Summary
Hydatidiform benler, morfolojik özelliklerine ve molar genomlara ebeveyn katkısına göre sınıflandırılabilen heterojen etiyolojileri olan anormal insan gebelikleridir. Burada formalin-sabit parafin gömülü azı laksamalarının multipleks mikrouydu DNA genotipleme ve akış sitometrisi protokolleri, sonuçların yorumlanması ve entegrasyonu ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Hidatidiform mol (HM), aşırı trofoblastik proliferasyon ve anormal embriyonik gelişim ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Mikroskobik morfolojik değerlendirmeye dayalı iki tip HM vardır: komple HM (CHM) ve kısmi HM (PHM). Bunlar, molar genomlarına ebeveyn katkısına göre daha fazla alt bölümlere ayrılabilir. HM'nin morfoloji ve genotip analizleri ile böyle bir karakterizasyonu, hasta yönetimi ve bu ilginç patolojinin temel anlayışı için çok önemlidir. HM'nin morfolojik analizinin geniş bir gözlemci ler arası değişkenliğe tabi olduğu ve HM'yi CHM ve PHM'ye doğru bir şekilde sınıflandırmak ve bunları hidropik molar olmayan düşüklerden ayırmak için tek başına yeterli olmadığı belgelenmiştir. Genotipleme analizi çoğunlukla optimal kaliteden daha az olan ve sonuç olarak yanlış sonuçlara yol açabilecek formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) döllenme ürünlerinden DNA ve dokular üzerinde yapılır. Bu makalede FFPE molar dokularının çokk genotipleme ve akış sitometri analizleri için ayrıntılı protokoller, bu yöntemlerin sonuçlarının yorumlanması, bunların sorun giderme ve morfolojik değerlendirme ile entegrasyon ile birlikte sağlanmaktadır. , p57KIP2 immünohistokimya, ve floresan yerinde hibridizasyon (FISH) doğru ve sağlam bir tanı ulaşmak için. Burada yazarlar, son 10 yılda yaklaşık 400 conception ürününün analizinden öğrenilen yöntem ve dersleri paylaşıyorlar.
Introduction
Hydatidiform mol (HM), anormal embriyonik gelişim, trofoblastın hiperproproproproproproprobu ve koryonik villinin hidropik dejenerasyonu (CV) ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Tarihsel olarak, HM iki tip, tam HM (CHM) ve kısmi HM (PHM) sadece morfolojik değerlendirme1dayalı bölünmüş olması için kullanılır. Ancak, morfolojik değerlendirmenin tek başına HM'yi iki alt tipe (CHM ve PHM) ayırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırmak için yeterli olmadığı gösterilmiştir2,3,4.
CHM ve PHM'nin malignitelere göre farklı eğilimleri olduğundan, hastalara uygun takip ve yönetimi sağlamak için genotik HM tipini doğru bir şekilde belirlemek önemlidir. Sonuç olarak, son yıllarda, azı laklarına ebeveyn katkısını belirlemek ve HM'nin doğru bir sınıflandırmasına ulaşmak amacıyla çeşitli metodolojiler geliştirilmiş ve geliştirilmiştir. Bunlar arasında karyotip analizi, kromozom bantlama polimorfizmi, insan lökosit antijeni (HLA) serolojik yazma, restriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi, değişken tandem tekrarı sayısı, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve p57 KIP2 immünohistokimya. Bu, hm gebelerinin genomlarına ebeveyn katkısına dayalı doğru bir alt bölüme sahip olmasına olanak sağlamıştır: Dploid androgenetik monospermik veya diploid androgenetik dispermik olan CHM ve triploid olan PHM, %99 ve olguların %1'inde monospermik5,6,7,8. Ayrıca, son yirmi yılda ortaya çıkan başka bir genotypic HM tipi vardır, hangi diploid biparental olduğunu. İkincisi çoğunlukla tekrarlayan ve tek bir aile üyesi etkileyebilir (simpleks durumlarda) veya en az iki aile üyesi (ailesel durumlarda). Bu diploid biebeveyn benler çoğunlukla NLRP7 veya KHDC3L hastalarda9,10,11,12resesif mutasyonlar neden olur. NLRP7'de resesif mutasyonu olan hastalarda diploid biebeveynLI HM morfolojik analiz ile CHM veya PHM tanısı konabilir ve bu hastalardamutasyonların şiddeti ile ilişkili gibi görüner13,14. HM'nin genotiplerine göre sınıflandırılmasına ek olarak, çeşitli genotipleme yöntemlerinin tanıtımı ve kullanımı, çeşitli molar varlıkların molar olmayan düşüklerden, örneğin aneuploid diploid biebeveyn kavramları ndan ayırt edilebilmiştir ve diğer kavram türleri5,15. Bu tür kavramlar bazı trofoblast proliferasyonu ve bir dereceye kadar HM bazı morfolojik özellikleri taklit anormal villous morfolojisi olabilir.
Bu makalenin amacı, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokuların çokkatlı genotipleme ve akış sitometrisi için ayrıntılı protokoller sağlamak ve bu yöntemlerin sonuçlarının kapsamlı analizleri ve bunların diğer yöntemlerle bütünleştirilmesi azı laklarının doğru ve kesin tanısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırma McGill Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar çalışmaya katılmak ve ffpe ürünlerinin çeşitli patoloji bölümlerinden alınması için yazılı izin verilmiştir.
NOT: Akış sitometrisi ile genotipleme ve ploidi tayini için çeşitli yöntemler olmakla birlikte, burada sağlanan protokoller her biri için bir platform kullanarak bir analiz yöntemini tanımlar.
1. Genotipleme
-
En iyi FFPE bloğunun seçimi
- Gebeliğin her FF ÜRÜNÜ (POC) için, mikroskopi ile morfolojik değerlendirme için, mevcut her blok için bir tane olan 1.2 ve 1.3 bölümlerinde açıklandığı şekilde 4 μm kalınlığında hematoksilin ve eozin (H&E) lekeli kesitler hazırlayın.
- H&E slaytları ve hafif mikroskobu kullanarak, en fazla koroyonik villi (CV) miktarına sahip FFPE bloğunu ve mümkünse, CV'si anne dokularından ayrı ve iç içe olmayan bloğu seçin.
-
Kesit
- Kesiti kolaylaştırmak için seçilen bloğu 15 dakika boyunca buzüzerine yerleştirin.
- Mikrotomu mikroskobik morfolojik değerlendirme için 4 μm kalınlığında ve DNA ekstraksiyonu için 10 μm kalınlığında kesecek şekilde ayarlayın.
- Soğuk bloğu mikrotome yerleştirin ve DNA ekstraksiyonu için bloktaki CV miktarına bağlı olarak H&E boyama için her bloktan bir bölüm ve seçilen bloktan 10−30 kesit kesin.
