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Genetics

माइक्रोसैटेलाइट डीएनए जेनोटाइपिंग और फ्लो साइटोमेट्री प्लॉयडी फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड हाइडाटिफॉर्म मोलर टिज़केस का विश्लेषण करता है।

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60366
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2,3
1Department of Experimental Medicine, McGill University, 2Department of Human Genetics, McGill University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, McGill University

Summary

Hydatidiform moles विषमांगी एटिओलोलोजी के साथ असामान्य मानव गर्भधारण कर रहे हैं कि उनके आकृतिक सुविधाओं और मोलर जीनोम के लिए माता पिता का योगदान के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है. यहाँ, मल्टीप्लेक्स माइक्रोसेटेलाइट डीएनए जीनोटाइपिंग और प्रवाह साइटोमेट्री के प्रोटोकॉल को फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड मोलर ऊतकों के विस्तार से वर्णित किया गया है, परिणामों की व्याख्या और एकीकरण के साथ।

Abstract

Hydatidiform तिल (एचएम) एक असामान्य मानव गर्भावस्था अत्यधिक trophoblastic प्रसार और असामान्य भ्रूण विकास की विशेषता है. सूक्ष्म रूपात्मक मूल्यांकन, पूर्ण एचएम (सीएचएम) और आंशिक एचएम (पीएचएम) के आधार पर एचएम के दो प्रकार हैं। इन्हें मोलर जीनोम में माता-पिता के योगदान के आधार पर और विभाजित किया जा सकता है। एचएम की ऐसी विशेषता, आकृति विज्ञान और जीनोटाइप विश्लेषण द्वारा, रोगी प्रबंधन के लिए और इस पेचीदा विकृति की मौलिक समझ के लिए महत्वपूर्ण है। यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि एचएम के रूपात्मक विश्लेषण व्यापक interobserver परिवर्तनशीलता के अधीन है और अपने दम पर पर्याप्त नहीं है सही CHM और PHM में एचएम वर्गीकृत और उन्हें hydropic गैर-मोलर गर्भपात से अलग. जेनोटाइपिंग विश्लेषण ज्यादातर डीएनए और ऊतकों पर औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) गर्भाधान के उत्पादों से किया जाता है, जो इष्टतम गुणवत्ता से कम है और इसके परिणामस्वरूप गलत निष्कर्ष ले जा सकता है। इस आलेख में, FFPE मोलर ऊतकों के मल्टीप्लेक्स जीनोटाइपिंग और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं, इन विधियों के परिणामों की व्याख्या के साथ, उनकी समस्या निवारण, और आकृतिक मूल्यांकन के साथ एकीकरण , p57KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, और एक सही और मजबूत निदान तक पहुँचने के लिए situ संकरीकरण (फिश) में फ्लोरोसेंट। यहाँ, लेखकों तरीकों और गर्भाधान के लगभग 400 उत्पादों के विश्लेषण से पिछले 10 वर्षों में सीखा सबक का हिस्सा है.

Introduction

एक hydatidiform तिल (एचएम) एक असामान्य मानव गर्भावस्था असामान्य भ्रूण विकास, ट्रोपोब्लास्ट के अतिप्रसार, और chorionic villi (सीवी) के हाइड्रोपिक अध: पतन की विशेषता है। ऐतिहासिक रूप से, एचएम को दो प्रकारों में विभाजित किया जाता था, पूर्ण एचएम (सीएचएम) और आंशिक एचएम (पीएचएम) केवल आकृतिक मूल्यांकन1पर आधारित होता था। तथापि, यह दर्शाया गया है कि केवल रूपात्मक मूल्यांकन एचएम को दो उपप्रकारों (सीएचएम और पीएचएम) में वर्गीकृत करने और उन्हें गैर-मोलर गर्भपात2,3,4से अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं है।

क्योंकि CHM और PHM द्रोह करने के लिए विभिन्न propensities है, इसलिए यह सही रोगियों के लिए उचित अनुवर्ती और प्रबंधन प्रदान करने के लिए एचएम के जीनोटिपिक प्रकार का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। नतीजतन, पिछले दशकों में, कई तरीकों को विकसित किया गया है और मोलर ऊतकों के लिए माता पिता के योगदान की पहचान करने और एचएम का एक सही वर्गीकरण तक पहुँचने के उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है। इनमें केरियोटाइप विश्लेषण, गुणसूत्र बैंडिंग बहुरूपता, मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन (एचएलए) सीरियोलॉजिकल टाइपिंग, प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता, अग्रानुक्रम दोहराता की चर संख्या, माइक्रोसैटेलाइट जीनोटाइपिंग, प्रवाह साइटोमेट्री, और p57 शामिल हैं। KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री. यह उनके जीनोम के लिए माता पिता के योगदान के आधार पर एचएम अवधारणाओं का सटीक उपविभाजन की अनुमति दी है, इस प्रकार है: CHM, जो द्विगुणित और पादपिक मोनोस्पर्मिक या द्विगुणित और पादपजनिक अपरूपण कर रहे हैं, और PHM, जो त्रिगुणित हैं, 99% में dispermic और 1% मामलों में मोनोस्पर्मी5,6,7,8. इसके अलावा, वहाँ एचएम का एक और जीनोटिपिक प्रकार है कि पिछले दो दशकों में उभरा है, जो द्विगुणित द्विगुणित है. उत्तरार्द्ध ज्यादातर आवर्तक है और एक ही परिवार के सदस्य (सरल मामलों) या कम से कम दो परिवार के सदस्यों (परिवार के मामलों) को प्रभावित कर सकते हैं. ये द्विगुणित द्वि-पैरेले मोल्स अधिकतर रोगियों में एनएलआरपी7 या केएचडीसी3एल में अप्रभावी उत्परिवर्तनों के कारण होते हैं9,10,11,12. NLRP7 में अप्रभावी उत्परिवर्तन ों वाले रोगियों में द्विगुणित द्वि-माता- एचएम को रूपात्मक विश्लेषण द्वारा सीएचएम या पी एच एम के रूप में निदान किया जा सकता है और ऐसा रोगियों में उत्परिवर्तनों की गंभीरता से जुड़ा हुआ प्रतीत होता है13,14. एचएम के वर्गीकरण के अलावा उनके जीनोटाइप के अनुसार, कई जीनोटाइपिंग विधियों के परिचय और उपयोग ने विभिन्न मोलर संस्थाओं के भेद को गैर-मोलर गर्भपातों से भेद की अनुमति दी, जैसे कि एनुलॉयड द्विगुणित द्विगुणित संकल्पनाऔर अन्य प्रकार की धारणाएं5,15. इस तरह की धारणाओं में कुछ ट्रोफोब्लास्ट प्रसार और असामान्य ग्रामीण आकृति विज्ञान हो सकता है जो कुछ हद तक एचएम की कुछ आकृतिक विशेषताओं की नकल करते हैं।

इस लेख का उद्देश्य multix जीनोटाइपिंग और औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों के प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है, और इन विधियों के परिणामों और अन्य तरीकों के साथ उनके एकीकरण के व्यापक विश्लेषण के लिए मोलर ऊतकों का सही और निर्णायक निदान।

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Protocol

इस शोध अध्ययन को मैकगिल संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी रोगियों को अध्ययन में भाग लेने के लिए लिखित सहमति प्रदान की और गर्भाधान के अपने FFPE उत्पादों (पीओसी) विभिन्न पैथोलॉजी विभागों से प्राप्त किया है।

नोट: जबकि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जीनोटाइपिंग और गुणा निर्धारण के लिए कई तरीके हैं, यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल प्रत्येक के लिए एक मंच का उपयोग करके विश्लेषण की एक विधि का वर्णन करते हैं।

