Summary
Udvikling af murine modeller med specifikke gener muteret i hoved og halscancer patienter er nødvendig for forståelsen af neoplasi. Her præsenterer vi en protokol for in vitro-omdannelse af primære murine tunge celler ved hjælp af en adeno-associeret virus-Cas9 system til at generere murine HNC cellelinjer med specifikke genomiske ændringer.
Abstract
Brugen af primære normale epitelceller gør det muligt at reproducerbart inducere genomiske ændringer, der kræves for cellulære transformation ved at indføre specifikke mutationer i onkogener og tumor suppressor gener, ved hjælp af klyngeopdelte regulerende hinanden kort palindromiske REPEAT (crispr)-baseret genom redigerings teknologi i mus. Denne teknologi giver os mulighed for nøjagtigt at efterligne de genetiske ændringer, der opstår i menneskelige kræftformer ved hjælp af mus. Ved genetisk omdanne murine primære celler, vi kan bedre studere kræft udvikling, progression, behandling, og diagnose. I denne undersøgelse, vi brugte CRE-inducerbar Cas9 mus tungen epitelceller til at muliggøre genomredigering ved hjælp af adeno-associeret virus (AAV) in vitro. Specifikt, ved at ændre KRAS, P53 og APC i normale tunge epitelceller, vi genereret en murine hoved og halscancer (HNC) cellelinje in vitro, som er tumorigent i syngeneiske mus. Den metode, der præsenteres her, beskriver i detaljer, hvordan man genererer HNC cellelinjer med specifikke genomændringer og forklarer deres egnethed til at forudsige tumorprogression i syngeneiske mus. Vi forestiller, at denne lovende metode vil være informativ og nyttig til at studere tumor biologi og terapi af HNC.
Introduction
HNC er en almindelig malignitet på verdensplan1. Modellering tilblivelsen af HNC neoplasi er i øjeblikket på et videnskabeligt vendepunkt2. Mens mange genetiske mutationer er blevet identificeret i HNC2,3,4 (f. eks. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 og RAS), er de specifikke kombinationer af genomændringer, der kræves i koncert for at inducere HNC, stadig uklare.
Den nuværende brug af humane HNC cellelinjer har bidraget væsentligt til at belyse mekanismerne i forbindelse med patogenese og behandling3. Men studiet af humane cellelinjer i immunkompromitterede murine systemer har sine begrænsninger, fordi disse systemer ikke adresserer in vivo neoplastisk proces, rollen af specifikke genmutationer og behandlingsrespons i et immun mikromiljø. Derfor er udvikling og etablering af murine cellelinjer med specifikke genetiske ændringer af afgørende betydning for at undersøge, hvordan forskellige gener bidrager til transformationsprocessen, og for at afprøve nye molekyle baserede terapier hos immunkompetente mus.
Genfunktions undersøgelser i biomedicinsk forskning er blevet væsentligt påvirket af fremskridt inden for DNA-redigeringsteknologier ved at indføre dobbelt strengene pauser (DSBs), for eksempel5. Disse teknologier, herunder brugen af zink finger nucleaser, transkriptionsaktivator-lignende Effector nucleaser, og grupperet regulerende hinanden korte palindromiske gentagelser (crispr/Cas9), giver mulighed for manipulation af ethvert gen af interesse på sin locus. De seneste CRISPR/Cas9-systemer består af en guide RNA (gRNA), der dirigerer Cas9 nuclease til at generere en DSB på et bestemt sted i genomet. Dette system har opnået stor anerkendelse i at modificere endogene gener i enhver celle eller målvæv, selv i de mest traditionelt vanskelige at behandle organismer5. Det har flere fordele i forhold til andre systemer på grund af sin enkelhed, hastighed og effektivitet.
I onkologi har CRISPR/CAS9-teknologien opfyldt behovet for effektivt at efterligne kræftceller. For at etablere dette system i HNC, vi manipulerede den potente KRAS onkogen og to vigtige tumor suppressor gener, APC og P536. Ifølge GENIE database7, denne kombination er sjælden i HNC. RAS-mutationer (HRAS, NTM og KRAS) er kun til stede i ~ 7% af alle HNC-populationer. Disse tumorer tendens til at være modstandsdygtig over for terapi8,9.