NOT: CV dolu bloklar için DNA ekstraksiyonu için 10 bölüm yeterlidir. Bloğun sadece %10'u CV, geri kalanı ise anne dokuları ise yeterli miktarda DNA sağlamak için 20−30 kesite ihtiyaç duyulabilmektedir. - Forceps kullanarak, her bölümü 45 °C su banyosuna aktarın. Daha önce bir kalem kullanarak örnek kimlik numarası ile etiketlenmiş bir pozitif yüklü slayt(Malzeme Tablosu)ile su banyosundan bölümü alın.
- Bölümleri içeren slaytları 65 °C'de bir fırına yerleştirin ve bölümlerin slaytlara yapışmasını bekleyin. H&E için slaytları 25 dakika fırında tutun.
NOT: Daha kısa kuluçka süresi dokuları slaytlara biraz daha az yapışır ve dolayısıyla anne dokularının çıkarılmasını kolaylaştırır.
-
H&E boyama
- Slaytların oda sıcaklığına (10 dk) kadar soğumasını bekleyin.
- Reaktif hazırlama
- Eosin Y çalışma solüsyonu hazırlayın (%0.25) Tablo 1'egöre . İyi bir şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında saklayın.
- Hematoksilin 5x'in stok çözeltisini suda seyrelterek hematoksilin çözeltisini hazırlayın (yani 80 mL suyu 20 mL hematoksilin ile karıştırın).
NOT: Depolama için folyo hematoksilin stok çözeltisi sarın.
- Tablo 2'yegöre bir duman kaputunun altında doğru reaktiflerle boyama kavanozları hazırlayın.
- Slaytları Tablo 2'yegöre doğru zaman dilimi için uygun boyama kavanozlarına batırarak H&E boyama gerçekleştirin.
- Morfolojik analiz için 4 μm kesitleri montaj ortamı ve cam kapaklı kapaklı kapaklı(Malzeme Tablosu) monte edin.
NOT: Genotipleme için 10 μm kesitler örtülmemelidir. - Zehirli ksilen kokularının dağılabilmesi için duman kaputunun altındaki 10 μm'lik kesitleri en az 3 saat bekletin.
DİkKAT: Tüm boyama adımları bir duman başlık altında yapılmalıdır. Ksilen kokuları toksik olduğu için ksilen ürünleri her zaman kaputun altında tutulmalıdır. Ayrıca, ksilen ve hematoksilin özel kaplarda atılması gerekir. Bu konteynerler dolduğunda, laboratuvarın güvenlik organizasyonu tarafından tavsiye edildiği şekilde atılmalıdır.
| Reaktif | Miktar |
| Eosin Y stok çözeltisi (%1) | 250 mL |
| %80 Etanol | 750 mL |
| Buzul Asetik Asit (Konsantre) | 5 mL |
Tablo 1: Eozin Y çalışma çözeltisi (%0.25) Hazırlık.
| Kullanılan reaktif (depo başına 100 mL) | Süre |
| 1) Ksilen | 5 dk |
| 2) Ksilen | 5 dk |
| 3) %100 Etanol | 2 dk |
| 4) %95 Etanol | 2 dk |
| 5) %70 Etanol | 2 dk |
| 6) %50 Etanol | 2 dk |
| 7) Distile su | 5 dk |
| 8) Hematoksilin | 4 dk |
| 9) Distile su | 5 dk |
| 10) Eozin | 1 dk |
| 11) %95 Etanol | 5 dk |
| 12) %100 Etanol | 5 dk |
| 13) Ksilen | 5 dk |
| 14) Ksilen | 5 dk |
Tablo 2: H&E boyama protokolü için reaktifler ve süreler.
-
CV Yalıtımı
- Hafif bir stereomikroskop altında, H&E-lekeli 10 μm kalınlığındaki kesitlerden istenmeyen anne dokularını kazımak için forseps ve suyla nemlendirilmiş kağıt mendiller(Malzeme Tablosu)kullanın.
NOT: Nihai amaç slaytlar üzerinde CV veya fetal membranlar (mevcut) başka bir şey tutmak ve böylece diğer tüm dokuları kaldırmaktır. Detaylara titizlikle dikkat gerektirdiğinden, bu adım, blota bağlı olarak çok fazla zaman alabilirsiniz. - Anne dokularından arınmış olduğundan emin olmak için temizlikten sonra slaytları ikinci bir kişiye iki kez kontrol edin.
- Temizlenmiş slaytların fotoğraflarını çekin veya veri yorumuna yardımcı olmak için aşağıdakileri belgeleyin: 1) dokunun temizlenmesinin zor olup olmadığı, hemorajik veya çok temiz, 2) kullanılan kesit sayısı ve 3) temizlenmiş dokuların yaklaşık miktarı.
NOT: Şekil 1, temizlenmesi kolay bir slayt örneği sağlar. Kabaca bu miktarda CV içeren bir blok için DNA ekstraksiyonu için 10 bölüm yeterlidir. Şekil 2'deki slaytta anne dokuları ile iç içe olan çok az CV'si vardır, bu da temizlemeyi çok zor ve zaman alıcı hale getirir. Kabaca bu miktarda CV içeren bir blok için DNA çıkarma için 30 bölüm gereklidir. - Küçük nemlendirilmiş kağıt mendiller kullanarak CV toplayın. Forceps kullanarak, nemlendirilmiş kağıt mendil küçük bir parça gözyaşı ve CV toplamak için kullanabilirsiniz.
- Kağıt mendil parçalarını ekli CV'si ile 1,5 mL etiketli bir tüpe yerleştirin.
- Bu adımda kullanılan kağıt mendil miktarını en aza indirin, çünkü DNA çıkarma sütununu çok fazla tıkayabilir ve dolayısıyla toplanan DNA'nın son miktarını azaltabilir. Ortalama olarak, numune başına yedi küçük kağıt mendilden daha az kullanmayı hedefleyin. Büyük miktarda CV varlığı nedeniyle bu mümkün değilse, ekstraksiyonu kolaylaştırmak için numuneyi iki tüpe bölün.
- Hafif bir stereomikroskop altında, H&E-lekeli 10 μm kalınlığındaki kesitlerden istenmeyen anne dokularını kazımak için forseps ve suyla nemlendirilmiş kağıt mendiller(Malzeme Tablosu)kullanın.
Şekil 1: Genotipleme için temsili slayt. Üst: Anne dokularından arınmak için "temizlenmesi" gereken bir slayt. Alt: Temizlendikten sonra gösterilen aynı slayt ve şimdi DNA çıkarma için CV'den başka bir şey içermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Genotipleme için temsili slayt. Üst: Anne dokularından arınmak için "temizlenmesi" gereken bir slayt. Alt: Temizlendikten sonra gösterilen aynı slayt ve şimdi DNA çıkarma için CV'den başka bir şey içermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- DNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek için FFPE kitinden(Malzeme Tablosu)DNA çıkarma protokolünü uygulayın.
NOT: Bazı kitler son elüsyon için 15−20 μL elüsyon arabelleği kullanmanızı önerir. Deneyimlerinden, 15 μL elütion tamponu ile elüsasyon çoğu örnek için iyi çalışır. Seyreltmeler gerektiğinde stok DNA'dan hazırlanabilir.