1. जेनोटाइपिंग

  1. सर्वश्रेष्ठ FFPE ब्लॉक का चयन
    1. गर्भाधान (पीओसी) के प्रत्येक एफएफपीई उत्पाद के लिए, माइक्रोस्कोपी द्वारा आकृतिक मूल्यांकन के लिए, खंड 1.2 और 1.3 में वर्णित के रूप में 4 मीटर मोटी हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग वर्गों तैयार करें।
    2. एच एंड ई स्लाइड और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, FFPE ब्लॉक है कि chorionic villi (सीवी) की सबसे बड़ी राशि है का चयन करें, और यदि संभव हो तो, ब्लॉक है कि सीवी से अलग है, और नहीं के साथ intermingled, मातृ ऊतकों.
  2. अनुभागीकरण
    1. अनुभाग की सुविधा के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ पर चुना ब्लॉक रखें।
    2. सूक्ष्म रूपात्मक रूपात्मक मूल्यांकन के लिए 4 डिग्री मीटर मोटी और डीएनए निष्कर्षण के लिए 10 डिग्री मीटर मोटी वर्गों में कटौती करने के लिए सूक्ष्मकोत समायोजित करें।
    3. microtome में ठंडा ब्लॉक प्लेस और एच एंड ई धुंधला और चुने हुए ब्लॉक से 10 डिग्री 30 वर्गों के लिए प्रत्येक ब्लॉक से एक खंड में कटौती, ब्लॉक में सीवी की राशि के आधार पर, डीएनए निष्कर्षण के लिए.
      नोट: सीवी से भरे हुए ब्लॉक के लिए, 10 अनुभाग डीएनए निष्कर्षण के लिए पर्याप्त हैं। यदि ब्लॉक के केवल 10% के बारे में सीवी शामिल हैं, जबकि बाकी मातृ ऊतकों हैं, तो डीएनए की पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए 20 डिग्री 30 वर्गों की आवश्यकता है।
    4. संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक अनुभाग को 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें। एक सकारात्मक आरोप स्लाइड के साथ पानी के स्नान से अनुभाग उठाओ (सामग्री की तालिका) कि पहले एक पेंसिल का उपयोग नमूना पहचान संख्या के साथ लेबल है.
    5. 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में वर्गों युक्त स्लाइड प्लेस वर्गों स्लाइड का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए। 25 मिनट के लिए ओवन में एच एंड ई के लिए स्लाइड रखें. 20 मिनट के लिए ओवन में डीएनए निष्कर्षण के लिए स्लाइड रखें।
      नोट: कम ऊष्मायन समय ऊतकों को स्लाइडों से थोड़ा कम अनुयायी बनाता है और परिणामस्वरूप मातृ ऊतकों को हटाने में मदद करता है।
  3. एच एंड ई धुंधला
    1. स्लाइड कमरे के तापमान (10 मिनट) को ठंडा करने की अनुमति दें।
    2. अभिकर्मक तैयारी
      1. Eosin Y कार्य समाधान तैयार करें (0.25%) तालिका 1के अनुसार। अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      2. पानी में हेमटॉक्सिलिन 5x के स्टॉक समाधान को कम करके काम कर रहे हेमेटॉक्सिलिन समाधान तैयार करें (यानी, 20 एमएल हेमेटोक्सिलिन के साथ 80 एमएल पानी मिलाएं)।
        नोट: भंडारण के लिए पन्नी में हेमेटॉक्सिलिन के स्टॉक समाधान लपेटें।
    3. सारणी 2के अनुसार धूआं के हुड के नीचे सही अभिकर्मकों के साथ दागदार जार तैयार कीं।
    4. तालिका 2के अनुसार सही समय अवधि के लिए उपयुक्त धुंधला जार में स्लाइड को डुबोकर एच एंड ई के दाग को निष्पादित करें।
    5. कांच के कवरलिप्स (सामग्री कीसारणी)के साथ बढ़ते मध्यम और आवरण के साथ आकृतिक विश्लेषण के लिए 4 डिग्री मीटर खंडों को माउंट करें।
      नोट: जीनोटाइपिंग के लिए 10 डिग्री मीटर वर्गों को कवर नहीं किया जाना चाहिए।
    6. विषाक्त xylene odors नष्ट करने के लिए आदेश में 3 एच की एक न्यूनतम के लिए धूआं हुड के तहत 10 डिग्री मीटर वर्गों छोड़ दें.
      चेतावनी: सभी धुंधला कदम एक धूआं हुड के तहत प्रदर्शन किया जाना चाहिए. Xylene उत्पादों को हुड के नीचे हर समय रखा जाना चाहिए क्योंकि xylene odors विषाक्त कर रहे हैं. इसके अलावा, xylene और hematoxylin विशेष कंटेनरों में खारिज करने की जरूरत है. एक बार इन कंटेनरों भरा हुआ है, वे प्रयोगशाला के सुरक्षा संगठन द्वारा की सिफारिश के रूप में खारिज कर दिया जाना चाहिए.
अभिकर्मक मात्रा
Eosin वाई शेयर समाधान (1%) 250 एमएल
80% इथेनॉल 750 एमएल
ग्लेशियल एसिटिक एसिड (केंद्रित) 5 एमएल

तालिका 1: Eosin Y कार्य समाधान (0.25%) तैयारी.

अभिकर्मक इस्तेमाल किया (100 एमएल प्रति बिन) अवधि
1) Xylene 5 मिनट
2) Xylene 5 मिनट
3) 100% इथेनॉल 2 मिनट
4) 95% इथेनॉल 2 मिनट
5) 70% इथेनॉल 2 मिनट
6) 50% इथेनॉल 2 मिनट
7) आसवन पानी 5 मिनट
8) हेमैटोक्सिलिन 4 मिनट
9) आसवनित जल 5 मिनट
10) ईओसिन 1 मिनट
11) 95% इथेनॉल 5 मिनट
12) 100% इथेनॉल 5 मिनट
13) जाइलीन 5 मिनट
14) Xylene 5 मिनट

तालिका 2: अभिकर्मकों और एच एंड ई धुंधला प्रोटोकॉल के लिए durations.

  1. सीवी का अलगाव
    1. एक हल्के स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, एच एंड ई से अवांछित मातृ ऊतकों को खत्म करने के लिए पानी से बने कागज पोंछे (सामग्री की तालिका)के संदग और छोटे टुकड़े का उपयोग करें।
      नोट: अंतिम लक्ष्य के लिए कुछ भी नहीं है लेकिन CV या भ्रूण झिल्ली रखने के लिए है (जब मौजूद) स्लाइड पर और इस तरह अन्य सभी ऊतकों को दूर करने के लिए. इस कदम के समय और धैर्य की एक बहुत जरूरत हो सकती है, ब्लॉक पर निर्भर करता है, क्योंकि यह विवरण के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है.
    2. एक दूसरे व्यक्ति को सफाई के बाद स्लाइड की दो बार जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे मातृ ऊतकों से मुक्त हैं।
    3. डेटा व्याख्या के साथ मदद करने के लिए निम्नलिखित दस्तावेज़ साफ़ करें या दस्तावेज़ की फ़ोटो लें: 1) क्या ऊतक को साफ करना मुश्किल था, रक्तस्रावी, या बहुत साफ, 2) उपयोग किए गए वर्गों की संख्या, और 3) साफ ऊतकों की अनुमानित राशि।
      नोट: चित्र 1 साफ़ करने के लिए आसान है जो किसी स्लाइड का एक उदाहरण प्रदान करता है। सीवी की मोटे तौर पर इस राशि वाले एक ब्लॉक के लिए, 10 वर्गों डीएनए निष्कर्षण के लिए पर्याप्त हैं। चित्र 2 में स्लाइड में बहुत कम सीवी है जो मातृ ऊतकों के साथ intermingled हैं, यह बहुत मुश्किल है और साफ करने के लिए समय लेने वाली बना रही है। सीवी की लगभग इस राशि वाले ब्लॉक के लिए, डीएनए निष्कर्षण के लिए 30 वर्गों की आवश्यकता होती है।
    4. कागज पोंछे के छोटे गीला टुकड़े का उपयोग कर CV ले लीजिए. forceps का उपयोग करना, गीला कागज पोंछे के बाहर एक छोटा सा टुकड़ा आंसू और इसका इस्तेमाल CV इकट्ठा करने के लिए.
    5. कागज पोंछे के टुकड़े उनके संलग्न CV के साथ एक लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में रखें.
    6. इस चरण में उपयोग किए गए पेपर वाइप्स की मात्रा को कम करें क्योंकि बहुत अधिक डीएनए निष्कर्षण कॉलम को रोक सकता है और परिणामस्वरूप एकत्र किए गए डीएनए की अंतिम मात्रा को कम कर सकता है। औसत पर, प्रति नमूना कागज पोंछे के कम से कम सात छोटे टुकड़े का उपयोग करने का लक्ष्य. यदि सीवी की बड़ी मात्रा की उपस्थिति के कारण यह संभव नहीं है, तो निष्कर्षण की सुविधा के लिए नमूने को दो ट्यूबों के बीच विभाजित करें।