Levering af Cas9 og dens gRNA opnås gennem viral transduktion ved hjælp af enten AAVs eller lentivira. Rekombinant AAV er ofte den foretrukne metode til at levere gener til at målrette celler på grund af sin høje titer, mild immunrespons, evne til at overføre en bred vifte af celler, og generelle sikkerhed. Ved hjælp af et AAV-system, forskellige vævsspecifikke muse cellelinjer er blevet genereret, og nye cellelinjer er stadig ved at blive udviklet10,11,12. Men, et effektivt genomisk redigeringssystem, der kan generere murine HNC cellelinje modeller celler mangler at blive udviklet. I denne undersøgelse, vi søgte at udvikle et in vitro AAV-Cas9-baseret system til omdannelse af primære murine tunge celler i en tumorigent tilstand. Denne unikke CRISPR/Cas9 transformation protokol og den etablerede tumor cellelinje kan bruges til bedre at forstå biologi HNC induceret af en mangfoldighed af genomiske ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Ben Gurion universitetet i Negev Animal Care og use udvalget. Dyreforsøg blev godkendt af IACUC (IL. 80-12-2015 og IL. 29-05-2018 (E)). Alle aspekter af dyreforsøg, boliger og miljøforhold, der anvendes i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr13.
1. adeno-associeret virus produktion
- Dag 1: cellekultur
- Frø 4 x 106 HEK293T celler pr. 14,5 cm plade i 15 ml DMEM. Forbered 10 plader til transfektering med polyethylenimin (PEI) (1 μg/μl).
- Dag 2: Transfection af HEK293T celler ved hjælp af PEI
- Fjern medier og genfeed med varm DMEM 1 h før transfection.
- Prewarm transfektering reagenser og DMEM.
- Brug 10 μg plasmid af interesse, der indeholder AAV ITR (AAV pCM109 EFS CRE SG APC SG KRAS SG P53-KRAS HDR), 10 μg AAV 2/9n kapsid plasmid (med rep-genet AAV2 og Cap-genet på AAV9 og 10 μg af hjælpe plasmid (paddelta F5 Helper) pr. plade (Se tabel over materialer).
Bemærk: en ny generation af Helper plasmid-pAdDeltaF614,15,16 , der også kan bruges til AAV-produktion er tilgængelig. - Plasmiderne blandes i 1 mL almindelig DMEM pr. plade. Tilsæt derefter 90 μL polyethylenimin (total plasmid: PEI koncentration = 1:3) til plasmid mix og vortex kortvarigt.
- Den PEI-plasmid-DNA-blanding inkubates i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Tilsæt blandingen dråbevis på toppen af de HEK293T celler og overføre pladerne til cellen kultur inkubator ved 37 °c med 5% Co2 for 24 h.
- Dag 3: medium ændring efter transfektering
- Fjern mediet helt, og tilsæt 15 mL frisk DMEM.
- Dag 5: høst af virus
- Forbered en tør is/ethanol bad.
- Saml cellerne med en celle skraber og overfør dem til 50 mL rør (2 plader pr. 50 mL rør).
- Spin rør ved 800 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten fra alle rørene. Tilsæt 0,5 mL af lyse bufferen (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) pr. plade (dvs. 5 mL for 10 plader) til det første rør. Resuspendere cellerne og overføre den samlede volumen til næste rør og fortsætte indtil det sidste rør.
- Cellesuspensionen overføres til et nyt 50 mL rør. Rørene skylles med samme mængde lysis-buffer (0,5 mL pr. plade) med samme overførselsmetode som beskrevet i trin 1.4.4.
- Under forudsætning af cellesuspensionen til tre runder af ~ 10 min fryse/tø cyklusser mellem en tør is/ethanol bad og en 37 °C vandbad. Vortex kort efter hver optøning.
- Hvis rensningen udføres samme dag, indstilles equilibrationen og elueringsbufferen (Se tabel 1 for opskriften) på rt.
- Tilsæt 50 enheder benzonase pr. plade og Inkubér ved 37 °C i 1,5 h.
Bemærk: Benzonase anvendes til at fordøje residualnukleinsyrer fra værts producent cellerne og plasmid-DNA, der findes i cellesuspensionen. - Drej rørene ved 3.000 x g i 15 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten opsamles i en sprøjte med en 18 G stål nål, og opløsningen skubbes gennem et 0,45 μm filter til et 15 mL rør for at opnå det rå lysstof.
- Det rå lysstof opbevares ved 4 °C i et par uger indtil rensning eller rensning fortsættes.
2. AAV rensning
- Dag 5 eller senere
- Placer equilibrationen og elueringsbufferen ved RT.
- Vask kromatografi kolonnerne med 10 mL ækvibrations buffer.
- Tilsæt 0,5 mL pr. plade heparin-agopstået til kolonne17 , og tilsæt derefter equilibrations bufferen (4X volumenet af heparin-agopstod). Bland løsningerne ved at invertere søjlen, og lad de agopstået sediment.