-
DNA nicelleştirme
- Laboratuvar spektrofotometre cihazı kullanarak, 1 μL DNA yükleyin ve ölçüm ölçümü için 260 nm'de absorbans ölçün.
- %2'lik agarose jelüzerine 1 μL DNA yükleyin ve nitel değerlendirme için 80−100 V voltajda jel elektroforezini çalıştırın.
- 1.6.1 ve 1.6.2 adımlarının sonuçlarına göre, çokkatlı kısa tandem tekrarı (STR) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonunda kullanılacak DNA hacmini seçin. Aşağıdaki PCR amplifikasyonunda en az 1000 ng DNA kullanmayı amaçlayın.
NOT: Şekil 3, DNA konsantrasyonları (spektrofotometre sonuçlarına göre) ve aşağıdaki çok katlı STR PCR için önerilen DNA çözeltisinin hacmi ile birlikte jellerin temsili örneklerini göstermektedir.
Şekil 3: DNA niceliği için temsili jel. Spektrofotometre kullanılarak ölçülen her DNA'nın konsantrasyonları ve multipleks PCR için kullanılan miktarlar dahildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
-
PCR amplifikasyonu
- Çok katlı STR sistemi(Tablo Malzemeler)kullanarak floresan mikrouydu genotipleme gerçekleştirin.
- Çok katlı STR sistemi(Tablo Malzemeler)kullanarak PCR amplifikasyonu için Şekil 4'te gösterilen PCR koşullarını kullanın.
NOT: Bu çok katlı STR sisteminde aşağıdaki astarlar kullanılmaktadır: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S817, D5S817, D5S817.
Şekil 4: Multipleks STR sistemi için PCR çevrim koşulları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
-
PCR ürünlerini kapiller elektroforez ile çözün.
- Çok katlı sistemin iç standart şeridinin 0,5 l'lik ve yüksek deiyonize formamidin 9,5 μL 'lik(Malzeme Tablosu)her güçlendirilmiş numunenin 1 0,5 l'sini askıya alın.
- Numuneleri, alet ve multipleks sisteminin boya seti için uygun bir ayırma matrisi(Malzeme Tablosu)kullanarak bir kapiller elektroforez aleti(Malzeme Tablosu)ile çalıştırın.
- Veri analizi
- Verileri bir DNA parçası analiz yazılımıyla analiz edin ve kökenini belirlemek için POC alellerini ebeveyn alelleriyle karşılaştırın.
- Boyut standardı ayarlayın.
NOT: Bu, yazılımın multipleks STR sisteminde kullanılan merdiveni tanımasına ve merdivene dayalı olarak amplikonlara baz çiftleri atamasına olanak tanır. Aşağıdaki adımlar belirli bir yazılım içindir(Malzeme Tablosu)ancak diğer yazılım türlerinin de ayarlanmasında yardımcı olabilir.- Yazılımı açın. Yeni Projeyi Başlat'a ve ardından Yeni Boyut Standardı'natıklayın.
- Boyut standardına bir ad verin (örn. ABI_600).
- Yeni Boyut Standart ını Girin adlıkutuya: aşağıdakileri girin: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Ardından Boyut Ekle(ler)'etıklayın.
NOT: Girilen sayılar sağdaki kutunun altında görünür ve bu kutuya Current Size Standard Definition (bkz. Şekil 5). - Kaydet'etıklayın.
- Bir dosyayı almak ve çözümlemek için Dosya Ekle'yitıklatın ve çözümlenecek fsa dosyasını seçin. Seçili Dosyaları Ekle'ye ve ardından Tamam'atıklayın. Ardından şu adımları izleyin:
- Boyut Standart sütununa bulun ve ABI_600'ü (veya boyut standardına hangi ad verildiyonu) seçin.
- Analiz Yöntemialtında, Boyutlandırma Varsayılanı - NPP'yi tıklatın ve ardından yeşil Analiz düğmesine tıklayın.
- Dosya artık görüntülenmeye hazır. Verileri istenilen şekilde görüntülemek için görüntüleme seçeneklerini ayarlayın.
- Sorun giderme - analiz yöntemi
NOT: Yazılım bazen zirveleri tanımlamak ve doğru hizalamak için başarısız olabilir. Bu zirveleri ya çok düşük ya da çok yüksek olduğunda olur. Aşağıdaki iki analiz yöntemi bunun için düzeltilebilir ve bir örnek yeniden test edilmeden önce denenmelidir.- Yüksek zirveler için analiz yöntemi 1:
- Yeni Analiz Yöntemi'ni tıklatın ve yüksek tepelerle (veya kişisel tercihe göre başka bir ad) adını adlandırın.
- Analiz ve boyutlandırma için Aralık'a ve ardından Kısmi Aralık'a tıklayın. Daha sonra Başlangıç Noktası ve Başlangıç Boyutuiçin 100 yazın.
- Dur Noktasıiçin 10.000 girin. Stop Boyutuiçin 1000 girin.
- Sonra Minimum tepe yükseklikleri tıklayın ve renkler için tepe eşik aşağıdaki gibi numaraları değiştirin: Mavi: 50; Yeşil: 50; Sarı: 20; Kırmızı: 100; Turuncu: 5000.
- Yeni çözümleme yöntemini kaydedin.
- Düşük zirveler için analiz yöntemi 2:
- Yeni Analiz Yöntemi'ni tıklatın ve düşük tepelerle (veya kişisel tercihe göre başka bir ad) adını adlandırın.
- Analiz ve boyutlandırma için Aralık'a ve ardından Kısmi Aralık'a tıklayın. Daha sonra Başlangıç Noktası ve Başlangıç Boyutuiçin 100 yazın.
- Dur Noktasıiçin 10.000 girin. Stop Boyutuiçin 1000 girin.
- Ardından Kalite Bayrakları'na tıklayın ve 0,5'ten 1'ekadar okunacak şekilde Geçiş Aralığını değiştirin. 0,0'dan 0,0'akadar okunacak şekilde Düşük Kalite Aralığını değiştirin. Doğrusallığı aşağıdakilere değiştirin: (bp) 100,0'dan (bp) 800,0'akadar.
- Yeni çözümleme yöntemini kaydedin.
NOT: Artık Analiz Yöntemi altında Düşük Tepeler veya Yüksek Tepeler'i seçip yeşil Analiz düğmesine tıklayarak bir dosyayı yeniden çözümlemek mümkündür.
- Yüksek zirveler için analiz yöntemi 1:
Şekil 5: Boyut Standart Düzenleyicisini gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Akış Sitometrisi
-
İdeal FFPE bloğunu seçme
- H&E slaytları ve hafif bir mikroskop kullanarak, dokularının yaklaşık %50-70'ine sahip bir FFPE bloğu seçin.
