20% der Patienten werden mit einer lokalisierten Krankheit diagnostiziert, die für den kurativen chirurgischen Eingriff geeignet ist2,3. Die übrigen Patienten werden in der Regel mit einer Kombination von Chemotherapeutika behandelt, die bei einer Minderheit der Patienten wirksam sind4,5. Um diesen dringenden klinischen Bedürfnissen gerecht zu werden, arbeiten die Forscher aktiv an Früherkennungsstrategien und der Entwicklung wirksamerer Therapien. Um die klinische Übersetzung wichtiger Entdeckungen zu beschleunigen, verwenden Wissenschaftler gentechnisch veränderte Mausmodelle, von Patienten abgeleitete Xenografts, monolayer Zelllinien und zuletzt Organoidmodelle6.
Dreidimensionale epitheliale Organoidkultur mit Wachstumsfaktor und Wnt-Ligand-reichen Bedingungen zur Stimulierung der Proliferation von untransformierten Vorläuferzellen wurden zuerst für den Mausdarmbeschrieben 7 und wurden schnell an normales menschliches Bauchspeicheldrüsengewebe angepasst8. Zusätzlich zu normalen duktalen Gewebe, Organoid-Methodik ermöglicht die Isolierung, Expansion, und Studie des menschlichen PDAC8. Wichtig ist, dass die Methode die Etablierung von Organoiden aus chirurgischen Proben sowie Feine und Kernnadelbiopsien unterstützt, so dass Forscher alle Stadien der Krankheit9,10untersuchen können. Interessanterweise rekapitulieren patientenabgeleitete Organoide gut beschriebene Tumortranskriptomik-Subtypen und können die Entwicklung von Präzisionsmedizinplattformen9,11ermöglichen.
Aktuelle Organoidprotokolle für PDAC ermöglichen die erfolgreiche Erweiterung von mehr als 70% der Patientenproben von chemonaiven Patienten9. Hier stellen wir die Standardmethoden unseres Labors zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Andere ORGANoide PDAC-Methoden wurden beschrieben12,13 aber es wurde kein Vergleich dieser Methode durchgeführt. Da diese Technologie relativ neu ist und schnell voranschreitet, erwarten wir, dass sich diese Protokolle weiterentwickeln und verbessern werden; die Prinzipien der Gewebehandhabung und der organoiden Kultur werden jedoch weiterhin nützlich sein.
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Protocol
Alle menschlichen Gewebesammlungen für forschungstechnische Verwendung wurden von unserem Internal Review Board (IRB) überprüft und genehmigt. Alle folgenden Protokolle werden unter aseptischen Bedingungen in einer Laborumgebung für Säugetiergewebekultur durchgeführt.
1. Medienvorbereitung
- Konditionierte Medienvorbereitung.
HINWEIS: Die menschlichen Pankreasorganoid-Medien erfordert reichlich Wachstumsfaktoren und Nährstoffe sowie konditionierte Mediensupplementierung, um ausreichende Wachstumsstimulation für Organoid-Expansion zu bieten. Beide nachstehend beschriebenen konditionierten Medien werden aus handelsüblichen Zelllinien hergestellt (siehe Materialtabelle). Vollständige Protokolle und Materialien finden Sie auf den Websites der Hersteller.- Produzieren Sie R-spondin1 konditionierte Medien nach dem Herstellerprotokoll.
- Erstens, erweitern Sie die 293T-Zellen, die R-Spondin1 mit geeigneten Antibiotika (Zeocin) Selektionsmethoden in Gegenwart von reichlich Serum (10%) exemitenlassen. Bei der Herstellung von konditionierten Medien die Antibiotikaauswahl und das Serum so zurückziehen und wegwaschen, dass in den endgültigen konditionierten Medien kein Antibiotikum und kein Serum vorhanden sind. Wichtig ist, dass die konditionierten Medien nach der Entnahme (0,2 m) gefiltert werden müssen, um eine Kreuzkontamination zu verhindern.
- Aliquoted konditionierte Medien bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch (innerhalb von 6 Monaten) oder bei -20 °C für Langzeitlagerung (mehr als 6 Monate) lagern. Frost-Tau-Zyklen sollten vermieden werden.
- Produzieren Sie L-Wnt-3A konditionierte Medien nach dem Herstellerprotokoll.