- Eluere ækvibrations bufferen fra kolonnen ved tyngdekraft.
Bemærk: Efterlad en vis ækvibrations buffer for at forhindre, at agopstod tørrer ud. - Læg det rå lysstof på søjlen og Inkuber i 2 timer ved 4 °C med konstant agitation. Placer søjlen i en oprejst position, og lad den agopstod til sediment.
- Elute det rå lysat ved tyngdekraften.
- Kolonnen vaskes med en ækvibrations buffer (4X volumenet af heparin-agten).
- Placer et 100 kDa centrifugal protein filter under kolonnen og elueres virussen ved hjælp af en eluering buffer (3x volumen af heparin-agopstået) i filteret.
Bemærk: elueringsbufferen må ikke overstige 15 mL. - Filteret centrifugeres ved 3.000 x g i ~ 30 minutter, indtil der er mindre end 1 ml tilbage i filteret.
- Fyld filteret med PBS og centrifugeres ved 3.000 x g i ~ 30 min., indtil der er mindre end 1 ml tilbage i filteret. Gentag dette trin 2x for at fjerne alle salte.
- Koncentrer virus opløsningen i filteret ved centrifugering ved 3.000 x g for at nå et så lille volumen som muligt (mindre end 200 μl).
- Aspirér virus opløsningen med en nål og en sprøjte, og skub opløsningen gennem et 0,22 μm filter ind i et rør.
- Foretag aliquoter af koncentrerede virale partikler til opbevaring.
Bemærk: aliquoterne skal være ~ 20 μL for kort tids opbevaring ved 4 °C og ~ 5 μL for langtidsopbevaring ved-80 °C. - Bestemme viral titer og viral transduktion effektivitet som beskrevet tidligere14,18,19,20.
3. isolation og kultur af primære celler
- Dag 1
- Euthanize en 6-ugers gammel mandlig eller kvindelig B6; 129-gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *,-EGFP) Fezh/j ved co2 kvælning eller enhver anden iacuc godkendt protokol.
Bemærk: disse crispr/Cas9 Knockin-mus har CRE rekombinase-afhængige udtryk af Cas9 endonuklease og egfp instrueret af en CAG-promotor. Den opstrøms LOX-stop-LOX (LSL)-sekvens, der er til stede i genomet af disse mus, forhindrer ekspression af Cas9 og EGFP i fravær af CRE-genkombinase. Når de anvendes i kombination med single guide RNAs (sgRNAs) og en CRE-kilde, tillader de redigering af enkelte eller flere muse gener in vivo eller ex vivo14. - Dissekere tungen fra de aflives mus ved hjælp af kirurgisk saks.
- Manuelt dissociere vævet ved at hakde tungen væv i meget små fragmenter ved hjælp af en skalpel. Vævs fragmenter opsamles i et 15 mL rør, der indeholder 4,5 ml RPMI plain medium (med ud serum).
- Tilsæt Triple-enzym blandingen (200 μl) (Se tabel 1 for opskriften) til vævs fragmenter.
- Inkubér vævs enzym blandingen ved 37 °C i 30 minutter, og Tap røret hver 10 min for at øge enzymatisk dissociation af vævet.
- Der tilsættes 5% føtal bovint serum (FBS) indeholdende HBSS/PBS til vævs enzym blandingen for at standse enzym virkningen.
- Filtrer ovenstående cellesuspension gennem et sterilt 70 μm nylon mesh for at adskille de spredte celler og større vævs fragmenter.
- Den filtrerede cellesuspension vaskes ved centrifugering for 300 x g i 5 min i hbss/PBS ved rt.
- Resuspendere pellet i kulturmedium (10% FBS i RPMI/DMEM) og vokse i 60 mm kultur retter indtil særskilte celle kolonier dannes.
- Kultur celle aggregater bevaret oven på filteret i en 60 mm kultur skål indeholdende 3 mL komplette medier (10% FBS i RPMI/DMEM) indtil celle kolonier dannes.
- Mikroskopisk undersøge de primære celler for tilstedeværelsen af fibroblast kontaminering efter 1 uge af kultur. Behandl de primære celler udviklet fra aggregater og celle suspensioner med 0,25 trypsin 0,02% EDTA opløsning ved 37 °C i 1 min for at fjerne fibroblaster.
Bemærk: normalt producerer den primære kultur fra celle aggregater flere kolonier sammenlignet med enkelt celle suspensioner. Cellerne fra disse kolonier giver bedre transduktiviteteffektivitet med AAV-transduktion.
- Euthanize en 6-ugers gammel mandlig eller kvindelig B6; 129-gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 *,-EGFP) Fezh/j ved co2 kvælning eller enhver anden iacuc godkendt protokol.