NOT: Şekil 6, kabaca %50 CV (bölümün sağ yarısı) ve %50 maternal dokulardan (sol yarısı) oluştuğundan, akış sitometrisi analizi için uygun bir bloğun temsili bir örneğidir. Onlar diploid tepe için bir iç kontrol olarak hizmet çünkü maternal dokuların varlığı önemlidir. - İdeal cv miktarına sahip olmayan bloklar için, kesit işlemi gerçekleştirilirken CV için zenginleştirin. Bunu yapmak için, yeni kesilmiş bölümlerin hangi tarafında ilgili H&E slaytına göre daha fazla CV içerdiğini belirleyin. Buna dayanarak, CV için zenginleştirmek için atılması gereken diğer yarısını kesmek için bir bıçak kullanın.
NOT: Şekil 7 akış sitometri analizi için yeterli CV'si olmayan bir bloğu göstermektedir. Bu gibi bloklar için, daha az CV içeren yarısı, anne dokularına göre CV miktarlarını artırmak için, şekilde gösterildiği gibi atılır gibi kesilmelidir. Atılanları telafi etmek için daha fazla kesit kestiğinden emin olun.
- H&E slaytları ve hafif bir mikroskop kullanarak, dokularının yaklaşık %50-70'ine sahip bir FFPE bloğu seçin.
Şekil 6: Akış sitometrisi için ideal olan bir POC bloğunu temsil eden H&E bölümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Akış sitometrisi için daha zor bir bloğu temsil eden H&E bölümü. Bu temsilci H&E bölümü, CV için zenginleştirme amacıyla, akış sitometrisi analizi için bu bölümün sadece alt yarısının kullanılması gerektiğini göstermektedir. "CV" etiketli ana hatlar çoğunlukla CV'den oluşur.
- Kesit
- Kesiti kolaylaştırmak için blokları 15 dk buz üzerinde bırakın.
- Mümkün olan en iyi FFPE bloğu kullanarak, bir mikrotom kullanarak 50 μm kalınlığında (veya iki 100 μm kalınlığında kesin) dört bölüm kesin.
NOT: Akış sitometrisi için daha kalın kesitlere sahip olmak tercih edilir. - İdeal bir FFPE bloğu mevcut olmaması durumunda, yine de CV'nin anne dokusuna oranını korumayı amaçlamaktadır. Örneğin, bloğun yalnızca %30'u CV'den oluşurken, geri kalanı anne dokularını içeren bölümün en az yarısını çıkarın ve telafi etmek için daha fazla kesit kullanın (Bkz. Şekil 7).
- Bölümleri etiketli 15 mL tüplere yerleştirin.
NOT: Bir sonraki adımda kullanılan organik reaktifler mürekbete çözülüp çıkarabildiği için etiketlerin üzerine bantladığından emin olun.
- FFPE dokularından akış sitometri protokolü
- Deparafinizasyon ve rehidrasyon
- Bir duman başlığı altında aşağıdaki yıkıntıları(Tablo 3)gerçekleştirin.
- Tablo 3'te verilen sırayı izleyerek 15 mL'lik tüpü uygun reaktifin 6 mL'si ile doldurun, reaktifteki bölümleri ilgili süre boyunca bırakın ve vakum emme ve cam Pasteur pipetiyle reaktifi çıkarın.
- Her adım arasında Pasteur pipetini önce %70 etanol, sonra distile suya batırın ve bir sonraki adıma geçin.
- Reaktif ile birlikte doku parçaları kaldırmak için çok dikkatli olun. 15 mL'lik tüpü, sıvı reaktifinin dokuları çizmeden emmesini kolaylaştırmak için 60 derecelik bir açıya yatırın.
DİkKAT: Atılan sıvılar ksilen içerir ve ksilen atık kaplarına atılmalıdır.
- Çözüm hazırlama
- Çift distile su 1 L sitrik asit 2 g eriterek sitrat çözeltisi hazırlayın. pH'ı 6'ya getirin. 4 °C'de saklayın.
- Bin DaK başına 9 parçadan 2 mL pepsin 0.01 g eriterek pepsin çözeltisini hazırlayın, pH 1.64. Bu bir örnek için.
DİkKAT: Pepsin toksik ve kolayca dağıtmak ve hava yoluyla olabilir. Toz formunda pepsin kullanırken maske takın ve kullandıktan sonra çalışma alanının tamamını silin. - Propidium Iodide (PI)-ribonukle bir örnek için bir çözelti hazırlığı.
- 50 μL PI ile 450 μL PBS'yi karıştırın (10x'i seyreltmek için).
- Karışıma 50 μL ribonükle a (1 mg/mL) ekleyin. Her zaman folyoya sarılı tutun.
- Sindirim ve boyama
- 15 mL tüplere 4 °C sitrat çözeltisi ekleyin ve 2 saat boyunca 80 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Çözeltioda sıcaklığına (15 dk) kadar soğumaya bırakın. Sitrat çözeltisini çıkarın.
- 1x PBS, girdap 6 mL ekleyin ve dokuların dibe yerleşmek için 1−2 dk bekleyin. Vakum emme ve cam Pasteur pipet kullanarak 1x PBS çıkarın.
- 1 mL pepsin çözeltisi (önceden ısıtılmış 37 °C)'a ekleyin ve 37 °C'lik kuru bir banyoya 30 dk. Girdap her 10 dakikada bir yerleştirin. Bu kuluçka nın son 10 dakikasında PI-ribonükle a çözeltisini hazırlayın.
- 1x PBS, girdap 6 mL ekleyin ve dokuların dibe yerleşmek için 1−2 dk bekleyin. Vakum emme ve cam Pasteur pipet kullanarak 1x PBS çıkarın.
- PI-ribonüklea 550 μL bir çözelti ekleyin ve numuneleri 30 dakika boyunca 37 °C'lik kuru bir banyoya yerleştirin.
NOT: Bu noktada numuneler folyoya sarılır ve bir gecede 4 °C'de ertesi sabaha kadar bırakılabilir. - Çözeltiyi 48 μm'lik bir filtrasyon örgüsünden filtreleyin. Akış sitometresi ile kullanılabilir polistiren yuvarlak alt tüpler, filtrat toplamak. Tüpün üst kısmına 5 cm'ye 5 cm'lik filtrasyon örgüsünü yerleştirmek için, sıvının meshten ve tüpe boruyla boruya aktarılabildiği şekilde forceps kullanın.
NOT: Örnekler akış sitometresi ile çalıştırılacak hazırdır. Onlar çalıştırılmak için hazır olana kadar folyo sarılmış tutun.
- Kuruluşun akış sitometri sitometrisi platform teknisyeni yardımıyla bir akış sitometre ile örnekleri çalıştırın.
NOT: PE kanalı PI lekeli DNA'yı algılamak için kullanılır ve akış hızı satın alma sırasında Yavaş olarak ayarlanmalıdır. Analiz ve yorumlamayı kolaylaştırmak için diploid tepenin PE-A x ekseni boyunca kabaca 200 seviyesinde olmasını sağlayacak şekilde gerilimin seçildiğinden emin olun. Örnek başına en az 20.000 olay kaydetmeyi hedefliyoruz.