Figure 1
चित्र 1: जीनोटाइपिंग के लिए प्रतिनिधि स्लाइड. ऊपर: एक स्लाइड है कि मातृ ऊतकों से मुक्त बनने के लिए "साफ" की जरूरत है. नीचे: एक ही स्लाइड के बाद यह साफ किया गया है दिखाया गया है और अब डीएनए निष्कर्षण के लिए CV के अलावा कुछ भी नहीं होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जीनोटाइपिंग के लिए प्रतिनिधि स्लाइड। ऊपर: एक स्लाइड है कि मातृ ऊतकों से मुक्त बनने के लिए "साफ" की जरूरत है. नीचे: एक ही स्लाइड के बाद यह साफ किया गया है दिखाया गया है और अब डीएनए निष्कर्षण के लिए CV के अलावा कुछ भी नहीं होता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. डीएनए निष्कर्षण करने के लिए FFPE किट (सामग्री की तालिका)से डीएनए निष्कर्षण के प्रोटोकॉल का पालन करें।
    नोट: कुछ किट अंतिम elution के लिए elution बफर के 15 डिग्री 20 $L का उपयोग करने की सलाह देते हैं. अनुभव से, elution बफर के 15 डिग्री एल के साथ elution सबसे नमूने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. आवश्यकता के रूप में स्टॉक डीएनए से dilutions तैयार किया जा सकता है.
  1. डी.ए.ए.ए. परिमाणन
    1. एक प्रयोगशाला स्पेक्ट्रोफोटोमीटर डिवाइस का उपयोग करना, डीएनए के 1 डिग्री एल लोड और परिमाणीकरण के लिए 260 एनएम पर अवशोषण उपाय.
    2. एक 2% agarose जेल पर डीएनए के 1 $L लोड और गुणात्मक मूल्यांकन के लिए 80 डिग्री 100 वी की वोल्टेज पर जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस चलाते हैं।
    3. 1.6.1 और 1.6.2 चरणों के परिणामों के आधार पर, मल्टीप्लेक्स लघु अग्रानुक्रम दोहराने (एसटीआर) बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) प्रवर्धन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए डीएनए की मात्रा का चयन करें। पीसीआर प्रवर्धन है कि इस प्रकार में डीएनए के 1000 एनजी की एक न्यूनतम का उपयोग करने के लिए लक्ष्य।
      नोट: चित्रा 3 डीएनए की सांद्रता के साथ जैल के प्रतिनिधि उदाहरण प्रदर्शित करता है (स्पेक्ट्रोफोटोमीटर परिणामों के आधार पर), और इस प्रकार मल्टीप्लेक्स एसटीआर पीसीआर के लिए सिफारिश की है कि डीएनए समाधान की मात्रा.

Figure 3
चित्रा 3: डीएनए परिमाणीकरण के लिए प्रतिनिधि जेल. शामिल प्रत्येक डीएनए की सांद्रता, के रूप में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर मापा, और मल्टीप्लेक्स पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया मात्रा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. पीसीआर प्रवर्धन
    1. एक मल्टीप्लेक्स एसटीआर प्रणाली(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर फ्लोरोसेंट माइक्रोसैटेलाइट जीनोटाइपिंग करें।
    2. मल्टीप्लेक्स एसटीआर प्रणाली (सामग्री कीतालिका)का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन के लिए चित्र 4 में दर्शाए गए PCR स्थितियों का उपयोग करें।
      नोट: निम्नलिखित प्राइमर इस मल्टीप्लेक्स एसटीआर सिस्टम में उपयोग किया जाता है: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D58, D13S317, D58.

Figure 4
चित्र 4: मल्टीप्लेक्स एसटीआर सिस्टम के लिए PCR चक्र शर्तें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा पीसीआर उत्पादों को हल करें।
    1. मल्टीप्लेक्स प्रणाली के आंतरिक मानक लेन के 0.5 डिग्री एल में प्रत्येक प्रवर्धित नमूने के 1 डिग्री सेल्सियस और अत्यधिक deionized formamide के 9.5 डिग्री एल (सामग्री की तालिका) निलंबित.
    2. उपकरण और मल्टीप्लेक्स सिस्टम के डाई सेट के लिए एक उपयुक्त पृथक्करण मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण ( सामग्री कीतालिका) के माध्यम से नमूने चलाएं।
  1. डेटा विश्लेषण
    1. एक डीएनए टुकड़ा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण और उनके मूल निर्धारित करने के लिए माता पिता के alleles के लिए POC alleles की तुलना करें.
    2. आकार मानक सेट करें.
      नोट: यह सॉफ्टवेयर मल्टीप्लेक्स एसटीआर प्रणाली में उपयोग किया जाता है कि सीढ़ी को पहचान करने के लिए, और सीढ़ी के आधार पर amplicons के लिए basepairs आवंटित करने के लिए अनुमति देता है। निम्नलिखित कदम एक विशिष्ट सॉफ्टवेयर के लिए कर रहे हैं (सामग्री की तालिका) लेकिन सॉफ्टवेयर के अन्य प्रकार की स्थापना के लिए मदद के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है.
      1. सॉफ़्टवेयर खोलें। नई परियोजना प्रारंभ करें पर क्लिक करें और फिर नए आकार मानकपर क्लिक करें.
      2. आकार मानक को एक नाम दें (उदा., ABI$600).
      3. नया आकार मानक परिभाषा दर्ज करेंनाम बॉक्स में: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 475, 500, 550, 650. फिर आकार जोड़ें पर क्लिक करें|
        नोट: दर्ज की गई संख्याएँ दाईं ओर बॉक्स के नीचे दिखाई देंगी, जिसका नाम वर्तमान आकार मानक परिभाषा है (चित्र 5देखें).
      4. सहेजेंपर क्लिक करें.
    3. किसी फ़ाइल को आयात और विश्लेषित करने के लिए, फ़ाइलें जोड़ेंपर क्लिक करें, और विश्लेषण करने के लिए fsa फ़ाइल चुनें. चयनित फ़ाइलें जोड़ें पर क्लिक करें और फिर ठीकपर क्लिक करें. उसके बाद निम्न चरणों का पालन करें:
      1. आकार मानक स्तंभ का पता लगाएँ और ABI $600 (या जो भी नाम आकार मानक को दिया गया था) का चयन करें।
      2. विश्लेषण विधि केअंतर्गत, आकार डिफ़ॉल्ट - एनपीपी पर क्लिक करें और फिर हरे रंग का विश्लेषण करें बटन पर क्लिक करें।
      3. फ़ाइल अब देखने के लिए तैयार है. डेटा को वांछित के रूप में देखने के विकल्प समायोजित करें.
    4. समस्या निवारण - विश्लेषण विधि
      नोट: सॉफ्टवेयर कभी कभी चोटियों की पहचान और उन्हें सही ढंग से संरेखित करने के लिए असफल हो सकता है। यह तब होता है जब चोटियों या तो बहुत कम या बहुत अधिक हैं. निम्न दो विश्लेषण विधियाँ इसके लिए सही कर सकते हैं और एक नमूना retested है करने से पहले का प्रयास किया जाना चाहिए।
      1. उच्च चोटियों के लिए विश्लेषण विधि 1:
        1. नई विश्लेषण विधि पर क्लिक करें और यह उच्च चोटियों नाम (या व्यक्तिगत पसंद के अनुसार किसी अन्य नाम).
        2. विश्लेषण और आकार देने के लिए श्रेणी पर क्लिक करें और फिर आंशिक श्रेणी पर क्लिक करें. फिर प्रारंभ बिंदु और प्रारंभ आकारके लिए 100 में टाइप करें.
        3. स्टॉप पॉइंटके लिए, 10,000 दर्ज करें. रोक आकार के लिए, 1000 दर्ज करें.
        4. फिर न्यूनतम शिखर ऊंचाइयों पर क्लिक करें और संख्या इस तरह है कि रंग के लिए चोटी सीमा इस प्रकार है बदल: ब्लू: 50; हरा: 50; पीला: 20; लाल: 100; नारंगी: 5000.
        5. नई विश्लेषण विधि सहेजें।
      2. कम चोटियों के लिए विश्लेषण विधि 2:
        1. नई विश्लेषण विधि पर क्लिक करें और यह कम चोटियों नाम (या व्यक्तिगत पसंद के अनुसार किसी अन्य नाम).
        2. विश्लेषण और आकार देने के लिए श्रेणी पर क्लिक करें और फिर आंशिक श्रेणी पर क्लिक करें. फिर प्रारंभ बिंदु और प्रारंभ आकारके लिए 100 में टाइप करें.
        3. स्टॉप पॉइंटके लिए, 10,000 दर्ज करें. रोक आकार के लिए, 1000 दर्ज करें.
        4. फिर गुणवत्ता के झंडे पर क्लिक करें और पास रेंज को इस तरह बदलें कि यह 0.5 से 1 तकपढ़ता है. निम्न गुणवत्ता श्रेणी को इस प्रकार बदलें कि यह 0.0 से 0.0तक पढ़ता है। निम्नलिखित में रैखिकता को बदलें: से (bp) 100.0 करने के लिए (bp) 800.0|
        5. नई विश्लेषण विधि सहेजें।
          नोट: यह विश्लेषण विधि के तहत कम चोटियों या उच्च चोटियों का चयन और फिर हरे रंग का विश्लेषण बटन पर क्लिक करके एक फ़ाइल reanalyze करने के लिए अब संभव है.