- Erstens, erweitern Sie die L-M(TK-)Zellen, die L-Wnt-3A mit geeigneten Antibiotika-Selektionsmethoden (G-418) in Gegenwart von reichlich Serum (10%) exemitenlassen. Bei der Herstellung von konditionierten Medien die Antibiotikaauswahl so zurückziehen und wegwaschen, dass in den endgültigen konditionierten Medien kein Antibiotikum vorhanden ist; halten Sie jedoch das Serum während der gesamten Kultivierung und Konditionierung. Wichtig ist, dass die gesammelten konditionierten Medien gefiltert werden müssen (0,2 m), um Kreuzkontaminationen zu verhindern.
- Bewahren Sie das aliquoted konditionierte Medium bei 4 °C für den kurzfristigen Einsatz oder -20 °C für die Langzeitlagerung auf. Frost-Tau-Zyklen sollten vermieden werden.
- Zur Qualitätskontrolle führen Sie einen TOPFLASH-Test durch, um die Wnt-Aktivität von R-spondin1 und den L-Wnt-3A konditionierten Medien allein und in Kombination nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll14zu testen.
- Produzieren Sie R-spondin1 konditionierte Medien nach dem Herstellerprotokoll.
- Basalmedienvorbereitung: Verwenden Sie Basalmedien zur Vorbereitung vollständiger organoider Medien sowie Waschschritte für die organoide Arbeit. Ergänzung advanced DMEM/F-12 mit Glutamin bei einer Endkonzentration von 1x, HEPES (10 mM) und Penicillin/Streptomycin (100 U/ml). Basalmedien bei 4 °C lagern.
- Organoid Vollständige Medienzubereitung: Ergänzen Sie die Basalmedien mit R-spondin1 konditionierten Medien bei einer Endkonzentration von 10% v/v, L-Wnt-3A konditionierte Medien bei einer Endkonzentration von 50% v/v, Human EGF (50 ng/mL), Human FGF (100 ng/mL), Human Gastrin I (10 nM), Mouse Noggin (100 ng/mL), A83-01 (500 nM), B27 Supplement (1x), Nicotinamid (10 mM), N-Acetylcystein (1,25 mM) und Primocin (100 g/mL).
- Für primäre organoide Isolierungen, aufgetaute organoide Kulturen und Kulturen, die mit einzelnen Zellen beginnen, gehören Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 in einer Endkonzentration von 10,5 m.
- Bereiten Sie das humane organoide Gesamtmedium auf Eis vor und lagern Sie es bei 4 °C für den Einsatz innerhalb eines Monats. Aus diesem Grund empfehlen wir eine frische wöchentliche Medienaufbereitung.
2. Isolierung von PDAC-Organoiden
HINWEIS: Die Kellermembranextraktlösung (BME) (Wachstumsfaktor reduziert; siehe Materialtabelle)auf Eis in einer Umgebung von 4 °C (Kühlschrank oder Kühlraum) mindestens 12 h vor gebrauchen auftauen. Inkubieren Sie die Gewebekulturplatten für die organoide Kultur in einem 37 °C Inkubator für mindestens 12 h vor der Verwendung.
- Sammeln und transportieren Sie eine chirurgisch entfernte Tumorprobe für die Forschung in einer gepufferten Speicherlösung, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Verwenden Sie Basalmedien oder eine handelsübliche Gewebespeicherlösung.
- Fahren Sie fort, Organoide so schnell wie möglich nach Erhalt der Probe zu isolieren. Gewebe kann in der Speicherlösung bis zu 24 h nach der Operation gelagert werden und dennoch Organoide ergeben.
- Einmal im Labor, übertragen Tumor auf eine 10 cm Gewebekulturschale und entfernen Lagerungslösung.
- Beim Umgang mit dem Gewebe mit metallischen Zangen, zerkleinern Sie den Tumor mit einem #10 Skalpell in kleine Fragmente von 1 mm3 oder kleiner. Größere Fragmente werden länger dauern, um zu verdauen; daher darauf abzielen, homogene Gewebefragmentgrößen zu erzeugen. Wenn Gewebe bereits disaggregiert oder in kleiner als 1 mm3 Fragmente ist, überspringen Sie diesen Schritt.
- Übertragen Sie die Gewebefragmente in ein 15 ml konisches Rohr, das 10 ml Basalmedien enthält. Mischen Sie, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie nach dem Drehen die Basalmedien sorgfältig, um gewebefragmente zu vermeiden.