- Deparafinizasyon ve rehidrasyon
| Kullanılan reaktif (her biri 6 mL) | Süre |
| 1) Ksilen | 2 x 10 dk |
| 2) %100 Etanol | 2 x 10 dk |
| 3) %95 Etanol | 10 dk |
| 4) %70 Etanol | 10 dk |
| 5) %50 Etanol | 10 dk |
| 6) Distile su | 2 x 10 dk |
Tablo 3: Deparafinizasyon ve rehidrasyon için reaktifler ve süreler.
-
Akış sitometri veri analizi
- Akış sitometri analiz yazılımı(Malzeme Tablosu)ile verileri analiz edin.
NOT: Aşağıdaki adımlar belirli bir yazılım içindir(Malzeme Tablosu)ancak diğer yazılım türlerinin de ayarlanmasında yardımcı olabilir.- Örnekleri akış sitometreüzerinde çalıştırdıktan sonra, analiz için FCS 2.0 dosyalarını indirin.
- Akış sitometri analiz yazılımını açın, Dosya'ya tıklayın | Yeni Belge.
- Histogram simgesine ()
tıklayın ve dikdörtgen yapmak için işaretçiyi sürükleyin. - FCS dosyasına göz atın ve ardından Aç'atıklayın. X ekseni boyunca FCS-A'yı tıklatın ve ardından PE-A'yıseçin.
- Nokta Çizimi simgesine
() tıklayın ve ardından işaretçiyi sürükleyip histogram çiziminin altında başka bir dikdörtgen oluşturun. Ardından histogram için seçilen aynı FCS dosyasına göz atın. - Nokta çiziminin x eksenini PE-A ve y eksenini PE-Wolarak değiştirin.
NOT: Şekil 8A bu noktada çizerlerin görünümünü gösterir. - Bölge simgesine tıklayın
( ) ve şekil 8'deki nokta çiziminde gösterildiği gibi, diploid tepeden önce başlayan nokta çizimine bir kutu çizin (Şekil 8B'dekix ekseninde yaklaşık 100 ) ve x ekseninde 700 civarında sona eren B.
NOT: Şekil 8'deki diploid tepe kabaca x ekseninde 200'dedir. Bu, örnekler akış sitometresi aracılığıyla kaydedilirken, sadece sonuçların analizini ve yorumlanmasını kolaylaştırmak için rasgele seçilir. - Arsa üzerine tıklayın | Bölgeleri/Kapıları Edin,ardından Stratejialtında G0 hücresinin yanındaki hücreye R0 yazın. Ardından Kapat'atıklayın.
- Histogram her yerde tıklayın, sonra Arsa | Çizim/Yer Kaplamayı Biçimlendir. Geçitaltında, G0 = R0 seçin ve sonra Tamamtıklayın.
NOT: Bu bir ploidy zirveleri daha iyi görselleştirmek için izin veren gating adımdır. Histogram şimdi Şekil 8Bhistogram gibi görünmelidir. Nokta çiziminin belirli bölgelerine odaklanmak için oluşturulan kapıyla (2.4.1.7 adımda çizilen kutuyu hareket ettirerek) oynamak mümkündür. - Çizimleri etiketlemek için Metin Alanı simgesine (),
sonra belgenin üst kısmında bir kutu oluşturmak için işaretçiyi sürükleyin ve ardından aşağıdaki bilgileri yazın: Hasta Kimliği, POC Kimliği ve kullanılan blok (bir POC için birkaç blok olabileceğinden) , blokta bulunan yüzde CV, numuneyi çalıştırmak için kullanılan gerilim ve tarih.
- Akış sitometri analiz yazılımı(Malzeme Tablosu)ile verileri analiz edin.
tıklayın ve dikdörtgen yapmak için işaretçiyi sürükleyin.
() tıklayın ve ardından işaretçiyi sürükleyip histogram çiziminin altında başka bir dikdörtgen oluşturun. Ardından histogram için seçilen aynı FCS dosyasına göz atın.
( ) ve şekil 8'deki nokta çiziminde gösterildiği gibi, diploid tepeden önce başlayan nokta çizimine bir kutu çizin (Şekil 8B'dekix ekseninde yaklaşık 100 ) ve x ekseninde 700 civarında sona eren B.
sonra belgenin üst kısmında bir kutu oluşturmak için işaretçiyi sürükleyin ve ardından aşağıdaki bilgileri yazın: Hasta Kimliği, POC Kimliği ve kullanılan blok (bir POC için birkaç blok olabileceğinden) , blokta bulunan yüzde CV, numuneyi çalıştırmak için kullanılan gerilim ve tarih.
Şekil 8: Bir histogram ı ve temsili bir örneğin (A) ve (B) geçitli nokta çizimini görüntüleyen ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Azı laklarının karmaşıklığı ve çeşitli genotiplere sahip olmaları, morfolojik değerlendirme, p57 immünohistokimyası, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve FISH gibi çeşitli yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, bir hastaya (1790) sadece POC'ların mikrodizi analizi ile triploid olduğu tespit edilen iki PHM ile sevk edildi. Bu nedenle hastaya tekrarlayan PHM tanısı konuldu. Hastanın dna'sı ve partneri ile birlikte iki "PHM"in mikrouydu genotiplemesinde hastanın ilk köstebeği triploid dispermik iken(Şekil 9A),ikinci "PHM"inde triploid digynik genotip saptandı (Şekil 9 B) ve bu nedenle bir PHM değil, non-molar düşük.
Şekil 9 A'daki (siyah) ilk işaretleyici POC'da iki tepe gösterir. İlk zirve anneden kaynaklanır, çünkü sadece anne bu büyüklükte bir tepeye sahiptir. Aynı mantıktaki ikinci zirve, aynı alelleri paylaştığı için babadan kaynaklanır. İkinci tepenin ilkinden çok daha yüksek olduğuna dikkat edin, bu da muhtemelen o tepede aynı baba alelinin iki dozolduğunu gösteriyor. Daha sonra daha ayrıntılı olarak açıklanacaktır maternal kontaminasyon, poc ikinci anne alel pozisyonunda çok küçük bir tepe görüntüler, çünkü bu POC çok azdır.
Şekil 9 A'daki ikinci işaretçi (mavi) POC'da üç tepe gösterir. Bu zirvelerden ikisi babadan, biri anneden geliyor. Böylece, poc'da üç alel, iki babadan ve bir anneden olmak üzere üç alel olduğu bu işaretten tekrar görülmektedir. Şekil 9A'daki üçüncü ve dördüncü belirteçler ilk işaretçiye benzer ve babadan gelen iki alel ve anneden bir alel gösterir.
Dört belirteç de sürekli olarak üç alel (doz veya farklı boyutlarda üç alel varlığı ile), iki baba ve bir anneden kaynaklanan göstermek bu yana, bir bu POC triploid dispermik olduğu sonucuna varabiliriz, ve PHM tanısı doğrular.