4. AAV-transduktion af primærceller
- Dag 10
- Frø 2 x 105 primære celler pr brønd i 6 brønd plader i 2 ml komplette medier (10% FBS i rpmi/DMEM).
- Den næste dag, transduce cellerne med 1012 viral genom/ml (1010 transducere/ml) og inkubere cellerne i viral partikel-holdige medier for 48 h ved 37 °c.
- Fjern de virale partikel-holdige medier og fodre de AAV-transducerede celler med komplette medier.
Bemærk: kun celler, der gennemgik transduktion, vil udtrykke GFP og begynde at formere sig. Celler, der ikke undergår transduktion vil i sidste ende dø inden for 2 uger. - Efter 2 ugers kultur ekspansion, frø cellerne til validering og in vivo tumorigent eksperimenter.
Bemærk: genomisk DNA fromAAV-transducede celler og normale primære celler fra Cas9 mus blev ekstraheret til validering af specifik genomredigering ved hjælp af standardprotokoller. Sekvensering af det ekstraherede DNA og analyse af de sekvenserede data (tabel 2) blev udført ved hjælp af en indfangnings baseret næste generations sekvenserings analyse (f. eks. MSK-Impact platform) som beskrevet tidligere21.
5. validering af omdannelsen af normale celler til tumorigent celler ved hjælp af immunofluorescens og vestlige blotting
- Immunofluorescenstest
- Frø 2 x 105 celler på 12 mm glas dæksedler og placere dem i en inkubator natten over.
- Fix celler i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pH = 7,4) og proces for immunofluorescens mærkning.
- De faste celler med det første primære antistof inkubates i 1% BSA eller 1% serum i PBST i et befuret kammer i 1 time ved RT eller natten over ved 4 °C. De primære antistoffer, der anvendes, er kanin monoklonalt anti-KRT 14, kanin monoklonalt anti-E-cadherin-antistof og Cas9 mus mAb.
- Fjern den primære antistof opløsning fra dæksedlerne ved at vaske cellerne 3x i 5 minutter med 1x PBS.
- Inkuber cellerne med Cy3 æsel anti-kanin IgG og/eller Cy3 ged anti-mus IgG sekundære antistoffer i 5% BSA i PBST i 1 time ved RT i mørket.
- Fjern den sekundære antistof opløsning fra dæksedlerne, og vask cellerne 3x som beskrevet i trin 5.1.4.
- Monter dæksedlerne med et fald på monterings mediet, der indeholder DAPI (DAPI Fluoromount).
- Opbevares i mørke ved 4 °c, indtil slidene er afbildet ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
- Western blotting
- Frø 1 x 106 transformerede celler i en 100 mm kultur skål og placere dem i en inkubator natten over.
- Vask og skrabe de transformerede celler til 200 μl iskold PBS.
- Centrifuger røret med cellesuspensionen i 10 minutter ved 2.000 x g ved 4 °c for at pille cellerne.
- Opsug supernatanten og lysere cellerne ved hjælp af lysis-buffer (Se tabel 1) indeholdende fosfatasehæmmer cocktails og en proteasehæmmer i 10 min ved 4 °c. Der centrifugeres lysaterne i 10 minutter ved 10.000 x g og 4 °c, og de ryddede lysater opsamles.
- Brug et kommercielt tilgængeligt Bradford assay kit til at bestemme proteinkoncentrationen efter producentens protokol. Brug 4X prøve buffer (500 mm Tris pH = 6,8, 40% glycerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromphenolblåt blå) til at justere protein prøverne til 0,5 eller 1 μg/μl. kog ved 96 °c i 5 min.
Bemærk: prøverne kan opbevares ved-80 °C, eller indtil der udføres en Western blot-analyse. - Adskil lige mængder af samlet lysat (30 μg) med 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side). Sørg for, at farvestoffet når bunden af gelen. Overføre proteinet til nylon membranen ved semi-Dry blotting ved 25 V i 30 min.
- Hæld 5% BSA i Tris-bufferet saltvand (TBS)-0,1% Tween (TBST) over membranen for at dække det fuldstændigt. Bloker membranen i 1 time ved RT. Inkubér mebrane med primære antistoffer (anti-CRE, anti-Cas9, anti-GFP, anti-β køreledning i, anti P53, anti-phospho-ERK, og anti-β actin fortyndet i 5% BSA TBST) ved 4 °C natten over.