- In die Röhre, die die Gewebefragmente enthält, fügen Sie 9 ml Basalmedien und 1 ml 10x Sanfte Kollagennase/Hyaluronidase-Lösung hinzu. Um eine Verklumpung der Zellen während der Verdauung zu vermeiden, ergänzen Sie diese Lösung mit 20 l von 10 mg/ml DNAse I Lösung. Mischen Sie, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.
- Inkubieren Sie die enzymatische Verdauung bei 37 °C auf einem Nutator oder Rotator. Für eine ausreichende Vermischung während der Verdauung müssen sich die Gewebefragmente ständig durch die Lösung bewegen.
HINWEIS: Der Zeitpunkt für diese enzymatische Dissoziation des Tumors muss empirisch für jede Probe bestimmt werden. Eine erfolgreiche Verdauung des Tumors ist durch die Abnahme der Größe der Gewebefragmente gekennzeichnet, bis sie mit bloßem Auge nicht klar erkennbar sind. Gleichzeitig wird die Opazität der Lösung zunehmen, wenn mikroskopische Gewebefragmente freigesetzt werden. - Nach 30 min das konische Rohr aus dem 37 °C-Inkubator entfernen und beobachten. Wenn die Gewebefragmente noch deutlich sichtbar sind, setzen Sie die Dissoziation bei 37 °C bei konstanter Durchmischung fort. Wiederholen Sie diese Beobachtung alle 30 min, bis die meisten oder alle Gewebefragmente getrennt wurden. Abhängig von der Stringenz des Mischens sowie der Größe und Menge der Tumorfragmente kann dieser Schritt für kleine Proben nur 30 min oder bei größeren Tumorproben bis zu 12 h dauern.
- Sobald die enzymatische Dissoziation abgeschlossen ist, zentrieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min. Nach dem Spin sollte ein Zellpellet sichtbar sein und der Überstand sollte klar sein, was darauf hinweist, dass alle Zellen aus der Lösung gesponnen wurden. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die Drehung.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um den Verlust des Zellpellets zu vermeiden. Waschen Sie die Zellen sofort mit 10 ml Basalmedien, indem Sie die Rohre sanft mit Inversion mischen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig die Basalmedien, um Zellverluste zu vermeiden und wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal für insgesamt zwei Waschungen.
- Nach der zweiten Wäsche alle Basalmedien vorsichtig entfernen und 5 min auf Eis legen.
- Zu diesem Zeitpunkt legen Sie ein Aliquot von organoiden Komplettmedien in ein 37 °C Wasserbad, um vorzuwärmen.
- Mischen Sie das Zellpellet mit eiskaltem BME, während Sie die Röhre auf Eis halten. Die Saatdichte sollte für die Organoidisolation hoch sein. Für ein kleines Pellet (Volumen von 50 l) verwenden Sie 200 l BME, während für ein großes Pellet (ca. 200 L Volumen) 800 l BME verwenden. Mischen Sie die Zellen und BME auf Eis mit einer p200 Pipette, bis die Lösung homogen erscheint, während zu vermeiden, Blasen in der Lösung zu schaffen.
- Entdecken Sie eine 100-L-Kuppel in der Mitte eines Brunnens einer vorgewärmten 12-Well-Platte mit einer p200-Pipette. Wiederholen Sie dies, bis die gesamte BME-Lösung ausgegeben wurde. Übertragen Sie die Platte vorsichtig auf den 37 °C-Inkubator, damit sich das BME-Gel erstarren lässt.
- Nach 10 min, holen Sie die Platte und fügen Sie 1 ml vorgewärmte Organoid komplette Medien pro Brunnen. Geben Sie die Medien an der Seite des Brunnens, um Störungen der BME-Kuppel zu vermeiden.
- Beobachten Sie die Zellfragmente mit einem invertierten Gewebekulturmikroskop mit einer 4x Linse im hellen Feld.
HINWEIS: Einzelne Zellen und mikroskopische Gewebefragmente sollten deutlich sichtbar sein. Eine erfolgreiche Isolation zeichnet sich durch das Auftreten von mehr als 10 Organoiden nach 24-48 h aus; die Kultur sollte innerhalb einer Woche konfluent sein. Da Tumorproben heterogen sind, sind einige organoide Isolierungen schwieriger, da nur wenige Organoide pro Brunnen wachsen, wie in Abbildung 1dargestellt. Lassen Sie in diesem Fall die Kultur für bis zu zwei Wochen fortsetzen, um die Anzahl der Zellen zu maximieren, die für die Passage verfügbar sind. Um den Medienkonsum und die Verdunstung während der Kultur zu berücksichtigen, füllen Sie die Kulturen alle 5 Tage mit 200 L vorgewärmten organoiden Gesamtmedien auf.