Figure 5
चित्र 5: आकार मानक संपादक दिखा स्क्रीनशॉट. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. प्रवाह साइटोमेट्री

  1. आदर्श FFPE ब्लॉक का चयन
    1. एच एंड ई स्लाइड और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक FFPE ब्लॉक का चयन करें जिसमें सीवी से बने इसके ऊतकों का लगभग 50-70% है।
      नोट: चित्र 6 प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त ब्लॉक का एक प्रतिनिधि उदाहरण है, क्योंकि यह लगभग 50% CV (अनुभाग का दायाँ आधा) और 50% मातृ ऊतकों (बाएं आधा) से बना है। मातृ ऊतकों की उपस्थिति महत्वपूर्ण है क्योंकि वे द्विगुणित चोटी के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं.
    2. ब्लॉक है कि CV के आदर्श राशि नहीं है के लिए, CV के लिए समृद्ध के रूप में अनुभाग किया जाता है. ऐसा करने के लिए, पहचान जो ताजा कटौती वर्गों के पक्ष में अपनी इसी एच एंड ई स्लाइड के अनुसार अधिक CV शामिल हैं। उस के आधार पर, एक ब्लेड का उपयोग करने के लिए अन्य आधा है कि क्रम में CV के लिए समृद्ध करने के लिए खारिज कर दिया जाना चाहिए कटौती.
      नोट: चित्र 7 प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पर्याप्त CV नहीं है एक ब्लॉक से पता चलता है। इस तरह के एक के रूप में ब्लॉक के लिए, वर्गों को इस तरह से कटौती की जरूरत है कि आधे कि कम CV होता है क्रम में मातृ ऊतकों के संबंध में CV की मात्रा में वृद्धि करने के लिए खारिज कर दिया जाता है, के रूप में आंकड़ा में दिखाया गया है. क्या छोड़ दिया है के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए और अधिक वर्गों में कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें.

Figure 6
चित्र 6: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए आदर्श है कि एक POC ब्लॉक का प्रतिनिधित्व एच एंड ई अनुभाग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक अधिक कठिन ब्लॉक का प्रतिनिधित्व करने वाला एच एंड ई अनुभाग। इस प्रतिनिधि एच एंड ई अनुभाग से पता चलता है कि इस खंड के केवल नीचे आधा प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, CV के लिए समृद्ध के लक्ष्य के साथ. उल्लिखित क्षेत्र, जिसे "CV" का लेबल दिया गया है, ज्यादातर CV से बना है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. अनुभागीकरण
    1. अनुभाग की सुविधा के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ पर ब्लॉक छोड़ दें।
    2. सबसे अच्छा संभव FFPE ब्लॉक का उपयोग करना, चार वर्गों है कि 50 डिग्री मोटी (या दो 100 डिग्री मोटी वर्गों) एक microtome का उपयोग कर रहे हैं में कटौती.
      नोट: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए यह मोटा वर्गों के लिए बेहतर है।
    3. मामले में है कि एक आदर्श FFPE ब्लॉक उपलब्ध नहीं है, फिर भी मातृ ऊतक के लिए सीवी के अनुपात को बनाए रखने के उद्देश्य. उदाहरण के लिए, यदि केवल 30% ब्लॉक सीवी से बना है जबकि शेष में मातृ ऊतक हैं, तो उस अनुभाग के कम से कम आधे को हटा दें जिसमें मातृ ऊतक हैं और क्षतिपूर्ति करने के लिए अधिक अनुभागों का उपयोग करें (चित्र 7देखें)।
    4. वर्गों को लेबल 15 एमएल ट्यूबों में रखें।
      नोट: लेबल पर टेप करने के लिए सुनिश्चित करें क्योंकि अगले चरण में इस्तेमाल कार्बनिक अभिकर्मकों भंग कर सकते हैं और स्याही निकाल दें.
  2. FFPE ऊतकों से प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल
    1. Deparaffinization और पुनर्जलीकरण
      1. धूआं के हुड के अंतर्गत निम्नलिखित वाश (सारणी 3) का कार्य करें।
      2. 15 एमएल ट्यूब को उचित अभिकर्मक के 6 एमएल के साथ भरें, तालिका 3 में प्रस्तुत आदेश का पालन करते हुए, संबंधित अवधि के लिए अभिकर्मकों में वर्गों को छोड़ दें, और फिर वैक्यूम चूषण और एक ग्लास पेस्टर पिपेट का उपयोग करके अभिकर्मक को हटा दें।
      3. प्रत्येक चरण के बीच, 70% इथेनॉल में पहले पास्चर पिपेट डुबकी, फिर आसुत पानी में, और फिर अगले चरण के लिए आगे बढ़ें।
      4. अभिकर्मक के साथ ऊतक के टुकड़े को हटाने के लिए बहुत सावधान रहें। ड्राइंग ऊतकों के बिना तरल अभिकर्मक के चूषण की सुविधा के लिए एक 60 डिग्री कोण करने के लिए 15 एमएल ट्यूब झुकाव।
        चेतावनी: हटाए गए द्रवों में xylene होते हैं और xylene अपशिष्ट कंटेनरों में निपटाया जाना चाहिए।
    2. समाधान तैयारी
      1. द्वि आसुत जल के 1 ल् में 2 ग्राम साइट्रिक अम्ल को भंग करके साइट्रेट विलयन तैयार की जाइए। 6 करने के लिए पीएच लाओ. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      2. प्रति हजार NaCl, pH 1.64 9 भागों के 2 एमएल में 0.01 ग्राम पेप्सिन को भंग करके पेप्सिन समाधान तैयार करें। यह एक नमूने के लिए है.
        चेतावनी: Pepsin विषाक्त है और आसानी से फैलाने और हवाई बन सकता है. एक मुखौटा पहनें जब इसके पाउडर के रूप में pepsin से निपटने और इसे का उपयोग करने के बाद काम कर रहे क्षेत्र के सभी मिटा.
      3. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई)-रिबोनेक्यूलेस एक नमूने के लिए एक समाधान तैयारी।
        1. पीबीएस के 450 डिग्री एल (10x को पतला करने के लिए) के साथ पीआई के 50 डिग्री एल मिलाएं।
        2. मिश्रण में 50 डिग्री सेल्सियस राइबोनक्यूलेस ए (1 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें। पन्नी में हर समय लिपटे रखें.
    3. पाचन और धुंधला
      1. 15 एमएल ट्यूबों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस साइट्रेट समाधान जोड़ें तो 2 ज के लिए एक 80 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह है।
      2. समाधान कमरे के तापमान (15 मिनट) के लिए ठंडा करते हैं। साइट्रेट समाधान निकालें.
      3. 1x पीबीएस, भंवर के 6 एमएल जोड़ें, और ऊतकों को नीचे से व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए 1 "2 मिनट प्रतीक्षा करें। वैक्यूम चूषण और एक गिलास पास्चर पिपेट का उपयोग कर 1x पीबीएस निकालें।
      4. पेपसिन समाधान के 1 एमएल जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस शुष्क स्नान में जगह. भंवर हर 10 मिनट. इस ऊष्मायन के अंतिम 10 मिनट में PI-ribonuclease एक समाधान तैयार करें।
      5. 1x पीबीएस, भंवर के 6 एमएल जोड़ें, और ऊतकों को नीचे से व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए 1 "2 मिनट प्रतीक्षा करें। वैक्यूम चूषण और एक गिलास पास्चर पिपेट का उपयोग कर 1x पीबीएस निकालें।
      6. PI-ribonuclease एक समाधान के 550 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सूखी स्नान में नमूने जगह है।
        नोट: इस बिंदु पर, नमूने पन्नी में लपेटा जा सकता है और अगली सुबह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दिया.
      7. समाधान को 48-$m निस्पंदन मेश के माध्यम से फ़िल्टर करें. पॉलीस्टाइरीन गोल-नीचे ट्यूबों में छानना लीजिए, जिसे प्रवाह साइटोमीटर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। ट्यूब के शीर्ष भाग में निस्पंदन जाल के 5 सेमी टुकड़ा द्वारा 5 सेमी की जगह के लिए संदंश का उपयोग करें, ताकि तरल को जाल के माध्यम से और ट्यूब में पाइप किया जा सके।
        नोट: नमूने अब प्रवाह cytometer के साथ चलाने के लिए तैयार हैं. उन्हें पन्नी में लिपटे रखें जब तक वे चलाने के लिए तैयार हैं.
    4. संगठन के प्रवाह साइटोमेट्री मंच तकनीशियन की मदद से एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ नमूने चलाएँ।
      नोट: पीई चैनल पीआई दाग डीएनए का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है और प्रवाह दर अधिग्रहण के दौरान धीमी गति से करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. सुनिश्चित करें कि वोल्टेज इस तरह चुना जाता है कि द्विगुणित शिखर मोटे तौर पर 200 पीई-ए एक्स अक्ष के साथ विश्लेषण और व्याख्या की सुविधा के साथ है. प्रति नमूना कम से कम 20,000 ईवेंट रिकॉर्ड करने का लक्ष्य करें.
अभिकर्मक इस्तेमाल किया (6 एमएल प्रत्येक) अवधि
1) Xylene 2 x 10 मिनट
2) 100% इथेनॉल 2 x 10 मिनट
3) 95% इथेनॉल 10 मिनट
4) 70% इथेनॉल 10 मिनट
5) 50% इथेनॉल 10 मिनट
6) आसवन पानी 2 x 10 मिनट

तालिका 3: deparaffinization और पुनर्जलीकरण के लिए Reagents और durations.