- Efter inkubation vaskes membranerne i 10 minutter med 1x TBST, hvilket sikrer, at opløsningen dækker membranen helt. Udfør denne vask 3x, og tilsæt derefter peberrod peroxidase (HRP)-konjugeret sekundært antistof (fortyndet 1:10000 i 5% BSA TBST) til membranen. Inkuber i 1 time ved RT.
- Efter inkubation vaskes membranerne i 10 minutter med 1x TBST, hvilket sikrer, at opløsningen dækker membranen helt. Udfør chemiluminescens Imaging (Se tabel over materialer) for at eksponere båndene, og Tag billeder i overensstemmelse hermed.
- Validering af det tumorigene potentiale af transformerede celler i immunkompetente mus
Bemærk: mus blev vedligeholdt og behandlet i henhold til de institutionelle retningslinjer for Ben-Gurion universitetet i Negev. Nikke. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) og C57BL/6 mus blev anvendt til in vivo-undersøgelserne. Mus blev anbragt i luft-filtreret laminar flow kabinetter med en 12 timers lys/mørk cyklus og blev fodret mad og vand ad libitum.- Brug 6-8 uge-gamle kvindelige NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) og C57BL/6 mus til studiet.
- Trypsinize de AAV-Cas9 transformerede celler. Trypsinization stoppes ved hjælp af DMEM forvarmede ved 37 °c og opsamles i et 50 ml rør.
- Centrifuger røret ved 800 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres og opslæmmes celle pellet i DMEM medium uden FBS. Centrifugerings formen udføres igen, og celle pellet opslæmmes i 1x PBS.
Bemærk: Opbevar ikke cellerne i 1x PBS for længe. Opbevar altid cellesuspensionen på isen for at forhindre celle sammenklumpning. - Brug en automatisk celle tæller til at tælle cellerne og fortynde cellerne til den ønskede koncentration (2,5 x 107 celler/ml) ved hjælp af 1x PBS. Generer tumorer gennem en subkutan injektion af AAV-Cas9 transformerede cellesuspension i højre flanke af hver node. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (NOD. SCID) mus (2 x 106 celler/mus). At generere en orthotropic model i syngeneiske mus, injicere 0,5 × 106 primære celler eller AAV-Cas9 transformerede celler i TUNGEN af C57BL/6 immunkompetente mus.
- Euthanize dyrene 2 uger efter injektion ved co2 kvælning, og dissekere tumorer fra aflives mus til Immunhistokemi analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af AAV-systemet til at omdanne normale Cas9 celler
Figur 1 indeholder et detaljeret vektor kort over AAV transgene plasmid, der anvendes i dette studie. Figur 2 skitserer udformningen og arbejdet af AAV-Cas9 baseret-system. For at fremstille virale partikler blev de HEK293T celler transficeret med AAV transgen vektor og andre virale emballage vektorer ved hjælp af Pei transfektering metode. Efter transfection blev de virus-holdige celler indsamlet og lysed, og ved hjælp af den heparin-agopstod oprensningsproces blev de virale partikler renset og koncentreret (figur 2A). Disse rensede virale partikler blev anvendt til in vitro-omdannelsen af primære celler isoleret fra Cas9 mus for at kontrollere effekten. I vores system introduceres AAV transgene Expression-kassetten gennem homologe rekombination i den CRE-afhængige Cas9 Rosa26 målretnings skabelon i museceller, der bærer en allestedsnærværende CAG-promotor (pCAG), en LoxP-stop-LoxP-kassette (LSL), et Cas9 nuclease-gen, et selv kløende P2A peptid og reporter-genet (EGFP) flankeret af to homologe arme14. CRE-rekombinasaktiviteten for de transducerede celler er med til at gøre punkt Cas9 og GFP-udtrykket (figur 2B). Cas9 nuclease aktivitet introducerer en dobbelt-strandede pause på målet steder af interesse, instrueret gennem gRNAs, og hjælper i genredigering. AAV-systemet, der anvendes i denne undersøgelse, hjælper med at levere multiplexed grnas (sgrnas til KRAS, P53 og APC) og også i at udtrykke en onkogene KRASG12D allel gennem Homologisk styret reparation (HDR) i de transducerede celler.