3. Passage von PDAC-Organoiden
- Holen Sie die Platte aus dem Gewebekultur-Inkubator. Mit einem sterilen Zellheber heben Sie die BME-Kuppel vorsichtig so an, dass sie in den gesamten Medien schwebt. Vermeiden Sie das Abkratzen des Bodens des Brunnens, um keine Monolayer-Zellen zu entfernen, die am Kunststoff befestigt sind, da es sich in der Regel um Fibroblasten handelt.
- Mit einer p1000 Pipette die BME-Kuppel und das Medium vorsichtig auf ein 15 ml konisches Rohr übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden organoidhaltigen Brunnen.
- Waschen Sie jeden Brunnen, der mit 1 ml kaltem Basalmedium geerntet wurde, sanft und übertragen Sie ihn auf das 15 ml-Rohr mit den Organoiden.
- Die Lösung und die Organoide mit einer p1000 Pipette gründlich mischen und bei 200 x g 5 min nach unten drehen. Nach dem Spinnen erscheint eine BME-Schicht, die Organoide in Suspension und ein Organoidpellet enthält, an der Unterseite des Rohres. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um den Verlust der BME/Organoidschicht zu vermeiden. Legen Sie die Röhre auf Eis.
- 10 ml eiskalte Zellrückgewinnungslösung (CRS) in das Rohr geben und durch Inversion gründlich mischen. Dadurch werden die Proteinmatrizen des gegelten BME bei 4 °C depolymerisiert. Auf Eis für 30 min inkubieren, während alle 3 min durch Inversion gemischt wird. Falls verfügbar, legen Sie das Rohr 30 min auf einen rotierenden Mischer in einem kühlen Raum oder 4 °C Kühlschrank.
- Nach der 30 min Inkubation bei 200 x g für 5 min nach unten drehen. Das Organoidpellet sollte sichtbar sein, während die BME-Schicht weg sein sollte. Wenn die BME-Schicht verkleinert, aber immer noch sichtbar ist, brüten Sie für weitere 30 min bei 4 °C mit Mischen und Wiederholen spin.
- Sobald das BME depolymerisiert wurde, entfernen Sie das CRS, das das Organoidpellet hinterlässt. Waschen Sie die Organoide mit 10 ml Basalmedien, indem Sie sie mit Inversion mischen. Drehen Sie bei 200 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Legen Sie die Röhre mit dem Organoidpellet mindestens 5 min auf Eis.
- Optional, wenn eine Einzelzellpräparation gewünscht wird, inkubieren Sie die Organoide mit 3 ml Trypsin, ergänzt mit 30 l von 10 mg/ml DNAse I Lösung, um Klumpen bildung der Zellen während der Verdauung zu vermeiden.
- Inkubieren Sie die enzymatische Reaktion bei 37 °C mit sanfter Inversionsmischung alle 2 min für bis zu 10 min. Überwachen und bestätigen Sie eine erfolgreiche Einzelzelldissoziation unter Hellfeldmikroskop.
- Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, fügen Sie 10 ml eiskalte Basalmedien hinzu und drehen Sie sich bei 200 x g für 5 min.
- Waschen Sie Zellen mit 10 ml Basalmedien durch Mischen mit sanfter Inversion. Drehen Sie bei 200 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche noch einmal. Legen Sie das Rohr mit dem Zellpellet mindestens 5 min auf Eis.
HINWEIS: Wir empfehlen, diesen Schritt alle 3-5 Passagen während der regelmäßigen Wartung der Organoide durchzuführen, um eine homogene Kultur mit einer großen Anzahl von Organoiden zu erzeugen.
- Eiskaltes BME in das Zellpellet geben und vorsichtig auf Eis mischen, bis die Lösung mit einer p200 Pipette homogen ist. Während sie vermeiden, Blasen in der Mischung zu erzeugen, Pipette auf und ab mindestens 5-10x, platzierung die Spitze der Pipette in der Nähe der Unterseite des Rohres, um mechanisch zu helfen, die Organoide aufzubrechen. Als Leitfaden verwenden Sie das 4-6-fache des Volumens des BME/Zellpellets so, dass das Spaltverhältnis nicht mehr als 1:2 von einem Durchgang zum anderen beträgt.