Şekil 9B'deki dört belirteç de yine üç alel gösterir: Ilk belirteç ilk tepede anneden kaynaklanan iki doz, babadan kaynaklanan ikinci tepede bir doz gösterir. İkinci ve dördüncü belirteçler üç farklı tepeyi (yani, üç farklı alel) gösterir, ikisi annedendir. Üçüncü belirteç, ilk tepede babadan kaynaklanan bir doz, ikinci tepede ise anneden kaynaklanan iki doz gösterir. Bu nedenle, bu POC kökenli triploid digynic kromozomlar iki set anne ve bir set baba dan geliyor gelir beri. Bu nedenle non-molar düşük.
Şekil 9: Hastanın temsili genotipleme sonuçları 1790. (A) Triploid dispermik genotip gösteren hastanın ilk gebeliği sonuçlarını seçin. (B) Triploid digynic genotip gösteren hastanın ikinci gebeliğinden genotipleme sonuçlarını seçin. X ekseni baz çiftleri halindedir; etiketler ve basepair boyutları basitlik için atlanmıştır. Y ekseni tepe yüksekliğini temsil eder ve benzer şekilde basitlik için figürden atlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu hastaya başlangıçta iki PHM tanısı konuldu ve tek bir PHM'si varken daha fazla ben riski nden endişe ediyordu. Bu durumda sadece POC üzerinde SNP mikrodizi sınırlama vurgulamaktadır. SNP mikrodizi güçlü bir yöntemdir ve herhangi bir kromozom (trizomiler, monozomlar veya non-diploid genotipler) aneuploidies tespit etmek için en iyisidir; ancak, ebeveyn DNA'sı analiz edilmeden poc üzerinde tek başına yapıldığında triploidin kökeni belirlenemez. Genotip analizi ve yorumu hakkında daha fazla açıklama için, Murphy ve ark.16tarafından çalışmaya bakın.
Şekil 10A'da gösterilen temsili sonuçlar triploid bir gebeliktir. X ekseninin değerleri nükleer DNA içeriğini temsil ediyor. Örneğin, 200, belirli miktarda nükleer DNA içeriği içeren hücrelere verilen rasgele bir sayıdır. Bu nedenle, 400'deki bir zirve, 200 zirveye kıyasla iki katı nükleer DNA içeriği içeren hücreleri temsil eder. 300 civarındaki küçük zirve, 200 ve 400 zirvesi arasında yer alan ve bu nedenle triploid tepe olan nükleer DNA içeriğini temsil eder. Diploid bir gebeliğin(Şekil 10B)300 değerinde herhangi bir tepe içermediğine dikkat edin.
Bazı durumlarda triploid tepe çok incedir(Şekil 10C). Ancak fark edilen triploid tepe belirtildiğinde, öncelikle akış sitometrisi analizinde kullanılan bölümlerde bulunan CV miktarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Bölümlerin cv'si yaklaşık %20'den az olsaydı, çok düşük bir zirve olması beklendiği için gerçek bir triploid olması muhtemeldir. Alınan bölümlerde yüksek miktarda CV varsa, POC başka bir diploid hücresel popülasyonvarlığı ile mozaikçilikten şüphelenir. Bu, mükemmel bir triploid dispermi uygun olup olmadığını görmek için genotipleme sonuçları yeniden gözden geçirerek kontrol edilebilir ya da ayrıca X probları ile FISH tarafından teyit edilebilir, Y, ve 18 kromozomlar. Ayrıca, bu makalede açıklanan yazılımı kullanarak, bölüm 2.4.1'de açıklandığı gibi, kullanıcının gerçekten varsa triploid hücreleri için zenginleştirmek için belirli bir bölgeye odaklanmasına olanak tanıyan belirli kapılar belirlemek mümkündür.
Şekil 10: (A) ve (C)'de triploid gebeliği gösteren temsili akış sitometrisi sonuçları ve (B)'de diploid döllenme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HM heterojen etiyolojileri ile anormal insan gebelikleri ve farklı histolojik ve genotik türleri vardır, hangi onların doğru sınıflandırma ve tanı zor hale getirir. Histopatolojik morfolojik değerlendirme genellikle yanlış kanıtlanmıştır ve bu nedenle HM'yi CHM ve PHM olarak sınıflandırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırt etmek için tek başına güvenilmezdir. Bu nedenle, HM doğru bir tanı multiks mikrouydu DNA genotipleme, akış sitometri sitometri sitometri sitomi ile ploidi analizi, FISH ploidy analizi ve p57KIP2 immünohistokimya gibi diğer yöntemlerin kullanımını gerektirir. Bu yöntemlerin her birinin kendi sınırlamaları ve avantajları vardır.
Multipleks genotipleme ve akış sitometrisinin sınırlamaları ve avantajları
FfPE dokuları ile çalışırken anne kontaminasyonu en sık karşılaşılan sorunlardan biridir ve yanlış tanıya yol açarak anneyi POC dokularından ayırmanın önemini vurgulayabilir. Genotipleme zirvelerinden ne beklenebilir ve yorumlanmasına yardımcı olmak için anne kontaminasyonunu belirlemek önemlidir. Kontaminasyon seviyesi çok büyükse ve sonuçların güvenilir bir şekilde yorumlanmasını engelliyorsa, mümkün olan tüm anne dokularının çıkarılmasına ekstra özen göstererek DNA izolasyonunu ve ekstraksiyonunu tekrarlayın. Dokuların morfolojisinin net olmadığı bölgelerde, maternal kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için bu bölgelerin çıkarılması daha iyidir. Bu protokolde açıklanan yöntemin ilk avantajı, daha düşük maliyetine ek olarak, anne dokularının slaytlardan uzaklaştırılması, diğer yöntemlerin ise POC dokularının toplanmasından oluşmasıdır (bunları havaya maruz kaldığında polimerize olan çözelti ile kaplayarak ve dokuların kaldırılması) anne dokuları çıkarmadan. Burada açıklanan yöntem böylece kişinin kalan POC dokularına ikinci bir göz atmasına, gerektiğinde yeniden temizlenmesine ve daha sonra dna toplamasına ve çıkarmasına olanak tanır. İkinci avantajı ise, lekesiz kesitler ve örtülü harita kaydırağı nın kullanılmasının aksine, anne dokularının çıkarılmasını büyük ölçüde kolaylaştıran, ortaya çıkarılan H&E lekeli kesitlerde dokuları temizlememizdir. Ancak, ek boyama daha DNA bozabilir, ve bu daha fazla bölüm ekleyerek telafi edilir.
Analiz için ebeveyn DNA kullanılabilirliği başka bir sorundur. Her iki ebeveynin varlığı büyük ölçüde analiz ve genotipleme sonuçlarının yorumlanması kolaylaştırır. Ne yazık ki, ancak, baba DNA'sı mevcut değildir, bu da bazen analizi zorlaştırabilir, özellikle poc DNA'sının kalitesinin önceden fiksasyon veya uzun süreli depolama nedeniyle zayıf olduğu durumlarda (çalışırken daha sık tekrarlayan HM ile). Ayrıca, anne kanı her zaman DNA ekstraksiyonu için mevcut olmayabilir. Bu gibi durumlarda, maternal DNA daha önce açıklandığı gibi FFPE bloklarında bulunan maternal endometrial dokulardan elde edilebilir16. Ayrıca, yardımcı üreme teknolojilerinin kullanımından kaynaklanan azı laksamalarının karakterizasyonu mikrouydu genotip analizini zorlaştırabilir, çünkü vakaların çoğunda donörlerden (erkek veya dişilerden) alınan DNA genellikle mevcut değildir.