Figur 1: vektor kort over AAV-transgenplasmid, der anvendes i dette studie. Dette AAV-system har en AAV-rygrad, der udtrykker CRE rekombinase og tre U6-drevne sgRNAs rettet mod KRAS, P53 og APC. Det indeholder også en KRAS G12D Homology-rettet reparation (HDR) donor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: design og bearbejdning af et AAV-Cas9-system til omdannelse af normale celler. A) skitse til fremstilling og rensning af AAV-partikler fra HEK293T efter transftering af dem med AAV-transgenet og paknings plasmider. B) viral transduktion af primærceller med AAV-partikler og den mekanisme, hvormed CRE-afhængig Cas9 udtryk muliggør crispr-redigering og omdannelse af primære celler til tumorigent celler. En enkelt AAV-vektor, der integrerer gRNAs for tre forskellige gener med et Knockin af KRAS G12D allelen gennem HDR med en CRE rekombinase Expression-kassette, blev leveret til CRE-afhængige Cas9 musens primære celler. CRE-rekombinaseaktiviteten i de transducerede celler fører til excision af LoxP-stop-LoxP-kassetten og inducerer Cas9 og GFP-udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Validering af AAV-Cas9 systemet in vitro i isolerede mus embryonale fibroblast celler
Primære mus embryonale fibroblast (MEF) celler har udelukkende været anvendt til at studere konsekvenserne af genablation i cellulær vækst og spredning22. For at validere effektiviteten af AAV-Cas9 systemet ved omdannelse af normale celler, transducerede vi MEF-celler isoleret fra Cas9 muse embryoner (E14) med AAV. MEF-cellerne blev isoleret som beskrevet tidligere23,24. MEFs fra 14-dages-gamle Cas9 muse embryoner blev brugt, fordi de er lette at kultur og transduce in vitro. Kort sagt, for at omdanne MEFs via AAV-transduktion blev primære Mef'er ved ca. 30% sammenløbet anset for at være klar til transduktion. En time før transduktion blev MEF-kulturmediet ændret. Den rensede AAV blev optøet på is, og MEF-kultur medierne blev aspireret. Viral supernatanten med en titer varierende fra 106-1014 viral genom/ml blev tilsat til hver brønd og inkuberet natten over ved 37 °c. Den virale supernatanten blev fjernet efter 48 h, erstattet med 2 mL MEF-kulturmedium, og inkuberet derefter ved 37 °C indtil GFP-ekspression, ca. 5 dage efter transduktion. GFP-ekspression af Mef'er blev fremrykket og valideret. Bemærk, at for denne vektor fandt vi, at 1012 virale genomer/ml (svarende til 1010 transducere/ml) effektivt kunne omdanne primære MEF-celler til tumorigent mefs (figur 3A). De transducerede celler udtrykte CRE, Cas9 og GFP (figur 3B, C). For at få adgang til det tumorigent potentiale af AAV transformerede MEF celler, 0,5 x 106 celler (primær/AAV-transduced MEF) blev injiceret i tungen, læbe, og subkutant i NOD-scid mus. Transformerede celler dannede tumorer i disse mus, sammenlignet med den primære MEF, som ikke danner tumorer (figur 3D-F).
Figur 3: validering og in vitro-omdannelse af primære MEF-celler ved hjælp af AAV-Cas9-systemet. A) enskitse af in vitro-omdannelsen af fibroblaster fra embryoner indsamlet fra Cas9 mus ved hjælp af AAV-partikler. B) repræsentativt immunofluorescenbillede af primære MEF-og AAV-TRANSDUCEREDE MEF-celler, der viser ekspression af Gfp, CRE og Cas9. DAPI blev brugt til at plette kernen. (C) Western blotting viser CRE, CAS9, gfp, og β-actin i embryonale normale fibroblaster og genetisk redigerede fibroblaster. (D) repræsentativt billede af en tungen tumor, der udviklede sig i en NOD-scid mus efter injektion det med transformerede fibroblast celler. (E) repræsentativt billede af en læbe tumor, der dannes i en NOD-scid mus efter injektion det med transformerede fibroblast celler. F) repræsentativt billede af en flanke tumor, der udviklede sig i en NOD-scid-mus efter injektion af den med transformerede fibroblast celler. Pilene indikerer en tumor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
In vitro generation af den tumorigent murine tungen epitelial cellelinje fra primære tunge epitelceller ved hjælp af AAV-Cas9 system