- Mit einer p200-Pipette eine 100-L-Kuppel in der Mitte eines Brunnens einer vorgewärmten 12-Well-Platte erkennen; bis die gesamte BME-Lösung ausgegeben wurde. Übertragen Sie die Platte vorsichtig auf den 37 °C-Inkubator, damit sich das BME-Gel erstarren lässt. Nach 10 min, holen Sie die Platte und fügen Sie 1 ml vorgewärmte Organoid komplette Medien pro Brunnen. Geben Sie die Medien an der Seite des Brunnens, um Störungen der BME-Kuppel zu vermeiden.
- Organoide sollten sich reformieren und innerhalb von 24 h wachsen. Organoidkulturen werden in der Regel immer 7-10 Tage in Abhängigkeit von der Kulturdichte und Zellproliferation durchdrungen. Bei Bedarf die Kulturen alle 5 Tage mit 200 L vorgewärmten organoiden Komplettmedien auffüllen, um die Erschöpfung und Verdunstung des Wachstumsfaktors auszugleichen.
4. Einfrieren und Auftauen von PDAC-Organoiden
- Um die Organoide einzufrieren, fahren Sie mit der Ernte der Organoide fort und depolymerisieren Sie das BME, wie in den Schritten 3.1–3.7 beschrieben.
- Zum Zellpellet 1 ml Gefriermedium hinzufügen, sanft mischen und die Mischung in ein vorbeschriftetes Kryovial geben.
- Legen Sie den Kryovial in einen Gefrierbehälter, um eine sichere konstante Temperaturabnahme zu gewährleisten und in einem -80 °C Gefrierschrank zu platzieren. Nach 24 bis 48 h die gefrorenen Fläschchen in die Flüssigstickstofflagerung übertragen. Organoide können mit dieser Methode monatelang bis jahrelang kryokonserviert werden.
- Um die Organoide aufzutauen, holen Sie den gefrorenen Kryovial aus der Flüssigkeitsstickstofflagerung. Transportieren Sie die gefrorene Durchstechflasche auf Trockeneis in den Gewebekulturraum.
- Legen Sie das gefrorene Kryovial in das 37 °C Wasserbad, um die Organoide schnell aufzutauen und den Inhalt der Durchstechflasche in ein 15 ml konisches Rohr mit 9 ml Basalmedien zu übertragen, das auf Raumtemperatur erwärmt ist.
- Drehen Sie bei 200 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Legen Sie die Röhre mit dem Organoidpellet mindestens 5 min auf Eis.
- Fahren Sie fort, in BME wieder zu suspendieren und die Organoide wie in den Schritten 3.9–3.11 beschrieben zu verplatten.
HINWEIS: Organoide Kulturen erholen sich langsam nach einem Frost/Tau-Zyklus, daher können Kulturen für bis zu zwei Wochen vor dem Passieren gewachsen werden.
5. Charakterisierung von PDAC-Organoiden
HINWEIS: Die Charakterisierung der Organoide sollte nach mehreren Passagen auf einer etablierten Kultur durchgeführt werden, um das Risiko einer Kontamination durch nichtepitheliale Zelltypen wie Fibroblasten und Immunzellen zu verringern.
- Nukleinsäureextraktion aus PDAC-Organoiden
- Plattenorganoide auf einer 12-Well-Platte, die der Nukleinsäureextraktion gewidmet ist. Platte nicht mehr als 100 l BME pro Brunnen. Für eine ausreichende DNA/RNA-Ausbeute pro Kultur mindestens 2–4 Bohrungen. Wachsen Sie Organoide für bis zu 5 Tage, bis die Kulturen in der Nähe von Konfluent sind, aber frei von den übermäßigen Zellablagerungen, die sich in längerfristigen Kulturen ansammeln.
- Holen Sie die Platte aus dem 37 °C Inkubator und entfernen Sie vollständig alle Spuren von organoiden vollständigen Medien, so dass nur die BME-Kuppel mit den Organoiden auf der Platte.
- Fügen Sie jedem Brunnen 900 l Saures Phenolreagenz (siehe Materialtabelle)hinzu und mischen Sie sie gründlich mit einer p1000 Pipette, bis die Lösung homogen wird. Das BME wird vollständig im Säurephenol-Reagenz gelöst und Organoide werden nach einer kurzen 5 min Inkubation lyse.