Son olarak, büyük zirveleri pik yüksekliği açısından daha kısa olma eğilimindedir gerçeği, özellikle tepe yükseklikleri tek bir tepe de iki doz veya bir doz olup olmadığını belirlemek için kullanılması gerektiğinde, karışıklık başka bir olası kaynağıdır. Bunun üstesinden gelmenin bir yolu, ffpe dokularından dna'nın bozulmuş doğası nedeniyle büyük alel boyutu (baz çifti sayısı) zirvelerinin daha kısa olma eğiliminde olduğunu her zaman akılda tutmaktır, bu da daha büyük alellerin amplifikasyonu için daha az DNA kullanılabilir hale getirir. Buna ek olarak, daha kısa bir PCR parça amplifikasyonu daha büyük bir daha az zaman alır ve DNA'nın üstel amplifikasyonu daha büyük aleller daha az miktarda yol açar.
Akış sitometrisinin ana dezavantajı triploid gebelerin bazen gözden kaçabilir olmasıdır ve bu bloktaki yetersiz cv miktarlarından kaynaklanabilir. Ancak, bir triploid tepe varlığı bir triploid kesin bir göstergesidir. Bu yöntemin bu protokolü kullanarak trizomileri, tetraploid gebeleri veya diğer aneuploileri algılayacak kadar hassas olmadığını unutmayın. Tetraploid döllenmeler bu protokol tarafından saptanamaz, çünkü tetraploid tepe hücre döngüsünün G2 fazında aynı dikoid hücrelerin zirvesine karşılık gelir.
Bu sınırlamaları ve zorlukları bilmek hataları nazaltılmasına yardımcı olur. Bu nedenle önemli ve bazen farklı yöntemlerle aynı doku analiz etmek için gerekli, sonuçları karşılaştırmak, ve birbirleriyle uyumlu olduğundan emin olun. Değilse, sonuçların yeniden gözden geçirilmesi ve analizlerin tekraredilmesi gerekir. Çakışan sonuçlar gösteren birkaç durumda, tutarsızlıklar sadece deneyleri tekrarlayarak ve orijinal sorundan kaçınmak için uygun özen göstererek çözüldü. Diğer durumlarda, doku kesitlerinde FISH gibi ek yöntemler icra edilerek veya uygun belirteçlerle ek simpleks genotipleme yaparak tutarsızlıklar giderilmiştir.
Anne kontaminasyonunun belirlenmesi
POC DNA'sının maternal DNA ile kontaminasyonunun belirlenmesi ile ilgili olarak, kontaminasyon seviyesi POC'a iletilen maternal alel(ler)e ek olarak, POC'daki tüm lokuslarda tüm anne alellerinin varlığıyla yansıtılacaktır veya tanınacaktır.
Şekil 11A'damaternal DNA kontaminasyonundan kaynaklanan zirveler "c" ile etiketlenmiştir. Her tepe "c" ile işaretlenmiş anne de mevcut olduğunu dikkat edin, ve biz her üç işaretleri bu "c" zirveleri bakın. İkinci işaretçi için (mavi), "c" ile gösterilen maternal kontaminasyon zirvesinin ilk işaretleyicideki her "c" zirvesinden daha yüksek olduğunu, çünkü anne ikinci işaretleyici için homozigotdur; bu nedenle bu belirteç için kirleticinin yüksekliği iki katına çıkarılır. Bu POC'da, anne tarafından türetilen zirveler yoktur. Başka bir deyişle, bu POC anneden herhangi bir alel miras vermedi. Her işaretçide tek bir gerçek tepe vardır ve bu tepe annede bulunmaz. Bu yüzden gerçek zirvelerin babadan gelmiş olması gerektiğini biliyoruz. Diploidi gösteren karyotip veya akış sitometri analizinden elde edilen ploidi bilgi ile bu POC'nin hem androgenetik hem de diploid olduğu sonucuna varmak mümkündür.
Ayrıca, Şekil 11A'daki bu üç işaretçi, her işaretçi için her zaman tek bir gerçek tepe olduğunu ortaya koymaktadır. Sadece üç işaretleri burada gösterilmiştir, ancak, multipleks kitleri genellikle aynı desen ortaya çıkaracak çok daha fazla işaretleri ile birlikte gelir. Bu POC diploid olduğundan, her tepede iki doz olmalıdır. Bu bilgilerle, bu POC'nin androgenetik monospermik olduğu ve her bir belirteçte homozigot olduğu sonucuna varabiliriz.
Şekil 11B, diploid çift ebeveynli POC'yi temsil eder. İlk işaretçinin ilk zirvesi (yeşil) arasındaki küçük siyah çubuk, bu gerçek tepede bulunan tahmini kontaminasyon miktarını temsil eder. "R", poc DNA'sından gelen bu tepenin gerçek kısmını gösterir; "c" anne DNA'sından gelen bu tepenin kirletici kısmını temsil eder. Bir kontaminasyon seviyesini nasıl belirleyebiliriz? Anne alellerinden biri POC'da bulunmadığı ndan, annede bir belirteç heterozigot olduğunda bu durumda mümkündür. Örneğin, "c" ile etiketlenmiş ilk işaretleyicideki küçük tepe, bunun diğer anne tarafından kalıtsal tepe için beklenmesi gereken kontaminasyon düzeyi olduğunu gösterir. Sonuç olarak, maternal kökenli tüm POC zirveleri, az miktarda ki kontaminasyon nedeniyle babatarafından kalıtsal olarak devralınan zirvelerden biraz daha yüksektir. Şekil 11B'dekiüçüncü belirteç (siyah) için kontaminasyon seviyesinin normal miktarın iki katı olması beklenmektedir (çünkü anne bu spesifik belirteç için homozigotdur) ve bu nedenle ilk tepede sadece bir doz olduğu sonucu POC'da.
Şekil 11C triploid dispermik POC'u göstermektedir. İlk işaretçi (yeşil) POC'da üç tepe yi gösterir. Bu üç zirve benzer yüksekliklere sahip olduğundan, bu POC büyük olasılıkla triploid olduğu sonucuna varmak mümkündür. Bu işaretçideki üçüncü tepenin ilkinden daha kısa olduğunu unutmayın. Genel bir eğilim olarak, daha büyük zirvelerin daha kısa olma eğiliminde olması nedeniyle bu beklenir. İkinci tepe ilkinden biraz daha yüksektir ve bu, bar ve "c" ile belirtildiği gibi az miktarda anne kontaminasyonu yla hesaplanabilir. Ayrıca, bu üç tepeden ikisi annede bulunmaz ve bu nedenle babadan gelmiş olmalıdır. Şimdiye kadar, bu belirteç POC triploid olabileceğini gösterir (veya trizomi) ve kromozomların ekstra kümesinin kökeni baba olduğunu. Aynı zamanda bir dispermik gebe olduğunu gösterir, POC babadan iki farklı alelleri miras beri.