  1. प्रवाह साइटोमिट्री डेटा विश्लेषण
    1. एक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिका) .
      नोट: निम्नलिखित कदम एक विशिष्ट सॉफ्टवेयर के लिए कर रहे हैं (सामग्री की तालिका) लेकिन सॉफ्टवेयर के अन्य प्रकार की स्थापना के लिए मदद के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है.
      1. एक प्रवाह cytometer पर नमूने चलाने के बाद, विश्लेषण के लिए FCS 2.0 फ़ाइलें डाउनलोड करें.
      2. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें, फ़ाइल पर क्लिक करें | नया दस्तावेज़|
      3. हिस्टोग्राम चिह्न ()पर क्लिक करें, और तब आयत बनाने के लिए सूचक को खींचें.
      4. FCS फ़ाइल के लिए ब्राउज़ करें और फिर खोलेंपर क्लिक करें. x-अक्ष के साथ, FCS-A पर क्लिक करें और फिर पीई-एका चयन करें।
      5. Dot Plot आइकन परक्लिक करें ( ) और फिर हिस्टोग्राम प्लॉट के नीचे एक और आयत बनाने के लिए सूचक खींचें. फिर एक ही FCS फ़ाइल है कि हिस्टोग्राम के लिए चुना गया था के लिए ब्राउज़ करें.
      6. डॉट प्लॉट के x-अक्ष को PE-A और y-अक्ष को PE-Wमें परिवर्तित करें.
        नोट: चित्र 8A इस बिंदु पर भूखंडों की उपस्थिति को दर्शाता है।
      7. क्षेत्र चिह्न परक्लिक करें ( ) और बिंदु आलेख पर एक बॉक्स आरेखित करें जो द्विगुणित शिखर से पहले प्रारंभ होता है (चित्र 8खमें x-अक्ष पर लगभग 100 ) और जो x-अक्ष पर लगभग 700 समाप्त होता है, जैसा कि चित्र 8 में डॉट प्लॉट में दिखाया गया है बी.
        नोट: चित्र 8 में द्विगुणित शिखर ग-अक्ष पर लगभग 200 है। यह मनमाने ढंग से चुना जाता है के रूप में नमूने प्रवाह cytometer के माध्यम से दर्ज कर रहे हैं, बस विश्लेषण और परिणामों की व्याख्या की सुविधा के लिए.
      8. प्लॉट पर क्लिक करें | क्षेत्र/गेट्स संपादित करें,फिर रणनीतिके अंतर्गत G0 सेल के आगे वाले कक्ष में R0 लिखें. फिर बंदकरें पर क्लिक करें.
      9. हिस्टोग्राम पर कहीं भी क्लिक करें, फिर प्लॉट पर | प्रारूप प्लॉट/ गेट केअंतर्गत, G0 ] R0 का चयन करें और फिर ठीकपर क्लिक करें.
        नोट: यह एक बेहतर loidy चोटियों कल्पना करने के लिए अनुमति देता है कि gating कदम है. हिस्टोग्राम अब चित्र 8खमें हिस्टोग्राम की तरह दिखना चाहिए . यह (बिंदु साजिश के विशिष्ट क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करने के क्रम में चरण 2.4.1.7) में तैयार बॉक्स ले जाकर बनाया गेट के साथ चारों ओर खेलने के लिए संभव है.
      10. प्लॉट्स को लेबल करने के लिए, पाठ क्षेत्र चिह्न ()पर क्लिक करें, फिर दस्तावेज़ के शीर्ष पर एक बॉक्स बनाने के लिए सूचक को खींचें, और तब निम्न जानकारी लिखें: रोगी ID, POC ID और उपयोग किए गए ब्लॉक (क्योंकि एक POC के लिए कई ब्लॉक हो सकते हैं) , प्रतिशत CV ब्लॉक पर मौजूद, वोल्टेज नमूना चलाने के लिए इस्तेमाल किया, और तारीख.

Figure 8
चित्र 8: एक हिस्टोग्राम और एक प्रतिनिधि नमूने है कि ungated है की एक डॉट साजिश प्रदर्शित स्क्रीनशॉट (ए) और gated (बी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

मोलर ऊतकों की जटिलता और तथ्य यह है कि उनके पास विभिन्न जीनोटाइप हो सकते हैं, कड़े विश्लेषण और कई तरीकों जैसे कि आकृतिक मूल्यांकन, p57 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, माइक्रोसैटेलाइट जीनोटाइपिंग, प्रवाह साइटोमेट्री, और फिश का उपयोग आवश्यक है। उदाहरण के लिए, एक रोगी (1790) दो PHM कि केवल POCs के microarray विश्लेषण द्वारा tripoid होना पाया गया के साथ भेजा गया था. इसलिए रोगी को आवर्तक पीएचएम के साथ का निदान किया गया था। रोगी और उसके साथी के डीएनए के साथ उसके दो "PHM" के माइक्रोसैटेलाइट जीनोटाइपिंग से पता चला कि जबकि रोगी का पहला मोल त्रिगुणित डिस्परमिक है (चित्र 9ए), उसका दूसरा "पीएचएम" में त्रिगुणित डाइजीनिक जीनोटाइप होता है (चित्र 9 बी)और इसलिए एक PHM नहीं है, लेकिन एक गैर मोलर गर्भपात.

चित्र 9 ए (काले रंग में) में पहला मार्कर पीओसी में दो चोटियों को दर्शाता है। पहली चोटी माँ से निकलती है, क्योंकि केवल माँ के आकार का एक शिखर है। इसी तर्क के बाद, दूसरी चोटी पिता से निकलती है क्योंकि वह एक ही एलील को साझा करता है। सूचना कैसे दूसरी चोटी एक बहुत पहले से अधिक है, यह दर्शाता है कि वहाँ शायद उस चोटी में एक ही पैतृक allele की दो खुराकें हैं. मातृ संदूषण, जो बाद में और अधिक विस्तार से समझाया जाएगा, इस पीओसी में बहुत कम है क्योंकि पीओसी दूसरी मातृ एलीले की स्थिति में एक बहुत ही छोटी चोटी प्रदर्शित करता है।

चित्र 9 ए (नीले रंग में) में दूसरा मार्कर पीओसी में तीन चोटियों को दर्शाता है। इन चोटियों में से दो पिता से और एक माँ से उत्पन्न होते हैं. इस प्रकार, यह इस मार्कर से फिर से स्पष्ट है कि वहाँ तीन alleles पीओसी में मौजूद हैं, पिता से दो और माँ से एक. चित्र 9ए में तीसरे और चौथे मार्कर पहले मार्कर के समान हैं, और यह भी पिता से आ रही दो alleles और माँ से एक दिखा.

के बाद से सभी चार मार्करों लगातार तीन alleles दिखाने के लिए (दो खुराक से या विभिन्न आकारों के तीन alleles की उपस्थिति से), दो पिता से शुरू होने और माँ से एक, एक निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि इस पीओसी tripoid dispermic है, और PHM के निदान की पुष्टि करता है.

चित्रा 9बी में सभी चार मार्कर फिर से तीन alleles दिखा: पहले मार्कर पहले चोटी है कि माँ से उत्पन्न में दो खुराक और दूसरी चोटी है कि पिता से उत्पन्न में एक खुराक से पता चलता है. दूसरे और चौथे मार्कर तीन अलग-अलग चोटियों (यानी, तीन अलग-अलग एलील्स) दिखाते हैं, जिनमें से दो मां से हैं। तीसरे मार्कर पिता से शुरू होने वाली पहली चोटी में एक खुराक और माँ से शुरू होने वाली दूसरी चोटी में दो खुराक से पता चलता है. इसलिए, इस पीओसी मूल में tripoid digynic है के बाद से गुणसूत्रों के दो सेट माँ से आते हैं और एक सेट पिता से आता है. इसलिए यह एक गैर-मोलर गर्भपात है।

Figure 9
चित्र 9: रोगी 1790 के प्रतिनिधि जीनोटाइपिंग परिणाम। (ए) रोगी की पहली गर्भाधान के भू-लेखन के परिणामों का चयन करें जो त्रिगुणित डिस्परमिक जीनोटाइप दर्शाता है। (ख) रोगी की दूसरी गर्भाधान से जीनोटाइपिंग के परिणाम ों का चयन करें जो त्रिगुणित डाइजीनिक जीनोटाइप दर्शाता है। x-अक्ष basepairs में है; लेबल और basepair आकार सादगी के लिए छोड़ दिया गया है. y-अक्ष शिखर ऊँचाई का प्रतिनिधित्व करता है और इसी प्रकार सरलता के लिए आंकड़ा से छोड़ दिया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस रोगी को शुरू में दो PHM के साथ misdiagnosed किया गया था और अधिक moles के एक बढ़ा जोखिम के बारे में चिंता कर रहा था, जबकि वह एक ही PHM था. इस मामले में अकेले पीओसी पर SNP microarray की सीमा पर प्रकाश डाला गया. एसएनपी microarray एक शक्तिशाली विधि है और किसी भी गुणसूत्र (trisomies, monosomies, या गैर द्विगुणित जीनोटाइप) के anuploidies का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा है; हालांकि, जब माता पिता के डीएनए का विश्लेषण किए बिना अकेले पीओसी पर प्रदर्शन किया, triploidy की उत्पत्ति निर्धारित नहीं किया जा सकता है. जीनोटाइप विश्लेषण और व्याख्या के बारे में और अधिक स्पष्टीकरण के लिए, कृपया मर्फी एट अल16द्वारा अध्ययन देखें.