VORSICHT: Säurephenol ist eine gefährliche Chemikalie, die chemische Verbrennungen verursachen kann. Behandeln Sie mit Sorgfalt mit geeigneten Schutz und Technik. - Übertragen Sie die homogene Lösung auf ein 2 ml-Rohr und fügen Sie 200 l Chloroform hinzu. 5 min und Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Fahren Sie mit der RNA- und DNA-Extraktion gemäß dem Herstellerprotokoll fort. RNA kann aus der wässrigen Phase extrahiert werden, während DNA aus der Interphase und organischen Phase extrahiert werden kann. Einmal gereinigt und quantifiziert, können RNA und DNA, die aus verschiedenen Brunnen derselben Kultur isoliert sind, gepoolt werden, um die Ausbeute zu erhöhen.
HINWEIS: (1) Während wir dringend empfehlen, diese Nukleinsäureextraktionsmethode für RNA zu verwenden, gibt es viele gute Methoden zur Isolierung von DNA aus kultivierten Zellen. (2) Um das Vorhandensein von Tumorzellen innerhalb der Organoidkultur zu ermitteln, empfehlen wir, die DNA mit Ihrer bevorzugten Sequenzierungsmethode der nächsten Generation zu sequenzieren, um Mutationen innerhalb von PDAC-Kennzeichengenen zu identifizieren (KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A).
- Pharmakotypisierung von PDAC-Organoiden
- Isolieren Sie einzelne Zellen von Organoiden, wie oben in den Schritten 3.1–3.8 beschrieben. Um die Zellzahl zu maximieren, ernten Sie mindestens 10 Konfluentbrunnen einer 12-Well-Platte
- Resuspend einzelne Zellen in 1 ml humanen Organoid-Gesamtmedien. Das Vorhandensein von kleinzelligen Klumpen (2–10 Zellen) ist akzeptabel, größere Zellklumpen wirken sich jedoch negativ auf die nachgelagerte Analyse aus.
- Zählen Sie Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers und zeichnen Sie die Zelllebensfähigkeit auf. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und lebensfähigen Zellen, die in der 1 ml Suspension vorhanden sind.
- Für therapeutische Tests, Platte 1.000 lebensfähige Zellen pro Brunnen einer 384 Well Platte. Für eine 384 Wellplatte schätzen wir, dass wir 400.000 lebensfähige Zellen verwenden werden (berechnet für 400 Brunnen).
- Bereiten Sie Zellen für die Beschichtung vor, indem Sie auf Eis 800 l BME mit 7,2 ml organoiden vollständigen Medien, die die Zellen enthalten, mischen. Halten Sie mischung auf Eis und Platte 20 l pro Brunnen einer 384 Well Platte. Verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette und reservoir auf Eis gehalten, um effizient die Zellen zu platten. Um eine übermäßige Verdunstung von der Platte zu vermeiden, können die äußeren Brunnen als Reservoir (60 L PBS oder Wasser pro Brunnen) verwendet werden, aber dies führt zu einem Verlust von 76 experimentellen Brunnen.
- Drehen Sie die Platte bei 100 x g für 1 min in einem Schwenkeimer nach unten. Dadurch können sich die kleinen 20-L-Volumen- und Organoide am Boden der Platte absetzen.
- Legen Sie die Platte in den 37 °C Gewebekultur-Inkubator, damit sich Organoide bilden können. Nach 24 h, überprüfen Sie das Vorhandensein von Organoiden mit einem Hellfeldmikroskop.
- Gehen Sie mit der Behandlung von therapeutischen Verbindungen, die in DMSO gelöst werden, mit einem Arzneimitteldrucker oder einem gleichwertigen Instrument auf die Platte. Testen Sie jede Medikamentendosis in mindestens dreifachen Brunnen. Um eine effektive Dosis-Wirkungs-Analyse durchzuführen, bestimmen Sie den Dosisbereich für jedes Medikament empirisch, beginnend mit einer niedrigen, ineffektiven Dosis und endend mit einer hohen Dosis, in der die maximale Wirkung beobachtet wird. Beispiele für Dosisbereiche für chemotherapeutische Verbindungen wurden kürzlich veröffentlicht9.
- Setzen Sie die Zellen den therapeutischen Verbindungen für 3-5 Tage aus.