Efter validering af den transformerende egenskab af AAV-systemet ved hjælp af MEF-cellerne, isolerede vi primære tunge epiteliale celler fra Cas9 mus og dyrkede dem in vitro. De primære tunge celler blev transduceret med AAV viral partikler (1010 CFU/ml), og efter en uges celler begyndte at udtrykke gfp. Den tumorigent omdannelse af primære tunge epiteliale celler (figur 4A) blev bekræftet ved hjælp af immunofluorescens og vestlig blotting (figur 4B, C). De transformerede celler udviser forbedret KRT 14-, E-cadherin-og GFP-udtryk (figur 4B). Den tumorigent omdannelse af primære tunge epiteliale celler blev bekræftet ved ekspression af gfp (dvs. det CRE-afhængige udtryk for Cas9 og gfp) (figur 4C). Ekspression af KRT14 og E-cadherin bekræfter deres epiteliale celleegenskaber. Protein validering bekræftet forbedret β-køreledning i, phospho-Erk, og reduceret P53 udtryk (figur 4C), hvilket indikerer den effektive downregulation af APC og P53 og inkorporering af mutant KRAS ind i tungen celler, hvilket gør dem tumorigenic. Genomisk analyse ved dyb sekvensering af DNA isoleret fra de transformerede celler bekræftede den effektive genredigering og frame-Shift af TP53-og APC-generne ved AAV-Cas9-systemet (tabel 2). Den tumorigent egenskab af den AAV-transformerede tungen cellelinje blev yderligere vurderet ved at injicere den ind i tungen af immunkompetente vildtype C57BL/6 mus. De transformerede tunge celler, der er udpeget som KRAS-mutante epiteliale celler i tungen (KRAS mut EpT), danner tumorer effektivt i C57BL/6 mus (figur 4D). KRAS mut EpT tumorer blev evalueret af en oral og maxillofacial Surgery patolog ved rutinemæssig hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning og ved Immunhistokemi. Tumorer udstillet en spindel celle morfologi med fremtrædende nukleare atypia: pleomorfi, hyperchromatism, gigantiske kerner, flere nucleoli, og en høj mitotisk sats med atypiske mitotiske tal. Perivaskulær invasion og angioinvasion blev også noteret. Disse morfologiske funktioner blev ledsaget af meget begrænset til ikke-eksisterende tumor-associeret betændelse. Immun Histokemisk var neoplastiske celler cytoplasmically positive for E-cadherin og KRT 14, begge markører for epitelial væv. KRT 14 er typisk for planocellulært epitel, der understøtter tumor cellernes planocøse oprindelse og dermed diagnosen planocellulært karcinom (figur 4E). Denne fremgangsmåde giver derfor en alsidig metode til omdannelse af primære celler in vitro med en ønsket genmodifikation. Hertil kommer, at denne metode letter brugen af disse udviklede cellelinjer in vivo i syngeneiske mus for bedre forståelse af neoplasi i en reel tumor mikromiljø milieu.
Figur 4: in vitro-omdannelse af primære tunge epiteliale celler ved hjælp af AAV-Cas9 systemet. A) skematisk gengivelse af in vitro-omdannelsen af normale epiteliale celler opnået fra tungen af Cas9 mus. B) repræsentativt immunofluorescens billede af AAV-transducerede tunge epiteliale celler, der viser ekspression af KRT14, E-cadherin og gfp. (C) Western blot viser Cas9, β-køreledning og phospho-Erk docetaxels Opregulering med P53 Proteinniveau Nedregulering, der viser de genetisk redigerede epiteliale celler. (D) repræsentativt billede af en tumor, der udviklede sig i tungen af de immunkompetente mus efter injektion dem med transformerede tunge epiteliale celler (KRAS mut EpT). (E) repræsentative billeder af tumor vævs sektioner for H & E, e-cadherin, og krt 14 farvning ved 20x og 40x forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Cellelyse buffer til viral høst | Volumen |
| 150 mM NaCl | 876.6 mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605.7 mg |
| Brug HCl til at justere pH 8,5 | |
| Molekyle kvalitet vand | Fremstille op til 100 mL |
| Ækvibrations buffer | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18.64 mg |
| Bland alt i PBS 1X og Juster pH til 7,2 | Fremstille op til 100 mL |
| Elueringsbuffer | |
| 0,5 M NaCl | 2.92 g |
| Bland alt i PBS 1X og Juster pH til 7,2 | Fremstille op til 100 mL |
| 10X tredobbelt enzym stamopløsning: | |
| Kollagenase | 1 g afsluttende Konc. [10 mg/ml] |
| Hyaluronidase | 100 mg [1 mg/ml] |
| DNase | 20.000 enheder Final conc. [200 mg/ml] |
| PBS 1X | Fremstille op til 100 mL |
| Plasmid mix (til en 14,5 cm plade) | |
| AAV pCM109 EFS CRE SG APC SG KRAS SG P53-KRAS HDR | 10μg |
| AAV, 2/9, kapsid Vector | 10μg |
| pAD Delta F5 hjælper | 10μg |
| PEI (1μg/μl bestand) | 90 μl |
| DMEM | 1 mL |
Tabel 1: opskrifter på buffere, der anvendes i dette studie.