चित्र 10ए में दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम एक तिपाई गर्भाधान के हैं। एक्स-अक्ष के मान परमाणु डीएनए सामग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं। उदाहरण के लिए, 200 एक मनमाने ढंग से कोशिकाओं है कि परमाणु डीएनए सामग्री की एक निश्चित राशि होते हैं करने के लिए दिया संख्या है. इसलिए, 400 पर एक चोटी कोशिकाओं है कि परमाणु डीएनए सामग्री की मात्रा के रूप में 200 चोटी की तुलना में डबल मात्रा में होते हैं का प्रतिनिधित्व करता है. 300 के आसपास थोड़ा शिखर परमाणु डीएनए सामग्री है कि 200 और 400 चोटी के बीच में है और इसलिए tripoid चोटी है प्रतिनिधित्व करता है. ध्यान दीजिए कि द्विगुणित गर्भाधान ( चित्र 10ठ) में300मूल्य पर कोई शिखर नहीं होता है।

कुछ मामलों में त्रिगुणित शिखर बहुत सूक्ष्म होता है(चित्र 10ग)। जब भी एक मुश्किल से ध्यान देने योग्य tripoid चोटी उल्लेख किया है, यह पहले सीवी की राशि है कि प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया वर्गों में मौजूद थे पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि वर्गों के बारे में कम से कम था 20% CV, तो यह संभावना एक सच tripoidy हो जाएगा क्योंकि यह एक बहुत कम चोटी होने की उम्मीद है. यदि लिया वर्गों CV की उच्च मात्रा में था, पीओसी एक और द्विगुणित सेलुलर आबादी की उपस्थिति के साथ मोज़ेकवाद के संदिग्ध हो जाता है. यह जीनोटाइपिंग परिणामों की फिर से समीक्षा करके जांच की जा सकती है ताकि यह देखा जा सके कि क्या वे एक आदर्श तिपाई वाले डिस्पेयरी फिट हैं या एक्स, वाई, और 18 गुणसूत्रों से जांच के साथ FISH द्वारा पुष्टि की जा सकती है। इसके अलावा, इस आलेख में वर्णित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, यह विशिष्ट द्वार सेट करने के लिए संभव है, के रूप में अनुभाग 2.4.1 में वर्णित है, कि उपयोगकर्ता एक विशिष्ट क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए tripoid कोशिकाओं के लिए समृद्ध अगर वे वास्तव में मौजूद अनुमति देते हैं.

Figure 10
चित्र 10: प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री परिणाम में त्रिगुणित अवधारणाओं का प्रदर्शन (ए) और (सी), और एक द्विगुणित गर्भाधान में (बी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एचएम विषमांगी etiologies के साथ असामान्य मानव गर्भधारण कर रहे हैं और उनके सटीक वर्गीकरण और निदान चुनौतीपूर्ण बनाता है जो विभिन्न हिस्टोलॉजिकल और जीनोटिपिक प्रकार है। हिस्टोपैथोलॉजिकल रूपात्मक मूल्यांकन अक्सर गलत साबित हो गया था और इसलिए अपने दम पर अविश्वसनीय है CHM और PHM में एचएम वर्गीकृत और उन्हें गैर-मोलर गर्भपात से अलग. इसलिए, एचएम का सटीक निदान अन्य तरीकों जैसे मल्टीप्लेक्स माइक्रोसेटेलाइट डीएनए जीनोटाइपिंग, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अगुणित विश्लेषण, फिश द्वारा अगुणित विश्लेषण, और p57KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के उपयोग की आवश्यकता है। इन तरीकों में से प्रत्येक की अपनी सीमाएं और फायदे हैं।

बहुसंकेत जीनोटाइपिंग और प्रवाह साइटोमेट्री की सीमाएं और लाभ

मातृ संदूषण सबसे आम मुद्दों में से एक है जब FFPE ऊतकों के साथ काम कर रहा है और misdiagnosis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, इस प्रकार POC ऊतकों से मातृ को अलग करने के महत्व पर प्रकाश डाला. यह मातृ संदूषण की पहचान करने के लिए क्या genotyping चोटियों की उम्मीद करने के लिए और उनकी व्याख्या के साथ मदद करने के लिए एक विचार है महत्वपूर्ण है. यदि संदूषण का स्तर बहुत बड़ा है और परिणामों की विश्वसनीय व्याख्या को रोकता है, तो डीएनए अलगाव और निष्कर्षण को दोहराएं, सभी संभव मातृ ऊतकों को हटाने में अतिरिक्त देखभाल करें। उन क्षेत्रों में जहां ऊतकों की आकृति विज्ञान स्पष्ट नहीं है, मातृ संदूषण की संभावना को कम करने के लिए ऐसे क्षेत्रों को हटाना बेहतर है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का पहला लाभ, इसकी कम लागत के अलावा, यह है कि मातृ ऊतकों को स्लाइड से हटा दिया जाता है, जबकि अन्य तरीकों में POC ऊतकों को इकट्ठा करने से मिलकर बनता है (उन्हें समाधान के साथ कवर करके जो हवा के संपर्क में आने पर बहुलक बनाता है और ऊतकों को उठाने) मातृ ऊतकों को हटाने के बिना. यहाँ वर्णित विधि इस प्रकार एक शेष पीओसी ऊतकों पर एक दूसरे देखो लेने के लिए अनुमति देता है, फिर से साफ उन्हें यदि आवश्यक हो, के रूप में अक्सर मामला है, और फिर इकट्ठा करने और उन से डीएनए निकालने. दूसरा लाभ यह है कि हम uncoverslipped एच एंड ई दाग वर्गों पर ऊतकों को साफ है, जो बहुत मातृ ऊतकों को हटाने की सुविधा, के रूप में unstained वर्गों और एक coversslipped नक्शा स्लाइड के उपयोग के लिए विरोध किया. हालांकि, अतिरिक्त धुंधला आगे डीएनए नीचा हो सकता है, और इस के लिए और अधिक वर्गों जोड़कर मुआवजा दिया है.

विश्लेषण के लिए माता पिता के डीएनए की उपलब्धता एक और चुनौती है. दोनों माता पिता की उपस्थिति बहुत विश्लेषण और जीनोटाइपिंग परिणामों की व्याख्या की सुविधा. दुर्भाग्य से, तथापि, यह अक्सर मामला है कि पिता के डीएनए उपलब्ध नहीं है, जो कभी कभी विश्लेषण जटिल हो सकता है, विशेष रूप से मामलों में जहां पीओसी डीएनए की गुणवत्ता पूर्व निर्धारण या दीर्घकालिक भंडारण के कारण गरीब है (अधिक बार जब काम आवर्तक एचएम के साथ). इसके अलावा, मातृ रक्त हमेशा डीएनए निष्कर्षण के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है. ऐसे मामलों में, मातृ डीएनए पहले वर्णित16के रूप में FFPE ब्लॉक में मौजूद मातृ एंडोमेट्रियल ऊतकों से निकाला जा सकता है। इसके अलावा, मोलर ऊतकों की विशेषता है कि सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों के उपयोग से हुई microsatelite जीनोटाइप विश्लेषण जटिल हो सकता है क्योंकि, ज्यादातर मामलों में, दाताओं से डीएनए (पुरुषों या महिलाओं) आमतौर पर उपलब्ध नहीं है.

अंत में, तथ्य यह है कि बड़ी चोटियों के लिए चोटी ऊंचाई के मामले में कम हो जाते हैं भ्रम का एक और संभावित स्रोत है, खासकर जब चोटी हाइट्स अगर वहाँ दो खुराक या एक ही चोटी में एक खुराक रहे हैं निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है. इस पर काबू पाने के लिए एक तरह से हमेशा ध्यान में रखना है कि बड़े allele आकार की चोटियों (आधार जोड़े की संख्या) कम हो जाते हैं, FFPE ऊतकों से डीएनए की निम्नीकृत प्रकृति के कारण, जो कम डीएनए बड़ा alleles के प्रवर्धन के लिए उपलब्ध बनाता है. इसके अलावा, एक छोटे पीसीआर टुकड़ा प्रवर्धन एक बड़ा एक से कम समय लगता है, और डीएनए की घातीय प्रवर्धन बड़ा alleles की कम मात्रा में होता है.