- Optional, am Ende des Tests, Bild der Platte, um die therapeutische Wirkung auf Organoidgröße, Zahl und Morphologie zu bewerten.
- Bewerten Sie die Lebensfähigkeit anhand von 20 L pro Bohrung des Lumineszenzzell-Lebensfähigkeitsreagenzes (siehe Materialtabelle) gemäß dem Herstellerprotokoll. Für die Datenerfassung ist ein Luminometer und für die Datenanalyse eine Graphik-Software erforderlich.
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Representative Results
Um die Herausforderungen zu veranschaulichen, die mit der Isolierung von Organoiden aus PDAC verbunden sind, zeigen wir die Etablierung einer patientenabgeleiteten Organoidkultur aus einer kleinen hypozellulären Tumorprobe. Nach der ersten Beschichtung waren nur wenige Organoide pro Brunnen sichtbar, wie in Abbildung 1dargestellt. Organoide durften über einen Zeitraum von 2 Wochen größer werden und wurden gemäß unserem Protokoll durchdrungen, um eine robustere Kultur zu etablieren, wie in der frühen und späten Passage 1 repräsentative Bilder gezeigt (Abbildung 1). Es ist wichtig zu beachten, dass die größeren zystischen Organoide, die im späten primären Isolat beobachtet wurden, leicht in kleinere Fragmente während des Mischens von Organoiden mit eiskaltem BME zerlegt wurden, wie in Schritt 2.13 beschrieben.
Um das Ergebnis des Pharmakotypisierungsprotokolls zu demonstrieren, haben wir einzelne Zellen aus einem etablierten und schnell wachsenden repräsentativen PDAC-Organoid, wie in diesem Protokoll beschrieben, vorbereitet. 1.000 lebensfähige Zellen wurden pro Brunnen plattiert und konnten sich über 24 h erholen, bevor zytotoxische Chemotherapeutika, Gemcitabin und Paclitaxel, dosiert wurden. Wir führten einen 9-Punkt-Dosis-Ansprech-Assay in Dreifacharbeit durch, beginnend mit einer niedrigen Dosis von 100 pM und endeten mit einer hohen Dosis von 2 M. Nach einer 5-tägigen Behandlung wurden repräsentative Bilder für das Fahrzeug (DMSO), 2 M Gemcitabin und 2 M Paclitaxel behandelte Brunnen gemacht (Abbildung 2). Unmittelbar nach der Aufnahme der Bilder wurde die Zelllebensfähigkeit mit Deminuumzzelllebensfähigkeitsreagenz bewertet und mit Graphik gezeichnet (Abbildung 2).
Abbildung 1: Repräsentative Bilder werden für eine PDAC-Organoidisolation sowie nach dem ersten Durchgang gezeigt. Sowohl frühe (1–3 Tage) als auch späte (7–10 Tage) Zeitpunkte werden gezeigt, um das organoide Wachstum im Laufe der Zeit zu veranschaulichen. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Dosis-Antwort-Analyse. (Links) Repräsentative Dosis-Wirkungs-Analyse unter Verwendung einer etablierten PDAC-Organoidkultur, wobei die Standardabweichung von Triplicaten als Fehlerbalken dargestellt wird. (Rechts) Bilder, die den Effekt am Ende des Testes der Fahrzeugbehandlung (DMSO) sowie 2 M Gemcitabin und 2 M Paclitaxel veranschaulichen. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier stellen wir aktuelle Protokolle zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Unsere derzeitige Erfolgsquote bei der Etablierung einer organoiden Kultur liegt bei über 70 %; daher sind diese Methoden noch nicht perfektioniert und werden sich im Laufe der Zeit verbessern und weiterentwickeln. Die Stichprobengröße sollte in Betracht gezogen werden, da PDAC eine geringe neoplastische Zellulizität hat. Folglich enthalten kleine Proben nur wenige Tumorzellen und erzeugen nur eine Handvoll Organoide. Zusätzlich erhalten viele Patienten vor dem chirurgischen EingriffeineChemotherapie und/oder eine chemobestrahlte neoadjuvante Behandlung. Wenn die Behandlung für einen bestimmten Patienten wirksam ist, kann das Tumorgewebe frei von lebensfähigen Zellen sein. Die Erfassung von chemonaiven Patientenproben wird für die anfängliche Optimierung dieser Methoden bevorzugt, aber dies ist nicht immer möglich. Interessanterweise haben wir festgestellt, dass Ischämiezeit nach chirurgischer Entfernung des Tumorgewebes kein wesentliches Kriterium für eine erfolgreiche organoide Isolierung ist, solange die Probe innerhalb von 24 h verarbeitet wird.