Tabel 2: analysedata for genom af Kras mut EpT-celler. Venligst klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder har tidligere været anvendt til at omdanne primære celler i kultur med varierende grader af succes25,26,27,28. De fleste af disse metoder bruger mus fibroblast celler til omdannelse14,17,18,19 eller bruge kræftfremkaldende stoffer såsom 4-nitroquinoline-1-oxid (4-nqo)21,22 for at udvikle murine cellelinje modeller. Brug af knockout og transgene musemodeller har også i høj grad forbedret vores forståelse af de forskellige molekylære veje, der styrer udviklingen og differentieringen af HNC. Brug af murine orale epiteliale cellelinjer med et unikt genetisk mønster ville helt sikkert supplere disse undersøgelser, og deres efterfølgende biokemiske analyser ville bidrage til behandling og diagnose af HNC. Men kun nogle få rapporter har beskrevet etableringen af mus orale epiteliale celler28,29,30,31,32,33 og disse cellelinjer er ikke i udbredt brug.
Den største begrænsning af disse murine orale epiteliale cellelinjer er, at de ikke er karakteriseret udførligt på det molekylære niveau og blev fundet for at udtrykke ualmindelige gen mønstre. Således, den begrænsede molekylære forståelse af disse murine cellelinje modeller og manglen på en effektiv metode fik os til at udnytte det unikke potentiale i AAV-crispr genom redigerings teknologi i Cas9 Knock-in mus til at etablere murine cellelinjer med specifikke genændringer. I denne undersøgelse introducerede og udviklede vi et in vitro AAV-Cas9 system til omdannelse af primære murine celler til en tumorigent tilstand for at bekræfte de genetiske ændringer, der giver anledning til karcinom celler. Vi har med succes etableret murine Tongue epitelceller med specifikke genmutationer med høj effektivitet ved hjælp af AAV-mediated CRISPR-induceret somatisk gen redigering af flere sgRNA kombinationer.
Denne metode tilbyder en ny eksperimentel tilgang for bedre at forstå den celle-autonome ætiologi af HNC. Begyndende med murine primære tunge epiteliale celler, vi var i stand til at omdanne sådanne celler til tumorgenicitet ved at slette et begrænset sæt af gener og indføre en enkelt KRAS-mutation. Ved hjælp af denne metode er det nu muligt at undersøge, om andre gener, som vides at være impliceret i andre carcinomer, kan fremkalde maligniteter, der minder mere om HNC. De morfologiske egenskaber af tumorer fra KRAS mut EpT bekræftet planocellulært karcinom. Den histopatologiske analyse af KRAS mut EpT-tumorer i syngeneiske mus er forbundet med og støttende af den aggressive biologiske opførsel af hoved-og hals karcinom. Det kan således være muligt at forbinde de genotyper af kræftceller til specifikke kliniske og histopatologiske egenskaber af tumorer.
De vigtigste fordele ved denne metode er evnen til at udvikle cellelinjer fra primære celler fra ethvert organ ved hjælp af specifikke genmutationer og brugen af AAV-Cas9, hvilket gør systemet mere robust og stabilt. Det endogene Cas9 system gør det muligt at udnytte andre genknockouts. Den største ulempe ved den nuværende metode er den tid, der er nødvendig for at isolere og etablere den primære kultur samt den høje titer af virale partikler, der er nødvendige for at transducere de primære celler. Dette kan dog overvindes ved at standardisere isolations processen for hver celletype. Problemet med at kræve en høj AAV viral titer for effektiv transduktion kunne afhjælpes ved brug af den nyeste generation af kapsid og hjælper plasmider til viral emballage og en bedre rensningsproces.
I fremtiden kunne et bedre og mere effektivt AAV-system designes og ekstrapoleres in vivo for at lave Organspecifikke genetisk modificerede tumormodeller. Afslutningsvis, oprettelse af murine cellelinjer ved denne tilgang vil tjene som et værdifuldt in vitro cellekultur-baserede værktøj til at teste flere hypoteser i forbindelse med onkologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.S. er i det rådgivende udvalg for Bioscience Institute, og Menarini Ricerche har modtaget forskningsmidler fra Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics og Menarini Ricerche. M.S. er også medstifter af medendi Medical Travel, og har i de sidste 2 år modtaget honorarer fra menarini Ricerche og ADC Pharma. Alle andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Daniel Gitler for at give os pAd Delta 5 Helper plasmid. Dette arbejde blev finansieret af Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (til mig), de Forenede Stater-Israel binational Science Foundation (BSF, 2017323) (til mig og MS), Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (for mig), Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (for mig), og concern Foundation (#7895) (for mig). Fællesskabet: Alon-stipendiet til mig og BGU Kreitman-stipendierne til SJ og MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N.
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D.
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