प्रवाह साइटोमेट्री का मुख्य दोष यह है कि तिगुणित अवधारणाओं को कभी-कभी याद किया जा सकता है, और यह ब्लॉक में सीवी की अपर्याप्त मात्रा के कारण हो सकता है। हालांकि, एक तिपाई चोटी की उपस्थिति एक त्रिगुणित का एक निर्णायक संकेत है. ध्यान दें कि इस विधि trisomies का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है, tetraploid अवधारणाओं, या इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अन्य aneuploidies. टेट्रागुणित अवधारणाओं इस प्रोटोकॉल द्वारा पता लगाने योग्य नहीं हैं क्योंकि tetraploid चोटी कोशिका चक्र के G2 चरण में द्विगुणित कोशिकाओं के एक ही शिखर से मेल खाती है.

इन सीमाओं और चुनौतियों को जानने में मदद करता है गलतियों को कम करने. यह इस प्रकार महत्वपूर्ण है और कभी कभी विभिन्न तरीकों के साथ एक ही ऊतक का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है, परिणामों की तुलना करें, और सुनिश्चित करें कि वे एक दूसरे के साथ सामंजस्य कर रहे हैं. यदि वे नहीं हैं, तो परिणामों पर पुनर्विचार करने की आवश्यकता है और विश्लेषण को दोहराया जाना चाहिए। विरोधी परिणाम दिखाए गए कई मामलों के लिए, विसंगतियों का समाधान केवल प्रयोगों को दोहराकर और मूल समस्या से बचने के लिए उचित देखभाल करके किया गया था. अन्य मामलों में, इस तरह के ऊतक वर्गों पर FISH के रूप में अतिरिक्त तरीकों के प्रदर्शन या उपयुक्त मार्करों के साथ अतिरिक्त सिंप्लेक्स genotyping प्रदर्शन करके विसंगतियों का समाधान किया गया.

मातृ संदूषण की पहचान

मातृ डीएनए के साथ पीओसी डीएनए के संदूषण की पहचान करने के संबंध में, संदूषण के स्तर को पीओसी में सभी लोकी पर सभी मातृ एलेले की उपस्थिति से परिलक्षित या मान्यता प्राप्त होगी, जो पीओसी को प्रेषित मातृ एलेले (एस) के अतिरिक्त है।

चित्र 11कमें मातृ डीएनए संदूषण से उत्पन्न चोटियों को "ग" के साथ लेबल किया गया है। सूचना कैसे हर चोटी के साथ चिह्नित एक "ग" भी माँ में मौजूद है, और हम सभी तीन मार्करों में इन "ग" चोटियों देखते हैं. ध्यान दें कि दूसरे मार्कर के लिए (नीले रंग में), मातृ संदूषण शिखर द्वारा इंगित एक "ग" पहले मार्कर पर प्रत्येक "ग" चोटी से अधिक है क्योंकि माँ दूसरे मार्कर के लिए समयुग्मज है; संदूषक की ऊंचाई इसलिए इस मार्कर के लिए दोगुनी है. इस पीओसी में, वहाँ कोई मातृ व्युत्पन्न चोटियों रहे हैं. दूसरे शब्दों में, इस पीओसी को माँ से कोई भी एलीमेंटल प्राप्त नहीं हुआ था। प्रत्येक मार्कर पर केवल एक वास्तविक शिखर है और यह चोटी मां में मौजूद नहीं है। इसलिए हम जानते हैं कि असली चोटियों पिता से आया होगा. या तो karyotype या प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्विगुणिता का प्रदर्शन से द्विगुणित जानकारी के साथ, यह निष्कर्ष निकालना संभव है कि इस पीओसी दोनों मूल और द्विगुणित में orrogenetic है.

इसके अलावा, चित्र 11ए में इन तीन मार्करों से पता चलता है कि हर मार्कर के लिए हमेशा केवल एक ही वास्तविक शिखर होता है। केवल तीन मार्करों यहाँ सचित्र हैं, तथापि, मल्टीप्लेक्स किट अक्सर कई और अधिक मार्करों कि भी एक ही पैटर्न प्रकट होगा के साथ आते हैं. चूंकि इस पीओसी द्विगुणित है, वहाँ प्रत्येक चोटी में दो खुराक होना चाहिए. इस जानकारी के साथ, हम निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि इस पीओसी androgenetic मोनोस्पर्मी है और हर एक मार्कर पर समयुग्मज है.

चित्र 11ख एक द्विगुणित द्वि-पैरेन्टिक पीओसी का प्रतिनिधित्व करता है। पहले मार्कर (हरे रंग में) की पहली चोटी भर में थोड़ा काला बार संदूषण की अनुमानित राशि है कि इस असली चोटी के भीतर मौजूद है प्रतिनिधित्व करता है. "आर" POC डीएनए से आने वाले इस चोटी के वास्तविक भाग को इंगित करता है; "ग" मातृ डीएनए से आने वाले इस चोटी के संदूषक भाग का प्रतिनिधित्व करता है। कोई संदूषण के स्तर की पहचान कैसे कर सकता है? यह संभव है, इस मामले में, जब एक मार्कर माँ में विषमयुग्मज है क्योंकि मातृ एलील्स में से एक पीओसी में अनुपस्थित है। उदाहरण के लिए, "ग" के साथ लेबल किए गए पहले मार्कर में छोटी चोटी यह इंगित करती है कि यह संदूषण का वह स्तर है जिसकी अन्य मातृ विरासत में मिली चोटी के लिए अपेक्षित होनी चाहिए। नतीजतन, सभी पीओसी चोटियों कि मातृ मूल के हैं प्रदूषण की छोटी अतिरिक्त राशि के कारण पैतृक विरासत में मिली चोटियों की तुलना में थोड़ा अधिक हैं. चित्र 11खमें तीसरे मार्कर (काले रंग में) के लिए, संदूषण का स्तर सामान्य राशि को दोगुना होने की उम्मीद है (क्योंकि माँ इस विशिष्ट मार्कर के लिए समयुग्मज है), और इसलिए यह अनुमान लगा सकते हैं कि पहले शिखर में केवल एक खुराक है पीओसी में.

चित्र 11ग में त्रिगुणित विपरक पीओसी को दिखाया गया है। पहला मार्कर (हरे रंग में) पीओसी में तीन चोटियों से पता चलता है. चूंकि इन तीन चोटियों समान ऊंचाइयों है, यह निष्कर्ष है कि इस पीओसी की संभावना tripoid है संभव है. ध्यान दें कि इस मार्कर में तीसरे शिखर पहले से कम है. यह उम्मीद है क्योंकि, एक सामान्य प्रवृत्ति के रूप में, बड़े चोटियों के लिए कम हो जाते हैं. दूसरी चोटी पहले से थोड़ा अधिक है, और यह मातृ संदूषण की एक छोटी राशि के लिए जिम्मेदार हो सकता है, के रूप में बार और "ग द्वारा संकेत दिया." इसके अलावा, इन तीन चोटियों में से दो माँ में मौजूद नहीं हैं, और इसलिए पिता से आया होगा. इस प्रकार अब तक, इस मार्कर इंगित करता है कि पीओसी त्रिगुणित हो सकता है (या एक trisomy) और गुणसूत्रों के अतिरिक्त सेट की उत्पत्ति पैतृक है. यह भी इंगित करता है कि यह एक dispermic गर्भाधान है, क्योंकि पीओसी पिता से दो अलग alleles विरासत में मिला है.

चित्र 11ब् में दूसरा मार्कर (नीले रंग में) केवल दो शिखर है। संदूषण के स्तर के लिए लेखांकन के बाद, दूसरी चोटी पहले से अधिक दिखाई देता है, और यह बड़ा चोटियों के लिए सामान्य प्रवृत्ति के बावजूद है छोटे हो (एक प्रवृत्ति है कि हमेशा विश्लेषण के दौरान मन में रखा जाना चाहिए). इस प्रकार, यह संभावना है कि वहाँ है कि एक बड़ी चोटी में दो खुराक रहे हैं. यह भी तथ्य यह है कि पहले मार्कर triploidy का संकेत है द्वारा समर्थित है.

अंत में, चित्रा 11सी में तीसरा मार्कर (काले रंग में) तीन चोटियों से पता चलता है, फिर से triploidy का संकेत. मल्टीप्लेक्स किट में सबसे मार्करों विभिन्न गुणसूत्रों से आते हैं के बाद से, यह विश्वास है कि एक पीओसी कई अलग अलग मार्करों भर में तीन alleles की एक ही प्रवृत्ति को देखने के बाद tripoid है के साथ समाप्त करने के लिए संभव है. यह भी ध्यान दें कि तीन चोटियों में से दो पिता से उत्पन्न, dispermic मूल की पुष्टि.