Pankreasduktodalsocarcinom ist eine Krankheit, die durch eine starke desmoplastische Reaktion und Ablagerung einer dichten stromalen Matrix gekennzeichnet ist. Während Organoide ein ausgezeichnetes Werkzeug für die schnelle Isolierung und Ausdehnung des Epithelfachs sind, rekapituliert das Modell nicht die komplexe Stroma von PDAC. Andere Methoden wie patientenabgeleitete Xenografts16 oder Luftflüssigkeitsschnittstellenkultur17 ermöglichen ein stromales Fach, können jedoch eine Herausforderung sein, sich schnell zu erweitern. Bei der Wahl eines Modellsystems sollte der Forscher die Stärken und Schwächen der einzelnen6sorgfältig abwägen.
Die heterogene Biologie dieser Krankheit wirkt sich auf das organoide Establishment aus, da einige patientenabgeleitete Organoide in unseren Bedingungen extrem gut wachsen, während andere im Vergleich viel langsamer sind. Die protokolle oben beschreiben einen Wnt Ligand reichen Zustand zu isolieren und erweitern alle Patienten abgeleiteten Organoide, noch andere haben gezeigt, dass einige Patienten Tumoren sind in der Lage, in Abwesenheit von Wnt konditionierten Medienwachsen 11,12. Weitere Tests werden erforderlich sein, um festzustellen, ob die Verwendung einer Reihe von Medienbedingungen die erfolgreiche Etablierung von Organoiden verbessert, wie kürzlich bei Eierstockkrebsorganoiden18nachgewiesen wurde. Dieser Multiplex-Ansatz wird jedoch durch die geringe Anzahl von Tumorzellen begrenzt, die aus kleinen Patientenproben isoliert werden können. Zusätzlich können normale untransformierte duktale Organoide aus einer organoiden Isolierung entstehen, insbesondere wenn das Tumorgewebe an normales Gewebe angrenzt9. Um das Risiko einer normalen organoiden Kontamination zu reduzieren, können größere Gewebeproben in kleinere unabhängige Fragmente unterteilt werden, indem morphologische Unterschiede wie auch vaskularisierte (Blut ist sichtbar) im Vergleich zu hypovaskulären Regionen und harte Knötchen im Vergleich zu Weichgewebe verwendet werden.
Die hier beschriebenen Methoden und Protokolle sind die aktuellen Standardansätze, die in unserem Labor für die Organoidisolation verwendet werden, und sie sollten für jede Laborumgebung getestet und angepasst werden. Zum Beispiel ist die enzymatische Dissoziation (Schritte 2.6 bis 2.9) des Tumorgewebes besonders wichtig, um zu optimieren. Kleine Geräteunterschiede (Nutator vs RotatorMischer) können zu deutlich unterschiedlichen Timing für diesen Schritt führen. Darüber hinaus kann die Gewebedissoziation durch Erhöhung oder Verringerung der Konzentration der Collagenase/Hyaluronidase-Mischung fein abgestimmt werden. Es ist darauf zu achten, dass nicht alle Proben auf die gleiche Weise behandelt werden. Zum Beispiel können Organoide in einigen Fällen ohne mechanische oder enzymatische Dissoziation aus Aszitesflüssigkeit von fortgeschrittenen PDAC-Patienten isoliert werden.
DNA-Sequenzierung ist der aktuelle Goldstandard, um das Vorhandensein oder Fehlen von Tumororganoiden zu bestimmen, da PDAC durch häufige Mutationen in KRAS, TP53, SMAD4 und CDKN2A angetrieben wird. Transkriptomische Analysen können verschiedene Tumorsubtypen aufdecken, während Pharmakotypisierung patientenspezifische therapeutische Schwachstellen aufdecken kann9. Diese Protokolle ermöglichen es PDAC-Forschern, eine eigene Bibliothek von patientenabgeleiteten Organoiden zu entwickeln und die Biologie dieser Modelle zu profilieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Unterstützung des UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, Der Mitglieder des Lowy-Labors und der UC San Diego Department of Surgery, Division of Surgical Oncology. AML wird großzügig unterstützt von NIH CA155620, einem SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), und Spendern des Fund to Cure Pancreatic Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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