Şekil 11C'deki ikinci işaretçi (mavi) yalnızca iki tepeye sahiptir. Kontaminasyon düzeyi muhasebeden sonra, ikinci zirve ilkinden daha yüksek görünür ve bu daha büyük zirvelerin daha küçük olması için genel eğilime rağmen (analiz sırasında her zaman akılda tutulması gereken bir eğilim). Böylece, bu büyük bir tepe iki doz olması muhtemeldir. Bu da ilk belirteç triploidi göstergesi olduğu gerçeği ile desteklenir.
Son olarak, Şekil 11C'deki üçüncü belirteç (siyah) üç tepe yi gösterir ve yine triploidin göstergesidir. Çok katlı kitlerin çoğu farklı kromozomlardan geldiği için, bir POC'nin birkaç farklı belirteç arasında üç alelin aynı eğilimi gözlemledikten sonra triploid olduğu güvenle sonuçlandırmak mümkündür. Ayrıca bu işaretten, üç tepeden ikisinin babadan kaynaklandığı na dikkat edin, bu da dispermik kökeni doğrular.
Şekil 11: Maternal kontaminasyonun etkisini gösteren genotipleme sonuçları. Üst paneller POC'ye ait alelleri, alttaki paneller ise anneye ait olanları gösterir. (A),POC androgenetik monospermik ve kontaminasyon düzeyi bir ok ve harf "c ile vurgulanır." (B),POC diploid biparental ve kontaminasyon düzeyi "c" harfi ile vurgulanır. (C),POC triploid dispermik tir ve kontaminasyon seviyesi "c" harfi ile vurgulanır. Küçük siyah çubuklar, tepe yüksekliklerinin ne kadarının anne kontaminasyonundan geldiğini gösterir ve bu nedenle tepe yükseklikleri karşılaştırırken dikkate alınmalıdır. X ekseni baz çiftleri halindedir; etiketler ve basepair boyutları basitlik için atlanmıştır. Y ekseni tepe yüksekliğini temsil eder ve benzer şekilde basitlik için figürden atlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Zorlu vakalara örnekler
Bir dizi durumda, sadece aynı anda her üç değerlendirme (yani, akış, p57KIP2, ve multipleks genotipleme) sahip bir sonuca ulaşmak mümkün oldu. Örneğin, bir durumda (808) olmayan bir molar düşük olarak adlandırıldı. Histopatolojik değerlendirme, molar döllenme şüphesine ve POC'nin genotipleme analizine yol açarak üç tepeyi açıkça gösteren bir belirteç ortaya çıkardı (ikisi babadan, biri anneden). P57KIP2 sonuçları kesin değildi. Akış sitometri analizi FISH analizi ile doğrulandı küçük bir triploid tepe ortaya, ayrıca başka bir diploid hücresel popülasyonvarlığını ekarte. FISH onayı ile, POC gerçekten bir triploid dispermik köstebek olduğu sonucuna varmak mümkün oldu.
Başka bir olgu (1192) da non-molar düşük olarak adlandırıldı. Bu POC'nin CV'si anne dokuları ile iç içe ydi ve son derece nekrotik tiyatla, temizlik sürecini çok zorlaştırıyordu. Sonuç olarak, ilk genotipleme analizi yüksek düzeyde maternal kontaminasyon göstermiştir, böylece her maternal alel POC'da görülebilir (olası kontaminasyonun iyi bir göstergesidir). Ayrıca, p57KIP2 ne yazık ki sonuçsuz oldu, büyük olasılıkla dokunun nekrotik doğası nedeniyle, belki de gecikmiş fiksasyon nedeniyle. Akış sitometri sonuçları, ancak, triploidi göstergesi idi, ayrıca FISH tarafından doğrulandı. DNA kontaminasyon seviyesini azaltmak ve belirsiz morfolojisi olan dokuları ortadan kaldırmak amacıyla yeniden çıkarıldı. Yeni genotipleme sonuçlarının analizi, maternal kontaminasyonun olası varlığını hesaplarken, POC'nin triploid dispermik XXY PHM olduğu sonucuna varmamızı sağladı.
Tablo 4, analiz için kullanılan tipik yöntemleri özetleyilmiştir. HM şüphesi olan tüm dokularda morfolojik değerlendirme ve p57KIP2 immünohistokimyası ve en az bir genotipleme yöntemi kullanılması önerilir. Genotipleme yöntemleri arasında en bilgilendirici olan çok katlı DNA genotiplemedir. Farklı yöntemler arasındaki sonuçlar uyumlu olmadığında veya bazı sonuçlar yetersiz olduğunda, diğer genotipleme yöntemlerinin kullanılması gerekir. Tablo, her olası HM türü için beklenen uyumlu sonuçları, nadir istisnalar ve bunları çözmek için önerilerle birlikte gösterir.
Tablo 4: Tipik çözümleme sırası, beklenen sonuçlar ve bunları çözmek için önerilerile birlikte nadir özel durumlar. P57KIP2 immünohistokimya, CDKN1C geni tarafından kodlanmış p57KIP2proteininin ekspresyonunu saptamayı amaçlamaktadır. Bu gen paternally sitotrophoblast ve ilk trimester plasenta villous stroma baskılı ve sadece maternal genom ifade edilir. Bu nedenle, poc maternal genomvarlığını kolay ve ucuz bir şekilde tespit etmek için yardımcı bir belirteç olarak kullanılır. Morfolojik değerlendirmeye paralel olarak HM olduğundan şüphelenilen tüm POC'lar için p57KIP2 immünohistokimyasının yapılması tavsiye edilir. Yazarın laboratuvarında, p57KIP2 antikor ve Malzemeler Tablosu'nda belirtilen platformlar kullanılır ve yazarlar sonuçların kalitesinden çok memnundurlar. Kısaltmalar: IHC = immünohistokimya; Dip Ve = diploid androgenetik; Dip Bip = diploid biparental; Chr = kromozom; MC = düşük; ve TP = trofoblastik proliferasyon.
Yazarların bilgi en iyi, bu makalenin akış sitometri yanı sıra ffpe POC dokuların düşük maliyetli ve yüksek kaliteli multiks mikrouydu DNA genotipleme için ayrıntılı protokoller sağlamak için ilk. Sonuçların yorumlanması, sorun giderme ve doğru sonuçlara ulaşmak ve POC'lar ve HM tanıları ile diğer yöntemlerle entegrasyon ile birlikte açıklanmıştır. Yazarlar içtenlikle bu makalenin bu karmaşık varlık anlamaya çalışan araştırmacılar için yararlı olabilir umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar sophie Patrier ve Marianne Parésy orijinal akış sitometri protokolü paylaşımı için teşekkür ve Promega ve Qiagen malzemeleri ve reaktifler sağlamak için. Bu çalışma Réseau Québécois en Reprodüksiyon ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (MOP-130364) tarafından R.S.'ye destek lenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