Figure 11
चित्र 11: जेनोटाइपिंग परिणाम मातृ संदूषण के प्रभाव को चित्रित करते हैं। शीर्ष पैनलों alleles कि पीओसी के हैं और नीचे पैनलों उन है कि माँ के हैं दिखाने के लिए. में (क) पीओसी एन्ड्रोजेनेटिक मोनोस्पर्मिक है और संदूषण का स्तर एक तीर और अक्षर "ग" द्वारा हाइलाइट किया जाता है। में (बी), पीओसी द्विगुणित है, और संदूषण के स्तर को अक्षर "ग" द्वारा हाइलाइट किया गया है. में (सी), पीओसी tripoid dispermic है और संदूषण के स्तर पत्र "ग द्वारा प्रकाश डाला है." छोटे काले सलाखों से पता चलता है कि चोटी की ऊंचाई का कितना मातृ संदूषण से आता है और इसलिए ध्यान में रखा जाना चाहिए जब चोटी ऊंचाइयों की तुलना. x-अक्ष basepairs में है; लेबल और basepair आकार सादगी के लिए छोड़ दिया गया है. y-अक्ष शिखर ऊँचाई का प्रतिनिधित्व करता है और इसी प्रकार सरलता के लिए आंकड़ा से छोड़ दिया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चुनौतीपूर्ण मामलों के उदाहरण

कई मामलों के लिए, सभी तीन मूल्यांकन एक साथ (यानी, प्रवाह, p57KIP2, और मल्टीप्लेक्स जीनोटाइपिंग) होने से किसी निष्कर्ष पर पहुंचना संभव था। उदाहरण के लिए, एक मामले (808) एक गैर-मोलर गर्भपात के रूप में भेजा गया था. हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन एक मोलर गर्भाधान और पीओसी के जीनोटाइपिंग विश्लेषण के संदेह का कारण एक मार्कर से पता चला है कि स्पष्ट रूप से तीन चोटियों से पता चला (पिता से दो और माँ से एक). P57KIP2 परिणाम निर्णायक नहीं थे. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण एक छोटे तिगुणित चोटी है कि FISH विश्लेषण के साथ पुष्टि की थी, जो भी एक और द्विगुणित सेलुलर आबादी की उपस्थिति से इनकार कर दिया पता चला. FISH से पुष्टि के साथ, यह निष्कर्ष निकालना संभव था कि पीओसी वास्तव में एक tripoid dispermic तिल है.

एक अन्य मामले (1192) को गैर-मोलर गर्भपात भी कहा गया था। इस पीओसी के सीवी मातृ ऊतकों के साथ intermingled थे और अत्यधिक necrotic के रूप में अच्छी तरह से कर रहे थे, सफाई की प्रक्रिया बहुत चुनौतीपूर्ण बना रही है. नतीजतन, पहले जीनोटाइपिंग विश्लेषण से मातृ संदूषण का एक उच्च स्तर दिखाया गया, जैसे कि पीओसी में हर मातृ एलील देखा जा सकता है (संभावित संदूषण का एक अच्छा संकेत)। इसके अलावा, p57KIP2 दुर्भाग्य से अनिर्णायक था, ऊतक के नेक्रोटिक प्रकृति के कारण सबसे अधिक संभावना है, शायद देरी निर्धारण की वजह से. प्रवाह साइटोमेट्री परिणाम, तथापि, triploidy का संकेत है, जो भी FISH द्वारा की पुष्टि की गई थी. डीएनए संदूषण के स्तर को कम करने और अस्पष्ट आकृति विज्ञान के साथ ऊतकों को हटाने के लक्ष्य के साथ फिर से निकाला गया था. नए जीनोटाइपिंग परिणामों का विश्लेषण, जबकि मातृ संदूषण की संभावित उपस्थिति के लिए लेखांकन, हमें निष्कर्ष है कि POC एक tripoid dispermic XXY PHM था की अनुमति दी.

तालिका 4 विश्लेषण के लिए प्रयुक्त विशिष्ट विधियों की रूपरेखा प्रस्तुत करती है। एचएम के संदिग्ध सभी ऊतकों और कम से कम एक जीनोटाइपिंग विधि पर रूपात्मक मूल्यांकन और p57KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। जीनोटाइपिंग विधियों में, सबसे जानकारीपूर्ण मल्टीप्लेक्स डीएनए जीनोटाइपिंग है। जब विभिन्न विधियों के बीच परिणाम सामंजस्य नहीं हैं या जब कुछ परिणाम अनिर्णायक होते हैं, तो अन्य जीनोटाइपिंग विधियों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। तालिका दुर्लभ अपवाद और उन्हें हल करने के लिए सिफारिशों के साथ प्रत्येक संभव एचएम प्रकार के लिए अपेक्षित concordant परिणाम दर्शाता है.

Table 4

तालिका 4: विश्लेषण के विशिष्ट क्रम, अपेक्षित परिणाम, और उन्हें हल करने के लिए सिफारिशों के साथ दुर्लभ अपवाद. P57KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री p57KIP2की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए करना है, प्रोटीन CDKN1C जीन द्वारा कोडित. यह जीन साइटोट्रोफोब्लास्ट और पहली तिमाही प्लेसेंटा के ग्राम स्ट्रोमा में पैतृक रूप से अंकित है और केवल मातृ जीनोम से व्यक्त किया जाता है। इसलिए यह एक सहायक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है का पता लगाने के लिए, एक आसान और सस्ती तरीके से, पीओसी में मातृ जीनोम की उपस्थिति. यह रूपात्मक मूल्यांकन के समानांतर एचएम होने का संदेह सभी POCs के लिए p57KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है। लेखक की प्रयोगशाला में, p57KIP2 एंटीबॉडी और सामग्री की तालिका में संकेत प्लेटफार्मों का उपयोग किया जाता है और लेखकों के परिणामों की गुणवत्ता के साथ बहुत खुश हैं. संक्षिप्त नाम: IHC ] इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री; डुबकी और $ द्विगुणित और जननीय; Dip Bip ] द्विगुणित द्वि-माता-पिता; क्रोजेड गुणसूत्र; एम सी ] गर्भपात; और टी.पी. - ट्रोफोब्लास्टिक प्रसार.

लेखकों के ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह लेख प्रवाह साइटोमेट्री के साथ ही कम लागत और उच्च गुणवत्ता वाले मल्टीप्लेक्स माइक्रोसैटेलाइट डीएनए FFPE POC ऊतकों के जीनोटाइपिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए पहली बार है। परिणामों की व्याख्या भी उनके समस्या निवारण और अन्य तरीकों के उन लोगों के साथ एकीकरण के साथ सही निष्कर्ष तक पहुँचने के लिए और POCs और एचएम के निदान के साथ वर्णित है. लेखकों ईमानदारी से आशा है कि इस लेख के लिए उपयोगी हो सकता है शोधकर्ताओं को इस जटिल इकाई को समझने की कोशिश कर रहा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों की आपूर्ति और अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए मूल प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल साझा करने के लिए सोफी Patrier और Marianne Parsy धन्यवाद. इस काम के लिए आरसेउ कुब-कोइस एन प्रजनन और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (एमओपी-130364) द्वारा आर.एस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACS Canto II BD BioSciences 338960
Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer Applied biosystems 313001R Service offered by the Centre for Applied Genomics
(http://www.tcag.ca)
Citric acid Sigma 251275
Cytoseal 60, histopathology mounting medium Fisher 23244257
Eosin Y stock solution (1%) Fisher SE23-500D
FCSalyzer - flow cytometry analysis software SourceForge - https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kit Qiagen 80234
Forceps Fine Science Tools 11295-51 For sectioning and for the cleaning process
Glacial Acetic Acid (Concentrated) Sigma A6283-500mL
Glass coverslips: Cover Glass Fisher 12-541a
Hematoxylin Fisher CS401-1D
Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide Thermofisher 4311320
IHC platform: Benchmark Ultra Roche -
Kimwipes Ultident 30-34120
Microtome Leica RM2135
Microtome blades Fisher 12-634-1C
Nitex filtering mesh, 48 μm Filmar 74011 http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company
p57 antibody Cell Marque 457M
Pasteur pipette VWR 53499-632
PCR machine Perkin Elmer, Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0 Applied Biosystems 4381867 Software for genotyping analysis.
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7012
Polystyrene round-bottom tubes BD Falcon 352058
Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm Fisher 1255015
PowerPlex 16 HS System Promega Corporation DC2102
Propidium Iodide Sigma P4864
Ribonuclease A from bovine pancreas Sigma R4875
Separation matrix: POP-7 Polymer Thermofisher 4352759
UltraPure Agarose Fisher 16500-500
Xylene Fisher X3P1GAL

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References

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जेनेटिक्स अंक 152 प्रजनन हानि hydatidiform तिल मोलर गर्भावस्था गर्भपात एसटीआर जीनोटाइपिंग प्रवाह साइटोमेट्री एनुलॉयड द्विगुणित और जनजात
माइक्रोसैटेलाइट डीएनए जेनोटाइपिंग और फ्लो साइटोमेट्री प्लॉयडी फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड हाइडाटिफॉर्म मोलर टिज़केस का विश्लेषण करता है।
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Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, … More

Khawajkie, Y., Mechtouf, N., Nguyen, P., Slim, R. Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues. J. Vis. Exp. (152), e60366, doi:10.3791/60366 (2019).

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